DE69512817T2 - In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen - Google Patents

In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen

Info

Publication number
DE69512817T2
DE69512817T2 DE69512817T DE69512817T DE69512817T2 DE 69512817 T2 DE69512817 T2 DE 69512817T2 DE 69512817 T DE69512817 T DE 69512817T DE 69512817 T DE69512817 T DE 69512817T DE 69512817 T2 DE69512817 T2 DE 69512817T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
process according
type
alkyl
lipase
compounds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69512817T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69512817D1 (de
Inventor
Manfred T. Reetz
Joerg Simpelkamp
Albin Zonta
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Original Assignee
Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Studiengesellschaft Kohle gGmbH filed Critical Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Priority to DE69512817T priority Critical patent/DE69512817T2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69512817D1 publication Critical patent/DE69512817D1/de
Publication of DE69512817T2 publication Critical patent/DE69512817T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
    • C11C1/04—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis
    • C11C1/045—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis using enzymes or microorganisms, living or dead
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/003—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/08—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils with fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/10—Ester interchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)
  • Silicon Polymers (AREA)

Description

  • Gegenstand der Erfindung sind Enzymimmobilisate, welche durch Aufbau einer hydrophoben Matrix auf Siliciumoxidbasis nach dem Sol-Gel-Verfahren in Gegenwart von Lipasen hergestellt wurden, das Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Anwendung.
  • Der Einsatz von Lipasen für technische Anwendungen findet zunehmendes Interesse u. a. für die Hydrolyse oder Synthese von Estern sowie Umesterungsreaktionen unter milden Bedingungen, wobei überwiegend hydrophobe Substrate eingesetzt werden (K. D. Mukherjee, Biocatalysis 1990, 3, 277-293; T. Nielsen, Fette, Seifen, Anstrichmittel 1985, 87, 15-19). Wegen der oft breiten Substratspezifität werden Lipasen nicht nur in der Fettchemie, sondern auch zunehmend für stereoselektive Reaktionen in der organischen Synthese verwendet. Lipasen haben auch Anwendungen in der Therapeutik gefunden. Sie werden für die Behandlung von Verdauungsinsuffizienzen verwendet, die durch Pancreaskrankheiten oder Zystofibrose verursacht werden. Ein wichtiger Faktor für die Wirtschaftlichkeit eines enzymatischen Prozesses ist eine geeignete Methode zur Immobilisierung des Biokatalysators, um die leichte Rückgewinnung und mehrfache Verwendbarkeit des Enzyms zu ermöglichen sowie wenn möglich eine Erhöhung seiner Stabilität unter den Reaktionsbedingungen zu erreichen. Der Stand der Technik auf diesem Gebiet der Enzymtechnologie ist in der Übersichtsliteratur bereits mehrfach zusammengefaßt worden, z. B. für Lipasen (F. X. Malcata, H. R. Reyes, H. S. Garcia, C. G. Hill, Jr. und C. H. Amundson in J. Am. Oil Chem. Soc. 1990, 67, 890- 910). In manchen Fällen führt die Immobilisierung durch Einschluß der Lipase in eine feste Matrix, verglichen mit anderen Methoden, zu einer verbesserten Aktivitätsausbeute und Stabilität, ist jedoch meist aufwendiger in der Durchführung.
  • Die Herstellung von SiO&sub2;-Gelen nach dem Sol-Gel-Verfahren (C. J. Brinker, G. W. Scherer, Sol-Gel-Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel-Processing, Academic Press, San Diego 1990; L. L. Hench, J. K. West, Chem. Rev. 1990, 90, 33-72) durch Hydrolyse von Tetraalkoxysilanen wie Tetramethoxysilan oder Tetraethoxysilan läßt sich zum Einschluß von Biomolekülen in die anorganische Matrix verwenden. Zur Immobilisierung von Lipasen ist dieses Verfahren jedoch nicht geeignet, weil es nur sehr unbefriedigende Aktivitätsausbeuten liefert.
  • Überraschenderweise zeigt sich, daß der Einschluß von Lipasen in siliciumhaltigen Matrices, welche durch Hydrolyse von Alkoxysiliciumverbindungen mit organischen Substituenten am Silicium in Gegenwart von geeigneten Katalysatoren sowie weiteren, im folgenden beschriebenen Zusätzen erhalten werden, zu Materialien mit ungewöhnlich hohen katalytischen Aktivitäten führt. Dabei werden durch die Immobilisierung nach unserer Methode für Reaktionen in organischen Medien unerwartete Steigerungen der Aktivität um bis zu zwei Größenordnungen im Vergleich zu der eingesetzten kommerziellen Enzympräparation beobachtet, sowie eine um mehr als zwei Größenordnungen erhöhte Aktivität im Vergleich zu Immobilisaten, die nach den o. g. konventionellen Sol-Gel-Verfahren (unter Verwendung von Tetraalkoxysilanen allein) hergestellt wurden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immobilisierten Lipasen zeigen eine ausgezeichnete Stabilität einschließlich einer erhöhten Temperaturstabilität und sind breit anwendbar für Reaktionen sowohl in wäßrigen als auch in organischen Medien. Durch Variation der Immobilisierungsparameter lassen sich die Eigenschaften der Matrix und der erhaltenen Immobilisate steuern, was einen breiten Spielraum zur Optimierung für eine gegebene technische Anwendung ermöglicht.
  • Gegenstand der Erfindung sind Lipasen, welche in einer organische Substituenten enthaltenden Siliciumoxid-Matrix immobilisiert wurden, sowie das Verfahren zur Herstellung der derart immobilisierten Lipasen durch Hydrolyse von Siliciumverbindungen des Typs
  • RkR"&sub1;Si(OR')m (A) und/oder [(R'O)nRoSi]pX (B)
  • und/oder des Typs Y-(RqR"rSiO)SRqR"rSi-Y (C)
  • in Gegenwart einer wässrigen Lösung der Lipase, eventuell weiterer Lösungsmittel, eines (oder mehrerer) geeigneten Katalysators, eines oder mehrerer Additive mit positivem Einfluß auf Aktivität, Stabilität, mechanische oder magnetische Eigenschaften des erhaltenen immobilisierten Biokatalysators, wobei R und R" ein gesättigter oder ungesättigter Alkylsubstituent mit 1 bis 18 C-Atomen oder ein aromatischer Substituent, R' ein Alkylrest mit 1-5 C-Atomen oder ein Alkalimetallatom, X ein bi- oder höherfunktioneller Alkyl- oder Arylrest, und Y -OH, -OR oder -Si(OR')&sub3; ist, k und l Zahlen von 0 bis 3 (mit 0 < k + l < 4), m eine Zahl von 2 bis 4 (mit m = 4 - l - k), n eine Zahl von 1 bis 3, o eine Zahl von 0 bis 2 (mit o = 3 - n), p eine Zahl von 2 bis 4, r eine Zahl von 2 bis 4, q und r Zahlen von 0 bis 2 mit q + r = 2 und s eine Zahl von 1 bis 100 sind.
  • Vorzugsweise eingesetzte Siliciumkomponenten des Typs A, mit R' = Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl) oder Natrium, sind:
  • - AI: Alkyl- oder Aryltrialkoxysilane RSi(OR')&sub3; mit R = Alkyl mit einer Kettenlänge von C1 bis C18, Alkenyl, z. B. Vinyl, oder Aryl, z. B. Phenyl,
  • - AII: Dialkyl-, Alkylaryl- oder Diarylalkoxysilane RkR"2-kSi(OR') 2 mit R, R" = Alkyl mit einer Kettenlänge von C1 bis C18, z. B. Methyl, wobei Verbindungen des Typs All (mit nur zwei zur Vernetzung geeigneten Gruppen) in Kombination mit Komponenten des Typs AI oder AIII, z. B. in einem Molverhältnis (AI, AIII): AII von 3-6, eingesetzt werden können,
  • - AIII: Tetraalkoxysilane Si(OR')&sub4; in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C, wobei der Anteil der Siliciumatome mit einem oder mehreren organischen Substituenten mindestens 50 Atom- %, bezogen auf die eingesetzte Gesamtmenge an Silicium, beträgt.
  • Siliciumkomponenten des Typs B, mit R' = Alkyl, z. B. Methyl oder Ethyl, sind Bis(trialkoxysilyl)verbindungen der Formel (R'O)&sub3;Si- X-Si(OR')&sub3; mit X = Alkylen, z. B. (CH&sub2;)&sub2;&submin;&sub6;, Arylen (Verwendung wie bei AIII in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C).
  • Siliciumkomponenten des Typs C werden in Kombination mit Verbindungen des Typs A, insbesondere AI und AIII, eingesetzt und sind oligomere oder polymere Dialkylsiloxane, insbesondere Polydimethylsiloxan, z. B. mit Silanolendgruppen und einer Kettenlänge von 5-60 monomeren Einheiten. Das Molverhältnis A : C der Komponenten beträgt dabei z. B. 3-6.
  • Die verwendeten Siliciumverbindungen des Typs A und/oder B können mit einem Teil des Wassers unter Zusatz von Säure oder einem der o. g. basischen Katalysatoren, z. B. unter Einwirkung von Ultraschall, vorbehandelt werden. Die Silane können auch ohne Vorbehandlung direkt zur Enzymimmobilisierung eingesetzt werden.
  • Das in dieser Erfindung vorgestellte Verfahren ist breit anwendbar auf eine Reihe von Lipasen unterschiedlichster Herkunft. Die immobilisierten Lipasen können mikrobiellen Ursprungs sein, z. B. SP 523 Lipase (Novo), oder gewonnen aus Bakterien z. B. der Gattung Pseudomonas (z. B. Ps. fluorescens, Ps. cepacia), aus Hefen der Gattung Candida (z. B. C. antarctica, C. lipolytica), aus Schimmelpilzen der Gattungen Rhizopus (z. B. Rh. arrhizus, Rh. delemar, Rh. niveus), Penicillium (z. B. P. roqueforti), Aspergill us (z. B. A. niger), Mucor (z. B. M. miehei), pflanzlichen Ursprungs (z. B. aus Weizenkeim), sowie tierischen Ursprungs, z. B. aus Schweinepankreas. Eingesetzt werden 0.1-30 mg Lipase/mmol Siliciumverbindung(en). Bestimmungen des Proteingehaltes in Immobilisaten ohne zugesetztes Fremdprotein ergeben einen Immobilisierungsgrad von 10 bis > 95%, und die entsprechenden Beladungen betragen 0.2-80 mg immobilisiertes Lipaseprotein pro g resultierendes Enzymimmobilisat.
  • Als Katalysator werden verwendet: basische Verbindungen, z. B. Ammonium-und Alkalimetallhydroxide, vorzugsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in einer Stöchiometrie von 10-100 mmol/mol Siliciumverbindung(en); Ammoniak in einer Stöchiometrie von 1-10 mmol/mol Siliciumverbindung(en); Ammonium- und Alkalimetallfluoride, vorzugsweise Natriumfluorid oder Kaliumfluorid in einer Stöchiometrie von 0.1-100, vorzugsweise 1-10 mmol/mol Siliciumverbindung(en); sowie Kombinationen dieser Verbindungen.
  • Als Additive werden eingesetzt: (I) Proteine (0-200 mg Protein/mg Lipase), z. B. Albumin, Gelatine, Natriumcaseinat; (II) Polyhydroxyverbindungen (0-1000 mg Additiv/mg Lipase), z. B. Polyvinylalkohol (z. B. 0.05-200 mg/mg Lipase), Sorbitol, Glycerin, Polyethylenglycol (z. B. 0.5-1000 mg/mg Lipase); (III) unlösliche organische Polymere oder anorganische Verbindungen, z. B. Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;), Materialien auf SiO&sub2;-Basis, z. B. Celite®, offenporige Sintergläser wie z. B. Siran®, Controlled Porous Glass (CPG) oder Kieselgur; sowie Kombinationen dieser Verbindungen I-III. Art und Menge der zugesetzten Additive beeinflussen die erhaltene Aktivität der immobilisierten Lipase. Durch Zusatz geeigneter Additive lassen sich im Vergleich zu analogen Systemen ohne Additiv deutliche Steigerungen der Aktivitätsausbeute erzielen.
  • Wasser wird in Form von wäßrigen ungepufferten oder durch Zusatz geeigneter Puffersubstanzen gepufferter Lösungen der Lipase, der Additive, des Katalysators oder durch direkten Zusatz in das Reaktionsmedium eingebracht, in einer Stöchiometrie von 4-15, vorzugsweise 8-12, mol Wasser pro mol Siliciumverbindung(en). Als Puffermedien sind z. B. Natrium- oder Kaliumphosphatpuffer mit pH- Werten von 6-10 geeignet. Zum Reaktionsgemisch können organische Lösungsmittel wie z. B. aliphatische Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol, Propanol), THF, DMF, in geringen Mengen bis 20 Vol.-% zugesetzt werden, oder auf die Zugabe organischer Lösungsmittel kann ganz verzichtet werden.
  • Eine bevorzugte Methode zur Immobilisierung von Lipasen besteht z. B. in der Zugabe einer gepufferten oder ungepufferten wäßrigen Lösung des Enzyms bei Temperaturen von 0ºC-50ºC, vorzugsweise bei 4ºC bis Raumtemperatur, zu einem Gemisch aus Wasser oder wäßrigem Puffer, einer wäßrigen Lösung der o. g. Additive I und/oder II und einer wäßrigen Lösung des Katalysators, Mischen durch Schwenken oder Schütteln, Zugabe der Siliciumverbindungen (mit R' = Alkyl), wobei bei Verwendung von Komponenten mit stark unterschiedlicher Reaktionsgeschwindigkeit, wie z. B. Mischungen von Verbindungen des Typs AI und AIII, die weniger reaktiven Komponenten zuerst hinzugefügt werden, Mischen bis zur Bildung einer homogenen Phase und Schwenken oder Schütteln bis zur Gelierung des Reaktionsgemisches. Bei Auftreten einer stärkeren Wärmeentwicklung beim Gelieren wird beim und unmittelbar nach dem Gelieren bei 0ºC gekühlt. Die vollständig oder teilweise erstarrte Reaktionsmischung wird verschlossen stehengelassen, eventuell überstehende Flüssigkeit entfernt und die Produkte getrocknet. Die erhaltenen Produkte sind i. A. farblos und je nach den verwendeten Siliciumkomponenten spröde bis elastisch, harte glasartige Blöcke bis feine Pulver. Die erhaltenen Produkte können zerkleinert und in dieser Form insbesondere für Reaktionen in nichtwäßrigem Medium eingesetzt werden. Zur Verminderung der Gefahr unerwünschter Nebenreaktionen oder einer Kontaminierung durch überschüssigen Katalysator und Additive sowie zur Entfernung nur locker adsorbierter, nicht eingeschlossener Lipase, welche bei der Reaktion leichter ausgewaschen oder desaktiviert wird und damit zur Verminderung der Aktivität im Laufe des Katalysatoreinsatzes führt, wird allerdings ein Waschen des Enzymimmobilisates bevorzugt. Dazu werden die Immobilisate zerkleinert, mit Wasser oder wäßrigem Puffer (pH 6-8) geschüttelt, abfiltriert und mit Wasser sowie organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton gefolgt von Pentan, nachgewaschen, getrocknet und abschließend gemahlen.
  • Die erhaltenen Materialien sind meist weiße Pulver mit spezifischen Oberflächen (BET-Methode) von ca. 0.1-700 m²/g und einem Porenvolumen von ca. 0.001-1 cm³/g.
  • In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die zur Kondensation unter Gelbildung befähigten Si-OH-Gruppen nicht durch Hydrolyse von Si-O-Alkyl-Gruppen, sondern durch Protonierung von Si-O-Metallgruppen erzeugt. Dazu wird der pH-Wert einer wäßrigen Lösung eines Alkylsiliconates, z. B. Natriummethylsilico nat MeSi(ONa)&sub3;, durch Zugabe von Säuren, z. B. Salzsäure oder Essigsäure, auf pH 6-10 eingestellt, und die Lösung wird zu einem Gemisch aus Enzymlösung und weiteren o. g. Komponenten zugefügt. Zusätzlich können auch weitere Siliciumverbindungen der o. g. Typen A, B und/oder C mit R' = Alkyl zur Cokondensation in Kombination mit der in dieser Variante verwendeten Siliconatlösung eingesetzt werden.
  • In einer weiteren Variante wird die nach den o. g. Verfahren hergestellte Reaktionsmischung vor dem Gelieren in einen Überschuß von Wasser gegossen und unter starkem Rühren suspendiert. Nach dieser Methode erhält man das Enzymimmobilisat in Form annähernd sphärischer Partikel.
  • In einer weiteren Variante werden in das aus Silanen zusammen mit Enzymlösung und den weiteren o. g. Komponenten hergestellte Immobilisat als Additive des Typs III organische Polymere oder anorganische Materialien inkorporiert, beispielsweise Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) oder oxidische Materialien auf SiO&sub2;-Basis, z. B. Celite®, offenporige Sintergläser wie z. B. Siran, Controlled Porous Glass (CPG) oder Kieselgur. Dazu wird das Material entweder vor der Zugabe der Silane zum Reaktionsgemisch zugefügt oder aber nach Zugabe der Silane, aber jedenfalls vor Beginn der Gelierung zugegeben. Für das Aufbringen des Enzymimmobilisates auf große, offenporige Partikel wird das Reaktionsgemisch vor Beginn der Gelierung auf den Träger aufgebracht. Die Verwendung derartiger oxidischer Zusätze führt zu positiven Eigenschaften des Immobilisates, z. B. bezüglich der leichteren Abtrennung des immobilisierten Katalysators durch Einführung von magnetischen Eigenschaften im Falle von Magnetit bzw. für den Einsatz im kontinuierlichen Durchflußbetrieb durch die Erzeugung eines grobkörnigen Materials im Falle von porösen SiO&sub2;-Trägern wie Siran®, Die katalytische Aktivität des Immobilisates im Vergleich zu analogem Material ohne zugesetztes anorganisches Material zeigt i. A. keine Beeinträchtigung, oder die Aktivität wird sogar positiv beeinflußt.
  • Die nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren erhaltenen Enzymimmobilisate weisen eine hohe Aktivität bei Veresterungs- und Umesterungsreaktionen in organischem Medium auf. Sie sind i. A. um einen Faktor von 2 bis > 120 aktiver als die gleiche Menge der zur Immobilisierung eingesetzten kommerziellen Enzympräparate. Für Reaktionen in wäßrigem Medium, wie z. B. die Hydrolyse von Olivenölemulsionen, werden beispielsweise für Ps.- cepacia-Lipase Aktivitätsausbeuten bis 62%, bezogen auf die zur Immobilisierung eingesetzte Lipasemenge, erhalten.
  • Das Enzymimmobilisat zeigt hohe Stabilität in Wasser, organischem Medium oder bei der Lagerung in trockenem Zustand auch bei erhöhten Temperaturen. So wird bei dreimonatiger Lagerung beispielsweise einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten Ps.-cepacia-Lipase bei Raumtemperatur praktisch kein Aktivitätsverlust (d. h. weniger als 5%) beobachtet.
    • I. Beispiele: Beispiel 1 Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase
  • Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der Überstand wird zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml- Polypropylengefäß werden 0.58 ml Wasser, 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0,46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit 0.857 ml Methyltrimethoxysilan (6 mmol, mit mol Silan pro mol Wasser (gesamt) = 1 : 10) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s gründlich gemischt. Nach ca. 30 s geht die trübe Emulsion unter Wärmeentwicklung in eine klare homogene Lösung über, die bei 0ºC gekühlt wird, bis nach kurzer Zeit die gesamte Reaktionsmischung zu einem homogenen milchig-trüben Festkörper erstarrt. Dieser wird 24 h bei Raumtemperatur verschlossen stehengelassen, 3 d bei 30ºC unter Normaldruck getrocknet und schließlich gemörsert. Das Rohprodukt wird mit 10 ml Wasser 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt (350 U/min), über eine Glasfritte (D4) abfiltriert und mit 20 ml Wasser, gefolgt von zweimal 20 ml Aceton sowie 20 ml Pentan, gewaschen. Das Immobilisat wird 24 h bei 30ºC getrocknet und dann in einer Kugelmühle gemahlen.
  • Auswaage: 0.38 g,
  • mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.2 Aktivitätsfaktor [(Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der freien Lipase: 0.55% Umsatz/h~mg kommerzielle Lipase)]: 6.3 (Test 1)
    • Beispiel 2: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in Gelen des Typs AI, AI/AI', AI/AII, AI/C und B
  • Ps.-cepacia -Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der überstand wird zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml-Polypropylengefäß werden Wasser (so daß ein Verhältnis von mol Wasser (gesamt)/mol Silan(e) von 8 : 1 erhalten wird), 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (4% w/v, MG 15000, Fluka), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5,0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit der in der Tabelle angegebenen Menge der Siliciumverbindungen I und II versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s gründlich gemischt und anschließend bei 1200 U/min und Raumtemperatur geschüttelt. Nach ca. 30 s - 3 h setzt, i. A. unter Wärmeentwicklung, der Geliervorgang ein. Es wird bei 0ºC gekühlt, bis nach kurzer Zeit die Reaktionsmischung teilweise oder vollständig zu einem milchig-trüben Festkörper erstarrt, der wie in Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt wird.
  • [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat; [b] Aktivitätstest 1 (s. unten), (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der freien Lipase); [c] Test 2 (s. unten); [d] (Menge an immobilisiertem Protein = eingesetzte Proteinmenge - Proteinmenge in den Waschflüssigkeiten)/(Menge an zur Immobilisierung "eingesetztem Protein), BCA-Protein-Assay, Fa. Pierce, BSA- Standard; [e] M. G. 400-700; [f] M. G. 4200; n. b. = nicht bestimmt.
  • Abkürzungen: MTMS: Methyltrimethoxysilan (Fluka), ETMS: Ethyltrimethoxysilan (ABCR), VTMS: Vinyltrimethoxysilan (Fluka), PDMS: Polydimethylsiloxan m. Silanolendgruppen (ABCR), DMDES: Dimethyldiethoxysilan (Fluka), BTMSE: Bis(trimethoxysilyl)ethan (ABCR)
  • Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel der Immobilisate 2a und 2g:
  • - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung bei Raumtemperatur: > 95%
  • - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 31% (2a), 18% (2g)
  • - Restaktivität nach 30 Reaktionscyclen zu je 22 h bei 30ºC (batch-Verfahren, Veresterung von Laurinsäure mit 1- Octanol in 2,2,4-Trimethylpentan, siehe Aktivitätstest I, mit Waschen des Immobilisates nach jedem Cyclus): > 80% (2a, 2g)
  • - Restaktivität nach Lagerung in 1-Octanol, 28d bei 70ºC: 65% (2g)
    • Beispiel 3: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in Gelen des Typs AI/AIII, B/AIII, C/AIII
  • Wie in Beispiel 2, nur daß die zweite Siliciumverbindung (II) in allen Fällen Tetramethoxysilan (TMOS) ist.
  • In allen Fällen werden Wasser (so daß das in der Tabelle angegebene Verhältnis R = mol Wasser (gesamt)/mol Silan(e) erhalten wird), 0.2 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 0.1 ml 1 M NaF sowie 0.4 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit der in der Tabelle angegebenen Menge der Siliciumverbindungen I und II (TMOS) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 30 s (oder bei Mischungen, die schneller gelieren, bis zur Gelierung) intensiv gemischt und anschließend bei 1200 U/min und Raumtemperatur geschüttelt. Nach ca. 2 s bis 3 h setzt, i. A. unter Wärmeentwicklung, der Geliervorgang ein, und das Gemisch wird auf 0ºC gekühlt. Die weitere Behandlung des Immobilisats erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat, [b] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase), [c] Test 2, [d] (Menge an immobilisiertem Protein)/ (Menge an zur Immobilisierung eingesetztem Protein), [e] M. G. 400-700
  • Abkürzungen: MTMS: Methyltrimethoxysilan (Fluka), ETMS: Ethyltrimethoxysilan (ABCR), PTMS: Propyltrimethoxysilan (Aldrich), OTMS: Octyltrimethoxysilan (ABCR), ODTMS: Octadecyltrimethoxysilan (ABCR), PhTMS: Phenyltrimethoxysilan (Fluka), VTMS: Vinyltrimethoxysilan (Fluka), PDMS: Polydimethylsiloxan m. Silanolendgruppen (ABCR), BTMSH: Bis(trimethoxysilyl)hexan (ABCR)
    • Beispiel 4: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in einem Gel auf der Basis von Alkyltrimethoxysilan/Tetraethoxysilan
  • Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 3 wird verwendet, außer daß Tetraethoxysilan (TEOS) anstelle von Tetramethoxysilan (TMOS) verwendet wird. Das Produkt wird getrocknet und gewaschen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
  • [a] mg eingesetztes Enzymprotein/g Immobilisat, [b] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase), [c] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem Protein)
    • Beispiel 5: Immobilisierung verschiedener Lipasen in Gelen auf Methyltrimethoxysilanbasis
  • Durchführung wie in Beispiel 2a, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden. Gelierzeit: 0,5 min
  • [a] Bezugsquelle: Fluka (a, b, c, d, e, f, h), Novo (i); [b] Spezifikation des Herstellers (k. A. = keine Angabe); [c] zur Immobilisierung eingesetzte kommerzielle Lipase; [d] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [e] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [f] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein); [g] rekombinantes Enzym unbekannten mikrobiellen Ursprungs, Anfangsgeschwindigkeit (% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase), Aktivitätstest 1
  • Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel des Immobilisates 4d:
  • - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 70%
    • Beispiel 6: Immobilisierung verschiedener Lipasen in Gelen auf Methyltrimethoxysilan/Polydimethylsiloxan- Basis
  • Durchführung wie in Beispiel 2e, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden. Gelierzeit: 1-5 min
  • [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein)
  • Stabilität der Enzymimmobilisate am Beispiel des Immobilisats 5d:
  • - Restaktivität nach dreimonatiger Lagerung in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 bei Raumtemperatur: 92%
    • Beispiel 7: Immobilisierung verschiedener Lipasen in Gelen auf Propyltrimethoxysilan/Tetramethoxysilan-Basis
  • Durchführung wie in Beispiel 3c, nur daß anstelle von Amano- PS-Lipase verschiedene Lipasen unterschiedlicher Herkunft (jeweils die in der Tabelle angegebenen Menge an kommerzieller Lipase in 0.2 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.5, nach Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen) eingesetzt werden.
  • [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein); [f] Fluka, 3.3 U/mg Protein, 0.83% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase, Aktivitätstest 1; [g] Fluka, 50 U/mg Protein, 0.16% Umsatz/h · mg kommerzielle Lipase, Aktivitätstest 1
    • Beispiel 8: Immobilisierung von Pseudomonas cepacia-Lipase
  • Verfahren wie in Beispiel 2a, nur daß anstelle von 0.1 ml einer 1 M NaF-Lösung die unten angegebenen Katalysatoren und Wassermengen (bei konstantem Wert von R = 8) verwendet wurden. Die Gelierzeit betrug 0.5-1 min (8a), 24 h (8b, 8c), 48 h (8d).
  • Auswaagen 0.34-0.42 g
  • mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.1-1.3
    • Beispiel 9: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase
  • wie Beispiel 2a, nur daß unterschiedliche Additive und Wassermengen (bei konstantem Verhältnis R von Wasser : Silan = 8 : 1) wie in der Tabelle angegeben verwendet wurden.
  • Auswaagen 0.38-0.4 g
  • mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat: 1.1-1.2
    • Beispiel 10: Immobilisierung von Novo-SP-523-Lipase
  • Lipase SP 523 (Novo) wird in dest. Wasser suspendiert (50 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert und der Überstand zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2- ml-Polypropylengefäß (Eppendorf) werden 42 ul Wasser, 0.1 ml wäßrige Polyvinylalkohollösung (MG 15000, Fluka, 4% w/v), 14 ul 1 M NaF-Lösung sowie 0.1 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 2.06 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller SP-523-Lipase) gemischt und mit 0.217 ml PDMS (0.4 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie 0.221 ml Tetramethoxysilan (1.5 mmol, Fluka) versetzt. Das zweiphasige Gemisch wird auf einem Vortex-Schüttler 2 s gründlich gemischt, mit 1.2 g Siran (Schott, 16 h bei 60ºC vorbehandelt mit 1 N HCl, mit Wasser gewaschen, eingesetzt mit einem Wassergehalt von 30%) versetzt, bis zum Gelieren ca. 5 s auf dem Vortex-Schüttler gemischt und bei 0ºC 2 min gekühlt. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen, die mit dem Immobilisat imprägnierten Siranpartikel werden jedoch nicht zerkleinert.
  • Auswaage: 0.94 g
  • Beladung (SP-523-Lipase, mg eingesetztes gelöstes Protein/g Immobilisat): 2.2
  • Aktivitätausbeute [Test 1]: 112
  • [Aktivität (Gel mit Siran)]/[Aktivität (gleiche Menge Bulk-Gel ohne Siran)]: 1.9
  • % immobilisiertes Protein (aus Proteinbestimmung der Waschflüssigkeiten): 98
    • Beispiel 11: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in magnetithaltigen Trägern
  • Ps.-cepacia-Lipase (Amano PS) wird in dest. Wasser suspendiert (25 mg/ml), 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert und der Überstand zur Immobilisierung eingesetzt. In einem 2-ml-Polypropylengefäß (Eppendorf) werden 0.2 ml wäßrige Gelatinelösung (4% w/v, ICN), 0.1 ml 1 M NaF-Lösung sowie 0.2 ml der wäßrigen Enzymlösung (enthält 0.46 mg gelöstes Protein, entprechend 5.0 mg kommerzieller Amano-PS-Lipase) gemischt und mit 0.5 g Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;, frisch hergestellt nach Kobayashi et al., J. Coll. Interface Bei. 1991, 141, 505, Wassergehalt 70%) versetzt. Das Gemisch wird auf einem Vortex- Schüttler 2 s gründlich gemischt. Es werden 0.857 ml (6 mmol) MTMS zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird auf einem Vortex-Schüttler bis zur Gelierung nach 0.5-1 min gründlich gemischt und anschließend 1 min bei 0ºC gekühlt. Die weitere Behandlung des Gels erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, nur daß anstelle von Filtrationsvorgängen Dekantierungen unter Zuhilfenahme eines Permanentmagneten vorgenommen wurden.
  • Auswaage: 0.47 g
  • mg eingesetzte gelöste Lipase/g Immobilisat: 1.0
  • Aktivitätfaktor [Test 1]: 2.2
    • Beispiel 12: Immobilisierung von Lipasen in Gelen aus Natriummethylsiliconat
  • Die in der Tabelle angebene Menge an kommerzieller Lipase wird in 1 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, suspendiert, 15 min geschüttelt und durch Zentrifugation von festen Rückständen befreit. Unmittelbar vor der Immobilisierung werden 4 ml Natriummethylsiliconat-Lösung (30% in Wasser, 7.5 mmol, ABCR) unter starkem Rühren mit 0.65 ml konz. HCl versetzt, so daß ein pH-Wert von 8.0-8.5 resultiert. Zu einer Mischung aus 0.25 ml Enzymlösung, 0.25 ml Albuminlösung (50 mg/ml Rinderserumalbumin, Sigma), 0.1 ml 1 M Natriumfluorid und 0.5 ml 1M Na-Phosphatpuffer pH 7.0 werden 0.5 ml Polydimethylsiloxan (0.9 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie anschließend 0.5 ml der Natriumsiliconatlösung (entprechend 0.8 mmol) zugegeben, und das Gemisch wird auf einem Vortexschüttler bis zur Gelierung, ca. 1-2 s, gründlich durchmischt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • [a] Bezugsquellen und spez. Aktivität vgl. Beispiel 5, Ps.- fluorescens-Lipase: Fluka, 31.5 U/mg Protein; [b] eingesetzte kommerzielle Lipase; [c] mg eingesetztes lösliches Enzymprotein/g Immobilisat; [d] Test 1, (Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase); [e] (Menge an immobilisiertem Protein)/(Menge an zur Immobilisierung eingesetztem löslichem Protein), [f] % Umsatz/h (Anfangsgeschwindigkeit) für die kommerzielle Lipase
    • Beispiel 13: Immobilisierung von Novo-SP-523-Lipase
  • 50 mg SP-523-Lipase (Novo) werden in 1 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, suspendiert, 15 min geschüttelt und durch Zentrifugation von festen Rückständen befreit. Es werden 0.1 ml Enzymlösung (entsprechend 5 mg kommerzieller Lipase, 3.8 mg gelöstem Protein), 0.2 ml 1 M Na-Phosphatpuffer pH 7.0, 0.1 ml Polyvinylalkohol (M. G. 15000, 4% in Wasser) und 0.04 ml 1 M Natriumfluoridlösung gemischt, mit 0.2 ml Polydimethylsiloxan (0.36 mmol, MG 400-700, ABCR) sowie anschließend mit 0.2 ml Natriummethylsiliconat-Lösung (30% in Wasser, 0.38 mmol, ABCR) und 0.03 ml konz. Salzsäure versetzt, das Gemisch wird ca. 1 s gemischt (Vortexschüttler) und mit 1 g Siran® (Schott) gründlich gemischt. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen, die mit dem Immobilisat imprägnierten Siranpartikel werden jedoch nicht zerkleinert.
  • Auswaage: 1.2 g,
  • Beladung (Lipase, mg eingesetztes gelöstes Protein/g Immobilisat): 3.1
  • Aktivitätsfaktor [Test 1]: 187
  • [Aktivität (Gel mit Siran)]/[Aktivität (gleiche Menge Bulk-Gel ohne Siran)]: 1.4
  • % immobilisiertes Protein (aus Proteinbestimmung der Waschflüssigkeiten): 96
    • Beispiel 14: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in einem von MTMS abgeleiteten Sonogel
  • Ps.-cepacia-Lipase (Amano PS) wird in destilliertem Wasser (25 mg/ml) suspendiert, 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, zentrifugiert, und der Überstand wird zur Immobilisierung verwendet.
  • In einem 20-ml-Polypropylengefäß werden 4,81 ml Methyltrimethoxysilan (MTMS), 1,17 ml destilliertes Wasser und 0,03 ml 0,001 M wäßrige NaF-Lösung gemischt und 1 h lang bei 0ºC einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Nach der Ultraschallbehandlung werden 0,086 ml 1 M wäßrige NaF-Lösung, 0,20 ml wäßrige Polyvinylalkohol-Lösung (4 Gew.-%), 0,20 ml Lipase-Lösung und 0,164 ml destilliertes Wasser zu 1,071 ml von MTMS abgeleitetem Sol gegeben, das durch Ultraschallbehandlung erhalten wurde.
  • Das Gemisch wird mit einem Vortex-Schüttler gerührt (ungefähr 5 s) und dann bis zur Gelierung leicht bei Raumtemperatur geschüttelt (200 U/min). Das Produkt wird wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet und gewaschen.
  • Auswaage: 411 mg,
  • mg eingesetzte gelöste Amano-PS-Lipase/g Immobilisat): 1.1
  • Aktivitätsfaktor: 7.09
    • Beispiel 15: Immobilisierung von Ps.-cepacia-Lipase in einem von MTMS/PDMS abgeleiteten Aerogel
  • Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 2(e) wird verwendet. Nach der Gelierung wird das gelhaltige Polypropylengefäß in einen Autoklaven (200 ml) gegeben und mit Kohlendioxid (ungefähr 90 g) unter überkritischen Bedingungen (40ºC, 90 bar) getrocknet. Nach 24 h wird das Immobilisat gewaschen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
  • Auswaage: 0.29 g,
  • mg eingesetzte gelöste Lipase/g Immobilisat): 1.5
  • Aktivitätsfaktor [(Aktivität des Immobilisats)/(Aktivität der kommerziellen Lipase)] = 14.1
  • Immobilisierungsgrad: 0.65
    • II. Aktivitätstests und Reaktionen unter Verwendung immobilisierter Lipasen (1) Veresterung von Laurinsäure mit 1-Octanol
  • Das Enzymimmobilisat (100-1000 mg je nach Beladung) wird in einem 50 ml Zentrifugenbecher (Polypropylen, mit Schraubverschluß) mit einer Mischung von 100 mg Laurinsäure (0.5 mmol, Fluka), 0.158 ml 1-Octanol (1 mmol, Merck) und 2,2,4-Trimethylpentan (ad 10 ml, Aldrich) versetzt, der Becher wird verschlossen und in einem Wasserbad bei 30ºC und 180 U/min geschüttelt. Zur Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit werden in regelmäßigen Abständen Proben (0.15 ml) abgenommen und das Verhältnis von Laurinsäureoctylester zu Laurinsäure gaschromatographisch bestimmt (0.25 mm FFAP-Kapillarsäule, 15 m). Zur Bestimmung des Aktivitätsfaktors wird die derart ermittelte Reaktionsgeschwindigkeit dividiert durch diejenige Reaktionsgeschwindigkeit, die unter gleichen Bedingungen mit einer Menge an kommerziellem Enzympräparat erhalten wird, welche der zur Immobilisierung eingesetzten Menge gleich ist.
    • (2) Hydrolyse von Olivenölemulsionen
  • Zu 20 ml einer Lösung von Gummi arabicum (Sigma, 100 g/l in Wasser) werden 6.5 ml Olivenöl (Sigma, filtriert über Aluminiumoxid B, Aktivitätsstufe I) gegeben, und die Mischung wird mit einem Mixer 30 min homogenisiert. Zu 25 ml der Substratemulsion werden 20 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 9, zugegeben, der pH-Wert mit 0.1 M NaOH auf 8.0 eingestellt, und das Gemisch wird 2 min homogenisiert. In einem 2-ml-Eppendorfgefäß werden 10 mg des Enzymimmobilisats 5 min mit 0.1 ml Wasser geschüttelt, mit 0.9 ml der gepufferten Substratemulsion versetzt, auf einem Vortexschüttler 5 s gründlich gemischt und bei 30ºC und 1200 U/min 0.5-2 h geschüttelt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0.1 ml einer Lösung von konz. Schwefelsäure (1 ml) in Hexan/i-Propanol 1 : 5 (10 ml) beendet, und das Reaktionsgemisch mit 0.6 ml Hexan extrahiert. 0.4 ml der Hexanphase werden mit 1 ml Aceton/Ethanol 1 : 1 sowie Phenolphthalein versetzt, und die freie Fettsäure wird mit 0.1 M ethanolischer Kaliumhydroxidlösung titriert. Die Aktivitätsausbeute wird ermittelt durch Vergleich der erhaltenen Umsätze mit dem Umsatz, der unter identischen Reaktionsbedingungen mit einer Lösung der freien Lipase erreicht wird, und in Prozent angegeben.
    • (3) stereoselektive Veresterungen racemischer sekundärer Alkohole am Beispiel der Veresterung von 1-Phenylethanol mit Acetanhydrid und immobilisierter Ps.-cepacia-Lipase
  • Das Enzymimmobilisat (immobilisiert nach Beispiel 2e, Menge je nach Beladung) wird in 4 ml Benzol suspendiert, mit 2.4 umol Acetanhydrid sowie 2.4 umol des racemischen 1-Phenylethanols versetzt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur und 400 U/min geschüttelt. Zum Verfolgen der Reaktion werden in regelmäßigen Abständen Proben (0.15 ml) entnommen, mit 0.15 ml 5%iger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt, und nach Zentrifugation wird die organische Phase gaschromatographisch untersucht. Der Enantiomerenüberschuß nach beendeter Reaktion wurde gaschromatographisch (0.25 mm Kapillare, 30 m, Säulenmaterial: 6-t- Butyldimethylsilyl-2,3-dimethyl-&beta;-cyclodextrin, 20% in UV1701) bestimmt:
  • Umsatz: 50%; %ee (Ester): > 99; %ee (Alkohol): > 99
    • (4) Umesterung von Olivenöl mit Palmitinsäure am Beispiel immobilisierter Novo-SP523-Lipase
  • 0.2 g Palmitinsäure werden in der Wärme in 1.5 ml 2,2,4-Trimethylpentan gelöst, mit 0.2 ml Triolein (Sigma) gemischt, und das Enzymimmobilisat (Novo-SP-523-Lipase, immobilisiert gemäß Beispiel 12, Wassergehalt 16%, 58 mg, entprechend 0.15 mg des zur Immobilisierung eingesetzten löslichen Lipaseproteins) wird zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 40ºC und 1200 U/min geschüttelt. In regelmäßigen Abständen werden Proben (0.05 ml) abgenommen, und der Umsatz wird gaschromatographisch verfolgt (nach Silylierung mit BSTFA/TMCS (99 : 1)/Pyridin; Kapillarsäule mit PSO48-Phase). Die Aktivität (definiert als Verbrauch an Palmitinsäure von 1 U = 1 umol/min) beträgt 0.56 U, entsprechend 11.28 U/g Immobilisat.
    • (5) Hydrolyse von Olivenöl am Beispiel immobilisierter Ps.- cepacia-Lipase
  • Immobilisierte Ps.-cepacia-Lipase (Immobilisierungsmethode wie oben beschrieben bei zum Teil abweichender eingesetzter Enzymmenge; Menge nach Beladung, entprechend 0.12 mg zur Immobilisierung eingesetztem Lipaseprotein) wird mit 10 ml Wasser sowie 10 ml Olivenöl gemischt und bei 40ºC und 230 min&supmin;¹ geschüttelt (50 ml Polypropylengefäß mit Schraubverschluß, 2.7 cm Durchmesser). In regelmäßigen Zeitabständen werden Proben der Ölphase (0.15 ml) entnommen, mit Aceton/Ethanol 1 : 1 (1 ml) und Phenolphthalein versetzt, und die freigesetzte Fettsäure wird mit 0.06 M ethanolischer KOH titriert.
  • [a] mg zur Immobilisierung eingesetztes lösliches Enzymprotein/g erhaltenes Immobilisat;
  • [b] Anfangsgeschwindigkeit (mmol freigesetzte Säure/h)/mg zur Immobilisierung eingesetztes Lipaseprotein, v(frei) = 0.13 mmol KOH/h · mg kommerzielle Lipase)

Claims (16)

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Lipasen, dadurch gekennzeichnet, daß Lipasen in einer organische Substituenten über Si-C-Bindungen enthaltenden hydrophoben Siliciumoxidmatrix immobilisiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Lipasen in Gegenwart von Siliciumverbindungen mit nicht hydrolysierbaren organischen sowie hydrolysierbaren Substituenten und Mischungen solcher Siliciumverbindungen mit solchen, die nur vollständig hydrolysierbare Substituenten enthalten, in Gegenwart mindestens eines Katalysators und gegebenenfalls in Gegenwart mindestens eines Additivs immobilisiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs RkR"&sub1;Si(OR')m (A) und/oder [(R'O)nRoSi]pX (B) und/oder des Typs Y-(RqR"rSiO)SRqR"rSi-Y (C) verwendet werden, wobei R und R" aus einem gesättigten oder ungesättigten Alkylsubstituenten mit 1 bis 18 C-Atomen oder einem aromatischen Substituenten ausgewählt sind, R' ein Alkylrest mit 1-5 C-Atomen oder ein Alkalimetallatom ist X ein bi- oder höherfunktioneller Alkyl- oder Arylrest ist und Y -OH, -OR oder -Si(OR')&sub3; ist, k und l Zahlen von 0 bis 3 sind (mit 0 < k + l < 4), m eine Zahl von 2 bis 4 ist (mit m = 4 - l - k), n eine Zahl von 1 bis 3 ist, o eine Zahl von 0 bis 2 ist (mit o = 3 - n), p eine Zahl von 2 bis 4 ist, q und r Zahlen von 0 bis 2 sind (mit q + r = 2) und s eine Zahl von 1 bis 100 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs A verwendet werden, in denen R' = Alkyl oder Natrium ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs B verwendet werden, in denen R' = Alkyl, X = Alkylen oder Arylen ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs C in Kombination mit Verbindungen des Typs A eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs A mit R' = Alkyl oder Natrium eingesetzt werden, insbesondere AI, Alkyl- oder Aryltrialkoxysilane RSi(OR')&sub3; mit R = Alkyl mit einer Kettenlänge von C&sub1; bis C&sub1;&sub8;, Alkenyl oder Aryl.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs AII, Dialkyl-, Alkylaryl- oder Diarylalkoxysilane RkR"2-kSi(OR')&sub2; mit R, R" = Alkyl mit einer Kettenlänge von C&sub1; bis C&sub1;&sub8;, mit R' = Alkyl oder Natrium, in Kombination mit Komponenten des Typs AI eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs AIII, Tetraalkoxysilane Si(OR')&sub4; mit R' = Alkyl oder Natrium, in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, B oder C eingesetzt werden, wobei der Anteil der Siliciumatome mit einem oder mehreren organischen Substituenten mindestens 50 Atom-%, bezogen auf die eingesetzte Gesamtmenge an Silicium, beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Siliciumverbindungen des Typs B, in denen R' = Alkyl mit X = Alkylen oder Arylen ist, in Kombination mit Silanen des Typs AI, AII, C sowie B mit unterschiedlichem X verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Katalysatoren basische Verbindungen wie Ammonium- und Alkalimetallhydroxide, Ammoniak, Ammonium- und Alkalimetallfluoride sowie Kombinationen dieser Verbindungen eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Additive Proteine wie Albumin, Gelatine, Natriumcaseinat oder Polyhydroxyverbindungen wie Polyvinylalkohol, Sorbitol, Glycerin, Polyethylenglykol oder unlösliche organische Polymere oder anorganische Verbindungen wie Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;), Celite, offenporige Sintergläser oder Kieselgur eingesetzt werden.
13. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12 erhältlichen Lipasen zur Hydrolyse und/oder Umesterung von Estern sowie Veresterung von Alkohlen mit Säuren oder Säurederivaten.
14. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12 erhältlichen Lipasen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung digestiver Insuffizienzen, die durch pankreatische Fibrose verursacht werden.
15. Immobilisierte Lipase, die nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12 erhältlich ist.
16. Verfahren zur Hydrolyse und/oder Umesterung von Estern, das das Umsetzen der immobilisierten Lipase nach Anspruch 15 mit den Estern in organischen Medien umfaßt.
DE69512817T 1994-03-11 1995-03-04 In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen Expired - Fee Related DE69512817T2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE69512817T DE69512817T2 (de) 1994-03-11 1995-03-04 In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4408152A DE4408152A1 (de) 1994-03-11 1994-03-11 Immobilisierte Lipasen in hydrophoben Sol-Gel-Materialien
DE69512817T DE69512817T2 (de) 1994-03-11 1995-03-04 In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69512817D1 DE69512817D1 (de) 1999-11-25
DE69512817T2 true DE69512817T2 (de) 2000-04-06

Family

ID=6512449

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4408152A Withdrawn DE4408152A1 (de) 1994-03-11 1994-03-11 Immobilisierte Lipasen in hydrophoben Sol-Gel-Materialien
DE69512817T Expired - Fee Related DE69512817T2 (de) 1994-03-11 1995-03-04 In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4408152A Withdrawn DE4408152A1 (de) 1994-03-11 1994-03-11 Immobilisierte Lipasen in hydrophoben Sol-Gel-Materialien

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5817493A (de)
EP (1) EP0676414B1 (de)
JP (1) JPH07274964A (de)
AT (1) ATE185816T1 (de)
CA (1) CA2144218A1 (de)
DE (2) DE4408152A1 (de)
DK (1) DK0676414T3 (de)
ES (1) ES2137388T3 (de)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
DE19731990A1 (de) * 1997-07-25 1999-01-28 Studiengesellschaft Kohle Mbh Verfahren zur Herstellung und Identifizierung von neuen Hydrolasen mit verbesserten Eigenschaften
US6756217B1 (en) * 1998-05-29 2004-06-29 Southern Illinois University Glass composite materials containing alkoxosilane derivative having alterable charge, hydrophobic and hydrophilic groups
DE19850507C1 (de) * 1998-11-03 2000-05-04 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Acrylsäureestern und/oder Methacrylsäureestern von hydroxyfunktionellen Siloxanen und/oder polyoxyalkylenmodifizierten Siloxanen und deren Verwendung
FR2788280B1 (fr) * 1999-01-08 2001-04-06 Sophim Procede de fabrication d'un emollient non gras a partir d'extraits d'olives
US20010046493A1 (en) * 2000-02-24 2001-11-29 Alex Margolin Lipase-containing composition and methods of use thereof
DE10041809A1 (de) * 2000-08-25 2002-03-07 Giesing Michael Arrays immobilisierter Biomoleküle, deren Herstellung und Verwendung
DE10046039A1 (de) * 2000-09-18 2002-03-28 Basf Ag Polykondensation von organischen Siliciumverbindungen
US6569233B2 (en) 2001-09-25 2003-05-27 W. R. Grace & Co.-Conn. Pumpably verifiable fluid fiber compositions
US6790275B2 (en) 2001-09-25 2004-09-14 W. R. Grace & Co.-Conn. Pumpably verifiable fluid fiber compositions
US6855556B2 (en) 2002-01-04 2005-02-15 Becton, Dickinson And Company Binding protein as biosensors
US20030153026A1 (en) * 2002-01-04 2003-08-14 Javier Alarcon Entrapped binding protein as biosensors
US20030207304A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-06 Eric Black Glycerol-doped aerogel coatings as biological capture media
CA2486676A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Mcmaster University Polyol-modified silanes as precursors for silica
WO2004018360A1 (en) * 2002-08-23 2004-03-04 Mcmaster University Methods and compounds for controlling the morphology and shrinkage of silica derived from polyol-modified silanes
US7311926B2 (en) * 2002-12-20 2007-12-25 Battelle Memorial Institute Biocomposite materials and methods for making the same
US7142464B2 (en) * 2003-04-29 2006-11-28 Saifun Semiconductors Ltd. Apparatus and methods for multi-level sensing in a memory array
US7642077B2 (en) 2003-12-08 2010-01-05 Genencor International, Inc. Biocomposite comprising co-precipitate of enzyme, silicate and polyamine
ATE476659T1 (de) * 2004-06-09 2010-08-15 Becton Dickinson Co Sensor für mehrere analyte
CN101068565B (zh) * 2004-10-14 2010-11-17 胞囊纤维化基础治疗公司 治疗胰腺功能不全的包含脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物
FR2877007B1 (fr) * 2004-10-22 2006-12-08 Rhodia Chimie Sa Preparation de silicones et silanes fonctionnalises via une catalyse enzymatique
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US20100196344A1 (en) * 2005-10-14 2010-08-05 Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating pancreatic insufficiency
IL180598A0 (en) * 2007-01-08 2007-07-04 Basheer Sobhi Immobilized interfacial enzymes of improved and stabilized activity
ITMI20070435A1 (it) 2007-03-05 2008-09-06 Innovate Biotechnology Srl 2',3'-di-o-acil-5-fluoronucleosidi
DE102010028788B4 (de) * 2010-05-10 2022-03-31 Tutech Innovation Gmbh Ein in der Reaktivrektifikation einsetzbarer, einen Biokatalysator aufweisender Kolonneneinbau und dessen Verwendung in der Reaktivrektifikation
EP2834355A4 (de) * 2012-04-06 2016-03-23 Akermin Inc Polysilikat-polysilikon-enzymimmobilisierungsmaterialien
CA2922223C (en) 2012-11-05 2021-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services And Human Services Ketone bodies to protect tissues from damage by ionizing radiation
GB2552704A (en) * 2016-08-04 2018-02-07 Univ Bath Biomolecule preservation
CN114836409A (zh) * 2022-05-05 2022-08-02 南京师范大学 生物分子的固定化方法及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2267992A1 (de) * 1974-04-19 1975-11-14 Rhone Poulenc Ind
US4148689A (en) * 1976-05-14 1979-04-10 Sanraku-Ocean Co., Ltd. Immobilization of microorganisms in a hydrophilic complex gel
DE3537259A1 (de) * 1985-10-19 1987-04-23 Hoechst Ag Copolymerisat, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als enzymtraeger
SU1696475A1 (ru) * 1989-02-09 1991-12-07 Институт Микробиологии Ан Узсср Способ получени иммобилизованной липазы
EP0418355B1 (de) * 1989-04-04 1994-08-17 PITTNER, Fritz, Ass.Prof.Doz.Dr. Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen od.dgl. an einem träger
US5200334A (en) * 1991-08-13 1993-04-06 The Regents Of The University Of California Sol-gel encapsulated enzyme
JP3030245B2 (ja) * 1995-12-26 2000-04-10 三洋電機株式会社 画像表示装置

Also Published As

Publication number Publication date
CA2144218A1 (en) 1995-09-12
DK0676414T3 (da) 2000-04-25
DE69512817D1 (de) 1999-11-25
JPH07274964A (ja) 1995-10-24
EP0676414B1 (de) 1999-10-20
ES2137388T3 (es) 1999-12-16
ATE185816T1 (de) 1999-11-15
US5817493A (en) 1998-10-06
US6080402A (en) 2000-06-27
DE4408152A1 (de) 1995-09-14
EP0676414A1 (de) 1995-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69512817T2 (de) In Sol-Gel immobilizierte Lipase bearbeitet hydrophoben Substanzen
DE68907611T2 (de) Auf teilchen immobilisierte lipasezubereitung, verfahren zur herstellung und deren verwendung.
Reetz et al. Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrophobic sol‐gel materials
EP2011865B1 (de) Enzympräparate
EP0140542B1 (de) Immobilisierte Lipase-Zubereitung und deren Verwendung
DE3886412T2 (de) Verfahren zur immobilisierung von lipasen.
Stamatis et al. Kinetic study of lipase catalyzed esterification reactions in water‐in‐oil microemulsions
EP2163617B1 (de) Enzympräparate
de Fuentes et al. Different phyllosilicates as supports for lipase immobilisation
JPH08511159A (ja) 固定化リパーゼ
JPH0458958B2 (de)
DE3872924T2 (de) Verfahren zur herstellung von optisch aktiven verbindungen.
Soares et al. Characterization of sol–gel encapsulated lipase using tetraethoxysilane as precursor
Yong et al. Kinetic studies on immobilised lipase esterification of oleic acid and octanol
US5232843A (en) Preparation of immobilized lipase by adsorption of lipase and a non-lipase protein on a support
ITPD20100392A1 (it) Metodo per l&#39;immobilizzazione covalente di enzimi su supporti polimerici solidi funzionalizzati
Chen et al. Polyvinyl formal resin plates impregnated with lipase-entrapped sol–gel polymer for flavor ester synthesis
Diaz et al. Effect of nonionic surfactants on Rhizopus homothallicus lipase activity: a comparative kinetic study
EP0424130B1 (de) Enzym auf einem Träger
Soares et al. Characterization of sol-gel bioencapsulates for ester hydrolysis and synthesis
JP2657887B2 (ja) 固定化酵素の調製方法
Yamane A Comparison of Assays on Hydrolytic Activity of Lipase with and without Surfactant Bioreactors for Fats and Oils, Part IX.
JPS6251594B2 (de)
Dierov et al. Preparation of immobilized lipases of the fungus Rhizopus microsporus UzLT-1 and their properties
EP0648277A1 (de) Mikrobielle esterase zur enantioselektiven spaltung von 1-arylalkylestern.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee