JPH07274964A - ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼ - Google Patents

ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼ

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JPH07274964A
JPH07274964A JP7052392A JP5239295A JPH07274964A JP H07274964 A JPH07274964 A JP H07274964A JP 7052392 A JP7052392 A JP 7052392A JP 5239295 A JP5239295 A JP 5239295A JP H07274964 A JPH07274964 A JP H07274964A
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alkyl
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マンフレート・テー・レーツ
Joerg Simpelkamp
イェルク・ジンペルカンプ
Albin Zonta
アルビン・ツォンタ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｓi−Ｃ結合に結合した非加水分解性の有機
置換基を含むシリカマトリックスに反応により固定化さ
れたリパーゼの製造方法 【効果】 固定化されたリパーゼは加水分解反応、エス
テル交換反応、エステル化反応等において高い活性を有
し、また貯蔵安定性に優れる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リパーゼ存在下の、ゾ
ル−ゲル法によるシリカーをベースにした疎水性マトリ
ックスの構築により製造した酵素固定体、その製造方法
およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】技術的な利用においてリパーゼを用いる
ことは、特に疎水性の基質が主に用いられる、温和な条
件下でのエステルの加水分解または合成、およびエステ
ル交換反応において益々興味が持たれている(ケー・デ
ィー・ムクヘルジー(Ｋ．Ｄ．Ｍukherjee)、バイオキャ
タリシス(Ｂiocatalysis)、１９９０年、３巻、２７７
〜２９３ページ；ティー・ニールセン(Ｔ．Ｎielsen)、
フェッテ,ザイフェン,アンストリッヒミッテル(Ｆett,
Ｓeifen,Ａnstrichmittel)、１９８５年、８７巻、１５
〜１９ページ)。その基質特異性がしばしば広いので、
リパーゼは脂質化学においてばかりではなく、有機合成
における立体選択的な反応についても益々しばしば用い
られている。リパーゼは病気治療にも用途が見出されて
いる。リパーゼはすい臓病または胆のう線維症により起
こる消化不全の治療に用いられている。酵素反応の経済
的効率についての重要な要素は、酵素の容易な回収と多
数回の使用を可能にし、もし可能なら反応条件における
その安定性を増加させるために、バイオキャタリストの
固定化のために適した方法である。酵素技術のこの分野
における先行技術は、例えばリパーゼについての総説文
献(エフ・エックス・マルカタ(Ｆ．Ｘ．Ｍalcata)、エ
ッチ・アール・レイス(Ｈ．Ｒ．Ｒeys)、エッチ・エス
・ガルシア(Ｈ．Ｓ．Ｇarcia)、Ｃ．Ｇ．ヒル・ジュニ
アー(Ｃ．Ｇ．Ｈill,Ｊr．)およびシー・エッチ・アム
ンドソン(Ｃ．Ｈ．Ａmundson)、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・オイル・ケミカル・ソサエティ(Ｊ．Ａm．Ｏ
il Ｃhem．Ｓoc.。)、１９９０年、６７巻、８９０〜９
１０ページ)に数回要約されている。いくつかの例で
は、リパーゼを固体のマトリックスに導入することによ
る固定化の結果として、他の方法に比べて活性収量と安
定性の改良がもたらされるが、たいていの場合実施する
のが複雑である。
【０００３】テトラメトキシシランまたはテトラエトキ
シシラン等のテトラアルコキシシランの加水分解による
ゾル−ゲル法(シー・ジェー・ブリンカー(Ｃ．Ｊ．Ｂri
nker)、ジー・ダブリュー・シェラー(Ｇ．Ｗ．Ｓchere
r)、ゾル−ゲル・サイエンス(Ｓol−Ｇel Ｓcience)：
ザ・フィジックス・アンド・ケミストリー・オブ・ゾル
−ゲル・プロセシング(Ｔhe Ｐhysics and Ｃhemist
ry of Ｓol−Ｇelprocessing)、アカデミック・プレ
ス、サン・ジェゴ、１９９０；エル・エル・ヘンチ
(Ｌ．Ｌ,Ｈench)、ジェー・ケー・ウエスト(Ｊ．Ｋ．Ｗ
est)、ケミカル・レビュー(Ｃhem．Ｒev．)、１９９０
年、９０巻、３３〜７２ページ)によるＳiＯ2ゲルの製
造は、無機マトリックス中に生体物質を導入するのに用
いることができる。しかしリパーゼの固定化のためには
この方法は適していない。何故ならその方法は非常に不
満足な活性収量を与えるのみであるからである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】適当な触媒および以下に
記載する他の添加剤の存在下に、シリコンに結合した有
機の置換基を有するアルコキシシリコン化合物の加水分
解により得られるシリコン含有マトリックスへリパーゼ
を包括すると、異常に大きい触媒活性を有する材料が得
られることが驚くべきことに見出された。本発明の方法
による固定化により、商業的に入手できる酵素製品に比
べてツーオーダーまでの大きさの活性の予期しない増
加、および上述の従来のゾル−ゲル法により(テトラア
ルコキシシランのみを用いる)製造された固定化体と比
べてツーオーダーの以上の大きさの活性の増加が有機媒
体中での反応において認められている。本発明の方法に
より製造した固定化リパーゼは、温度安定性の増加を含
む優れた安定性を示し、水性および有機媒体の両方にお
ける反応について広範囲に利用できる。固定化のパラメ
ーターを変化させることにより、マトリックスの性質お
よび得られる固定化体の性質をコントロールでき、その
ことは与えられた技術的利用についての広範囲の最適化
を可能にする。
【０００５】本発明は、有機置換基を有するシリカマト
リックスに固定化されたリパーゼ、およびＲkＲ″lＳi
(ＯＲ′)m (Ａ）および／または［(Ｒ′Ｏ)nＲoＳi]p
Ｘ (Ｂ)のタ イプ、 および／またはＹ−(ＲqＲ″rＳi
Ｏ)sＲqＲ″rＳi−Ｙ (Ｃ)のタイプ(式中、Ｒおよび
Ｒ″は１〜１８個の炭素原子を有する飽和または不飽和
のアルキル置換基または芳香族置換基から選択され、
Ｒ′は１〜５個の炭素原子を有するアルキル残基または
アルカリ金属原子であり、Ｘは２官能性またはそれ以上
の多官能性のアルキル若しくはアリール残基、またはヘ
テロ原子であり、Ｙは−ＯＨ、−ＯＲ、または−Ｓi(Ｏ
Ｒ′)3であり、kおよびlは０〜３の数であり(k＋l＜
４)、mは２〜４の数であり(m＝４−l−k)、nは１〜３の
数であり、oは０〜２の数であり(o＝３−n)、pは２〜４
の数であり、qおよびrは０〜２の数であり(q＋r＝２)、
sは１〜１００の数である。)のシリコン化合物を、リパ
ーゼ水溶液の存在下、および場合により付加的な溶媒、
１(または以上)の適当な触媒、および得られる固定化酵
素の活性、安定性および機械的または磁気的性質にポジ
ティブな影響を有する１以上の添加剤の存在下に、加水
分解する方法で固定化したリパーゼの製造方法に関す
る。
【０００６】好ましく用いられる、Ｒ′がアルキル(例
えばメチル、エチル)またはナトリウムであるＡタイプ
のシリコン成分は以下のものである。: −ＡＩ: ＲがＣ1〜Ｃ18の鎖長を有するアルキル、アル
ケニル例えばビニル、アルール例えばフェニルであるア
ルキルまたはアリールトリアルコキシシランＲＳi(Ｏ
Ｒ′)3 。 −ＡＩＩ: Ｒ,Ｒ″がＣ1〜Ｃ18の鎖長を有するアルキ
ル、例えばメチルである、ジアルキル、アルキルアリー
ルまたはジアリールアルコキシシランＲkＲ″2-kＳi(Ｏ
Ｒ′)2 。タイプＡＩＩの化合物(架橋に適した２つの基
しか有しない)は、タイプＡＩまたはＡＩＩＩの成分
と、例えば３〜６の(ＡＩ、ＡＩＩＩ):ＡＩＩモル比
で、組合せて用いてよい。 −ＡＩＩＩ: タイプＡＩ、ＡＩＩ、ＢまたはＣのシラ
ンと組合せたテトラアルコキシシランＳi(ＯＲ′)4 。
１以上の有機置換基を有するシリコン原子の割合は、用
いたシリコンの全量を基準にして少なくとも５０原子％
である。
【０００７】Ｒ′がアルキル、例えばメチルまたはエチ
ルであるタイプＢのシリコン成分は、Ｘがアルキレン、
例えば(ＣＨ2)2〜6、アリーレンまたはＯである式(Ｒ′
Ｏ)3Ｓi−Ｘ−Ｓi(ＯＲ′)3のビス(トリアルコキシシリ
ル)化合物である(タイプＡＩ、ＡＩＩ、ＢまたＣのタイ
プのシランと組合せてＡＩＩＩと共に用いる。)。Ｃタ
イプのシリコン化合物はＡタイプの化合物、特にＡＩお
よびＡＩＩＩと組合せて用い、オリゴマーまたはポリマ
ー性のジアルキルシロキサン、特に、例えばシラノール
末端基と５〜６０のモノマー単位の鎖長を有するポリジ
メチルシロキサンである。成分のＡ:Ｃのモル比は例え
ば３〜６である。
【０００８】用いるタイプＡおよび／またはＢのシリコ
ン化合物は、酸または上述の塩基性触媒を添加した水
で、例えば超音波の作用により前処理してもよい。その
シランは前処理工程なしに酵素固定化に直接用いてもよ
い。
【０００９】本発明において提供される方法は、多くの
様々な起源のリパーゼに広く適用可能である。固定化さ
れたリパーゼは、微生物起源、例えばＳＰ５２３リパー
ゼ(ノボ(Ｎovo))であってよく、例えばシュウドモナス
(Ｐseudomonas)属(例えばシュウドモナスフルオレセン
ス(Ｐs．fluorescens)、シュウドモナスセパシア(Ｐs．
cepacia))のバクテリアから、カンディダ(Ｃandida)属
(例えばカンディダアンタルクチカ(Ｃ．antarctica)、
カンディダリポリチカ(Ｃ．lipolytica))の酵母から、
リゾプス(Ｒhizopus)属(例えばリゾプスアーリザス(Ｒ
h．arrhizus)、リゾプスデレマー(Ｒh．delemar)、リゾ
プスニベウス(Ｒh．niveus))、ペニシリウム(Ｐenicill
ium)属(例えばペニシリウムロクェフォルティ(Ｐ．roqu
eforti))、アスペルギルス(Ａspergillus)属(例えばア
スペルギルスニガー(Ａ．niger))、ムコール(Ｍucor)属
(例えばムコールミーハイ(Ｍ．miehei))の糸状菌から得
てもよく、植物起源(例えば麦芽から)であってよく、例
えばポルシンパンクレア(porcine pancreas)からの動
物起源であってもよい。１mmolのシリコン化合物当たり
０.１〜３０mgのリパーゼを用いる。加える外部タンパ
ク質なしの固定体中のタンパク質含量の測定により固定
化度は１０〜９５％以上であり、対応するローディング
(loading)は、生じた酵素固定体１g当り、０．２〜８０
mgの固定化リパーゼタンパク質であることがわかった。
【００１０】用いる触媒は、１モルのシリコン化合物当
り１０〜１００mmolの化学量論量の、塩基性化合物、例
えばアンモニウムヒドロオキサイドおよびアルカリ金属
ヒドロオキサイド、好ましくは水酸化ナトリウムまた水
酸化カリウム; １モルのシリコン化合物当り１〜１０m
molの化学量論量のアンモニア; １モルのシリコン化合
物当り０．１〜１００、好ましくは１〜１０mmolの化学
量論量のアンモニウムフルオライドおよびアルカリ金属
フルオライド、好ましくはフッ化ナトリウムまたはフッ
化カリ;およびそのような化合物の組合せを含む。
【００１１】以下の添加剤を用いる：(Ｉ)タンパク質
(０〜２００mgのタンパク質／mgリパーゼ)、例えばアル
ブミン、ゼラチン、カゼイン酸ナトリウム；(ＩＩ)ポリ
ヒドロキシ化合物(０〜１０００mg添加剤／mgリパー
ゼ)、例えばポリビニル，アルコール(例えば０．０５〜
２００mg／mgリパーゼ)、ソルビット、グリセロール、
ポリエチレングリコール(例えば０．５〜１０００mg／m
gリパーゼ)；(ＩＩＩ)不溶性有機ポリマーまたは無機化
合物、例えばマグネタイト(Ｆe3Ｏ4)、ＳiＯ2をベース
にした物質、例えばセライト(登録商標)、シラン(Ｓira
n)(登録商標)等のオープンポア焼結ガラス、コントロー
ルされた多孔性ガラス(ＣＰＧ)またはケイ藻土；および
そのような化合物(Ｉ)〜(ＩＩＩ)の組合せ。添加剤の種
類および量は、固定化リパーゼの得られる活性に影響す
る。適当な添加剤の添加によって、添加剤のない類似の
系と比べて、活性収率の顕著な増加を達成できる。
【００１２】水は、適当な緩衝物質の添加により緩衝化
されまたは緩衝化されない、リパーゼ、添加剤、触媒の
水溶液の形で、さもなくば直接反応媒体に、１モルのシ
リコン化合物当り４〜１５モル、好ましくは８〜１２モ
ル量導入される。適した緩衝媒体は例えばpＨ値６〜１
０を有するリン酸ナトリウムまたはカリウム緩衝液であ
る。脂肪族アルコール(例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール)、ＴＨＦ、ＤＭＦ等の有機溶媒を２
０容量％までの少量反応混合物に加えてもよく、または
有機溶媒の添加はなしですますこともできる。
【００１３】リパーゼを固定化する好ましい方法は例え
ば、酵素の緩衝化したまたは緩衝化しない水溶液を、水
または水性緩衝液、上述の添加剤Ｉおよび／またはＩＩ
の水溶液、および触媒の水溶液の混合物に、０℃〜５０
℃、好ましくは４℃〜室温で加え、スワーリングまたは
振とうにより撹拌し、シリコン化合物(Ｒ′＝アルキル)
を加え(例えばタイプＡＩおよびＡＩＩＩの化合物の混
合物などの非常に異なった反応速度を有する成分を用い
る場合には反応性の小さい成分を先ず加える。)、均一
な相が形成するまで撹拌し、反応混合物がゲル化するま
でスワーリングまたは振とうすることを含んでなる。ゲ
ル化が顕著な熱の発生を伴うなら、混合物をゲル化の間
および直後０℃に冷却する。完全にまたは部分的に凝結
した反応混合物を閉じた容器中で放置し、上清液を、も
しあるなら除去し、生成物を乾燥する。得られる生成物
は一般に無色であり、用いたシリコン成分によって、脆
性〜弾力性であり、硬いガラス状の塊または細かい粉末
である。得られる生成物を砕き、特に非水媒体中の反応
の場合にはこの形で用いてよい。しかし酵素固定化体を
洗浄し、望ましくない副反応および過剰の触媒および添
加剤による汚染の危険を減少させ、反応中により容易に
溶解しまたは脱活性化し、触媒作用中に活性の減少をも
たらす、ゆるく吸着した包括されないリパーゼを除去す
るのが好ましい。これを行うために固定化物を粉砕し、
水または水性緩衝液(pＨ６〜８)で振とうし、濾過し、
水および有機溶媒、好ましくはアセトンおよびその後ペ
ンタンで洗浄し、乾燥し、最後に摩砕する。
【００１４】得られる材料は約０．１〜７００m2／gの
比表面積(ＢＥＴ法)および約０．００１〜１cm3／gのポ
ア体積を有する、たいていは白色の粉末である。
【００１５】本発明による方法の変形では、ゲル生成を
伴い縮合可能なＳi−ＯＨ基は、Ｓi−Ｏ−アルキル基の
加水分解によっては生成せず、むしろＳi−Ｏ−金属基
のプロトン化により生成する。これを行うためにアルキ
ルシリコネート、例えばソジウムメチルシリコネートＭ
eＳi(ＯＮa)3の水溶液のpＨ値を、酸、例えば塩酸また
は酢酸の添加により、pＨ６〜１０に調節し、その溶液
を酵素溶液と他の上述した成分の混合物に加える。Ｒ′
がアルキルである上述のタイプＡ、Ｂおよび／またはＣ
の他のシリコン化合物を、この変形で用いるシリコン溶
液と組合せて、共縮合のため付加的に用い得る。
【００１６】他の変形においては、上記方法により調製
した反応混合物を、ゲル化の前に過剰の水に注ぎ、激し
く撹拌して懸濁させる。この方法によれば酵素固定化体
がほぼ球状粒子の形で得られる。
【００１７】さらに別の変形においては、有機ポリマー
または無機材料、例えばマグネタイト(Ｆe3Ｏ4)、ＳiＯ
2をベースにした酸化物材料、例えばセライト(Ｃelite)
(登録商標)、オープンポア焼結ガラス、例えばシラン
(Ｓiran)(登録商標)、コントロールした多孔性ガラス
(ＣＰＧ)またはケイ藻土をタイプＩＩＩの添加剤とし
て、酵素溶液および上述の他の成分と共にシランから調
製した固定体中に導入してもよい。その材料は、シラン
の添加前またはその後に、しかしゲル化が始まる前に任
意の速度で、反応混合物に加える。酵素固定体を大きい
オープンポアの粒子上に置くために、反応混合物をゲル
化が始まる前にその担体に適用する。そのような酸化物
添加剤の使用は、固定化体の実用的特徴、例えばマグネ
タイトの場合には磁気的性質の導入による固定化触媒の
より容易な分離、シラン(登録商標)などの多孔性ＳiＯ2
担体の場合には粗に粒状化した材料を生ずることにより
連続流動操作をもたらす。一般に固定化物の触媒活性は
無機材料を添加しない類似の材料に比べ悪影響を受け
ず、またはよい影響さえ受ける。
【００１８】本発明の方法により得た酵素固定体は有機
媒体中でのエステル化およびエステル交換反応において
高活性を示す。それらは一般に、固定化のために用いら
れた商業的に入手し得る酵素製品の同量より、２〜１２
０倍以上より活性である。例えばオリーブ油エマルジョ
ンの加水分解などの水性溶媒中の反応の場合には、固定
化に用いたリパーゼの量を基準にして６２％までのシュ
ウドモナスセパシアリパーゼについての活性収率が得ら
れる。
【００１９】その酵素固定体は水および有機媒体中で高
い安定性を示し、乾燥状態で貯蔵された場合には高温で
さえ高い安定性を示す。かくして例えば、本発明による
方法により固定化したシュウドモナスリパーゼの場合、
室温で３月貯蔵後に事実上活性の低下は認められない
(すなわち５％未満)。
【００２０】
【実施例】実施例１ シュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 リパーゼ(アマノＰＳ)を蒸留水に懸濁し(２５mg／ml)、
室温で１５分振とうし、遠心分離し、上清液を固定化に
用いる。２mlのポリプロピレン容器中で、０．５８mlの
水、０．２mlのポリビニルアルコール水溶液(分子量１
５,０００、フルカ、４重量／容量％)、０．１mlの１Ｍ
ＮaＦ、および０．２mlの酵素水溶液(０．４６mgの溶
解したタンパク質を含み、５．０mgの商業的に入手し得
るアマノＰＳリパーゼに対応する。)を混合し、０．８
５７mlのメチルトリメトキシシラン(６ミリモル、シラ
ンのモル／水(全量)のモル＝１:１０)を加える。その２
相の混合物をボルテックスシェーカーで３０秒間十分混
合する。３０秒後および熱の発生を伴って、曇ったエマ
ルジョンは透明な均一溶液となった。その溶液を、全反
応混合物が短い時間の後に均一な不透明な固体に凝結す
るまで、０℃で冷却する。この固体を閉じた容器中で室
温で２４時間放置し、３０℃常圧で３日間乾燥し、最後
に乳鉢で摩砕する。その粗生成物を１０mlの水で室温で
２時間振とうし(３５０cpm)、ガラスフリット(Ｄ４)で
濾過し、２０mlの水でおよび次に２０mlのアセトンで２
度および２０mlのペンタンで洗滌する。固定体は３０℃
で２４時間乾燥し、次にボールミルで粉砕する。 得られた重量: ０．３８g 溶解した用いたアマノＰＳリパーゼmg／固定体g: １．
２ 活性ファクター[固定体の活性／(遊離リパーゼの活性：
０．５５％変換率／時間・mg商業的に入手できるリパー
ゼ)]:６．３(テスト１)
【００２１】実施例２ タイプＡＩ、ＡＩ／ＡＩ′、Ａ
Ｉ／ＡＩＩ、ＡＩ／ＣおよびＢのゲル中へのシュウドモ
ナスセパシアのリパーゼ固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノＰＳ)を蒸留
水(２５mg／ml)に懸濁させ、室温で１５分間振とうし、
遠心分離し、上清液を固定化のために用いる。２mlのポ
リプロピレン容器中に、水(水(全量)／シランのモル比
が８:１となるような量)、０．２mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(４重量／容量％、分子量１５,０００、フル
スカ)、０．１mlの１Ｍ ＮaＦ、および０．２mlの酵素
水溶液(０．４６mgの溶解したタンパク質を含み、５．
０mgの商業的に入手できるアマノＰＳリパーゼに対応す
る。)を混合し、表に示す量のシリコン化合物Ｉおよび
ＩＩを加える。２相の混合物をボルテックスシェーカー
で３０秒間十分混合し、次に室温で１２００cpmで振と
うする。３０秒〜３時間後、および一般的に熱の発生を
伴って、ゲル化が始まる。短時間後反応混合物が部分的
にまたは完全に不透明な固体に凝結するまで混合物を０
℃で冷却する。その固体は実施例１に記載したように更
に処理する。
【００２２】
【表１】
【００２３】[a] 用いた酵素タンパク質のmg／固定体
のg [b] 活性テスト１(段落番号００５９参照)、(固定体の
活性／遊離リパーゼの活性) [c] テスト２(段落番号００６０参照) [d] (固定化されたタンパク質の量＝用いたタンパク質
の量−洗液中のタンパク質の量)／固定化に用いたタン
パク質の量)、ＢＣＡタンパク質アッセイ、ピアス(Ｐie
rce)、ＢＳＡスタンダード [e] 分子量４００〜７００ [f] 分子量４２００ n．d． 測定せず
【００２４】略号: ＭＴＭＳ:メチルトリメトキシシラン(フルカ) ＥＴＭＳ:エチルトリメトキシシラン(ＡＢＣＲ) ＶＴＭＳ:ビニルトリメトキシシラン(フルカ) ＰＤＭＳ:シラノール末端基を有するポリジメチルシロ
キサン(ＡＢＣＲ) ＤＭＤＥＳ:ジメチルジエトキシシラン(フルカ) ＢＴＭＳＥ:ビス(トリメトキシシリル)エタン(ＡＢＣ
Ｒ)
【００２５】固定体２aおよび２bにより例示される酵素
固定体の安定性： −室温で３月貯蔵後の残存活性: ９５％以上 −室温で３月０．１Ｍりん酸塩緩衝液中で貯蔵後の残存
活性: ３１％(２a)、１８％(２g) −各２２時間を要する３０℃で３０回の反応サイクル後
の残存活性(バッチ法、２,２,４−トリメチルペンタン
中でのラウリン酸の１−オクタノールによるエステル
化、テストＩを参照、固定体は各サイクル後洗滌する):
８０％以上(２a、２g) −７０℃で２８日間１−オクタノール中で貯蔵後の残存
活性: ６５％(２g)
【００２６】実施例３ タイプＡＩ／ＡＩＩＩ、Ｂ／Ａ
ＩＩＩ、Ｃ／ＡＩＩＩのゲル中でのシュウドモナスセパ
シアのリパーゼの固定化 第２のシリコン化合物(ＩＩ)が各場合にテトラメトキシ
シラン(ＴＭＯＳ)であることを除いて実施例２と同様に
行う。すべての場合に、水(比Ｒ＝表に示す水(全量)の
モル数／シランのモル数が得られるような量)、０．２m
lのポリビニルアルコール水溶液(分子量１５,０００、
フルカ、４重量／容量％)、０．１mlの１Ｍ ＮaＦおよ
び０．４mlの酵素水溶液(０．４６mgの溶解したタンパ
ク質を含み、５．０mgの商業的に入手し得るアマノＰＳ
リパーゼに対応する)を混合し、表に示す量のシリコン
化合物ＩおよびＩＩ(ＴＭＯＳ)を加える。その２相混合
物をボルテックスシェーカーで３０秒間混合し(または
混合物が早くゲル化する場合ゲル化するまで)、次に室
温で１２０cpmで振とうする。２秒〜３時間後そして一
般に熱の発生を伴ってゲル化が開始するので、混合物を
次に０℃に冷却する。固定体のさらなる処理を実施例１
に記載したように行う。
【００２７】
【表２】
【００２８】[a] 用いた酵素タンパク質のmg／固定化
体のg [b] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手し得る
リパーゼの活性 [c] テスト２ [d] (固定化されたタンパク質の量)／(固定化に用いた
タンパク質の量) [e] 分子量４００〜７００
【００２９】略号: ＭＴＭＳ:メチルトリメトキシシラン(フルカ) ＥＴＭＳ:エチルトリメトキシシラン(ＡＢＣＲ) ＰＴＭＳ:プロピルトリメトキシシラン(アルドリッチ) ＯＴＭＳ:オクチルトリメトキシシラン(ＡＢＣＲ) ＯＤＴＭＳ:オクタデシルトリメトキシシラン(ＡＢＣ
Ｒ) ＰhＴＭＳ:フェニルトリメトキシシラン(フルカ) ＶＴＭＳ:ビニルトリメトキシシラン(フルカ) ＰＤＭＳ:シラノール末端基を有するポリジメチルシロ
キサン(ＡＢＣＲ) ＢＴＭＳＨ:ビス(トリメトキシシリル)ヘキサン(ＡＢＣ
Ｒ)
【００３０】実施例４ アルキルトリメトキシシラン／
テトラエトキシシランをベースにしたゲル中でのシュウ
ドモナスセパシアリパーゼの固定化 テトラメトキシシラン(ＴＭＯＳ)の代わりにテトラトキ
シシラン(ＴＥＯＳ)を用いることを除いて実施例３と同
様に行う。生成物は実施例１と同様に乾燥し、洗浄す
る。
【００３１】
【表３】
【００３２】[a] 用いた酵素タンパク質のmg／固定体
のg [b] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [c] (固定化されたタンパク質量)／(固定化に用いたタ
ンパク質の量)
【００３３】実施例５ メチルトリメトキシシランをベ
ースにするゲル中の異なるリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ０．２mlの
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ７．５中の表に示
す商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心
分離で除いた後)をアマノＰＳリパーゼの代わりに用い
た外は、実施例２aと同様に行った。ゲル化時間:０．５
〜２分
【００３４】
【表４】
【００３５】[a] フルカ(a、b、c、d、e、f、h)、ノボ
(i)により提供 [b] 製造者により明示(n．sは明示されず) [c] 固定化のために用いた商業的に入手できるリパー
ゼ [d] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg／固定体のg [e] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手できる
リパーゼの活性) [f] (固定化されたタンパク質の量)／(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [g] 不明の微生物起源の組換え酵素 [h] 初速度(変換率％／時間・mg商業的に入手し得るリ
パーゼ)、活性テスト１
【００３６】固定体４dにより例示される酵素固定体の
安定性: −室温で３月、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、pＨ７．０中
に貯蔵後の残存活性：７０％
【００３７】実施例６ メチルトリメトキシシラン／ポ
リジメチルシロキサンをベースにしたゲル中での異なる
リパーゼの固定化 異なる起源の異なるリパーゼ(それぞれ０．２mlの０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pＨ７．５中での表に示
した商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠
心分離で除去後)を、アマノＰＳリパーゼの代わりに用
いた外は実施例２eと同様に行った。ゲル化時間:１〜５
分
【００３８】
【表５】
【００３９】[a] 供給者および比活性は実施例５を参
照 [b] 用いた商業的に入手し得るリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg／固定化体のg [d] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化タンパク質の量)／(固定化に用いた可溶性
タンパク質の量)
【００４０】固定体５dにより例示される酵素固定体の
安定性: −室温で３月、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、pＨ７．０中
で貯蔵後の残存活性:９２％
【００４１】実施例７ プロピルトリメトキシシラン／
テトラメトキシシランをベースにしたゲル中での異なっ
たリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ０．２mlの
０．１Ｍリン酸塩緩衝液、pＨ７．５中での表に示す商
業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心分離
で除去後)を、アマノＰＳリパーゼの代わりに用いた外
は実施例３cと同様に行った。ゲル化時間:０．５〜２分
【００４２】
【表６】
【００４３】[a] 供給者および比活性は実施例５を参
照 [b] 用いた商業的に入手可能なリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg／固定化体のg [d] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化されたタンパク質の量)／(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [f] フルカ、３．３Ｕ／mgタンパク質、０．８３％変
換率／時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テス
ト１ [g] フルカ、５０Ｕ／mgタンパク質、０．１６％変換
率／時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テスト
１
【００４４】実施例８ シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 以下に示した触媒および水量(Ｒ＝８の一定値で)を、
０．１mlの１Ｍ ＮaＦ溶液の代わりに用いた外は実施
例２aと同様に行う。ゲル化時間は０．５〜１分(８a)、
２４時間(８b、８c)、４８時間(８d)であった。得られ
た重量は０．３４〜０．４２gであった。溶解した用い
たアマノＰＳリパーゼのmg／固定体のg:１．１〜１．３
【００４５】
【表７】
【００４６】実施例９ シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 表に示した異なった添加剤および水量(水:シランの一定
比Ｒ＝８:１)を用いた外は実施例２aと同様に行った。
得られた重量は０．３８〜０．４gであった。用いた溶
解したアマノＰＳリパーゼのmg／固定体のg: １．１〜
１．２
【００４７】
【表８】
【００４８】実施例１０ ノボＳＰ５２３リパーゼの固
定化 リパーゼＳＰ５２３(ノボ)を蒸留水に懸濁し(５０mg／m
l)、室温で１５分振とうし、遠心分離し、上清液を固定
化に用いる。２mlのポリプロピレン容器(エッペンドル
フ)に、４２μlの水、０．１mlのポリビニルアルコール
水溶液(分子量１５,０００、フルカ、４重量／体積
％)、１４μlの１Ｍ ＮaＦ溶液、および０．１mlの酵
素水溶液(２．０６mgの溶解したタンパク質を含み、
５．０mgの商業的に入手し得るＳＰ５２３リパーゼに対
応する)を混合し、０．２１７mlのＰＤＭＳ(０．４ミリ
モル、分子量４００〜７００、ＡＢＣＲ)および０．２
２１mlのテトラメトキシシラン(１．５ミリモル、フル
カ)を加える。その二相の混合物をボルテックスシェー
カーで２秒間十分混合し、１．２gのシラン(Siran)(登
録商標)(ショット(Ｓchott)、１Ｎ ＨＣlで６０℃で１
６時間前処理し、水で洗滌し、３０％の水含量で使用)
を加え、混合物をボルテックスシェーカーで約５秒間ゲ
ル化が起るまで混合し、０℃で２分間冷却する。生成物
を乾燥し、実施例１に記載したように洗滌する。しかし
固定体を含浸したシラン粒子は粉砕しなかった。
【００４９】得られた重量:０．９４g ローディング(ＳＰ５２３リパーゼ、溶解した用いたタ
ンパク質のmg／固定体のg):２．２ 活性収量[テスト１]:１１２ [活性(シランを有するゲル)]／[活性(同量のシランを有
しないバルクゲル)]:１．９ 固定化されたタンパク質の％(洗液中のタンパク質の測
定から):９８％
【００５０】実施例１１ マグネタイトを含む担体中の
シュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノＰＳ)を蒸留
水中に懸濁し(２５mg／ml)、室温で１５分振とうし、遠
心分離し、上清液を固定化に用いる。２mlのポリプロピ
レン容器(エッペンドルフ)中に、０．２mlのゼラチン水
溶液(４重量／容量％、ＩＣＮ)、０．１mlの１Ｍ Ｎa
Ｆ、および０．２mlの酵素水溶液(０．４６mgの溶解し
たタンパク質を含み、５．０mgの商業的に入手し得るア
マノＰＳリパーゼに対応する)を混合し、０．５gのマグ
ネタイト(Ｆe3Ｏ4、コバヤシ等、ジャーナル・オブ・コ
ロイド・アンド・インターフェース・サイエンス(Ｊ．
Ｃoll．Ｉnterface Ｓci．)、１９９１年、１４１巻、
５０５頁に従って新しく調製、水含量７０％)を加え
る。混合物をボルテックスシェーカーで２秒間十分混合
し、０．８５７ml(６ミリモル)のＭＴＭＳを加え、反応
混合物をボルテックスシェーカーでゲル化が０．５〜１
分後起るまで十分に混合し、次に０℃で１分冷却する。
濾過操作の代わりに永久磁石の助けを借りたデカンテー
ションを行った外は実施例１と同様にゲルの処理を行っ
た。
【００５１】得られた重量:０．４７g 溶解した用いたリパーゼのmg／固定体のg: １．０ 活性ファクター[テスト１]: ２．２
【００５２】実施例１２ ソジウムメチルシリコネート
から調製したゲル中のリパーゼの固定化 表１に示した商業的に入手し得るリパーゼの量を１mlの
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pＨ７．０に懸濁さ
せ、１５分振とうし、遠心により固体残渣から遊離させ
る。固定化の直前に、０．６５mlの濃ＨＣlを４mlのソ
ジウムメチルシリコネート溶液(水中３０％、７．５ミ
リモル、ＡＢＣＲ)に激しく撹拌しながら加え、８．０
〜８．５のpＨ値とする。０．２５mlの酵素溶液、０．
２５mlのアルブミン溶液(５０mg／ml、牛血清アルブミ
ン、シグマ)、０．１mlの１Ｍフッ化ナトリウムおよび
０．５mlの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ７．０の混
合物に、０．５mlのポリジメチルシロキサン(０．９ミ
リモル、分子量４００〜７００、ＡＢＣＲ)続いて０．
５mlのソジウムシリコネート溶液(０．８ミリモルに相
当する)を加え、混合物をゲル化が起るまで、すなわち
１〜２秒間ボルテックスシェーカーで十分混合する。実
施例１に記載したのと同様にさらなる処理を行った。
【００５３】
【表９】
【００５４】[a] 供給者および比活性は実施例５を参
照、シュウドモナスフルオレッセンスリパーゼ：フル
カ、３１．５Ｕ／mgタンパク質 [b] 用いた商業的に入手できるリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg／固定体のg [d] テスト１、(固定体の活性)／(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化したタンパク質の量)／(固定化に用いた可
溶性タンパク質の量) [f] 商業的に入手し得るリパーゼについての変換率％
／時間(初速)
【００５５】実施例１３ ノポＳＰ５２３リパーゼの固
定化 ５０mgのＳＰ５２３リパーゼ(ノボ)を１mlの０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pＨ７．０に懸濁し、１５分振
とうし、遠心により固体残渣から遊離させる。０．１ml
の酵素溶液(５mgの商業的に入手し得るリパーゼに対応
する。３．８mgの溶解したタンパク質)、０．２mlの１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ７．０、０．１mlのポリ
ビニルアルコール(分子量１５,０００、水中４％)、お
よび０．０４mlの１Ｍフッ化ナトリウム溶液を混合し、
０．２mlのポリジメチルシロキサン(０．３６ミリモ
ル、分子量４００〜７００、ＡＢＣＲ)続いて０．２ml
のソジウムメチルシリコネート溶液(水中３０％、０．
３８ミリモル、ＡＢＣＲ)および０．０３mlの濃塩酸を
加え、混合物を約１秒混合し(ボルテックスシェーカ
ー)、１gのシラン(登録商標)(ショット)と十分混合す
る。生成物を実施例１に記載したように乾燥し、洗滌す
る。固定体を浸み込ませたシラン粒子は粉砕しなかっ
た。
【００５６】得られた重量: １．２g ローディング(リパーゼ、溶解した用いたタンパク質のm
g／固定体のg):３.１ 活性ファクター[テスト１]:１８７ [活性(シランを有するゲル)]／[活性(同量のシランのな
いバルクゲル)]:１．４ 固定化されたタンパク質の％(洗液中のタンパク質測定
から):９６
【００５７】実施例１４ ＭＴＭＳからのソノゲル(son
ogel)中のシュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアリパーゼ(アマノＰＳ)を蒸溜水
に懸濁し(２５mg／ml)、室温で１５分振とうし、遠心分
離し、上清液を固定化に用いる。２０mlのポリピロピレ
ン容器中に、４．８１mlのメチルトリメトキシシラン
(ＭＴＭＳ)、１．１７mlの蒸溜水および０．０３mlの
０．００１Ｍ ＮaＦ水溶液を混合し、０℃で１時間ソニ
ケート(sonicate)する。ソニケーション後、０．０８６
mlの１Ｍ ＮaＦ水溶液、０．２０mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(４重量／容量％)、０．２０mlのリパーゼ溶
液および０．１６４mlの蒸溜水を、１．０７１mlのＭＴ
ＭＳからソニケーションにより得られたゾルに加える。
混合物をボルテックシェーカーで攪拌し(約５秒)、ゲル
化が生ずるまで室温で次におだやかに振とうする(２０
０rpm)。生成物を実施例１と同様に乾燥し、洗浄する。 得られた重量：４１１mg 溶解した用いたアマノＰＳリパーゼのmg／固定体のｇ：
１．１ 活性ファクター：７．０９
【００５８】実施例１５ ＭＴＭＳ／ＰＤＭＳからのア
エロゲル(aerogel)中のシュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 実施例２(e)と同様に行う。ゲル化が起こった後、ゲル
を含むポリピロピレン容器をオートクレーブ(２００ml)
中に置き、超臨界条件(４０℃、９０バール)下の２酸化
炭素(約９０ｇ)で乾燥する。２４時間後、固定体を実施
例１と同様に洗浄する。 得られた重量：０．２９ｇ 溶解した用いたリパーゼmg／固定体のｇ：１．５ 活性ファクター[(固定体の活性／商業的に入手し得るリ
パーゼの活性)]：１４.１ 固定化度：０．６５
【００５９】活性テストおよび固定化リパーゼを用いる
反応 (１)ラウリン酸の１−オクタノールによるエステル化 ５０mlの遠心カップ(ポリプロピレン、スクリューキャ
ップを備える)中の酵素固定体(ローディングにより１０
０〜１０００mg)に、１００mgのラウリン酸(０．５ミリ
モル、フルカ)、０．１５８mlの１−オクタノール(１ミ
リモル、メルク)および２,２,４−トリメチルペンタン
(１０ml、アルドリッチ)の混合物を加え、カップを閉
じ、水浴中で３０℃で１８０cpmで振とうする。初速度
を測定するために、サンプル(０．１５ml)を規則的な間
隔で取り出し、オクチルラウレートのラウリン酸に対す
る比をガスクロマトグラフィ(０．２５mmＦＦＡＰキャ
ピラリーカラム,１５m)により測定する。活性ファクタ
ーで決定するためかくして測定された反応速度を、固定
化に用いた量に等しい商業的に入手可能な酵素製品の量
による同じ条件下で得られる反応速度で割る。
【００６０】(２)オリーブ油エマルジョンの加水分解 ２０mlのアラビアゴム溶液(シグマ、水中１００g／l)に
６．５mlのオリーブ油(シグマ、アルミナＢを通して濾
過、活性レベルＩ)を加え、混合物をミキサーで３０分
ホモジナイズする。２５mlの基質エマルジョンに２０ml
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 pＨ９を加え、pＨ
値を０．１Ｍ ＮaＯＨで８．０に調節し、混合物を２
分ホモジナイズする。２mlのエッペンドロフ容器中で、
１０mgの酵素固定体を０．１mlの水と５分間振とうし、
０．９mlの緩衝化された基質エマルジョンを加え、混合
物をボルテックスシェーカーで５秒間十分混合し、３０
℃、１２００cpmで０．５〜２時間振とうする。反応
は、ヘキサン／i−プロパノール１:５(１０ml)中の濃硫
酸(１ml)の溶液０．１mlを加えることにより終了させ、
反応混合物を０．６mlのヘキサンで抽出する。０．４ml
のヘキサン層に１mlのアセトン／エタノール１:１およ
びフェノールフタレンを加え、遊離の脂肪酸をエタノー
ル中の０．１Ｍ水酸化カリウムで滴定する。活性収率
は、得られた収率を、遊離のリパーゼの水溶液を用いて
同一条件下で得られた収率と比較することにより決定さ
れ、％で示す。
【００６１】(３)１−フェニルエタノールの無水酢酸お
よび固定化シュウドモナスセパシアリパーゼによるエス
テル化により例示されるラセミ性二級アルコールの立体
選択性エステル化 酵素固定体(実施例２eに従って固定化、その量はローデ
ィングによる)を４mlのベンゼンに懸濁し、２．４マイ
クロモルの無水酢酸および２．４マイクロモルのラセミ
の１−フェニルエタノールを加え、混合物を室温で４０
０cpmで振とうする。反応を追跡するためにサンプル
(０．１５ml)を規則的な間隔で取り出し、０．１５mlの
５％Ｎa2ＣＯ3でおよび遠心の後分配する。有機層をガ
スクロマトグラフィーで調べる。反応完了後のエナンチ
オマー過剰をガスクロマトグラフィで測定した(０．２
５mmキャピラリー、３０m、カラム材料:６−t−ブチル
ジメチルシリル−２,３−ジメチル−β−シクロデキス
トリン、ＵＶ１７０１中２０％)。 収率: ５０％、％ee(エステル):＞９９、％ee(アルコ
ール):＞９９
【００６２】(４)固定化されたノボＳＰ５２３リパーゼ
により例示されるオリーブ油のパルミチン酸によるエス
テル交換 ０．２gのパルミチン酸を１．５mlの２,２,４−トリメ
チルペンタン中に加熱しながら溶解し、０．２mlのトリ
オレイン(シグマ)と混合し、酵素固定体(ノボＳＰ５２
３リパーゼ、実施例１２に従い固定化、水含量１６％、
５８mg、固定化に用いた可溶性リパーゼタンパク質０．
１５mgに対応)を加える。反応混合物を４０℃、１２０
０cpmで振とうする。規則的な間隔でサンプル(０．０５
ml)を取り出し、収率をガスクロマトグラフィにより追
跡する(ＢＳＴＦＡ／ＴＭＣＳ(９９:１)／ピリジンによ
るシリル化に従う; ＰＳＯ４８相を有するキャピラリ
ーカラム)。活性(１Ｕ＝１マイクロモル／分のパルミチ
ン酸消費として定義する)は０．５６Ｕであり、１１．
２８Ｕ／g固定化体に対応する。
【００６３】(５)固定化シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼにより例示されるオリーブ油の加水分解 固定化したシュウドモナスセパシアリパーゼ(時には異
なる酵素量で上記のような固定化方法、量はローディン
グにより、固定化のために用いたリパーゼタンパク質
０．１２mgに対応する)を１０mlの水および１０mlのオ
リーブ油と混合し、４０℃で２３０cpmで振とうする(ス
クリューキャップを備えた５０mlのポリプロピレン容
器、直径２．７cm)。規則的な間隔で油層のサンプル
(０．１５ml)を取り出し、アセトン／エタノール１:１
(１ml)およびフェノールフタレンを加え、遊離した脂肪
酸をエタノール中の０．０６Ｍ ＫＯＨで滴定する。
【００６４】
【表１０】 [a] 固定化に用いた可溶性酵素タンパク質のmg／得ら
れた固定体のg [b] 初速度(遊離した酸のミリモル／時間)／固定化に
用いたリパーゼタンパク質のmg、ｖ(遊離)＝０．１３ミ
リモルのＫＯＨ／時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｐ 7/62 7432−4Ｂ 7/64 7432−4Ｂ // Ｃ１１Ｃ 1/04 3/10 (72)発明者 マンフレート・テー・レーツ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム／ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ１番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内 (72)発明者 イェルク・ジンペルカンプ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム／ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ１番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内 (72)発明者 アルビン・ツォンタ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム／ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ１番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リパーゼを、Ｓi−Ｃ結合を介して結合
    した有機置換基を有するシリカマトリックスに固定する
    ことを特徴とする固定化リパーゼの製造方法。
  2. 【請求項２】 非加水分解性の有機置換基および加水分
    解性の置換基を有するシリコン化合物、並びにそのよう
    なシリコン化合物と完全に加水分解性の置換基のみを有
    するシリコン化合物との混合物の存在下に、少なくとも
    一つの触媒の存在下に、および場合により少なくとも１
    つの添加剤の存在下に、リパーゼを固定化することを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 【化１】タイプ ＲkＲ″lＳi(ＯＲ′)m (Ａ) および／
    またはタイプ [(Ｒ′Ｏ)nＲoＳi]pＸ (Ｂ) および／ま
    たはタイプ Ｙ−(ＲqＲ″rＳiＯ)sＲqＲ″rＳi−Ｙ
    (Ｃ)のシリコン化合物(式中、ＲおよびＲ″は１〜１８
    個の炭素原子を有する飽和または不飽和のアルキル置換
    基または芳香族置換基から選択され、Ｒ′は１〜５個の
    炭素原子を有するアルキル残基またはアルカリ金属原子
    であり、Ｘは２官能性またはそれ以上の多官能性のアル
    キル若しくはアリール残基、またはヘテロ原子であり、
    Ｙは−ＯＨ、−ＯＲ、またはＳi(ＯＲ′)3であり、kお
    よびlは０〜３の数であり(k＋l＜４)、mは２〜４の数で
    あり(m＝４−l−k)、nは１〜３の数であり、oは０〜２
    の数であり(o＝３−n)、pは２〜４の数であり、qおよび
    rは０〜２の数であり(q＋r＝２)、sは１〜１００の数で
    ある。)を用いることを特徴とする請求項１または２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 Ｒ′がアルキルまたはナトリウムである
    タイプＡのシリコン化合物を用いることを特徴とする請
    求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 Ｒ′がアルキルであり、Ｘがアルキレン
    またはアリーレンであるタイプＢのシリコン化合物を用
    いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 タイプＣのシリコン化合物をタイプＡの
    化合物と組合せて用いることを特徴とする請求項１〜３
    のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 Ｒ′がアルキルまたはナトリウムである
    タイプＡのシリコン化合物、特にＲがＣ1〜Ｃ18の鎖長
    を有するアルキル、アルケニル、またはアリールである
    タイプＡＩのアルキルまたはアリールトリアルコキシシ
    ランＲＳi(ＯＲ′)3を用いることを特徴とする請求項４
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 Ｒ,Ｒ″がＣ1〜Ｃ18の鎖長を有するアル
    キルであり、Ｒ′がアルキルまたはナトリウムである、
    タイプＡＩＩのシリコン化合物、ジアルキル−、アルキ
    ルアリール−またはジアリールアルコキシシランＲ
    kＲ″2-kＳi(ＯＲ′)2を、タイプＡＩの成分と組合せて
    用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  9. 【請求項９】 Ｒ′がアルキルまたはナトリウムである
    タイプＡＩＩＩのシリコン化合物、テトラアルコキシシ
    ランＳi(ＯＲ′)4を、タイプＡＩ、ＡＩＩ、ＢまたはＣ
    のシランと組合せて用い、１以上の有機置換基を有する
    シリコン原子の割合が、用いたシリコンの全量を基準に
    して少なくとも５０原子％であることを特徴とする請求
    項４に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 Ｒ′がアルキルであり、Ｘがアルキレ
    ン、アリーレンまたはＯであるタイプＢのシリコン化合
    物を、タイプＡＩ、ＡＩＩ、Ｃおよび異なったＸを有す
    るＢと組合せて用いることを特徴とする請求項５に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 水酸化アンモニウム、アルカリ金属水
    酸化物、アンモニア、フッ化アンモニウム、アルカリ金
    属フッ化物およびこれらの組合せ等の塩基性化合物を触
    媒として用いることを特徴とする請求項１または２に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 アルブミン、ゼラチン、カゼイン酸ナ
    トリウム等のタンパク質、またはポリビニルアルコー
    ル、ソルビット、グリセロール、ポリエチレングリコー
    ル等のポリヒドロキシ化合物、または不溶性有機ポリマ
    ー、またはマグネタイト(Ｆe3Ｏ4)、セライト、オープ
    ンポア焼結ガラス、若しくはケイ藻土等の無機化合物を
    添加剤として用いることを特徴とする請求項１または２
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 エステルの加水分解および／またはエ
    ステル交換、並びにアルコールの酸または酸誘導体によ
    るエステル化のための請求項１〜１２のいずれかに記載
    の方法により製造したリパーゼの使用。
  14. 【請求項１４】 胆のう線維症により起こされる消化不
    全の治療のための請求項１〜１２のいずれかに記載のリ
    パーゼの使用。
JP7052392A 1994-03-11 1995-03-13 ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼ Withdrawn JPH07274964A (ja)

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