DE69512817T2 - In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen - Google Patents
In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben SubstanzenInfo
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Description
- Gegenstand der Erfindung sind Enzymimmobilisate, welche durch Aufbau einer hydrophoben Matrix auf Siliciumoxidbasis nach dem Sol-Gel-Verfahren in Gegenwart von Lipasen hergestellt wurden, das Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Anwendung.
- Der Einsatz von Lipasen für technische Anwendungen findet zunehmendes Interesse u. a. für die Hydrolyse oder Synthese von Estern sowie Umesterungsreaktionen unter milden Bedingungen, wobei überwiegend hydrophobe Substrate eingesetzt werden (K. D. Mukherjee, Biocatalysis 1990, 3, 277-293; T. Nielsen, Fette, Seifen, Anstrichmittel 1985, 87, 15-19). Wegen der oft breiten Substratspezifität werden Lipasen nicht nur in der Fettchemie, sondern auch zunehmend für stereoselektive Reaktionen in der organischen Synthese verwendet. Lipasen haben auch Anwendungen in der Therapeutik gefunden. Sie werden für die Behandlung von Verdauungsinsuffizienzen verwendet, die durch Pancreaskrankheiten oder Zystofibrose verursacht werden. Ein wichtiger Faktor für die Wirtschaftlichkeit eines enzymatischen Prozesses ist eine geeignete Methode zur Immobilisierung des Biokatalysators, um die leichte Rückgewinnung und mehrfache Verwendbarkeit des Enzyms zu ermöglichen sowie wenn möglich eine Erhöhung seiner Stabilität unter den Reaktionsbedingungen zu erreichen. Der Stand der Technik auf diesem Gebiet der Enzymtechnologie ist in der Übersichtsliteratur bereits mehrfach zusammengefaßt worden, z. B. für Lipasen (F. X. Malcata, H. R. Reyes, H. S. Garcia, C. G. Hill, Jr. und C. H. Amundson in J. Am. Oil Chem. Soc. 1990, 67, 890- 910). In manchen Fällen führt die Immobilisierung durch Einschluß der Lipase in eine feste Matrix, verglichen mit anderen Methoden, zu einer verbesserten Aktivitätsausbeute und Stabilität, ist jedoch meist aufwendiger in der Durchführung.
- Die Herstellung von SiO&sub2;-Gelen nach dem Sol-Gel-Verfahren (C. J. Brinker, G. W. Scherer, Sol-Gel-Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel-Processing, Academic Press, San Diego 1990; L. L. Hench, J. K. West, Chem. Rev. 1990, 90, 33-72) durch Hydrolyse von Tetraalkoxysilanen wie Tetramethoxysilan oder Tetraethoxysilan läßt sich zum Einschluß von Biomolekülen in die anorganische Matrix verwenden. Zur Immobilisierung von Lipasen ist dieses Verfahren jedoch nicht geeignet, weil es nur sehr unbefriedigende Aktivitätsausbeuten liefert.
- Überraschenderweise zeigt sich, daß der Einschluß von Lipasen in siliciumhaltigen Matrices, welche durch Hydrolyse von Alkoxysiliciumverbindungen mit organischen Substituenten am Silicium in Gegenwart von geeigneten Katalysatoren sowie weiteren, im folgenden beschriebenen Zusätzen erhalten werden, zu Materialien mit ungewöhnlich hohen katalytischen Aktivitäten führt. Dabei werden durch die Immobilisierung nach unserer Methode für Reaktionen in organischen Medien unerwartete Steigerungen der Aktivität um bis zu zwei Größenordnungen im Vergleich zu der eingesetzten kommerziellen Enzympräparation beobachtet, sowie eine um mehr als zwei Größenordnungen erhöhte Aktivität im Vergleich zu Immobilisaten, die nach den o. g. konventionellen Sol-Gel-Verfahren (unter Verwendung von Tetraalkoxysilanen allein) hergestellt wurden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immobilisierten Lipasen zeigen eine ausgezeichnete Stabilität einschließlich einer erhöhten Temperaturstabilität und sind breit anwendbar für Reaktionen sowohl in wäßrigen als auch in organischen Medien. Durch Variation der Immobilisierungsparameter lassen sich die Eigenschaften der Matrix und der erhaltenen Immobilisate steuern, was einen breiten Spielraum zur Optimierung für eine gegebene technische Anwendung ermöglicht.
- Gegenstand der Erfindung sind Lipasen, welche in einer organische Substituenten enthaltenden Siliciumoxid-Matrix immobilisiert wurden, sowie das Verfahren zur Herstellung der derart immobilisierten Lipasen durch Hydrolyse von Siliciumverbindungen des Typs
- RkR"&sub1;Si(OR')m (A) und/oder [(R'O)nRoSi]pX (B)
- und/oder des Typs Y-(RqR"rSiO)SRqR"rSi-Y (C)
- in Gegenwart einer wässrigen Lösung der Lipase, eventuell weiterer Lösungsmittel, eines (oder mehrerer) geeigneten Katalysators, eines oder mehrerer Additive mit positivem Einfluß auf Aktivität, Stabilität, mechanische oder magnetische Eigenschaften des erhaltenen immobilisierten Biokatalysators, wobei R und R" ein gesättigter oder ungesättigter Alkylsubstituent mit 1 bis 18 C-Atomen oder ein aromatischer Substituent, R' ein Alkylrest mit 1-5 C-Atomen oder ein Alkalimetallatom, X ein bi- oder höherfunktioneller Alkyl- oder Arylrest, und Y -OH, -OR oder -Si(OR')&sub3; ist, k und l Zahlen von 0 bis 3 (mit 0 < k + l < 4), m eine Zahl von 2 bis 4 (mit m = 4 - l - k), n eine Zahl von 1 bis 3, o eine Zahl von 0 bis 2 (mit o = 3 - n), p eine Zahl von 2 bis 4, r eine Zahl von 2 bis 4, q und r Zahlen von 0 bis 2 mit q + r = 2 und s eine Zahl von 1 bis 100 sind.
- Vorzugsweise eingesetzte Siliciumkomponenten des Typs A, mit R' = Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl) oder Natrium, sind:
- - AI: Alkyl- oder Aryltrialkoxysilane RSi(OR')&sub3; mit R = Alkyl mit einer Kettenlänge von C1 bis C18, Alkenyl, z. B. Vinyl, oder Aryl, z. B. Phenyl,
- - AII: Dialkyl-, Alkylaryl- oder Diarylalkoxysilane RkR"2-kSi(OR') 2 mit R, R" = Alkyl mit einer Kettenlänge von C1 bis C18, z. B. Methyl, wobei Verbindungen des Typs All (mit nur zwei zur Vernetzung geeigneten Gruppen) in Kombination mit Komponenten des Typs AI oder AIII, z. B. in einem Molverhältnis (AI, AIII): AII von 3-6, eingesetzt werden können,
- - AIII: Tetraalkoxysilane Si(OR')&sub4; in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C, wobei der Anteil der Siliciumatome mit einem oder mehreren organischen Substituenten mindestens 50 Atom- %, bezogen auf die eingesetzte Gesamtmenge an Silicium, beträgt.
- Siliciumkomponenten des Typs B, mit R' = Alkyl, z. B. Methyl oder Ethyl, sind Bis(trialkoxysilyl)verbindungen der Formel (R'O)&sub3;Si- X-Si(OR')&sub3; mit X = Alkylen, z. B. (CH&sub2;)&sub2;&submin;&sub6;, Arylen (Verwendung wie bei AIII in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C).
- Siliciumkomponenten des Typs C werden in Kombination mit Verbindungen des Typs A, insbesondere AI und AIII, eingesetzt und sind oligomere oder polymere Dialkylsiloxane, insbesondere Polydimethylsiloxan, z. B. mit Silanolendgruppen und einer Kettenlänge von 5-60 monomeren Einheiten. Das Molverhältnis A : C der Komponenten beträgt dabei z. B. 3-6.
- Die verwendeten Siliciumverbindungen des Typs A und/oder B können mit einem Teil des Wassers unter Zusatz von Säure oder einem der o. g. basischen Katalysatoren, z. B. unter Einwirkung von Ultraschall, vorbehandelt werden. Die Silane können auch ohne Vorbehandlung direkt zur Enzymimmobilisierung eingesetzt werden.
- Das in dieser Erfindung vorgestellte Verfahren ist breit anwendbar auf eine Reihe von Lipasen unterschiedlichster Herkunft. Die immobilisierten Lipasen können mikrobiellen Ursprungs sein, z. B. SP 523 Lipase (Novo), oder gewonnen aus Bakterien z. B. der Gattung Pseudomonas (z. B. Ps. fluorescens, Ps. cepacia), aus Hefen der Gattung Candida (z. B. C. antarctica, C. lipolytica), aus Schimmelpilzen der Gattungen Rhizopus (z. B. Rh. arrhizus, Rh. delemar, Rh. niveus), Penicillium (z. B. P. roqueforti), Aspergill us (z. B. A. niger), Mucor (z. B. M. miehei), pflanzlichen Ursprungs (z. B. aus Weizenkeim), sowie tierischen Ursprungs, z. B. aus Schweinepankreas. Eingesetzt werden 0.1-30 mg Lipase/mmol Siliciumverbindung(en). Bestimmungen des Proteingehaltes in Immobilisaten ohne zugesetztes Fremdprotein ergeben einen Immobilisierungsgrad von 10 bis > 95%, und die entsprechenden Beladungen betragen 0.2-80 mg immobilisiertes Lipaseprotein pro g resultierendes Enzymimmobilisat.
- Als Katalysator werden verwendet: basische Verbindungen, z. B. Ammonium-und Alkalimetallhydroxide, vorzugsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in einer Stöchiometrie von 10-100 mmol/mol Siliciumverbindung(en); Ammoniak in einer Stöchiometrie von 1-10 mmol/mol Siliciumverbindung(en); Ammonium- und Alkalimetallfluoride, vorzugsweise Natriumfluorid oder Kaliumfluorid in einer Stöchiometrie von 0.1-100, vorzugsweise 1-10 mmol/mol Siliciumverbindung(en); sowie Kombinationen dieser Verbindungen.
- Als Additive werden eingesetzt: (I) Proteine (0-200 mg Protein/mg Lipase), z. B. Albumin, Gelatine, Natriumcaseinat; (II) Polyhydroxyverbindungen (0-1000 mg Additiv/mg Lipase), z. B. Polyvinylalkohol (z. B. 0.05-200 mg/mg Lipase), Sorbitol, Glycerin, Polyethylenglycol (z. B. 0.5-1000 mg/mg Lipase); (III) unlösliche organische Polymere oder anorganische Verbindungen, z. B. Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;), Materialien auf SiO&sub2;-Basis, z. B. Celite®, offenporige Sintergläser wie z. B. Siran®, Controlled Porous Glass (CPG) oder Kieselgur; sowie Kombinationen dieser Verbindungen I-III. Art und Menge der zugesetzten Additive beeinflussen die erhaltene Aktivität der immobilisierten Lipase. Durch Zusatz geeigneter Additive lassen sich im Vergleich zu analogen Systemen ohne Additiv deutliche Steigerungen der Aktivitätsausbeute erzielen.
- Wasser wird in Form von wäßrigen ungepufferten oder durch Zusatz geeigneter Puffersubstanzen gepufferter Lösungen der Lipase, der Additive, des Katalysators oder durch direkten Zusatz in das Reaktionsmedium eingebracht, in einer Stöchiometrie von 4-15, vorzugsweise 8-12, mol Wasser pro mol Siliciumverbindung(en). Als Puffermedien sind z. B. Natrium- oder Kaliumphosphatpuffer mit pH- Werten von 6-10 geeignet. Zum Reaktionsgemisch können organische Lösungsmittel wie z. B. aliphatische Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol, Propanol), THF, DMF, in geringen Mengen bis 20 Vol.-% zugesetzt werden, oder auf die Zugabe organischer Lösungsmittel kann ganz verzichtet werden.
- Eine bevorzugte Methode zur Immobilisierung von Lipasen besteht z. B. in der Zugabe einer gepufferten oder ungepufferten wäßrigen Lösung des Enzyms bei Temperaturen von 0ºC-50ºC, vorzugsweise bei 4ºC bis Raumtemperatur, zu einem Gemisch aus Wasser oder wäßrigem Puffer, einer wäßrigen Lösung der o. g. Additive I und/oder II und einer wäßrigen Lösung des Katalysators, Mischen durch Schwenken oder Schütteln, Zugabe der Siliciumverbindungen (mit R' = Alkyl), wobei bei Verwendung von Komponenten mit stark unterschiedlicher Reaktionsgeschwindigkeit, wie z. B. Mischungen von Verbindungen des Typs AI und AIII, die weniger reaktiven Komponenten zuerst hinzugefügt werden, Mischen bis zur Bildung einer homogenen Phase und Schwenken oder Schütteln bis zur Gelierung des Reaktionsgemisches. Bei Auftreten einer stärkeren Wärmeentwicklung beim Gelieren wird beim und unmittelbar nach dem Gelieren bei 0ºC gekühlt. Die vollständig oder teilweise erstarrte Reaktionsmischung wird verschlossen stehengelassen, eventuell überstehende Flüssigkeit entfernt und die Produkte getrocknet. Die erhaltenen Produkte sind i. A. farblos und je nach den verwendeten Siliciumkomponenten spröde bis elastisch, harte glasartige Blöcke bis feine Pulver. Die erhaltenen Produkte können zerkleinert und in dieser Form insbesondere für Reaktionen in nichtwäßrigem Medium eingesetzt werden. Zur Verminderung der Gefahr unerwünschter Nebenreaktionen oder einer Kontaminierung durch überschüssigen Katalysator und Additive sowie zur Entfernung nur locker adsorbierter, nicht eingeschlossener Lipase, welche bei der Reaktion leichter ausgewaschen oder desaktiviert wird und damit zur Verminderung der Aktivität im Laufe des Katalysatoreinsatzes führt, wird allerdings ein Waschen des Enzymimmobilisates bevorzugt. Dazu werden die Immobilisate zerkleinert, mit Wasser oder wäßrigem Puffer (pH 6-8) geschüttelt, abfiltriert und mit Wasser sowie organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton gefolgt von Pentan, nachgewaschen, getrocknet und abschließend gemahlen.
- Die erhaltenen Materialien sind meist weiße Pulver mit spezifischen Oberflächen (BET-Methode) von ca. 0.1-700 m²/g und einem Porenvolumen von ca. 0.001-1 cm³/g.
- In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die zur Kondensation unter Gelbildung befähigten Si-OH-Gruppen nicht durch Hydrolyse von Si-O-Alkyl-Gruppen, sondern durch Protonierung von Si-O-Metallgruppen erzeugt. Dazu wird der pH-Wert einer wäßrigen Lösung eines Alkylsiliconates, z. B. Natriummethylsilico nat MeSi(ONa)&sub3;, durch Zugabe von Säuren, z. B. Salzsäure oder Essigsäure, auf pH 6-10 eingestellt, und die Lösung wird zu einem Gemisch aus Enzymlösung und weiteren o. g. Komponenten zugefügt. Zusätzlich können auch weitere Siliciumverbindungen der o. g. Typen A, B und/oder C mit R' = Alkyl zur Cokondensation in Kombination mit der in dieser Variante verwendeten Siliconatlösung eingesetzt werden.
- In einer weiteren Variante wird die nach den o. g. Verfahren hergestellte Reaktionsmischung vor dem Gelieren in einen Überschuß von Wasser gegossen und unter starkem Rühren suspendiert. Nach dieser Methode erhält man das Enzymimmobilisat in Form annähernd sphärischer Partikel.
- In einer weiteren Variante werden in das aus Silanen zusammen mit Enzymlösung und den weiteren o. g. Komponenten hergestellte Immobilisat als Additive des Typs III organische Polymere oder anorganische Materialien inkorporiert, beispielsweise Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) oder oxidische Materialien auf SiO&sub2;-Basis, z. B. Celite®, offenporige Sintergläser wie z. B. Siran, Controlled Porous Glass (CPG) oder Kieselgur. Dazu wird das Material entweder vor der Zugabe der Silane zum Reaktionsgemisch zugefügt oder aber nach Zugabe der Silane, aber jedenfalls vor Beginn der Gelierung zugegeben. Für das Aufbringen des Enzymimmobilisates auf große, offenporige Partikel wird das Reaktionsgemisch vor Beginn der Gelierung auf den Träger aufgebracht. Die Verwendung derartiger oxidischer Zusätze führt zu positiven Eigenschaften des Immobilisates, z. B. bezüglich der leichteren Abtrennung des immobilisierten Katalysators durch Einführung von magnetischen Eigenschaften im Falle von Magnetit bzw. für den Einsatz im kontinuierlichen Durchflußbetrieb durch die Erzeugung eines grobkörnigen Materials im Falle von porösen SiO&sub2;-Trägern wie Siran®, Die katalytische Aktivität des Immobilisates im Vergleich zu analogem Material ohne zugesetztes anorganisches Material zeigt i. A. keine Beeinträchtigung, oder die Aktivität wird sogar positiv beeinflußt.
- Die nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren erhaltenen Enzymimmobilisate weisen eine hohe Aktivität bei Veresterungs- und Umesterungsreaktionen in organischem Medium auf. Sie sind i. A. um einen Faktor von 2 bis > 120 aktiver als die gleiche Menge der zur Immobilisierung eingesetzten kommerziellen Enzympräparate. Für Reaktionen in wäßrigem Medium, wie z. B. die Hydrolyse von Olivenölemulsionen, werden beispielsweise für Ps.- cepacia-Lipase Aktivitätsausbeuten bis 62%, bezogen auf die zur Immobilisierung eingesetzte Lipasemenge, erhalten.
- Das Enzymimmobilisat zeigt hohe Stabilität in Wasser, organischem Medium oder bei der Lagerung in trockenem Zustand auch bei erhöhten Temperaturen. So wird bei dreimonatiger Lagerung beispielsweise einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten Ps.-cepacia-Lipase bei Raumtemperatur praktisch kein Aktivitätsverlust (d. h. weniger als 5%) beobachtet.
- Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der Überstand wird zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml- Polypropylengefäß werden 0.58 ml Wasser, 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0,46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit 0.857 ml Methyltrimethoxysilan (6 mmol, mit mol Silan pro mol Wasser (gesamt) = 1 : 10) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s gründlich gemischt. Nach ca. 30 s geht die trübe Emulsion unter Wärmeentwicklung in eine klare homogene Lösung über, die bei 0ºC gekühlt wird, bis nach kurzer Zeit die gesamte Reaktionsmischung zu einem homogenen milchig-trüben Festkörper erstarrt. Dieser wird 24 h bei Raumtemperatur verschlossen stehengelassen, 3 d bei 30ºC unter Normaldruck getrocknet und schließlich gemörsert. Das Rohprodukt wird mit 10 ml Wasser 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt (350 U/min), über eine Glasfritte (D4) abfiltriert und mit 20 ml Wasser, gefolgt von zweimal 20 ml Aceton sowie 20 ml Pentan, gewaschen. Das Immobilisat wird 24 h bei 30ºC getrocknet und dann in einer Kugelmühle gemahlen.
- Auswaage: 0.38 g,
- mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.2 Aktivitätsfaktor [(Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der freien Lipase: 0.55% Umsatz/h~mg kommerzielle Lipase)]: 6.3 (Test 1)
- Ps.-cepacia -Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der überstand wird zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml-Polypropylengefäß werden Wasser (so daß ein Verhältnis von mol Wasser (gesamt)/mol Silan(e) von 8 : 1 erhalten wird), 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (4% w/v, MG 15000, Fluka), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5,0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit der in der Tabelle angegebenen Menge der Siliciumverbindungen I und II versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s gründlich gemischt und anschließend bei 1200 U/min und Raumtemperatur geschüttelt. Nach ca. 30 s - 3 h setzt, i. A. unter Wärmeentwicklung, der Geliervorgang ein. Es wird bei 0ºC gekühlt, bis nach kurzer Zeit die Reaktionsmischung teilweise oder vollständig zu einem milchig-trüben Festkörper erstarrt, der wie in Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt wird.
- [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat; [b] Aktivitätstest 1 (s. unten), (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der freien Lipase); [c] Test 2 (s. unten); [d] (Menge an immobilisiertem Protein = eingesetzte Proteinmenge - Proteinmenge in den Waschflüssigkeiten)/(Menge an zur Immobilisierung "eingesetztem Protein), BCA-Protein-Assay, Fa. Pierce, BSA- Standard; [e] M. G. 400-700; [f] M. G. 4200; n. b. = nicht bestimmt.
- Abkürzungen: MTMS: Methyltrimethoxysilan (Fluka), ETMS: Ethyltrimethoxysilan (ABCR), VTMS: Vinyltrimethoxysilan (Fluka), PDMS: Polydimethylsiloxan m. Silanolendgruppen (ABCR), DMDES: Dimethyldiethoxysilan (Fluka), BTMSE: Bis(trimethoxysilyl)ethan (ABCR)
- Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel der Immobilisate 2a und 2g:
- - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung bei Raumtemperatur: > 95%
- - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 31% (2a), 18% (2g)
- - Restaktivität nach 30 Reaktionscyclen zu je 22 h bei 30ºC (batch-Verfahren, Veresterung von Laurinsäure mit 1- Octanol in 2,2,4-Trimethylpentan, siehe Aktivitätstest I, mit Waschen des Immobilisates nach jedem Cyclus): > 80% (2a, 2g)
- - Restaktivität nach Lagerung in 1-Octanol, 28d bei 70ºC: 65% (2g)
- Wie in Beispiel 2, nur daß die zweite Siliciumverbindung (II) in allen Fällen Tetramethoxysilan (TMOS) ist.
- In allen Fällen werden Wasser (so daß das in der Tabelle angegebene Verhältnis R = mol Wasser (gesamt)/mol Silan(e) erhalten wird), 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.4 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit der in der Tabelle angegebenen Menge der Siliciumverbindungen I und II (TMOS) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s (oder bei Mischungen, die schneller gelieren, bis zur Gelierung) intensiv gemischt und anschließend bei 1200 U/min und Raumtemperatur geschüttelt. Nach ca. 2 s bis 3 h setzt, i. A. unter Wärmeentwicklung, der Geliervorgang ein, und das Gemisch wird auf 0ºC gekühlt. Die weitere Behandlung des Immobilisats erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
- [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat, [b] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase), [c] Test 2, [d] (Menge an immobilisiertem Protein)/ (Menge an zur Immobilisierung eingesetztem Protein), [e] M. G. 400-700
- Abkürzungen: MTMS: Methyltrimethoxysilan (Fluka), ETMS: Ethyltrimethoxysilan (ABCR), PTMS: Propyltrimethoxysilan (Aldrich), OTMS: Octyltrimethoxysilan (ABCR), ODTMS: Octadecyltrimethoxysilan (ABCR), PhTMS: Phenyltrimethoxysilan (Fluka), VTMS: Vinyltrimethoxysilan (Fluka), PDMS: Polydimethylsiloxan m. Silanolendgruppen (ABCR), BTMSH: Bis(trimethoxysilyl)hexan (ABCR)
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 3 wird verwendet, außer daß Tetraethoxysilan (TEOS) anstelle von Tetramethoxysilan (TMOS) verwendet wird. Das Produkt wird getrocknet und gewaschen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat, [b] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase), [c] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem Protein)
- Durchführung wie in Beispiel 2a, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden. Gelierzeit: 0,5 min
- [a] Bezugsquelle: Fluka (a, b, c, d, e, f, h), Novo (i); [b] Spezifikation des Herstellers (k. A. = keine Angabe); [c] zur Immobilisierung eingesetzte kommerzielle Lipase; [d] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [e] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [f] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein); [g] rekombinantes Enzym unbekannten mikrobiellen Ursprungs, Anfangsgeschwindigkeit (% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase), Aktivitätstest 1
- Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel des Immobilisates 4d:
- - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 70%
- Durchführung wie in Beispiel 2e, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden. Gelierzeit: 1-5 min
- [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein)
- Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel des Immobilisats 5d:
- - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 92%
- Durchführung wie in Beispiel 3c, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden.
- [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein); [f] Fluka, 3.3 U/mg Protein, 0.83% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase, Aktivitätstest 1; [g] Fluka, 50 U/mg Protein, 0.16% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase, Aktivitätstest 1
- Verfahren wie in Beispiel 2a, nur daß anstelle von 0.1 ml einer 1 M NaF-Lösung die unten angegebenen Katalysatoren und Wassermengen (bei konstantem Wert von R = 8) verwendet wurden. Die Gelierzeit betrug 0.5-1 min (8a), 24 h (8b, 8c), 48 h (8d).
- Auswaagen 0.34-0.42 g
- mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.1-1.3
- wie Beispiel 2a, nur daß unterschiedliche Additive und Wassermengen (bei konstantem Verhältnis R von Wasser : Silan = 8 : 1) wie in der Tabelle angegeben verwendet wurden.
- Auswaagen 0.38-0.4 g
- mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.1-1.2
- Lipase SP 523 (Novo) wird in dest. Wasser suspendiert (50 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert und der Überstand zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2- ml-Polypropylengefäß (Eppendorf) werden 42 ul Wasser, 0.1 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 14 ul 1 M NaF-Lösung sowie 0.1 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 2.06 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller SP-523-Lipase) gemischt und mit 0.217 ml PDMS (0.4 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie 0.221 ml Tetramethoxysilan (1.5 mmol, Fluka) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 2 s gründlich gemischt, mit 1.2 g Siran (Schott, 16 h bei 60ºC vorbehandelt mit 1 N HCl, mit Wasser gewaschen, eingesetzt mit einem Wassergehalt von 30%) versetzt, bis zum Gelieren ca. 5 s auf dem Vortex-Schüttler gemischt und bei 0ºC 2 min gekühlt. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen, die mit dem Immobilisat imprägnierten Siranpartikel werden jedoch nicht zerkleinert.
- Auswaage: 0.94 g
- Beladung (SP-523-Lipase, mg eingesetztes gelöstes Protein/g Immobilisat): 2.2
- Aktivitätausbeute [Test 1]: 112
- [Aktivität (Gel mit Siran)]/[Aktivität (gleiche Menge Bulk-Gel ohne Siran)]: 1.9
- % immobilisiertes Protein (aus Proteinbestimmung der Waschflüssigkeiten): 98
- Ps.-cepacia-Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert und der Überstand zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml-Polypropylengefäß (Eppendorf) werden 0.2 ml wäßrige Gelatinelösung (4% w/v, ICN), 0.1 ml 1 M NaF-Lösung sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit 0.5 g Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;, frisch hergestellt nach Kobayashi et al., J. Coll. Interface Bei. 1991, 141, 505, Wassergehalt 70%) versetzt. Das Gemisch wird auf einem Vortex- Schüttler 2 s gründlich gemischt. Es werden 0.857 ml (6 mmol) MTMS zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird auf einem Vortex-Schüttler bis zur Gelierung nach 0.5-1 min gründlich gemischt und anschließend 1 min bei 0ºC gekühlt. Die weitere Behandlung des Gels erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, nur daß anstelle von Filtrationsvorgängen Dekantierungen unter Zuhilfenahme eines Permanentmagneten vorgenommen wurden.
- Auswaage: 0.47 g
- mg eingesetzte gelöste Lipase/g Immobilisat: 1.0
- Aktivitätfaktor [Test 1]: 2.2
- Die in der Tabelle angebene Menge an kommerzieller Lipase wird in 1 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, suspendiert, 15 min geschüttelt und durch Zentrifugation von festen Rückständen befreit. Unmittelbar vor der Immobilisierung werden 4 ml Natriummethylsiliconat-Lösung (30% in Wasser, 7.5 mmol, ABCR) unter starkem Rühren mit 0.65 ml konz. HCl versetzt, so daß ein pH-Wert von 8.0-8.5 resultiert. Zu einer Mischung aus 0.25 ml Enzymlösung, 0.25 ml Albuminlösung (50 mg/ml Rinderserumalbumin, Sigma), 0.1 ml 1 M Natriumfluorid und 0.5 ml 1M Na-Phosphatpuffer pH 7.0 werden 0.5 ml Polydimethylsiloxan (0.9 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie anschließend 0.5 ml der Natriumsiliconatlösung (entprechend 0.8 mmol) zugegeben, und das Gemisch wird auf einem Vortexschüttler bis zur Gelierung, ca. 1-2 s, gründlich durchmischt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
- [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5, Ps.- fluorescens-Lipase: Fluka, 31.5 U/mg Protein; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein), [f] % Umsatz/h (Anfangsgeschwindigkeit) für die kommerzielle Lipase
- 50 mg SP-523-Lipase (Novo) werden in 1 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, suspendiert, 15 min geschüttelt und durch Zentrifugation von festen Rückständen befreit. Es werden 0.1 ml Enzymlösung (entsprechend 5 mg kommerzieller Lipase, 3.8 mg gelöstem Protein), 0.2 ml 1 M Na-Phosphatpuffer pH 7.0, 0.1 ml Polyvinylalkohol (M. G. 15000, 4% in Wasser) und 0.04 ml 1 M Natriumfluoridlösung gemischt, mit 0.2 ml Polydimethylsiloxan (0.36 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie anschließend mit 0.2 ml Natriummethylsiliconat-Lösung (30% in Wasser, 0.38 mmol, ABCR) und 0.03 ml konz. Salzsäure versetzt, das Gemisch wird ca. 1 s gemischt (Vortexschüttler) und mit 1 g Siran® (Schott) gründlich gemischt. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen, die mit dem Immobilisat imprägnierten Siranpartikel werden jedoch nicht zerkleinert.
- Auswaage: 1.2 g,
- Beladung (Lipase, mg eingesetztes gelöstes Protein/g Immobilisat): 3.1
- Aktivitätsfaktor [Test 1]: 187
- [Aktivität (Gel mit Siran)]/[Aktivität (gleiche Menge Bulk-Gel ohne Siran)]: 1.4
- % immobilisiertes Protein (aus Proteinbestimmung der Waschflüssigkeiten): 96
- Ps.-cepacia-Lipase (Amano PS) wird in destilliertem Wasser (25 mg/ml) suspendiert, 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der Überstand wird zur Immobilisierung verwendet.
- In einem 20-ml-Polypropylengefäß werden 4,81 ml Methyltrimethoxysilan (MTMS), 1,17 ml destilliertes Wasser und 0,03 ml 0,001 M wäßrige NaF-Lösung gemischt und 1 h lang bei 0ºC einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Nach der Ultraschallbehandlung werden 0,086 ml 1 M wäßrige NaF-Lösung, 0,20 ml wäßrige Polyvinylalkohol-Lösung (4 Gew.-%), 0,20 ml Lipase-Lösung und 0,164 ml destilliertes Wasser zu 1,071 ml von MTMS abgeleitetem Sol gegeben, das durch Ultraschallbehandlung erhalten wurde.
- Das Gemisch wird mit einem Vortex-Schüttler gerührt (ungefähr 5 s) und dann bis zur Gelierung leicht bei Raumtemperatur geschüttelt (200 U/min). Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen.
- Auswaage: 411 mg,
- mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat): 1.1
- Aktivitätsfaktor: 7.09
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 2(e) wird verwendet. Nach der Gelierung wird das gelhaltige Polypropylengefäß in einen Autoklaven (200 ml) gegeben und mit Kohlendioxid (ungefähr 90 g) unter überkritischen Bedingungen (40ºC, 90 bar) getrocknet. Nach 24 h wird das Immobilisat gewaschen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Auswaage: 0.29 g,
- mg eingesetzte gelöste Lipase/g Immobilisat): 1.5
- Aktivitätsfaktor [(Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase)] = 14.1
- Immobilisierungsgrad: 0.65
- Das Enzymimmobilisat (100-1000 mg je nach Beladung) wird in einem 50 ml Zentrifugenbecher (Polypropylen, mit Schraubverschluß) mit einer Mischung von 100 mg Laurinsäure (0.5 mmol, Fluka), 0.158 ml 1-Octanol (1 mmol, Merck) und 2,2,4-Trimethylpentan (ad 10 ml, Aldrich) versetzt, der Becher wird verschlossen und in einem Wasserbad bei 30ºC und 180 U/min geschüttelt. Zur Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit werden in regelmäßigen Abständen Proben (0.15 ml) abgenommen und das Verhältnis von Laurinsäureoctylester zu Laurinsäure gaschromatographisch bestimmt (0.25 mm FFAP-Kapillarsäule, 15 m). Zur Bestimmung des Aktivitätsfaktors wird die derart ermittelte Reaktionsgeschwindigkeit dividiert durch diejenige Reaktionsgeschwindigkeit, die unter gleichen Bedingungen mit einer Menge an kommerziellem Enzympräparat erhalten wird, welche der zur Immobilisierung eingesetzten Menge gleich ist.
- Zu 20 ml einer Lösung von Gummi arabicum (Sigma, 100 g/l in Wasser) werden 6.5 ml Olivenöl (Sigma, filtriert über Aluminiumoxid B, Aktivitätsstufe I) gegeben, und die Mischung wird mit einem Mixer 30 min homogenisiert. Zu 25 ml der Substratemulsion werden 20 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 9, zugegeben, der pH-Wert mit 0.1 M NaOH auf 8.0 eingestellt, und das Gemisch wird 2 min homogenisiert. In einem 2-ml-Eppendorfgefäß werden 10 mg des Enzymimmobilisats 5 min mit 0.1 ml Wasser geschüttelt, mit 0.9 ml der gepufferten Substratemulsion versetzt, auf einem Vortexschüttler 5 s gründlich gemischt und bei 30ºC und 1200 U/min 0.5-2 h geschüttelt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0.1 ml einer Lösung von konz. Schwefelsäure (1 ml) in Hexan/i-Propanol 1 : 5 (10 ml) beendet, und das Reaktionsgemisch mit 0.6 ml Hexan extrahiert. 0.4 ml der Hexanphase werden mit 1 ml Aceton/Ethanol 1 : 1 sowie Phenolphthalein versetzt, und die freie Fettsäure wird mit 0.1 M ethanolischer Kaliumhydroxidlösung titriert. Die Aktivitätsausbeute wird ermittelt durch Vergleich der erhaltenen Umsätze mit dem Umsatz, der unter identischen Reaktionsbedingungen mit einer Lösung der freien Lipase erreicht wird, und in Prozent angegeben.
- Das Enzymimmobilisat (immobilisiert nach Beispiel 2e, Menge je nach Beladung) wird in 4 ml Benzol suspendiert, mit 2.4 umol Acetanhydrid sowie 2.4 umol des racemischen 1-Phenylethanols versetzt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur und 400 U/min geschüttelt. Zum Verfolgen der Reaktion werden in regelmäßigen Abständen Proben (0.15 ml) entnommen, mit 0.15 ml 5%iger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt, und nach Zentrifugation wird die organische Phase gaschromatographisch untersucht. Der Enantiomerenüberschuß nach beendeter Reaktion wurde gaschromatographisch (0.25 mm Kapillare, 30 m, Säulenmaterial: 6-t- Butyldimethylsilyl-2,3-dimethyl-β-cyclodextrin, 20% in UV1701) bestimmt:
- Umsatz: 50%; %ee (Ester): > 99; %ee (Alkohol): > 99
- 0.2 g Palmitinsäure werden in der Wärme in 1.5 ml 2,2,4-Trimethylpentan gelöst, mit 0.2 ml Triolein (Sigma) gemischt, und das Enzymimmobilisat (Novo-SP-523-Lipase, immobilisiert gemäß Beispiel 12, Wassergehalt 16%, 58 mg, entprechend 0.15 mg des zur Immobilisierung eingesetzten löslichen Lipaseproteins) wird zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 40ºC und 1200 U/min geschüttelt. In regelmäßigen Abständen werden Proben (0.05 ml) abgenommen, und der Umsatz wird gaschromatographisch verfolgt (nach Silylierung mit BSTFA/TMCS (99 : 1)/Pyridin; Kapillarsäule mit PSO48-Phase). Die Aktivität (definiert als Verbrauch an Palmitinsäure von 1 U = 1 umol/min) beträgt 0.56 U, entsprechend 11.28 U/g Immobilisat.
- Immobilisierte Ps.-cepacia-Lipase (Immobilisierungsmethode wie oben beschrieben bei zum Teil abweichender eingesetzter Enzymmenge; Menge nach Beladung, entprechend 0.12 mg zur Immobilisierung eingesetztem Lipaseprotein) wird mit 10 ml Wasser sowie 10 ml Olivenöl gemischt und bei 40ºC und 230 min&supmin;¹ geschüttelt (50 ml Polypropylengefäß mit Schraubverschluß, 2.7 cm Durchmesser). In regelmäßigen Zeitabständen werden Proben der Ölphase (0.15 ml) entnommen, mit Aceton/Ethanol 1 : 1 (1 ml) und Phenolphthalein versetzt, und die freigesetzte Fettsäure wird mit 0.06 M ethanolischer KOH titriert.
- [a] mg zur Immobilisierung eingesetztes lösliches Enzymprotein/g erhaltenes Immobilisat;
- [b] Anfangsgeschwindigkeit (mmol freigesetzte Säure/h)/mg zur Immobilisierung eingesetztes Lipaseprotein, v(frei) = 0.13 mmol KOH/h · mg kommerzielle Lipase)
Claims (16)
1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Lipasen, dadurch gekennzeichnet,
daß Lipasen in einer organische Substituenten über Si-C-Bindungen enthaltenden
hydrophoben Siliciumoxidmatrix immobilisiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Lipasen in Gegenwart
von Siliciumverbindungen mit nicht hydrolysierbaren organischen sowie
hydrolysierbaren Substituenten und Mischungen solcher Siliciumverbindungen mit solchen,
die nur vollständig hydrolysierbare Substituenten enthalten, in Gegenwart
mindestens eines Katalysators und gegebenenfalls in Gegenwart mindestens eines
Additivs immobilisiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
Siliciumverbindungen des Typs RkR"&sub1;Si(OR')m (A) und/oder [(R'O)nRoSi]pX (B) und/oder
des Typs Y-(RqR"rSiO)SRqR"rSi-Y (C) verwendet werden, wobei R und R" aus
einem gesättigten oder ungesättigten Alkylsubstituenten mit 1 bis 18 C-Atomen
oder einem aromatischen Substituenten ausgewählt sind, R' ein Alkylrest mit 1-5
C-Atomen oder ein Alkalimetallatom ist X ein bi- oder höherfunktioneller Alkyl-
oder Arylrest ist und Y -OH, -OR oder -Si(OR')&sub3; ist, k und l Zahlen von 0 bis 3
sind (mit 0 < k + l < 4), m eine Zahl von 2 bis 4 ist (mit m = 4 - l - k), n eine
Zahl von 1 bis 3 ist, o eine Zahl von 0 bis 2 ist (mit o = 3 - n), p eine Zahl von 2
bis 4 ist, q und r Zahlen von 0 bis 2 sind (mit q + r = 2) und s eine Zahl von 1 bis
100 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Siliciumverbindungen des Typs A verwendet werden, in denen R' = Alkyl oder Natrium ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Siliciumverbindungen des Typs B verwendet werden, in denen R' = Alkyl, X = Alkylen oder Arylen
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Siliciumverbindungen des Typs C in Kombination mit Verbindungen des Typs A eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des
Typs A mit R' = Alkyl oder Natrium eingesetzt werden, insbesondere AI, Alkyl-
oder Aryltrialkoxysilane RSi(OR')&sub3; mit R = Alkyl mit einer Kettenlänge von C&sub1;
bis C&sub1;&sub8;, Alkenyl oder Aryl.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des
Typs AII, Dialkyl-, Alkylaryl- oder Diarylalkoxysilane RkR"2-kSi(OR')&sub2; mit R,
R" = Alkyl mit einer Kettenlänge von C&sub1; bis C&sub1;&sub8;, mit R' = Alkyl oder Natrium, in
Kombination mit Komponenten des Typs AI eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des
Typs AIII, Tetraalkoxysilane Si(OR')&sub4; mit R' = Alkyl oder Natrium, in
Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C eingesetzt werden, wobei der
Anteil der Siliciumatome mit einem oder mehreren organischen Substituenten
mindestens 50 Atom-%, bezogen auf die eingesetzte Gesamtmenge an Silicium,
beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des
Typs B, in denen R' = Alkyl mit X = Alkylen oder Arylen ist, in Kombination mit
Silanen des Typs AI, AII, C sowie B mit unterschiedlichem X verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Katalysatoren
basische Verbindungen wie Ammonium- und Alkalimetallhydroxide, Ammoniak,
Ammonium- und Alkalimetallfluoride sowie Kombinationen dieser Verbindungen
eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Additive
Proteine wie Albumin, Gelatine, Natriumcaseinat oder Polyhydroxyverbindungen
wie Polyvinylalkohol, Sorbitol, Glycerin, Polyethylenglykol oder unlösliche
organische Polymere oder anorganische Verbindungen wie Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;),
Celite, offenporige Sintergläser oder Kieselgur eingesetzt werden.
13. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12 erhältlichen
Lipasen zur Hydrolyse und/oder Umesterung von Estern sowie Veresterung von
Alkohlen mit Säuren oder Säurederivaten.
14. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12 erhältlichen
Lipasen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung digestiver
Insuffizienzen, die durch pankreatische Fibrose verursacht werden.
15. Immobilisierte Lipase, die nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12
erhältlich ist.
16. Verfahren zur Hydrolyse und/oder Umesterung von Estern, das das Umsetzen der
immobilisierten Lipase nach Anspruch 15 mit den Estern in organischen Medien
umfaßt.
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