CN114836409A - 生物分子的固定化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物固定化技术，公开了一种生物分子的固定化方法及其应用。该生物分子的固定化方法包括以下步骤：在反应溶剂存在的条件下，将生物分子、金属盐与成型剂进行接触；其中，所述生物分子为细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶，所述成型剂含有咪唑和/或咪唑衍生物。本发明还提供了该固定化方法得到的固定化生物分子，以及该固定化生物分子在生物检测器、食品生产和制备临床注射剂中的至少一者中的应用。该方法能够快速对生物分子进行固定化，提高生物分子的稳定性，高效保持生物分子的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物固定化技术，具体地，涉及一种生物分子的固定化方法及其应用。
背景技术
细胞色素c(Cytochrome c，Cyt c)是一种以铁卟啉为辅基的可溶性色素蛋白，是构成细胞呼吸链的主要成员之一，广泛存在于动物的需氧组织中，集中分布于动物心肌细胞质内的线粒体膜的外表面。细胞色素c在生物氧化过程中是一个非常重要的电子传递体，加速酶促作用的进行，对因组织缺氧而引起的疯瘫、肺气肿等病疗效甚佳，尤其在病情恶化抢救时，静脉注射本品均有较好的效果，起到调整细胞呼吸与物质代谢的作用。但是细胞色素c对环境较为敏感，稳定性较弱，极大地限制了其应用范围。
葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖消耗氧气，产生葡萄糖酸和过氧化氢，在食品行业中应用非常广泛。近几年迅速发展起来的持续葡萄糖监测***以其使用方便和实时监测等特点，受到越来越多的糖尿病患者的青睐。葡萄糖生物传感器作为持续葡萄糖监测***的核心部件，其性能直接决定了持续葡萄糖监测***的性能和使用寿命。现有的葡萄糖生物传感器多是通过电化学方法检测葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化过程中生成的过氧化氢来对葡萄糖进行间接监测。但目前葡萄糖氧化酶溶液易受许多恶劣环境的影响，活性降低、使用寿命较短，使得持续葡萄糖监测的成本较高。
因此，开发一种能够提高细胞色素c和葡萄糖氧化酶这类生物分子的使用稳定性的方法，对于它们的应用推广尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的生物分子的使用稳定性低的问题，提供一种生物分子的固定化方法及其应用，该方法能够快速对生物分子进行固定化，提高生物分子的稳定性，且高效保持生物分子的生物活性。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种生物分子的固定化方法，该方法包括以下步骤：在反应溶剂存在的条件下，将生物分子、金属盐与成型剂进行接触；其中，所述生物分子为细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶，所述成型剂含有咪唑和/或咪唑衍生物。
优选地，所述金属盐选自铁盐、亚铁盐、锌盐和铜盐中的至少一种，更优选为锌盐。
优选地，所述咪唑衍生物为2-甲基咪唑和/或2-咪唑甲醛。
优选地，相对于1mg的所述生物分子，所述金属盐的用量为2-100μmol，优选为2-85μmol；所述成型剂的用量为80-250μmol，优选为120-200μmol。
优选地，所述反应溶剂为水和/或低级有机醇，优选为水。
优选地，所述接触的条件包括：pH为8-12，温度为20-40℃，时间为5-15min。
优选地，所述接触过程中还加入助剂，所述助剂含有酪蛋白酸盐和/或聚乙烯吡咯烷酮。
优选地，相对于1mg的所述生物分子，所述助剂的用量为1-3mg。
优选地，该方法还包括：将所述接触得到的反应液进行固液分离、洗涤，得到固定化生物分子。
本发明第二方面提供前述的固定化方法得到的固定化生物分子。
本发明第三方面提供前述的固定化生物分子在生物检测器、食品生产和制备临床注射剂中的至少一者中的应用。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明提供的生物分子的固定化方法，适用于对细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶进行固定化，不仅有效保持细胞色素c和葡萄糖氧化酶的生物活性，还能够有效提高细胞色素c和葡萄糖氧化酶在使用过程中的稳定性，有利于降低其保存难度和成本，具有广阔的应用前景；此外，该固定化方法操作简单，能够快速对生物分子进行固定化，成本低，具有很好的经济效益。
本发明提供的生物分子的固定化方法，将酪蛋白酸盐作为成型剂的组分，能够进一步提升固定化生物分子的稳定性能。
附图说明
图1是测试例中Bradford法的BSA蛋白标准曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种生物分子的固定化方法，该方法包括以下步骤：在反应溶剂存在的条件下，将生物分子、金属盐与成型剂进行接触；其中，所述生物分子为细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶，所述成型剂含有咪唑和/或咪唑衍生物。
本发明的发明人在研究过程中，意外地发现，将生物活性分子(细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶)在金属盐和含有咪唑和/或咪唑衍生物的成型剂的联合作用下，能够形成稳定的固定化状态，提高生物分子的稳定性，同时还能够保持生物分子的活性水平，进而提高生物分子对环境变化的适应能力，有利于降低其保存难度和成本，具有广阔的应用前景，对于细胞色素c在临床注射剂中的应用以及葡萄糖氧化酶在生物传感器、食品生产中的应用，具有极大的促进与推广作用。此外，该固定化方法操作简单，能够快速对生物分子进行固定化，成本低，具有很好的经济效益。
根据本发明，优选地，所述金属盐选自铁盐、亚铁盐、锌盐和铜盐中的至少一种。其中，铁盐、亚铁盐、锌盐和铜盐可以是相应的无机盐，也可以是相应的有机盐，例如，铁盐可以是硝酸铁、硫酸铁、氯化铁和醋酸铁中的至少一种，亚铁盐可以是硝酸亚铁、硫酸亚铁、氯化亚铁和醋酸亚铁中的至少一种，锌盐可以是硝酸锌、硫酸锌、氯化锌和醋酸锌中的至少一种，铜盐可以是硝酸铜、硫酸铜、氯化铜和醋酸铜中的至少一种。更优选地，所述金属盐为锌盐。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够对生物分子形成更好的包裹负载作用，使得生物分子的固定化效果更优。
本发明中，所述成型剂可以是含有咪唑，也可以是含有咪唑衍生物，或者是含有咪唑和咪唑衍生物，优选情况下，所述成型剂含有咪唑衍生物。
根据本发明，所述咪唑衍生物可以是咪唑的任意一种衍生物。优选地，所述咪唑衍生物为2-甲基咪唑和/或2-咪唑甲醛。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够与金属盐形成更好的配合作用，实现对生物分子的固定效果。
根据本发明，优选地，相对于1mg的所述生物分子，所述金属盐的用量为2-100μmol，优选为2-85μmol；所述成型剂的用量为80-250μmol，优选为120-200μmol。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够提高接触反应的效果，进一步优化对生物分子的固定化效果。
根据本发明，优选地，所述反应溶剂为水和/或低级有机醇，优选为水。所述水采用去离子水，即，除去了呈离子形式杂质后的纯水。低级有机醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇或者异丙醇，以低级有机醇作为反应溶剂时，也可以是其与去离子水形成的混合液。本发明中，可以将金属盐和成型剂分别用反应溶剂配制成相应的溶液后，再与生物分子混合进行所述接触。示例性地，金属盐的溶液浓度可以为30-50mM，成型剂的溶液浓度可以为140-400mM。
根据本发明，所述接触的温度、pH、时间等参数能够满足生物分子、金属盐与成型剂反应形成相应的固定化生物分子即可。优选地，所述接触的条件包括：pH为8-12，具体可以为8、9、10、11、12，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；温度为20-40℃，具体可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；时间为5-15min，具体可以为5min、7min、9min、11min、13min、15min，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。本发明中接触时pH的控制可以利用酸碱调节剂对接触的反应体系进行pH调节，也可以利用酸碱调节剂对金属盐的溶液和/或成型剂的溶液进行pH调节。
根据本发明，优选地，所述接触过程中还加入助剂，所述助剂含有酪蛋白酸盐和/或聚乙烯吡咯烷酮。助剂的添加可以是加入金属盐的溶液中，也可以是加入成型剂的溶液中。进一步优选地，助剂含有酪蛋白酸盐和聚乙烯吡咯烷酮，此时，酪蛋白酸盐和聚乙烯吡咯烷酮的摩尔量比优选为1-2:1。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够优化对生物分子的固定化效果，进一步提高生物分子的稳定性。本发明中，酪蛋白酸盐可以为酪蛋白酸钙和/或酪蛋白酸钠。
根据本发明，优选地，相对于1mg的所述生物分子，所述助剂的用量为1-3mg。
根据本发明，优选地，该方法还包括：将所述接触得到的反应液进行固液分离、洗涤，得到固定化生物分子。所述固液分离可以采用常规的固液分离的方式，例如离心、过滤、静置分离等，优选为采用离心，具体地，离心的条件包括：转速为5000-8000rpm，时间为8-12min。
根据本发明一种特别优选的实施方式，生物分子的固定化方法包括以下步骤：将生物分子与锌盐-水溶液、成型剂-助剂-水溶液混合，在pH为8-12，温度为20-40℃的条件下进行接触5-15min得到反应液，将反应液在转速为5000-8000rpm条件下离心8-12min，得到沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤，得到固定化生物分子；其中，所述生物分子为细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶，所述成型剂含有酪蛋白酸盐和咪唑衍生物，助剂含有酪蛋白酸盐和/或聚乙烯吡咯烷酮；相对于1mg的所述生物分子，锌盐的用量为2-6μmol，成型剂的用量为120-160μmol，助剂的用量为1-3mg。
基于本发明上述提供的生物分子的固定化方法，本发明第二方面提供前述的固定化方法得到的固定化生物分子。
基于本发明上述提供的固定化生物分子，本发明第三方面提供前述的固定化生物分子在生物检测器、食品生产和制备临床注射剂中的应用。具体地，生物分子为葡萄糖氧化酶时，形成的固定化生物分子主要应用于生物检测器和食品生产；生物分子为细胞色素c时，形成的固定化生物分子主要应用于制备临床注射剂。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，葡萄糖氧化酶采购自索莱宝公司、型号为G8030，细胞色素c采购自上海源叶生物科技有限公司，型号为S12059-100mg，2-甲基咪唑采购自大连美仑公司、型号为MB0348，2-咪唑甲醛采购自上海韶远试剂有限公司、型号为SY014217，酪蛋白酸钙采购自上海卡尔玛试剂公司、型号为P33548-100g，酪蛋白酸钠采购自阿拉丁试剂公司、型号为是S304898，聚乙烯吡咯烷酮采购自索莱宝公司、型号为P8060，其余原料和试剂均为常规的市售品。
以下实施例中，生物分子的浓度采用标准的考马斯亮蓝法(Bradford法)测得；无特征说明的情况下，室温为25±5℃。
实施例1
将5mg细胞色素c添加至4.5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液中(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1mg/mL，pH＝10.3)，再与0.5mL含有醋酸锌的去离子水溶液(醋酸锌浓度为40mM)混合，在pH为10、室温条件下放置接触10min得到反应液，将反应液在转速为6000rpm条件下离心10min，收集沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤2次，得到固定化细胞色素c。
实施例2
将5mg细胞色素c添加至2.5mL含有2-咪唑甲醛、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液中(2-甲基咪唑浓度为400mM，酪蛋白酸钠浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.9mg/mL)，再与2.5mL含有74.26mg醋酸锌的去离子水溶液混合，在pH为8、室温条件下放置接触5min得到反应液，将反应液在转速为5000rpm条件下离心12min，收集沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤2次，得到固定化细胞色素c。
实施例3
将5mg葡萄糖氧化酶添加至5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液中(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.5mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1.5mg/mL)，再与0.75mL含有醋酸锌的去离子水溶液(醋酸锌浓度为40mM)混合，在pH为12、室温条件下放置接触15min得到反应液，将反应液在转速为8000rpm条件下离心8min，收集沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤2次，得到固定化葡萄糖氧化酶。
实施例4
将5mg细胞色素c添加至2.5mL含有2-咪唑甲醛、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液中(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钙浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1mg/mL)，再与0.25mL含有醋酸锌的去离子水溶液(醋酸锌浓度为40mM)混合，在pH为10、室温条件下放置接触10min得到反应液，将反应液在转速为6000rpm条件下离心10min，收集沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤2次，得到固定化细胞色素c。
实施例5
将5mg葡萄糖氧化酶添加至3mL含有2-甲醛咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液中(2-甲醛咪唑浓度为400mM，酪蛋白酸钠浓度为1.5mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1.5mg/mL)，再与12.5mL含有硝酸锌的去离子水溶液(硝酸锌浓度为40mM)混合，在pH为12、室温条件下放置接触15min得到反应液，将反应液在转速为8000rpm条件下离心8min，收集沉淀产物，将沉淀产物用去离子水洗涤2次，得到固定化葡萄糖氧化酶。
实施例6
按照实施例3的方法制备固定化葡萄糖氧化酶，不同的是，将5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.5mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1.5mg/mL)替换为5mL含有2-甲基咪唑和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM，聚乙烯吡咯烷酮浓度为2mg/mL)。
实施例7
按照实施例1的方法制备固定化细胞色素c，不同的是，将4.5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1mg/mL，pH＝10.3)替换为4.5mL含有2-甲基咪唑的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM)。
实施例8
按照实施例3的方法制备固定化葡萄糖氧化酶，不同的是，将5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.5mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1.5mg/mL)替换为5mL含有2-甲基咪唑的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM)。
实施例9
按照实施例1的方法制备固定化细胞色素c，不同的是，将4.5mL含有2-甲基咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(2-甲基咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1mg/mL，pH＝10.3)替换为4.5mL含有咪唑、酪蛋白酸钠和聚乙烯吡咯烷酮的去离子水溶液(咪唑浓度为160mM，酪蛋白酸钠浓度为1.2mg/mL，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1mg/mL)。
实施例10
按照实施例1的方法制备固定化细胞色素c，不同的是，将pH为8、室温条件下放置接触5min得到反应液替换为pH为6.5、室温条件下放置接触5min得到反应液。
实施例11
按照实施例1的方法制备固定化细胞色素c，不同的是，将pH为8、室温条件下放置接触5min得到反应液替换为pH为8、室温条件下放置接触2h得到反应液。
测试例
采用Bradford法对实施例1-实施例11中初始生物分子的含量、反应液离心得到的上清液中生物分子的含量、沉淀产物的清洗液中生物分子的含量进行检测，计算生物分子(细胞色素c或者葡萄糖氧化酶)的负载量，结果见表1，其中Bradford法的BSA蛋白标准曲线如图1所示。
生物分子的负载量(g/g)＝(初始生物分子的含量-反应后上清液中生物分子的含量-清洗液中生物分子的含量)/固定化生物分子的质量。
将实施例1-实施例11制得的固定化细胞色素c或者固定化葡萄糖氧化酶，以游离的细胞色素c或者葡萄糖氧化酶作为对照，分别在100℃条件下和有机溶剂丙酮存在的条件下处理30min，然后测定细胞色素c或者葡萄糖氧化酶的生物活性，并计算固定化细胞色素c或者固定化葡萄糖氧化酶的生物活性残留率(相对于游离的细胞色素c或者葡萄糖氧化酶在室温下的初始生物活性)，结果见表1。
通过表1的结果可以看出，实施例1-实施例11采用本发明的固定化方法对生物分子(细胞色素c或者葡萄糖氧化酶)进行固定化处理，能够实现对生物分子的快速包裹效果，具有较高的负载量，且不需要考虑蛋白分子尺寸大小，且包裹固定化的生物分子在高温、有机溶剂等环境因素变化的条件下，仍能维持较高的生物活性，因此，固定化的生物分子的活性稳定性明显优于游离的生物分子。
表1
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物分子的固定化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：在反应溶剂存在的条件下，将生物分子、金属盐与成型剂进行接触；
其中，所述生物分子为细胞色素c和/或葡萄糖氧化酶，所述成型剂含有咪唑和/或咪唑衍生物。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述金属盐选自铁盐、亚铁盐、锌盐和铜盐中的至少一种，优选为锌盐。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述咪唑衍生物为2-甲基咪唑和/或2-咪唑甲醛。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的固定化方法，其特征在于，相对于1mg的所述生物分子，所述金属盐的用量为2-100μmol，优选为2-85μmol；所述成型剂的用量为80-250μmol，优选为120-200μmol。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的固定化方法，其特征在于，所述反应溶剂为水和/或低级有机醇，优选为水。
6.根据权利要求1至3中任意一项所述的固定化方法，其特征在于，所述接触的条件包括：pH为8-12，温度为20-40℃，时间为5-15min。
7.根据权利要求1至3中任意一项所述的固定化方法，其特征在于，所述接触过程中还加入助剂，所述助剂含有酪蛋白酸盐和/或聚乙烯吡咯烷酮；
优选地，相对于1mg的所述生物分子，所述助剂的用量为1-3mg。
8.根据权利要求1至3中任意一项所述的固定化方法，其特征在于，该方法还包括：将所述接触得到的反应液进行固液分离、洗涤，得到固定化生物分子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的固定化方法得到的固定化生物分子。
10.权利要求9所述的固定化生物分子在生物检测器、食品生产和制备临床注射剂中的至少一者中的应用。
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