JPH07274964A - ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼ - Google Patents
ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Si−C結合に結合した非加水分解性の有機
置換基を含むシリカマトリックスに反応により固定化さ
れたリパーゼの製造方法 【効果】 固定化されたリパーゼは加水分解反応、エス
テル交換反応、エステル化反応等において高い活性を有
し、また貯蔵安定性に優れる。
置換基を含むシリカマトリックスに反応により固定化さ
れたリパーゼの製造方法 【効果】 固定化されたリパーゼは加水分解反応、エス
テル交換反応、エステル化反応等において高い活性を有
し、また貯蔵安定性に優れる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、リパーゼ存在下の、ゾ
ル−ゲル法によるシリカーをベースにした疎水性マトリ
ックスの構築により製造した酵素固定体、その製造方法
およびその利用に関する。
ル−ゲル法によるシリカーをベースにした疎水性マトリ
ックスの構築により製造した酵素固定体、その製造方法
およびその利用に関する。
【0002】
【従来の技術】技術的な利用においてリパーゼを用いる
ことは、特に疎水性の基質が主に用いられる、温和な条
件下でのエステルの加水分解または合成、およびエステ
ル交換反応において益々興味が持たれている(ケー・デ
ィー・ムクヘルジー(K.D.Mukherjee)、バイオキャ
タリシス(Biocatalysis)、1990年、3巻、277
〜293ページ;ティー・ニールセン(T.Nielsen)、
フェッテ,ザイフェン,アンストリッヒミッテル(Fett,
Seifen,Anstrichmittel)、1985年、87巻、15
〜19ページ)。その基質特異性がしばしば広いので、
リパーゼは脂質化学においてばかりではなく、有機合成
における立体選択的な反応についても益々しばしば用い
られている。リパーゼは病気治療にも用途が見出されて
いる。リパーゼはすい臓病または胆のう線維症により起
こる消化不全の治療に用いられている。酵素反応の経済
的効率についての重要な要素は、酵素の容易な回収と多
数回の使用を可能にし、もし可能なら反応条件における
その安定性を増加させるために、バイオキャタリストの
固定化のために適した方法である。酵素技術のこの分野
における先行技術は、例えばリパーゼについての総説文
献(エフ・エックス・マルカタ(F.X.Malcata)、エ
ッチ・アール・レイス(H.R.Reys)、エッチ・エス
・ガルシア(H.S.Garcia)、C.G.ヒル・ジュニ
アー(C.G.Hill,Jr.)およびシー・エッチ・アム
ンドソン(C.H.Amundson)、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・オイル・ケミカル・ソサエティ(J.Am.O
il Chem.Soc.。)、1990年、67巻、890〜9
10ページ)に数回要約されている。いくつかの例で
は、リパーゼを固体のマトリックスに導入することによ
る固定化の結果として、他の方法に比べて活性収量と安
定性の改良がもたらされるが、たいていの場合実施する
のが複雑である。
ことは、特に疎水性の基質が主に用いられる、温和な条
件下でのエステルの加水分解または合成、およびエステ
ル交換反応において益々興味が持たれている(ケー・デ
ィー・ムクヘルジー(K.D.Mukherjee)、バイオキャ
タリシス(Biocatalysis)、1990年、3巻、277
〜293ページ;ティー・ニールセン(T.Nielsen)、
フェッテ,ザイフェン,アンストリッヒミッテル(Fett,
Seifen,Anstrichmittel)、1985年、87巻、15
〜19ページ)。その基質特異性がしばしば広いので、
リパーゼは脂質化学においてばかりではなく、有機合成
における立体選択的な反応についても益々しばしば用い
られている。リパーゼは病気治療にも用途が見出されて
いる。リパーゼはすい臓病または胆のう線維症により起
こる消化不全の治療に用いられている。酵素反応の経済
的効率についての重要な要素は、酵素の容易な回収と多
数回の使用を可能にし、もし可能なら反応条件における
その安定性を増加させるために、バイオキャタリストの
固定化のために適した方法である。酵素技術のこの分野
における先行技術は、例えばリパーゼについての総説文
献(エフ・エックス・マルカタ(F.X.Malcata)、エ
ッチ・アール・レイス(H.R.Reys)、エッチ・エス
・ガルシア(H.S.Garcia)、C.G.ヒル・ジュニ
アー(C.G.Hill,Jr.)およびシー・エッチ・アム
ンドソン(C.H.Amundson)、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・オイル・ケミカル・ソサエティ(J.Am.O
il Chem.Soc.。)、1990年、67巻、890〜9
10ページ)に数回要約されている。いくつかの例で
は、リパーゼを固体のマトリックスに導入することによ
る固定化の結果として、他の方法に比べて活性収量と安
定性の改良がもたらされるが、たいていの場合実施する
のが複雑である。
【0003】テトラメトキシシランまたはテトラエトキ
シシラン等のテトラアルコキシシランの加水分解による
ゾル−ゲル法(シー・ジェー・ブリンカー(C.J.Bri
nker)、ジー・ダブリュー・シェラー(G.W.Schere
r)、ゾル−ゲル・サイエンス(Sol−Gel Science):
ザ・フィジックス・アンド・ケミストリー・オブ・ゾル
−ゲル・プロセシング(The Physics and Chemist
ry of Sol−Gelprocessing)、アカデミック・プレ
ス、サン・ジェゴ、1990;エル・エル・ヘンチ
(L.L,Hench)、ジェー・ケー・ウエスト(J.K.W
est)、ケミカル・レビュー(Chem.Rev.)、1990
年、90巻、33〜72ページ)によるSiO2ゲルの製
造は、無機マトリックス中に生体物質を導入するのに用
いることができる。しかしリパーゼの固定化のためには
この方法は適していない。何故ならその方法は非常に不
満足な活性収量を与えるのみであるからである。
シシラン等のテトラアルコキシシランの加水分解による
ゾル−ゲル法(シー・ジェー・ブリンカー(C.J.Bri
nker)、ジー・ダブリュー・シェラー(G.W.Schere
r)、ゾル−ゲル・サイエンス(Sol−Gel Science):
ザ・フィジックス・アンド・ケミストリー・オブ・ゾル
−ゲル・プロセシング(The Physics and Chemist
ry of Sol−Gelprocessing)、アカデミック・プレ
ス、サン・ジェゴ、1990;エル・エル・ヘンチ
(L.L,Hench)、ジェー・ケー・ウエスト(J.K.W
est)、ケミカル・レビュー(Chem.Rev.)、1990
年、90巻、33〜72ページ)によるSiO2ゲルの製
造は、無機マトリックス中に生体物質を導入するのに用
いることができる。しかしリパーゼの固定化のためには
この方法は適していない。何故ならその方法は非常に不
満足な活性収量を与えるのみであるからである。
【0004】
【課題を解決するための手段】適当な触媒および以下に
記載する他の添加剤の存在下に、シリコンに結合した有
機の置換基を有するアルコキシシリコン化合物の加水分
解により得られるシリコン含有マトリックスへリパーゼ
を包括すると、異常に大きい触媒活性を有する材料が得
られることが驚くべきことに見出された。本発明の方法
による固定化により、商業的に入手できる酵素製品に比
べてツーオーダーまでの大きさの活性の予期しない増
加、および上述の従来のゾル−ゲル法により(テトラア
ルコキシシランのみを用いる)製造された固定化体と比
べてツーオーダーの以上の大きさの活性の増加が有機媒
体中での反応において認められている。本発明の方法に
より製造した固定化リパーゼは、温度安定性の増加を含
む優れた安定性を示し、水性および有機媒体の両方にお
ける反応について広範囲に利用できる。固定化のパラメ
ーターを変化させることにより、マトリックスの性質お
よび得られる固定化体の性質をコントロールでき、その
ことは与えられた技術的利用についての広範囲の最適化
を可能にする。
記載する他の添加剤の存在下に、シリコンに結合した有
機の置換基を有するアルコキシシリコン化合物の加水分
解により得られるシリコン含有マトリックスへリパーゼ
を包括すると、異常に大きい触媒活性を有する材料が得
られることが驚くべきことに見出された。本発明の方法
による固定化により、商業的に入手できる酵素製品に比
べてツーオーダーまでの大きさの活性の予期しない増
加、および上述の従来のゾル−ゲル法により(テトラア
ルコキシシランのみを用いる)製造された固定化体と比
べてツーオーダーの以上の大きさの活性の増加が有機媒
体中での反応において認められている。本発明の方法に
より製造した固定化リパーゼは、温度安定性の増加を含
む優れた安定性を示し、水性および有機媒体の両方にお
ける反応について広範囲に利用できる。固定化のパラメ
ーターを変化させることにより、マトリックスの性質お
よび得られる固定化体の性質をコントロールでき、その
ことは与えられた技術的利用についての広範囲の最適化
を可能にする。
【0005】本発明は、有機置換基を有するシリカマト
リックスに固定化されたリパーゼ、およびRkR″lSi
(OR′)m (A)および/または[(R′O)nRoSi]p
X (B)のタ イプ、 および/またはY−(RqR″rSi
O)sRqR″rSi−Y (C)のタイプ(式中、Rおよび
R″は1〜18個の炭素原子を有する飽和または不飽和
のアルキル置換基または芳香族置換基から選択され、
R′は1〜5個の炭素原子を有するアルキル残基または
アルカリ金属原子であり、Xは2官能性またはそれ以上
の多官能性のアルキル若しくはアリール残基、またはヘ
テロ原子であり、Yは−OH、−OR、または−Si(O
R′)3であり、kおよびlは0〜3の数であり(k+l<
4)、mは2〜4の数であり(m=4−l−k)、nは1〜3の
数であり、oは0〜2の数であり(o=3−n)、pは2〜4
の数であり、qおよびrは0〜2の数であり(q+r=2)、
sは1〜100の数である。)のシリコン化合物を、リパ
ーゼ水溶液の存在下、および場合により付加的な溶媒、
1(または以上)の適当な触媒、および得られる固定化酵
素の活性、安定性および機械的または磁気的性質にポジ
ティブな影響を有する1以上の添加剤の存在下に、加水
分解する方法で固定化したリパーゼの製造方法に関す
る。
リックスに固定化されたリパーゼ、およびRkR″lSi
(OR′)m (A)および/または[(R′O)nRoSi]p
X (B)のタ イプ、 および/またはY−(RqR″rSi
O)sRqR″rSi−Y (C)のタイプ(式中、Rおよび
R″は1〜18個の炭素原子を有する飽和または不飽和
のアルキル置換基または芳香族置換基から選択され、
R′は1〜5個の炭素原子を有するアルキル残基または
アルカリ金属原子であり、Xは2官能性またはそれ以上
の多官能性のアルキル若しくはアリール残基、またはヘ
テロ原子であり、Yは−OH、−OR、または−Si(O
R′)3であり、kおよびlは0〜3の数であり(k+l<
4)、mは2〜4の数であり(m=4−l−k)、nは1〜3の
数であり、oは0〜2の数であり(o=3−n)、pは2〜4
の数であり、qおよびrは0〜2の数であり(q+r=2)、
sは1〜100の数である。)のシリコン化合物を、リパ
ーゼ水溶液の存在下、および場合により付加的な溶媒、
1(または以上)の適当な触媒、および得られる固定化酵
素の活性、安定性および機械的または磁気的性質にポジ
ティブな影響を有する1以上の添加剤の存在下に、加水
分解する方法で固定化したリパーゼの製造方法に関す
る。
【0006】好ましく用いられる、R′がアルキル(例
えばメチル、エチル)またはナトリウムであるAタイプ
のシリコン成分は以下のものである。: −AI: RがC1〜C18の鎖長を有するアルキル、アル
ケニル例えばビニル、アルール例えばフェニルであるア
ルキルまたはアリールトリアルコキシシランRSi(O
R′)3 。 −AII: R,R″がC1〜C18の鎖長を有するアルキ
ル、例えばメチルである、ジアルキル、アルキルアリー
ルまたはジアリールアルコキシシランRkR″2-kSi(O
R′)2 。タイプAIIの化合物(架橋に適した2つの基
しか有しない)は、タイプAIまたはAIIIの成分
と、例えば3〜6の(AI、AIII):AIIモル比
で、組合せて用いてよい。 −AIII: タイプAI、AII、BまたはCのシラ
ンと組合せたテトラアルコキシシランSi(OR′)4 。
1以上の有機置換基を有するシリコン原子の割合は、用
いたシリコンの全量を基準にして少なくとも50原子%
である。
えばメチル、エチル)またはナトリウムであるAタイプ
のシリコン成分は以下のものである。: −AI: RがC1〜C18の鎖長を有するアルキル、アル
ケニル例えばビニル、アルール例えばフェニルであるア
ルキルまたはアリールトリアルコキシシランRSi(O
R′)3 。 −AII: R,R″がC1〜C18の鎖長を有するアルキ
ル、例えばメチルである、ジアルキル、アルキルアリー
ルまたはジアリールアルコキシシランRkR″2-kSi(O
R′)2 。タイプAIIの化合物(架橋に適した2つの基
しか有しない)は、タイプAIまたはAIIIの成分
と、例えば3〜6の(AI、AIII):AIIモル比
で、組合せて用いてよい。 −AIII: タイプAI、AII、BまたはCのシラ
ンと組合せたテトラアルコキシシランSi(OR′)4 。
1以上の有機置換基を有するシリコン原子の割合は、用
いたシリコンの全量を基準にして少なくとも50原子%
である。
【0007】R′がアルキル、例えばメチルまたはエチ
ルであるタイプBのシリコン成分は、Xがアルキレン、
例えば(CH2)2〜6、アリーレンまたはOである式(R′
O)3Si−X−Si(OR′)3のビス(トリアルコキシシリ
ル)化合物である(タイプAI、AII、BまたCのタイ
プのシランと組合せてAIIIと共に用いる。)。Cタ
イプのシリコン化合物はAタイプの化合物、特にAIお
よびAIIIと組合せて用い、オリゴマーまたはポリマ
ー性のジアルキルシロキサン、特に、例えばシラノール
末端基と5〜60のモノマー単位の鎖長を有するポリジ
メチルシロキサンである。成分のA:Cのモル比は例え
ば3〜6である。
ルであるタイプBのシリコン成分は、Xがアルキレン、
例えば(CH2)2〜6、アリーレンまたはOである式(R′
O)3Si−X−Si(OR′)3のビス(トリアルコキシシリ
ル)化合物である(タイプAI、AII、BまたCのタイ
プのシランと組合せてAIIIと共に用いる。)。Cタ
イプのシリコン化合物はAタイプの化合物、特にAIお
よびAIIIと組合せて用い、オリゴマーまたはポリマ
ー性のジアルキルシロキサン、特に、例えばシラノール
末端基と5〜60のモノマー単位の鎖長を有するポリジ
メチルシロキサンである。成分のA:Cのモル比は例え
ば3〜6である。
【0008】用いるタイプAおよび/またはBのシリコ
ン化合物は、酸または上述の塩基性触媒を添加した水
で、例えば超音波の作用により前処理してもよい。その
シランは前処理工程なしに酵素固定化に直接用いてもよ
い。
ン化合物は、酸または上述の塩基性触媒を添加した水
で、例えば超音波の作用により前処理してもよい。その
シランは前処理工程なしに酵素固定化に直接用いてもよ
い。
【0009】本発明において提供される方法は、多くの
様々な起源のリパーゼに広く適用可能である。固定化さ
れたリパーゼは、微生物起源、例えばSP523リパー
ゼ(ノボ(Novo))であってよく、例えばシュウドモナス
(Pseudomonas)属(例えばシュウドモナスフルオレセン
ス(Ps.fluorescens)、シュウドモナスセパシア(Ps.
cepacia))のバクテリアから、カンディダ(Candida)属
(例えばカンディダアンタルクチカ(C.antarctica)、
カンディダリポリチカ(C.lipolytica))の酵母から、
リゾプス(Rhizopus)属(例えばリゾプスアーリザス(R
h.arrhizus)、リゾプスデレマー(Rh.delemar)、リゾ
プスニベウス(Rh.niveus))、ペニシリウム(Penicill
ium)属(例えばペニシリウムロクェフォルティ(P.roqu
eforti))、アスペルギルス(Aspergillus)属(例えばア
スペルギルスニガー(A.niger))、ムコール(Mucor)属
(例えばムコールミーハイ(M.miehei))の糸状菌から得
てもよく、植物起源(例えば麦芽から)であってよく、例
えばポルシンパンクレア(porcine pancreas)からの動
物起源であってもよい。1mmolのシリコン化合物当たり
0.1〜30mgのリパーゼを用いる。加える外部タンパ
ク質なしの固定体中のタンパク質含量の測定により固定
化度は10〜95%以上であり、対応するローディング
(loading)は、生じた酵素固定体1g当り、0.2〜80
mgの固定化リパーゼタンパク質であることがわかった。
様々な起源のリパーゼに広く適用可能である。固定化さ
れたリパーゼは、微生物起源、例えばSP523リパー
ゼ(ノボ(Novo))であってよく、例えばシュウドモナス
(Pseudomonas)属(例えばシュウドモナスフルオレセン
ス(Ps.fluorescens)、シュウドモナスセパシア(Ps.
cepacia))のバクテリアから、カンディダ(Candida)属
(例えばカンディダアンタルクチカ(C.antarctica)、
カンディダリポリチカ(C.lipolytica))の酵母から、
リゾプス(Rhizopus)属(例えばリゾプスアーリザス(R
h.arrhizus)、リゾプスデレマー(Rh.delemar)、リゾ
プスニベウス(Rh.niveus))、ペニシリウム(Penicill
ium)属(例えばペニシリウムロクェフォルティ(P.roqu
eforti))、アスペルギルス(Aspergillus)属(例えばア
スペルギルスニガー(A.niger))、ムコール(Mucor)属
(例えばムコールミーハイ(M.miehei))の糸状菌から得
てもよく、植物起源(例えば麦芽から)であってよく、例
えばポルシンパンクレア(porcine pancreas)からの動
物起源であってもよい。1mmolのシリコン化合物当たり
0.1〜30mgのリパーゼを用いる。加える外部タンパ
ク質なしの固定体中のタンパク質含量の測定により固定
化度は10〜95%以上であり、対応するローディング
(loading)は、生じた酵素固定体1g当り、0.2〜80
mgの固定化リパーゼタンパク質であることがわかった。
【0010】用いる触媒は、1モルのシリコン化合物当
り10〜100mmolの化学量論量の、塩基性化合物、例
えばアンモニウムヒドロオキサイドおよびアルカリ金属
ヒドロオキサイド、好ましくは水酸化ナトリウムまた水
酸化カリウム; 1モルのシリコン化合物当り1〜10m
molの化学量論量のアンモニア; 1モルのシリコン化合
物当り0.1〜100、好ましくは1〜10mmolの化学
量論量のアンモニウムフルオライドおよびアルカリ金属
フルオライド、好ましくはフッ化ナトリウムまたはフッ
化カリ;およびそのような化合物の組合せを含む。
り10〜100mmolの化学量論量の、塩基性化合物、例
えばアンモニウムヒドロオキサイドおよびアルカリ金属
ヒドロオキサイド、好ましくは水酸化ナトリウムまた水
酸化カリウム; 1モルのシリコン化合物当り1〜10m
molの化学量論量のアンモニア; 1モルのシリコン化合
物当り0.1〜100、好ましくは1〜10mmolの化学
量論量のアンモニウムフルオライドおよびアルカリ金属
フルオライド、好ましくはフッ化ナトリウムまたはフッ
化カリ;およびそのような化合物の組合せを含む。
【0011】以下の添加剤を用いる:(I)タンパク質
(0〜200mgのタンパク質/mgリパーゼ)、例えばアル
ブミン、ゼラチン、カゼイン酸ナトリウム;(II)ポリ
ヒドロキシ化合物(0〜1000mg添加剤/mgリパー
ゼ)、例えばポリビニル,アルコール(例えば0.05〜
200mg/mgリパーゼ)、ソルビット、グリセロール、
ポリエチレングリコール(例えば0.5〜1000mg/m
gリパーゼ);(III)不溶性有機ポリマーまたは無機化
合物、例えばマグネタイト(Fe3O4)、SiO2をベース
にした物質、例えばセライト(登録商標)、シラン(Sira
n)(登録商標)等のオープンポア焼結ガラス、コントロー
ルされた多孔性ガラス(CPG)またはケイ藻土;および
そのような化合物(I)〜(III)の組合せ。添加剤の種
類および量は、固定化リパーゼの得られる活性に影響す
る。適当な添加剤の添加によって、添加剤のない類似の
系と比べて、活性収率の顕著な増加を達成できる。
(0〜200mgのタンパク質/mgリパーゼ)、例えばアル
ブミン、ゼラチン、カゼイン酸ナトリウム;(II)ポリ
ヒドロキシ化合物(0〜1000mg添加剤/mgリパー
ゼ)、例えばポリビニル,アルコール(例えば0.05〜
200mg/mgリパーゼ)、ソルビット、グリセロール、
ポリエチレングリコール(例えば0.5〜1000mg/m
gリパーゼ);(III)不溶性有機ポリマーまたは無機化
合物、例えばマグネタイト(Fe3O4)、SiO2をベース
にした物質、例えばセライト(登録商標)、シラン(Sira
n)(登録商標)等のオープンポア焼結ガラス、コントロー
ルされた多孔性ガラス(CPG)またはケイ藻土;および
そのような化合物(I)〜(III)の組合せ。添加剤の種
類および量は、固定化リパーゼの得られる活性に影響す
る。適当な添加剤の添加によって、添加剤のない類似の
系と比べて、活性収率の顕著な増加を達成できる。
【0012】水は、適当な緩衝物質の添加により緩衝化
されまたは緩衝化されない、リパーゼ、添加剤、触媒の
水溶液の形で、さもなくば直接反応媒体に、1モルのシ
リコン化合物当り4〜15モル、好ましくは8〜12モ
ル量導入される。適した緩衝媒体は例えばpH値6〜1
0を有するリン酸ナトリウムまたはカリウム緩衝液であ
る。脂肪族アルコール(例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール)、THF、DMF等の有機溶媒を2
0容量%までの少量反応混合物に加えてもよく、または
有機溶媒の添加はなしですますこともできる。
されまたは緩衝化されない、リパーゼ、添加剤、触媒の
水溶液の形で、さもなくば直接反応媒体に、1モルのシ
リコン化合物当り4〜15モル、好ましくは8〜12モ
ル量導入される。適した緩衝媒体は例えばpH値6〜1
0を有するリン酸ナトリウムまたはカリウム緩衝液であ
る。脂肪族アルコール(例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール)、THF、DMF等の有機溶媒を2
0容量%までの少量反応混合物に加えてもよく、または
有機溶媒の添加はなしですますこともできる。
【0013】リパーゼを固定化する好ましい方法は例え
ば、酵素の緩衝化したまたは緩衝化しない水溶液を、水
または水性緩衝液、上述の添加剤Iおよび/またはII
の水溶液、および触媒の水溶液の混合物に、0℃〜50
℃、好ましくは4℃〜室温で加え、スワーリングまたは
振とうにより撹拌し、シリコン化合物(R′=アルキル)
を加え(例えばタイプAIおよびAIIIの化合物の混
合物などの非常に異なった反応速度を有する成分を用い
る場合には反応性の小さい成分を先ず加える。)、均一
な相が形成するまで撹拌し、反応混合物がゲル化するま
でスワーリングまたは振とうすることを含んでなる。ゲ
ル化が顕著な熱の発生を伴うなら、混合物をゲル化の間
および直後0℃に冷却する。完全にまたは部分的に凝結
した反応混合物を閉じた容器中で放置し、上清液を、も
しあるなら除去し、生成物を乾燥する。得られる生成物
は一般に無色であり、用いたシリコン成分によって、脆
性〜弾力性であり、硬いガラス状の塊または細かい粉末
である。得られる生成物を砕き、特に非水媒体中の反応
の場合にはこの形で用いてよい。しかし酵素固定化体を
洗浄し、望ましくない副反応および過剰の触媒および添
加剤による汚染の危険を減少させ、反応中により容易に
溶解しまたは脱活性化し、触媒作用中に活性の減少をも
たらす、ゆるく吸着した包括されないリパーゼを除去す
るのが好ましい。これを行うために固定化物を粉砕し、
水または水性緩衝液(pH6〜8)で振とうし、濾過し、
水および有機溶媒、好ましくはアセトンおよびその後ペ
ンタンで洗浄し、乾燥し、最後に摩砕する。
ば、酵素の緩衝化したまたは緩衝化しない水溶液を、水
または水性緩衝液、上述の添加剤Iおよび/またはII
の水溶液、および触媒の水溶液の混合物に、0℃〜50
℃、好ましくは4℃〜室温で加え、スワーリングまたは
振とうにより撹拌し、シリコン化合物(R′=アルキル)
を加え(例えばタイプAIおよびAIIIの化合物の混
合物などの非常に異なった反応速度を有する成分を用い
る場合には反応性の小さい成分を先ず加える。)、均一
な相が形成するまで撹拌し、反応混合物がゲル化するま
でスワーリングまたは振とうすることを含んでなる。ゲ
ル化が顕著な熱の発生を伴うなら、混合物をゲル化の間
および直後0℃に冷却する。完全にまたは部分的に凝結
した反応混合物を閉じた容器中で放置し、上清液を、も
しあるなら除去し、生成物を乾燥する。得られる生成物
は一般に無色であり、用いたシリコン成分によって、脆
性〜弾力性であり、硬いガラス状の塊または細かい粉末
である。得られる生成物を砕き、特に非水媒体中の反応
の場合にはこの形で用いてよい。しかし酵素固定化体を
洗浄し、望ましくない副反応および過剰の触媒および添
加剤による汚染の危険を減少させ、反応中により容易に
溶解しまたは脱活性化し、触媒作用中に活性の減少をも
たらす、ゆるく吸着した包括されないリパーゼを除去す
るのが好ましい。これを行うために固定化物を粉砕し、
水または水性緩衝液(pH6〜8)で振とうし、濾過し、
水および有機溶媒、好ましくはアセトンおよびその後ペ
ンタンで洗浄し、乾燥し、最後に摩砕する。
【0014】得られる材料は約0.1〜700m2/gの
比表面積(BET法)および約0.001〜1cm3/gのポ
ア体積を有する、たいていは白色の粉末である。
比表面積(BET法)および約0.001〜1cm3/gのポ
ア体積を有する、たいていは白色の粉末である。
【0015】本発明による方法の変形では、ゲル生成を
伴い縮合可能なSi−OH基は、Si−O−アルキル基の
加水分解によっては生成せず、むしろSi−O−金属基
のプロトン化により生成する。これを行うためにアルキ
ルシリコネート、例えばソジウムメチルシリコネートM
eSi(ONa)3の水溶液のpH値を、酸、例えば塩酸また
は酢酸の添加により、pH6〜10に調節し、その溶液
を酵素溶液と他の上述した成分の混合物に加える。R′
がアルキルである上述のタイプA、Bおよび/またはC
の他のシリコン化合物を、この変形で用いるシリコン溶
液と組合せて、共縮合のため付加的に用い得る。
伴い縮合可能なSi−OH基は、Si−O−アルキル基の
加水分解によっては生成せず、むしろSi−O−金属基
のプロトン化により生成する。これを行うためにアルキ
ルシリコネート、例えばソジウムメチルシリコネートM
eSi(ONa)3の水溶液のpH値を、酸、例えば塩酸また
は酢酸の添加により、pH6〜10に調節し、その溶液
を酵素溶液と他の上述した成分の混合物に加える。R′
がアルキルである上述のタイプA、Bおよび/またはC
の他のシリコン化合物を、この変形で用いるシリコン溶
液と組合せて、共縮合のため付加的に用い得る。
【0016】他の変形においては、上記方法により調製
した反応混合物を、ゲル化の前に過剰の水に注ぎ、激し
く撹拌して懸濁させる。この方法によれば酵素固定化体
がほぼ球状粒子の形で得られる。
した反応混合物を、ゲル化の前に過剰の水に注ぎ、激し
く撹拌して懸濁させる。この方法によれば酵素固定化体
がほぼ球状粒子の形で得られる。
【0017】さらに別の変形においては、有機ポリマー
または無機材料、例えばマグネタイト(Fe3O4)、SiO
2をベースにした酸化物材料、例えばセライト(Celite)
(登録商標)、オープンポア焼結ガラス、例えばシラン
(Siran)(登録商標)、コントロールした多孔性ガラス
(CPG)またはケイ藻土をタイプIIIの添加剤とし
て、酵素溶液および上述の他の成分と共にシランから調
製した固定体中に導入してもよい。その材料は、シラン
の添加前またはその後に、しかしゲル化が始まる前に任
意の速度で、反応混合物に加える。酵素固定体を大きい
オープンポアの粒子上に置くために、反応混合物をゲル
化が始まる前にその担体に適用する。そのような酸化物
添加剤の使用は、固定化体の実用的特徴、例えばマグネ
タイトの場合には磁気的性質の導入による固定化触媒の
より容易な分離、シラン(登録商標)などの多孔性SiO2
担体の場合には粗に粒状化した材料を生ずることにより
連続流動操作をもたらす。一般に固定化物の触媒活性は
無機材料を添加しない類似の材料に比べ悪影響を受け
ず、またはよい影響さえ受ける。
または無機材料、例えばマグネタイト(Fe3O4)、SiO
2をベースにした酸化物材料、例えばセライト(Celite)
(登録商標)、オープンポア焼結ガラス、例えばシラン
(Siran)(登録商標)、コントロールした多孔性ガラス
(CPG)またはケイ藻土をタイプIIIの添加剤とし
て、酵素溶液および上述の他の成分と共にシランから調
製した固定体中に導入してもよい。その材料は、シラン
の添加前またはその後に、しかしゲル化が始まる前に任
意の速度で、反応混合物に加える。酵素固定体を大きい
オープンポアの粒子上に置くために、反応混合物をゲル
化が始まる前にその担体に適用する。そのような酸化物
添加剤の使用は、固定化体の実用的特徴、例えばマグネ
タイトの場合には磁気的性質の導入による固定化触媒の
より容易な分離、シラン(登録商標)などの多孔性SiO2
担体の場合には粗に粒状化した材料を生ずることにより
連続流動操作をもたらす。一般に固定化物の触媒活性は
無機材料を添加しない類似の材料に比べ悪影響を受け
ず、またはよい影響さえ受ける。
【0018】本発明の方法により得た酵素固定体は有機
媒体中でのエステル化およびエステル交換反応において
高活性を示す。それらは一般に、固定化のために用いら
れた商業的に入手し得る酵素製品の同量より、2〜12
0倍以上より活性である。例えばオリーブ油エマルジョ
ンの加水分解などの水性溶媒中の反応の場合には、固定
化に用いたリパーゼの量を基準にして62%までのシュ
ウドモナスセパシアリパーゼについての活性収率が得ら
れる。
媒体中でのエステル化およびエステル交換反応において
高活性を示す。それらは一般に、固定化のために用いら
れた商業的に入手し得る酵素製品の同量より、2〜12
0倍以上より活性である。例えばオリーブ油エマルジョ
ンの加水分解などの水性溶媒中の反応の場合には、固定
化に用いたリパーゼの量を基準にして62%までのシュ
ウドモナスセパシアリパーゼについての活性収率が得ら
れる。
【0019】その酵素固定体は水および有機媒体中で高
い安定性を示し、乾燥状態で貯蔵された場合には高温で
さえ高い安定性を示す。かくして例えば、本発明による
方法により固定化したシュウドモナスリパーゼの場合、
室温で3月貯蔵後に事実上活性の低下は認められない
(すなわち5%未満)。
い安定性を示し、乾燥状態で貯蔵された場合には高温で
さえ高い安定性を示す。かくして例えば、本発明による
方法により固定化したシュウドモナスリパーゼの場合、
室温で3月貯蔵後に事実上活性の低下は認められない
(すなわち5%未満)。
【0020】
【実施例】実施例1 シュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 リパーゼ(アマノPS)を蒸留水に懸濁し(25mg/ml)、
室温で15分振とうし、遠心分離し、上清液を固定化に
用いる。2mlのポリプロピレン容器中で、0.58mlの
水、0.2mlのポリビニルアルコール水溶液(分子量1
5,000、フルカ、4重量/容量%)、0.1mlの1M
NaF、および0.2mlの酵素水溶液(0.46mgの溶
解したタンパク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得
るアマノPSリパーゼに対応する。)を混合し、0.8
57mlのメチルトリメトキシシラン(6ミリモル、シラ
ンのモル/水(全量)のモル=1:10)を加える。その2
相の混合物をボルテックスシェーカーで30秒間十分混
合する。30秒後および熱の発生を伴って、曇ったエマ
ルジョンは透明な均一溶液となった。その溶液を、全反
応混合物が短い時間の後に均一な不透明な固体に凝結す
るまで、0℃で冷却する。この固体を閉じた容器中で室
温で24時間放置し、30℃常圧で3日間乾燥し、最後
に乳鉢で摩砕する。その粗生成物を10mlの水で室温で
2時間振とうし(350cpm)、ガラスフリット(D4)で
濾過し、20mlの水でおよび次に20mlのアセトンで2
度および20mlのペンタンで洗滌する。固定体は30℃
で24時間乾燥し、次にボールミルで粉砕する。 得られた重量: 0.38g 溶解した用いたアマノPSリパーゼmg/固定体g: 1.
2 活性ファクター[固定体の活性/(遊離リパーゼの活性:
0.55%変換率/時間・mg商業的に入手できるリパー
ゼ)]:6.3(テスト1)
室温で15分振とうし、遠心分離し、上清液を固定化に
用いる。2mlのポリプロピレン容器中で、0.58mlの
水、0.2mlのポリビニルアルコール水溶液(分子量1
5,000、フルカ、4重量/容量%)、0.1mlの1M
NaF、および0.2mlの酵素水溶液(0.46mgの溶
解したタンパク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得
るアマノPSリパーゼに対応する。)を混合し、0.8
57mlのメチルトリメトキシシラン(6ミリモル、シラ
ンのモル/水(全量)のモル=1:10)を加える。その2
相の混合物をボルテックスシェーカーで30秒間十分混
合する。30秒後および熱の発生を伴って、曇ったエマ
ルジョンは透明な均一溶液となった。その溶液を、全反
応混合物が短い時間の後に均一な不透明な固体に凝結す
るまで、0℃で冷却する。この固体を閉じた容器中で室
温で24時間放置し、30℃常圧で3日間乾燥し、最後
に乳鉢で摩砕する。その粗生成物を10mlの水で室温で
2時間振とうし(350cpm)、ガラスフリット(D4)で
濾過し、20mlの水でおよび次に20mlのアセトンで2
度および20mlのペンタンで洗滌する。固定体は30℃
で24時間乾燥し、次にボールミルで粉砕する。 得られた重量: 0.38g 溶解した用いたアマノPSリパーゼmg/固定体g: 1.
2 活性ファクター[固定体の活性/(遊離リパーゼの活性:
0.55%変換率/時間・mg商業的に入手できるリパー
ゼ)]:6.3(テスト1)
【0021】実施例2 タイプAI、AI/AI′、A
I/AII、AI/CおよびBのゲル中へのシュウドモ
ナスセパシアのリパーゼ固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノPS)を蒸留
水(25mg/ml)に懸濁させ、室温で15分間振とうし、
遠心分離し、上清液を固定化のために用いる。2mlのポ
リプロピレン容器中に、水(水(全量)/シランのモル比
が8:1となるような量)、0.2mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(4重量/容量%、分子量15,000、フル
スカ)、0.1mlの1M NaF、および0.2mlの酵素
水溶液(0.46mgの溶解したタンパク質を含み、5.
0mgの商業的に入手できるアマノPSリパーゼに対応す
る。)を混合し、表に示す量のシリコン化合物Iおよび
IIを加える。2相の混合物をボルテックスシェーカー
で30秒間十分混合し、次に室温で1200cpmで振と
うする。30秒〜3時間後、および一般的に熱の発生を
伴って、ゲル化が始まる。短時間後反応混合物が部分的
にまたは完全に不透明な固体に凝結するまで混合物を0
℃で冷却する。その固体は実施例1に記載したように更
に処理する。
I/AII、AI/CおよびBのゲル中へのシュウドモ
ナスセパシアのリパーゼ固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノPS)を蒸留
水(25mg/ml)に懸濁させ、室温で15分間振とうし、
遠心分離し、上清液を固定化のために用いる。2mlのポ
リプロピレン容器中に、水(水(全量)/シランのモル比
が8:1となるような量)、0.2mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(4重量/容量%、分子量15,000、フル
スカ)、0.1mlの1M NaF、および0.2mlの酵素
水溶液(0.46mgの溶解したタンパク質を含み、5.
0mgの商業的に入手できるアマノPSリパーゼに対応す
る。)を混合し、表に示す量のシリコン化合物Iおよび
IIを加える。2相の混合物をボルテックスシェーカー
で30秒間十分混合し、次に室温で1200cpmで振と
うする。30秒〜3時間後、および一般的に熱の発生を
伴って、ゲル化が始まる。短時間後反応混合物が部分的
にまたは完全に不透明な固体に凝結するまで混合物を0
℃で冷却する。その固体は実施例1に記載したように更
に処理する。
【0022】
【表1】
【0023】[a] 用いた酵素タンパク質のmg/固定体
のg [b] 活性テスト1(段落番号0059参照)、(固定体の
活性/遊離リパーゼの活性) [c] テスト2(段落番号0060参照) [d] (固定化されたタンパク質の量=用いたタンパク質
の量−洗液中のタンパク質の量)/固定化に用いたタン
パク質の量)、BCAタンパク質アッセイ、ピアス(Pie
rce)、BSAスタンダード [e] 分子量400〜700 [f] 分子量4200 n.d. 測定せず
のg [b] 活性テスト1(段落番号0059参照)、(固定体の
活性/遊離リパーゼの活性) [c] テスト2(段落番号0060参照) [d] (固定化されたタンパク質の量=用いたタンパク質
の量−洗液中のタンパク質の量)/固定化に用いたタン
パク質の量)、BCAタンパク質アッセイ、ピアス(Pie
rce)、BSAスタンダード [e] 分子量400〜700 [f] 分子量4200 n.d. 測定せず
【0024】略号: MTMS:メチルトリメトキシシラン(フルカ) ETMS:エチルトリメトキシシラン(ABCR) VTMS:ビニルトリメトキシシラン(フルカ) PDMS:シラノール末端基を有するポリジメチルシロ
キサン(ABCR) DMDES:ジメチルジエトキシシラン(フルカ) BTMSE:ビス(トリメトキシシリル)エタン(ABC
R)
キサン(ABCR) DMDES:ジメチルジエトキシシラン(フルカ) BTMSE:ビス(トリメトキシシリル)エタン(ABC
R)
【0025】固定体2aおよび2bにより例示される酵素
固定体の安定性: −室温で3月貯蔵後の残存活性: 95%以上 −室温で3月0.1Mりん酸塩緩衝液中で貯蔵後の残存
活性: 31%(2a)、18%(2g) −各22時間を要する30℃で30回の反応サイクル後
の残存活性(バッチ法、2,2,4−トリメチルペンタン
中でのラウリン酸の1−オクタノールによるエステル
化、テストIを参照、固定体は各サイクル後洗滌する):
80%以上(2a、2g) −70℃で28日間1−オクタノール中で貯蔵後の残存
活性: 65%(2g)
固定体の安定性: −室温で3月貯蔵後の残存活性: 95%以上 −室温で3月0.1Mりん酸塩緩衝液中で貯蔵後の残存
活性: 31%(2a)、18%(2g) −各22時間を要する30℃で30回の反応サイクル後
の残存活性(バッチ法、2,2,4−トリメチルペンタン
中でのラウリン酸の1−オクタノールによるエステル
化、テストIを参照、固定体は各サイクル後洗滌する):
80%以上(2a、2g) −70℃で28日間1−オクタノール中で貯蔵後の残存
活性: 65%(2g)
【0026】実施例3 タイプAI/AIII、B/A
III、C/AIIIのゲル中でのシュウドモナスセパ
シアのリパーゼの固定化 第2のシリコン化合物(II)が各場合にテトラメトキシ
シラン(TMOS)であることを除いて実施例2と同様に
行う。すべての場合に、水(比R=表に示す水(全量)の
モル数/シランのモル数が得られるような量)、0.2m
lのポリビニルアルコール水溶液(分子量15,000、
フルカ、4重量/容量%)、0.1mlの1M NaFおよ
び0.4mlの酵素水溶液(0.46mgの溶解したタンパ
ク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得るアマノPS
リパーゼに対応する)を混合し、表に示す量のシリコン
化合物IおよびII(TMOS)を加える。その2相混合
物をボルテックスシェーカーで30秒間混合し(または
混合物が早くゲル化する場合ゲル化するまで)、次に室
温で120cpmで振とうする。2秒〜3時間後そして一
般に熱の発生を伴ってゲル化が開始するので、混合物を
次に0℃に冷却する。固定体のさらなる処理を実施例1
に記載したように行う。
III、C/AIIIのゲル中でのシュウドモナスセパ
シアのリパーゼの固定化 第2のシリコン化合物(II)が各場合にテトラメトキシ
シラン(TMOS)であることを除いて実施例2と同様に
行う。すべての場合に、水(比R=表に示す水(全量)の
モル数/シランのモル数が得られるような量)、0.2m
lのポリビニルアルコール水溶液(分子量15,000、
フルカ、4重量/容量%)、0.1mlの1M NaFおよ
び0.4mlの酵素水溶液(0.46mgの溶解したタンパ
ク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得るアマノPS
リパーゼに対応する)を混合し、表に示す量のシリコン
化合物IおよびII(TMOS)を加える。その2相混合
物をボルテックスシェーカーで30秒間混合し(または
混合物が早くゲル化する場合ゲル化するまで)、次に室
温で120cpmで振とうする。2秒〜3時間後そして一
般に熱の発生を伴ってゲル化が開始するので、混合物を
次に0℃に冷却する。固定体のさらなる処理を実施例1
に記載したように行う。
【0027】
【表2】
【0028】[a] 用いた酵素タンパク質のmg/固定化
体のg [b] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性 [c] テスト2 [d] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
タンパク質の量) [e] 分子量400〜700
体のg [b] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性 [c] テスト2 [d] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
タンパク質の量) [e] 分子量400〜700
【0029】略号: MTMS:メチルトリメトキシシラン(フルカ) ETMS:エチルトリメトキシシラン(ABCR) PTMS:プロピルトリメトキシシラン(アルドリッチ) OTMS:オクチルトリメトキシシラン(ABCR) ODTMS:オクタデシルトリメトキシシラン(ABC
R) PhTMS:フェニルトリメトキシシラン(フルカ) VTMS:ビニルトリメトキシシラン(フルカ) PDMS:シラノール末端基を有するポリジメチルシロ
キサン(ABCR) BTMSH:ビス(トリメトキシシリル)ヘキサン(ABC
R)
R) PhTMS:フェニルトリメトキシシラン(フルカ) VTMS:ビニルトリメトキシシラン(フルカ) PDMS:シラノール末端基を有するポリジメチルシロ
キサン(ABCR) BTMSH:ビス(トリメトキシシリル)ヘキサン(ABC
R)
【0030】実施例4 アルキルトリメトキシシラン/
テトラエトキシシランをベースにしたゲル中でのシュウ
ドモナスセパシアリパーゼの固定化 テトラメトキシシラン(TMOS)の代わりにテトラトキ
シシラン(TEOS)を用いることを除いて実施例3と同
様に行う。生成物は実施例1と同様に乾燥し、洗浄す
る。
テトラエトキシシランをベースにしたゲル中でのシュウ
ドモナスセパシアリパーゼの固定化 テトラメトキシシラン(TMOS)の代わりにテトラトキ
シシラン(TEOS)を用いることを除いて実施例3と同
様に行う。生成物は実施例1と同様に乾燥し、洗浄す
る。
【0031】
【表3】
【0032】[a] 用いた酵素タンパク質のmg/固定体
のg [b] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [c] (固定化されたタンパク質量)/(固定化に用いたタ
ンパク質の量)
のg [b] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [c] (固定化されたタンパク質量)/(固定化に用いたタ
ンパク質の量)
【0033】実施例5 メチルトリメトキシシランをベ
ースにするゲル中の異なるリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ0.2mlの
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5中の表に示
す商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心
分離で除いた後)をアマノPSリパーゼの代わりに用い
た外は、実施例2aと同様に行った。ゲル化時間:0.5
〜2分
ースにするゲル中の異なるリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ0.2mlの
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5中の表に示
す商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心
分離で除いた後)をアマノPSリパーゼの代わりに用い
た外は、実施例2aと同様に行った。ゲル化時間:0.5
〜2分
【0034】
【表4】
【0035】[a] フルカ(a、b、c、d、e、f、h)、ノボ
(i)により提供 [b] 製造者により明示(n.sは明示されず) [c] 固定化のために用いた商業的に入手できるリパー
ゼ [d] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定体のg [e] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手できる
リパーゼの活性) [f] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [g] 不明の微生物起源の組換え酵素 [h] 初速度(変換率%/時間・mg商業的に入手し得るリ
パーゼ)、活性テスト1
(i)により提供 [b] 製造者により明示(n.sは明示されず) [c] 固定化のために用いた商業的に入手できるリパー
ゼ [d] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定体のg [e] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手できる
リパーゼの活性) [f] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [g] 不明の微生物起源の組換え酵素 [h] 初速度(変換率%/時間・mg商業的に入手し得るリ
パーゼ)、活性テスト1
【0036】固定体4dにより例示される酵素固定体の
安定性: −室温で3月、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.0中
に貯蔵後の残存活性:70%
安定性: −室温で3月、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.0中
に貯蔵後の残存活性:70%
【0037】実施例6 メチルトリメトキシシラン/ポ
リジメチルシロキサンをベースにしたゲル中での異なる
リパーゼの固定化 異なる起源の異なるリパーゼ(それぞれ0.2mlの0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5中での表に示
した商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠
心分離で除去後)を、アマノPSリパーゼの代わりに用
いた外は実施例2eと同様に行った。ゲル化時間:1〜5
分
リジメチルシロキサンをベースにしたゲル中での異なる
リパーゼの固定化 異なる起源の異なるリパーゼ(それぞれ0.2mlの0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5中での表に示
した商業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠
心分離で除去後)を、アマノPSリパーゼの代わりに用
いた外は実施例2eと同様に行った。ゲル化時間:1〜5
分
【0038】
【表5】
【0039】[a] 供給者および比活性は実施例5を参
照 [b] 用いた商業的に入手し得るリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定化体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化タンパク質の量)/(固定化に用いた可溶性
タンパク質の量)
照 [b] 用いた商業的に入手し得るリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定化体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化タンパク質の量)/(固定化に用いた可溶性
タンパク質の量)
【0040】固定体5dにより例示される酵素固定体の
安定性: −室温で3月、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.0中
で貯蔵後の残存活性:92%
安定性: −室温で3月、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.0中
で貯蔵後の残存活性:92%
【0041】実施例7 プロピルトリメトキシシラン/
テトラメトキシシランをベースにしたゲル中での異なっ
たリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ0.2mlの
0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.5中での表に示す商
業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心分離
で除去後)を、アマノPSリパーゼの代わりに用いた外
は実施例3cと同様に行った。ゲル化時間:0.5〜2分
テトラメトキシシランをベースにしたゲル中での異なっ
たリパーゼの固定化 異なった起源の異なったリパーゼ(それぞれ0.2mlの
0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.5中での表に示す商
業的に入手し得るリパーゼの量、不溶性成分を遠心分離
で除去後)を、アマノPSリパーゼの代わりに用いた外
は実施例3cと同様に行った。ゲル化時間:0.5〜2分
【0042】
【表6】
【0043】[a] 供給者および比活性は実施例5を参
照 [b] 用いた商業的に入手可能なリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定化体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [f] フルカ、3.3U/mgタンパク質、0.83%変
換率/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テス
ト1 [g] フルカ、50U/mgタンパク質、0.16%変換
率/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テスト
1
照 [b] 用いた商業的に入手可能なリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定化体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化されたタンパク質の量)/(固定化に用いた
可溶性タンパク質の量) [f] フルカ、3.3U/mgタンパク質、0.83%変
換率/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テス
ト1 [g] フルカ、50U/mgタンパク質、0.16%変換
率/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ、活性テスト
1
【0044】実施例8 シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 以下に示した触媒および水量(R=8の一定値で)を、
0.1mlの1M NaF溶液の代わりに用いた外は実施
例2aと同様に行う。ゲル化時間は0.5〜1分(8a)、
24時間(8b、8c)、48時間(8d)であった。得られ
た重量は0.34〜0.42gであった。溶解した用い
たアマノPSリパーゼのmg/固定体のg:1.1〜1.3
ーゼの固定化 以下に示した触媒および水量(R=8の一定値で)を、
0.1mlの1M NaF溶液の代わりに用いた外は実施
例2aと同様に行う。ゲル化時間は0.5〜1分(8a)、
24時間(8b、8c)、48時間(8d)であった。得られ
た重量は0.34〜0.42gであった。溶解した用い
たアマノPSリパーゼのmg/固定体のg:1.1〜1.3
【0045】
【表7】
【0046】実施例9 シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 表に示した異なった添加剤および水量(水:シランの一定
比R=8:1)を用いた外は実施例2aと同様に行った。
得られた重量は0.38〜0.4gであった。用いた溶
解したアマノPSリパーゼのmg/固定体のg: 1.1〜
1.2
ーゼの固定化 表に示した異なった添加剤および水量(水:シランの一定
比R=8:1)を用いた外は実施例2aと同様に行った。
得られた重量は0.38〜0.4gであった。用いた溶
解したアマノPSリパーゼのmg/固定体のg: 1.1〜
1.2
【0047】
【表8】
【0048】実施例10 ノボSP523リパーゼの固
定化 リパーゼSP523(ノボ)を蒸留水に懸濁し(50mg/m
l)、室温で15分振とうし、遠心分離し、上清液を固定
化に用いる。2mlのポリプロピレン容器(エッペンドル
フ)に、42μlの水、0.1mlのポリビニルアルコール
水溶液(分子量15,000、フルカ、4重量/体積
%)、14μlの1M NaF溶液、および0.1mlの酵
素水溶液(2.06mgの溶解したタンパク質を含み、
5.0mgの商業的に入手し得るSP523リパーゼに対
応する)を混合し、0.217mlのPDMS(0.4ミリ
モル、分子量400〜700、ABCR)および0.2
21mlのテトラメトキシシラン(1.5ミリモル、フル
カ)を加える。その二相の混合物をボルテックスシェー
カーで2秒間十分混合し、1.2gのシラン(Siran)(登
録商標)(ショット(Schott)、1N HClで60℃で1
6時間前処理し、水で洗滌し、30%の水含量で使用)
を加え、混合物をボルテックスシェーカーで約5秒間ゲ
ル化が起るまで混合し、0℃で2分間冷却する。生成物
を乾燥し、実施例1に記載したように洗滌する。しかし
固定体を含浸したシラン粒子は粉砕しなかった。
定化 リパーゼSP523(ノボ)を蒸留水に懸濁し(50mg/m
l)、室温で15分振とうし、遠心分離し、上清液を固定
化に用いる。2mlのポリプロピレン容器(エッペンドル
フ)に、42μlの水、0.1mlのポリビニルアルコール
水溶液(分子量15,000、フルカ、4重量/体積
%)、14μlの1M NaF溶液、および0.1mlの酵
素水溶液(2.06mgの溶解したタンパク質を含み、
5.0mgの商業的に入手し得るSP523リパーゼに対
応する)を混合し、0.217mlのPDMS(0.4ミリ
モル、分子量400〜700、ABCR)および0.2
21mlのテトラメトキシシラン(1.5ミリモル、フル
カ)を加える。その二相の混合物をボルテックスシェー
カーで2秒間十分混合し、1.2gのシラン(Siran)(登
録商標)(ショット(Schott)、1N HClで60℃で1
6時間前処理し、水で洗滌し、30%の水含量で使用)
を加え、混合物をボルテックスシェーカーで約5秒間ゲ
ル化が起るまで混合し、0℃で2分間冷却する。生成物
を乾燥し、実施例1に記載したように洗滌する。しかし
固定体を含浸したシラン粒子は粉砕しなかった。
【0049】得られた重量:0.94g ローディング(SP523リパーゼ、溶解した用いたタ
ンパク質のmg/固定体のg):2.2 活性収量[テスト1]:112 [活性(シランを有するゲル)]/[活性(同量のシランを有
しないバルクゲル)]:1.9 固定化されたタンパク質の%(洗液中のタンパク質の測
定から):98%
ンパク質のmg/固定体のg):2.2 活性収量[テスト1]:112 [活性(シランを有するゲル)]/[活性(同量のシランを有
しないバルクゲル)]:1.9 固定化されたタンパク質の%(洗液中のタンパク質の測
定から):98%
【0050】実施例11 マグネタイトを含む担体中の
シュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノPS)を蒸留
水中に懸濁し(25mg/ml)、室温で15分振とうし、遠
心分離し、上清液を固定化に用いる。2mlのポリプロピ
レン容器(エッペンドルフ)中に、0.2mlのゼラチン水
溶液(4重量/容量%、ICN)、0.1mlの1M Na
F、および0.2mlの酵素水溶液(0.46mgの溶解し
たタンパク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得るア
マノPSリパーゼに対応する)を混合し、0.5gのマグ
ネタイト(Fe3O4、コバヤシ等、ジャーナル・オブ・コ
ロイド・アンド・インターフェース・サイエンス(J.
Coll.Interface Sci.)、1991年、141巻、
505頁に従って新しく調製、水含量70%)を加え
る。混合物をボルテックスシェーカーで2秒間十分混合
し、0.857ml(6ミリモル)のMTMSを加え、反応
混合物をボルテックスシェーカーでゲル化が0.5〜1
分後起るまで十分に混合し、次に0℃で1分冷却する。
濾過操作の代わりに永久磁石の助けを借りたデカンテー
ションを行った外は実施例1と同様にゲルの処理を行っ
た。
シュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアのリパーゼ(アマノPS)を蒸留
水中に懸濁し(25mg/ml)、室温で15分振とうし、遠
心分離し、上清液を固定化に用いる。2mlのポリプロピ
レン容器(エッペンドルフ)中に、0.2mlのゼラチン水
溶液(4重量/容量%、ICN)、0.1mlの1M Na
F、および0.2mlの酵素水溶液(0.46mgの溶解し
たタンパク質を含み、5.0mgの商業的に入手し得るア
マノPSリパーゼに対応する)を混合し、0.5gのマグ
ネタイト(Fe3O4、コバヤシ等、ジャーナル・オブ・コ
ロイド・アンド・インターフェース・サイエンス(J.
Coll.Interface Sci.)、1991年、141巻、
505頁に従って新しく調製、水含量70%)を加え
る。混合物をボルテックスシェーカーで2秒間十分混合
し、0.857ml(6ミリモル)のMTMSを加え、反応
混合物をボルテックスシェーカーでゲル化が0.5〜1
分後起るまで十分に混合し、次に0℃で1分冷却する。
濾過操作の代わりに永久磁石の助けを借りたデカンテー
ションを行った外は実施例1と同様にゲルの処理を行っ
た。
【0051】得られた重量:0.47g 溶解した用いたリパーゼのmg/固定体のg: 1.0 活性ファクター[テスト1]: 2.2
【0052】実施例12 ソジウムメチルシリコネート
から調製したゲル中のリパーゼの固定化 表1に示した商業的に入手し得るリパーゼの量を1mlの
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に懸濁さ
せ、15分振とうし、遠心により固体残渣から遊離させ
る。固定化の直前に、0.65mlの濃HClを4mlのソ
ジウムメチルシリコネート溶液(水中30%、7.5ミ
リモル、ABCR)に激しく撹拌しながら加え、8.0
〜8.5のpH値とする。0.25mlの酵素溶液、0.
25mlのアルブミン溶液(50mg/ml、牛血清アルブミ
ン、シグマ)、0.1mlの1Mフッ化ナトリウムおよび
0.5mlの1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の混
合物に、0.5mlのポリジメチルシロキサン(0.9ミ
リモル、分子量400〜700、ABCR)続いて0.
5mlのソジウムシリコネート溶液(0.8ミリモルに相
当する)を加え、混合物をゲル化が起るまで、すなわち
1〜2秒間ボルテックスシェーカーで十分混合する。実
施例1に記載したのと同様にさらなる処理を行った。
から調製したゲル中のリパーゼの固定化 表1に示した商業的に入手し得るリパーゼの量を1mlの
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に懸濁さ
せ、15分振とうし、遠心により固体残渣から遊離させ
る。固定化の直前に、0.65mlの濃HClを4mlのソ
ジウムメチルシリコネート溶液(水中30%、7.5ミ
リモル、ABCR)に激しく撹拌しながら加え、8.0
〜8.5のpH値とする。0.25mlの酵素溶液、0.
25mlのアルブミン溶液(50mg/ml、牛血清アルブミ
ン、シグマ)、0.1mlの1Mフッ化ナトリウムおよび
0.5mlの1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の混
合物に、0.5mlのポリジメチルシロキサン(0.9ミ
リモル、分子量400〜700、ABCR)続いて0.
5mlのソジウムシリコネート溶液(0.8ミリモルに相
当する)を加え、混合物をゲル化が起るまで、すなわち
1〜2秒間ボルテックスシェーカーで十分混合する。実
施例1に記載したのと同様にさらなる処理を行った。
【0053】
【表9】
【0054】[a] 供給者および比活性は実施例5を参
照、シュウドモナスフルオレッセンスリパーゼ:フル
カ、31.5U/mgタンパク質 [b] 用いた商業的に入手できるリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化したタンパク質の量)/(固定化に用いた可
溶性タンパク質の量) [f] 商業的に入手し得るリパーゼについての変換率%
/時間(初速)
照、シュウドモナスフルオレッセンスリパーゼ:フル
カ、31.5U/mgタンパク質 [b] 用いた商業的に入手できるリパーゼ [c] 用いた可溶性酵素タンパク質のmg/固定体のg [d] テスト1、(固定体の活性)/(商業的に入手し得る
リパーゼの活性) [e] (固定化したタンパク質の量)/(固定化に用いた可
溶性タンパク質の量) [f] 商業的に入手し得るリパーゼについての変換率%
/時間(初速)
【0055】実施例13 ノポSP523リパーゼの固
定化 50mgのSP523リパーゼ(ノボ)を1mlの0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に懸濁し、15分振
とうし、遠心により固体残渣から遊離させる。0.1ml
の酵素溶液(5mgの商業的に入手し得るリパーゼに対応
する。3.8mgの溶解したタンパク質)、0.2mlの1
Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、0.1mlのポリ
ビニルアルコール(分子量15,000、水中4%)、お
よび0.04mlの1Mフッ化ナトリウム溶液を混合し、
0.2mlのポリジメチルシロキサン(0.36ミリモ
ル、分子量400〜700、ABCR)続いて0.2ml
のソジウムメチルシリコネート溶液(水中30%、0.
38ミリモル、ABCR)および0.03mlの濃塩酸を
加え、混合物を約1秒混合し(ボルテックスシェーカ
ー)、1gのシラン(登録商標)(ショット)と十分混合す
る。生成物を実施例1に記載したように乾燥し、洗滌す
る。固定体を浸み込ませたシラン粒子は粉砕しなかっ
た。
定化 50mgのSP523リパーゼ(ノボ)を1mlの0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に懸濁し、15分振
とうし、遠心により固体残渣から遊離させる。0.1ml
の酵素溶液(5mgの商業的に入手し得るリパーゼに対応
する。3.8mgの溶解したタンパク質)、0.2mlの1
Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、0.1mlのポリ
ビニルアルコール(分子量15,000、水中4%)、お
よび0.04mlの1Mフッ化ナトリウム溶液を混合し、
0.2mlのポリジメチルシロキサン(0.36ミリモ
ル、分子量400〜700、ABCR)続いて0.2ml
のソジウムメチルシリコネート溶液(水中30%、0.
38ミリモル、ABCR)および0.03mlの濃塩酸を
加え、混合物を約1秒混合し(ボルテックスシェーカ
ー)、1gのシラン(登録商標)(ショット)と十分混合す
る。生成物を実施例1に記載したように乾燥し、洗滌す
る。固定体を浸み込ませたシラン粒子は粉砕しなかっ
た。
【0056】得られた重量: 1.2g ローディング(リパーゼ、溶解した用いたタンパク質のm
g/固定体のg):3.1 活性ファクター[テスト1]:187 [活性(シランを有するゲル)]/[活性(同量のシランのな
いバルクゲル)]:1.4 固定化されたタンパク質の%(洗液中のタンパク質測定
から):96
g/固定体のg):3.1 活性ファクター[テスト1]:187 [活性(シランを有するゲル)]/[活性(同量のシランのな
いバルクゲル)]:1.4 固定化されたタンパク質の%(洗液中のタンパク質測定
から):96
【0057】実施例14 MTMSからのソノゲル(son
ogel)中のシュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアリパーゼ(アマノPS)を蒸溜水
に懸濁し(25mg/ml)、室温で15分振とうし、遠心分
離し、上清液を固定化に用いる。20mlのポリピロピレ
ン容器中に、4.81mlのメチルトリメトキシシラン
(MTMS)、1.17mlの蒸溜水および0.03mlの
0.001M NaF水溶液を混合し、0℃で1時間ソニ
ケート(sonicate)する。ソニケーション後、0.086
mlの1M NaF水溶液、0.20mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(4重量/容量%)、0.20mlのリパーゼ溶
液および0.164mlの蒸溜水を、1.071mlのMT
MSからソニケーションにより得られたゾルに加える。
混合物をボルテックシェーカーで攪拌し(約5秒)、ゲル
化が生ずるまで室温で次におだやかに振とうする(20
0rpm)。生成物を実施例1と同様に乾燥し、洗浄する。 得られた重量:411mg 溶解した用いたアマノPSリパーゼのmg/固定体のg:
1.1 活性ファクター:7.09
ogel)中のシュウドモナスセパシアのリパーゼの固定化 シュウドモナスセパシアリパーゼ(アマノPS)を蒸溜水
に懸濁し(25mg/ml)、室温で15分振とうし、遠心分
離し、上清液を固定化に用いる。20mlのポリピロピレ
ン容器中に、4.81mlのメチルトリメトキシシラン
(MTMS)、1.17mlの蒸溜水および0.03mlの
0.001M NaF水溶液を混合し、0℃で1時間ソニ
ケート(sonicate)する。ソニケーション後、0.086
mlの1M NaF水溶液、0.20mlのポリビニルアルコ
ール水溶液(4重量/容量%)、0.20mlのリパーゼ溶
液および0.164mlの蒸溜水を、1.071mlのMT
MSからソニケーションにより得られたゾルに加える。
混合物をボルテックシェーカーで攪拌し(約5秒)、ゲル
化が生ずるまで室温で次におだやかに振とうする(20
0rpm)。生成物を実施例1と同様に乾燥し、洗浄する。 得られた重量:411mg 溶解した用いたアマノPSリパーゼのmg/固定体のg:
1.1 活性ファクター:7.09
【0058】実施例15 MTMS/PDMSからのア
エロゲル(aerogel)中のシュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 実施例2(e)と同様に行う。ゲル化が起こった後、ゲル
を含むポリピロピレン容器をオートクレーブ(200ml)
中に置き、超臨界条件(40℃、90バール)下の2酸化
炭素(約90g)で乾燥する。24時間後、固定体を実施
例1と同様に洗浄する。 得られた重量:0.29g 溶解した用いたリパーゼmg/固定体のg:1.5 活性ファクター[(固定体の活性/商業的に入手し得るリ
パーゼの活性)]:14.1 固定化度:0.65
エロゲル(aerogel)中のシュウドモナスセパシアのリパ
ーゼの固定化 実施例2(e)と同様に行う。ゲル化が起こった後、ゲル
を含むポリピロピレン容器をオートクレーブ(200ml)
中に置き、超臨界条件(40℃、90バール)下の2酸化
炭素(約90g)で乾燥する。24時間後、固定体を実施
例1と同様に洗浄する。 得られた重量:0.29g 溶解した用いたリパーゼmg/固定体のg:1.5 活性ファクター[(固定体の活性/商業的に入手し得るリ
パーゼの活性)]:14.1 固定化度:0.65
【0059】活性テストおよび固定化リパーゼを用いる
反応 (1)ラウリン酸の1−オクタノールによるエステル化 50mlの遠心カップ(ポリプロピレン、スクリューキャ
ップを備える)中の酵素固定体(ローディングにより10
0〜1000mg)に、100mgのラウリン酸(0.5ミリ
モル、フルカ)、0.158mlの1−オクタノール(1ミ
リモル、メルク)および2,2,4−トリメチルペンタン
(10ml、アルドリッチ)の混合物を加え、カップを閉
じ、水浴中で30℃で180cpmで振とうする。初速度
を測定するために、サンプル(0.15ml)を規則的な間
隔で取り出し、オクチルラウレートのラウリン酸に対す
る比をガスクロマトグラフィ(0.25mmFFAPキャ
ピラリーカラム,15m)により測定する。活性ファクタ
ーで決定するためかくして測定された反応速度を、固定
化に用いた量に等しい商業的に入手可能な酵素製品の量
による同じ条件下で得られる反応速度で割る。
反応 (1)ラウリン酸の1−オクタノールによるエステル化 50mlの遠心カップ(ポリプロピレン、スクリューキャ
ップを備える)中の酵素固定体(ローディングにより10
0〜1000mg)に、100mgのラウリン酸(0.5ミリ
モル、フルカ)、0.158mlの1−オクタノール(1ミ
リモル、メルク)および2,2,4−トリメチルペンタン
(10ml、アルドリッチ)の混合物を加え、カップを閉
じ、水浴中で30℃で180cpmで振とうする。初速度
を測定するために、サンプル(0.15ml)を規則的な間
隔で取り出し、オクチルラウレートのラウリン酸に対す
る比をガスクロマトグラフィ(0.25mmFFAPキャ
ピラリーカラム,15m)により測定する。活性ファクタ
ーで決定するためかくして測定された反応速度を、固定
化に用いた量に等しい商業的に入手可能な酵素製品の量
による同じ条件下で得られる反応速度で割る。
【0060】(2)オリーブ油エマルジョンの加水分解 20mlのアラビアゴム溶液(シグマ、水中100g/l)に
6.5mlのオリーブ油(シグマ、アルミナBを通して濾
過、活性レベルI)を加え、混合物をミキサーで30分
ホモジナイズする。25mlの基質エマルジョンに20ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH9を加え、pH
値を0.1M NaOHで8.0に調節し、混合物を2
分ホモジナイズする。2mlのエッペンドロフ容器中で、
10mgの酵素固定体を0.1mlの水と5分間振とうし、
0.9mlの緩衝化された基質エマルジョンを加え、混合
物をボルテックスシェーカーで5秒間十分混合し、30
℃、1200cpmで0.5〜2時間振とうする。反応
は、ヘキサン/i−プロパノール1:5(10ml)中の濃硫
酸(1ml)の溶液0.1mlを加えることにより終了させ、
反応混合物を0.6mlのヘキサンで抽出する。0.4ml
のヘキサン層に1mlのアセトン/エタノール1:1およ
びフェノールフタレンを加え、遊離の脂肪酸をエタノー
ル中の0.1M水酸化カリウムで滴定する。活性収率
は、得られた収率を、遊離のリパーゼの水溶液を用いて
同一条件下で得られた収率と比較することにより決定さ
れ、%で示す。
6.5mlのオリーブ油(シグマ、アルミナBを通して濾
過、活性レベルI)を加え、混合物をミキサーで30分
ホモジナイズする。25mlの基質エマルジョンに20ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH9を加え、pH
値を0.1M NaOHで8.0に調節し、混合物を2
分ホモジナイズする。2mlのエッペンドロフ容器中で、
10mgの酵素固定体を0.1mlの水と5分間振とうし、
0.9mlの緩衝化された基質エマルジョンを加え、混合
物をボルテックスシェーカーで5秒間十分混合し、30
℃、1200cpmで0.5〜2時間振とうする。反応
は、ヘキサン/i−プロパノール1:5(10ml)中の濃硫
酸(1ml)の溶液0.1mlを加えることにより終了させ、
反応混合物を0.6mlのヘキサンで抽出する。0.4ml
のヘキサン層に1mlのアセトン/エタノール1:1およ
びフェノールフタレンを加え、遊離の脂肪酸をエタノー
ル中の0.1M水酸化カリウムで滴定する。活性収率
は、得られた収率を、遊離のリパーゼの水溶液を用いて
同一条件下で得られた収率と比較することにより決定さ
れ、%で示す。
【0061】(3)1−フェニルエタノールの無水酢酸お
よび固定化シュウドモナスセパシアリパーゼによるエス
テル化により例示されるラセミ性二級アルコールの立体
選択性エステル化 酵素固定体(実施例2eに従って固定化、その量はローデ
ィングによる)を4mlのベンゼンに懸濁し、2.4マイ
クロモルの無水酢酸および2.4マイクロモルのラセミ
の1−フェニルエタノールを加え、混合物を室温で40
0cpmで振とうする。反応を追跡するためにサンプル
(0.15ml)を規則的な間隔で取り出し、0.15mlの
5%Na2CO3でおよび遠心の後分配する。有機層をガ
スクロマトグラフィーで調べる。反応完了後のエナンチ
オマー過剰をガスクロマトグラフィで測定した(0.2
5mmキャピラリー、30m、カラム材料:6−t−ブチル
ジメチルシリル−2,3−ジメチル−β−シクロデキス
トリン、UV1701中20%)。 収率: 50%、%ee(エステル):>99、%ee(アルコ
ール):>99
よび固定化シュウドモナスセパシアリパーゼによるエス
テル化により例示されるラセミ性二級アルコールの立体
選択性エステル化 酵素固定体(実施例2eに従って固定化、その量はローデ
ィングによる)を4mlのベンゼンに懸濁し、2.4マイ
クロモルの無水酢酸および2.4マイクロモルのラセミ
の1−フェニルエタノールを加え、混合物を室温で40
0cpmで振とうする。反応を追跡するためにサンプル
(0.15ml)を規則的な間隔で取り出し、0.15mlの
5%Na2CO3でおよび遠心の後分配する。有機層をガ
スクロマトグラフィーで調べる。反応完了後のエナンチ
オマー過剰をガスクロマトグラフィで測定した(0.2
5mmキャピラリー、30m、カラム材料:6−t−ブチル
ジメチルシリル−2,3−ジメチル−β−シクロデキス
トリン、UV1701中20%)。 収率: 50%、%ee(エステル):>99、%ee(アルコ
ール):>99
【0062】(4)固定化されたノボSP523リパーゼ
により例示されるオリーブ油のパルミチン酸によるエス
テル交換 0.2gのパルミチン酸を1.5mlの2,2,4−トリメ
チルペンタン中に加熱しながら溶解し、0.2mlのトリ
オレイン(シグマ)と混合し、酵素固定体(ノボSP52
3リパーゼ、実施例12に従い固定化、水含量16%、
58mg、固定化に用いた可溶性リパーゼタンパク質0.
15mgに対応)を加える。反応混合物を40℃、120
0cpmで振とうする。規則的な間隔でサンプル(0.05
ml)を取り出し、収率をガスクロマトグラフィにより追
跡する(BSTFA/TMCS(99:1)/ピリジンによ
るシリル化に従う; PSO48相を有するキャピラリ
ーカラム)。活性(1U=1マイクロモル/分のパルミチ
ン酸消費として定義する)は0.56Uであり、11.
28U/g固定化体に対応する。
により例示されるオリーブ油のパルミチン酸によるエス
テル交換 0.2gのパルミチン酸を1.5mlの2,2,4−トリメ
チルペンタン中に加熱しながら溶解し、0.2mlのトリ
オレイン(シグマ)と混合し、酵素固定体(ノボSP52
3リパーゼ、実施例12に従い固定化、水含量16%、
58mg、固定化に用いた可溶性リパーゼタンパク質0.
15mgに対応)を加える。反応混合物を40℃、120
0cpmで振とうする。規則的な間隔でサンプル(0.05
ml)を取り出し、収率をガスクロマトグラフィにより追
跡する(BSTFA/TMCS(99:1)/ピリジンによ
るシリル化に従う; PSO48相を有するキャピラリ
ーカラム)。活性(1U=1マイクロモル/分のパルミチ
ン酸消費として定義する)は0.56Uであり、11.
28U/g固定化体に対応する。
【0063】(5)固定化シュウドモナスセパシアのリパ
ーゼにより例示されるオリーブ油の加水分解 固定化したシュウドモナスセパシアリパーゼ(時には異
なる酵素量で上記のような固定化方法、量はローディン
グにより、固定化のために用いたリパーゼタンパク質
0.12mgに対応する)を10mlの水および10mlのオ
リーブ油と混合し、40℃で230cpmで振とうする(ス
クリューキャップを備えた50mlのポリプロピレン容
器、直径2.7cm)。規則的な間隔で油層のサンプル
(0.15ml)を取り出し、アセトン/エタノール1:1
(1ml)およびフェノールフタレンを加え、遊離した脂肪
酸をエタノール中の0.06M KOHで滴定する。
ーゼにより例示されるオリーブ油の加水分解 固定化したシュウドモナスセパシアリパーゼ(時には異
なる酵素量で上記のような固定化方法、量はローディン
グにより、固定化のために用いたリパーゼタンパク質
0.12mgに対応する)を10mlの水および10mlのオ
リーブ油と混合し、40℃で230cpmで振とうする(ス
クリューキャップを備えた50mlのポリプロピレン容
器、直径2.7cm)。規則的な間隔で油層のサンプル
(0.15ml)を取り出し、アセトン/エタノール1:1
(1ml)およびフェノールフタレンを加え、遊離した脂肪
酸をエタノール中の0.06M KOHで滴定する。
【0064】
【表10】 [a] 固定化に用いた可溶性酵素タンパク質のmg/得ら
れた固定体のg [b] 初速度(遊離した酸のミリモル/時間)/固定化に
用いたリパーゼタンパク質のmg、v(遊離)=0.13ミ
リモルのKOH/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ
れた固定体のg [b] 初速度(遊離した酸のミリモル/時間)/固定化に
用いたリパーゼタンパク質のmg、v(遊離)=0.13ミ
リモルのKOH/時間・mg商業的に入手し得るリパーゼ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 9/20 C12P 7/62 7432−4B 7/64 7432−4B // C11C 1/04 3/10 (72)発明者 マンフレート・テー・レーツ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム/ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ1番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内 (72)発明者 イェルク・ジンペルカンプ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム/ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ1番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内 (72)発明者 アルビン・ツォンタ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム/ルール、カイザー−ビルヘルム−プ ラッツ1番 シュトゥディエンゲゼルシャ フト・コーレ・ミット・ベシュレンクテ ル・ハフツング内
Claims (14)
- 【請求項1】 リパーゼを、Si−C結合を介して結合
した有機置換基を有するシリカマトリックスに固定する
ことを特徴とする固定化リパーゼの製造方法。 - 【請求項2】 非加水分解性の有機置換基および加水分
解性の置換基を有するシリコン化合物、並びにそのよう
なシリコン化合物と完全に加水分解性の置換基のみを有
するシリコン化合物との混合物の存在下に、少なくとも
一つの触媒の存在下に、および場合により少なくとも1
つの添加剤の存在下に、リパーゼを固定化することを特
徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 【化1】タイプ RkR″lSi(OR′)m (A) および/
またはタイプ [(R′O)nRoSi]pX (B) および/ま
たはタイプ Y−(RqR″rSiO)sRqR″rSi−Y
(C)のシリコン化合物(式中、RおよびR″は1〜18
個の炭素原子を有する飽和または不飽和のアルキル置換
基または芳香族置換基から選択され、R′は1〜5個の
炭素原子を有するアルキル残基またはアルカリ金属原子
であり、Xは2官能性またはそれ以上の多官能性のアル
キル若しくはアリール残基、またはヘテロ原子であり、
Yは−OH、−OR、またはSi(OR′)3であり、kお
よびlは0〜3の数であり(k+l<4)、mは2〜4の数で
あり(m=4−l−k)、nは1〜3の数であり、oは0〜2
の数であり(o=3−n)、pは2〜4の数であり、qおよび
rは0〜2の数であり(q+r=2)、sは1〜100の数で
ある。)を用いることを特徴とする請求項1または2に
記載の方法。 - 【請求項4】 R′がアルキルまたはナトリウムである
タイプAのシリコン化合物を用いることを特徴とする請
求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 R′がアルキルであり、Xがアルキレン
またはアリーレンであるタイプBのシリコン化合物を用
いることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項6】 タイプCのシリコン化合物をタイプAの
化合物と組合せて用いることを特徴とする請求項1〜3
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 R′がアルキルまたはナトリウムである
タイプAのシリコン化合物、特にRがC1〜C18の鎖長
を有するアルキル、アルケニル、またはアリールである
タイプAIのアルキルまたはアリールトリアルコキシシ
ランRSi(OR′)3を用いることを特徴とする請求項4
に記載の方法。 - 【請求項8】 R,R″がC1〜C18の鎖長を有するアル
キルであり、R′がアルキルまたはナトリウムである、
タイプAIIのシリコン化合物、ジアルキル−、アルキ
ルアリール−またはジアリールアルコキシシランR
kR″2-kSi(OR′)2を、タイプAIの成分と組合せて
用いることを特徴とする請求項4に記載の方法。 - 【請求項9】 R′がアルキルまたはナトリウムである
タイプAIIIのシリコン化合物、テトラアルコキシシ
ランSi(OR′)4を、タイプAI、AII、BまたはC
のシランと組合せて用い、1以上の有機置換基を有する
シリコン原子の割合が、用いたシリコンの全量を基準に
して少なくとも50原子%であることを特徴とする請求
項4に記載の方法。 - 【請求項10】 R′がアルキルであり、Xがアルキレ
ン、アリーレンまたはOであるタイプBのシリコン化合
物を、タイプAI、AII、Cおよび異なったXを有す
るBと組合せて用いることを特徴とする請求項5に記載
の方法。 - 【請求項11】 水酸化アンモニウム、アルカリ金属水
酸化物、アンモニア、フッ化アンモニウム、アルカリ金
属フッ化物およびこれらの組合せ等の塩基性化合物を触
媒として用いることを特徴とする請求項1または2に記
載の方法。 - 【請求項12】 アルブミン、ゼラチン、カゼイン酸ナ
トリウム等のタンパク質、またはポリビニルアルコー
ル、ソルビット、グリセロール、ポリエチレングリコー
ル等のポリヒドロキシ化合物、または不溶性有機ポリマ
ー、またはマグネタイト(Fe3O4)、セライト、オープ
ンポア焼結ガラス、若しくはケイ藻土等の無機化合物を
添加剤として用いることを特徴とする請求項1または2
に記載の方法。 - 【請求項13】 エステルの加水分解および/またはエ
ステル交換、並びにアルコールの酸または酸誘導体によ
るエステル化のための請求項1〜12のいずれかに記載
の方法により製造したリパーゼの使用。 - 【請求項14】 胆のう線維症により起こされる消化不
全の治療のための請求項1〜12のいずれかに記載のリ
パーゼの使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4408152A DE4408152A1 (de) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | Immobilisierte Lipasen in hydrophoben Sol-Gel-Materialien |
DE4408152-9 | 1994-03-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07274964A true JPH07274964A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=6512449
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7052392A Withdrawn JPH07274964A (ja) | 1994-03-11 | 1995-03-13 | ゾル−ゲル法による疎水性材料に固定化されたリパーゼ |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5817493A (ja) |
EP (1) | EP0676414B1 (ja) |
JP (1) | JPH07274964A (ja) |
AT (1) | ATE185816T1 (ja) |
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