CN101068565B - 治疗胰腺功能不全的包含脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗包括胰腺功能不全的疾病的组合物。本发明的组合物包括特定比例的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，为例如患有胰腺功能不全的患者提供有益的结果。本发明也涉及用该组合物治疗胰腺功能不全的方法。

Description

治疗胰腺功能不全的包含脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物

与相关申请的交叉参考

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2004年10月14日提交的美国临时专利申请60/618,764的权益，在此通过参考将其内容引入本文。

发明的技术领域

本发明涉及治疗疾病，包括胰腺功能不全的组合物。本发明的组合物包括特定比例的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，为例如患有胰腺功能不全的患者提供有益的结果。本发明也涉及用该组合物治疗胰腺功能不全的方法。

发明背景

消化作用构成了一种生理学过程，通过该作用，摄取的食物被分解成容易吸收的营养组分。在摄取后，食物通过胃肠道不同的段，并主要通过消化酶进行消化。该过程必需的三组消化酶包括脂酶(用于脂肪的消化)、蛋白酶(用于蛋白质的消化)和淀粉酶(用于糖类的消化)。

食物消化和营养物吸收发生在小肠中。在那里，消化酶将摄取的食物分解使其易于吸收。大多数消化酶由胰分泌，并通过胰管进入小肠。

胰影响很多适当的消化、营养和代谢所需的外分泌和内分泌活动。胰的外分泌活动包括分泌蛋白质，所述蛋白质在小肠中发挥酶的作用而催化脂肪水解成甘油和脂肪酸，催化蛋白质成为肽和氨基酸，催化糖成为糊精、二糖和单糖，例如葡萄糖。外分泌的胰腺功能不全(下文作＂胰腺功能不全＂)导致胰脏功能降低，其可由很多的临床疾病引起的。例如，胰腺功能不全与囊性纤维化病、慢性胰腺炎、急性胰腺炎、胰腺癌和Shwachmann-Diamond综合征有关[E.P.DiMagno等，inThe Pancreas：Biology，Pathobiology and Disease，2d Ed.，V.Liang等，eds.，pp.665-701(1993)]。

在患有胰腺功能不全的患者中，胰脏不能产生和/或分泌足够量的消化酶来支持正常的消化过程，包括脂肪、蛋白质和糖的消化。结果，这些患者患上了营养物吸收不良。胰脏功能不全的临床表现包括腹部绞痛、胃气胀、腹泻、脂肪痢、恶心和体重下降。

胰腺功能不全存在于89％的患囊性纤维化病的患者中[D.Borowitz等，＂Use of Fecal Elastase-1 to IdentifyMisclassification of Functional Pancreatic Status in Patientswith Cystic Fibrosis＂，J.Pediatr.，145，pp.322-326(2004)]。囊性纤维化病是一种常染色体隐性遗传的遗传病，其主要作用于胃肠和呼吸***[S.M.Rowe等，＂Mechanisms of Disease：CysticFibrosis＂，N.Eng1.J.Med.，352，pp.1992-2001(1995)]。在囊性纤维化病的患者中产生了异常量和粘度的粘液，阻止分泌出足够量的胰酶。胰分泌物的体积减少导致胰管内的浓缩，阻止了酶和碳酸氢盐流入到十二指肠中。结果，患有胰腺功能不全的囊性纤维化病患者会发生消化不良以及脂肪和蛋白质显著的吸收不良。例如，这些患者典型地吸收小于60％的饮食脂肪[M.Kraisinger等，＂ClinicalPharmacology of Pancreatic Enzymes in Patients with CysticFibrosis and in vitro Performance of MicroencapsulatedFormulations＂，J.Clin.Pharmacol.，34，pp.158-166(1994)]。如果没有治疗，囊性纤维化病患者的消化不良和吸收不良会导致营养不良，无法增加或维持体重并降低生长，以及使慢性化脓性肺病恶化[K.Gaskin等，＂Improved Respiratory Prognosis in CF Patientswith Normal Fat Absorption＂，J.Pediatr.，100，pp.857-862(1982)；J.M.Littlewood等，＂Control of Malabsorptionin Cystic Fibrosis＂，Paediatr.Drugs，2，pp.205-222(2000)]。

迄今为止，胰腺功能不全的标准疗法主要是基于口服猪的胰脂酶，其包含脂酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性酶和淀粉酶。尽管猪的胰酶补充物包含大量的淀粉酶，但据报道，囊性纤维化病患者具有正常的淀粉酶水平[P.L.Townes等，＂Amylase Polymorphism：Studies of Sera and Duodenal Aspirates in Normal Individualsand in Cystic Fibrosis＂，Am.J.Hum.Genet.，28，Dp.378-389(1976)]。因此，据信淀粉酶没有增加多糖消化的功能[E.Lebenthal等，＂Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency：Present Status and Future Needs，＂Pancreas，9，pp.1-12(1994)]。猪的胰补充物中的脂酶、蛋白酶和淀粉酶组分典型地是1：3.5：3.5。

胰酶补充物通常是与食物一起口服的。当这些补充物通过低pH环境的胃时，这些酶的活性迅速减小。结果需要很高的酶浓度(有时多达每份食物15粒胶囊或片剂)来确保在近侧小肠中存在足够的活性酶以缓解胰腺功能不全。

因为蛋白酶和脂酶在胃的酸性环境中可以不可逆地变为非活性的，因此，可以将肠溶衣技术用于胰酯酶产品，以将其封闭在在微珠中，或用保护性肠溶衣处理它们。尽管这些肠溶衣改善了产品的性能，但仍然需要较大量的补充物才能得到治疗益处[J.H.Meyer，in Pancreatic Enzymes in Health and Disease，P.G.Lankisch，ed.，pp.71-88(1991)]。为实现减少治疗胰腺功能不全必需的片剂或胶囊量的目的，引进了高强度的胰脂酶产品线(

)。但是在1991年United States Cystic Fibrosis Foundation和FDA联合报道了，服用该高强度产品在患有囊性纤维化病的儿童中发生纤维性结肠病的多个病例[S.C.Fitzsimmons等，＂High-Dose Pancreatic-EnzymeSupplements and Fibrosing Colonopathy in Chil dren with CysticFibrosis＂，N.Eng1.J.Med.，336，pp.1283-1289(1997)]。在这些患者中，结肠纤维化导致狭窄，经常需要手术，在一些情况下，需要进行结肠切除术。

作为一种降低胰酶每日剂量的方法，FDA从市场上排除了高强度产品(定义为大于每kg体重2,500USP单位)[D.S.Borowitz等，＂Use of Pancreatic Enzyme Supplements for Patientswith CysticFibrosis in the Context of Fibrosing Colonopathy＂，J.Pediatr.，127，pp.681-684(1995)]。此外，United States Cystic FibrosisFoundation和FDA联合建议对胰酶提取物[Id.]的络合性质进行详细检查。Consensus Panel也建议调查替代的酸稳定的脂酶。

无论给出的胰酶补充物是否是肠溶衣包被的，由于患者中小肠的酸化作用的不同，这些补充物的生物利用度大为不同。结果，许多患者服用pH调节剂，例如组胺-2(H₂)受体阻断剂和质子泵抑制剂(PPI)来改善酶补充物的临床效力[P.G.Lankish，＂EnzymeTreatment of Exocrine Pancreatic Insufficiency in ChronicPancreatitis′，Digestion，54(Supp.2)，pp.21-29(1993)；D.Y.Graham，＂Pancreatic Enzyme Replacement：the Effect of Antacidsor Cimetidine＂，Dig.Dis.Sci.，27，pp.485-490(1982)；J.H.Saunders等，＂Inhibition of Gastric Secretion in Treatment ofPancreatic Insufficiency＂，Br.Med.J.，1，pp.418-419(1977)；H.G.Heijerman等，＂Omeprazole Enhances the Efficacy ofPancreatin(Pancrease)in Cystic Fibrosis＂，Ann.Inter.Med.，114，pp.200-201(1991)；M.J.Bruno等，＂Comparative Effeetsof Adjuvant Cimetidine and Omprazole during Pancreatic EnzymeReplacement Therapy＂，Dig.Dis.Sci.，39，pp.988-992(1994)]。

经鉴定，在效力和药物性质方面的差异和缺乏稳定性已经成为一些患者对常规的胰酶补充物应答性较差的重要因素[CL.Chase等，＂Enzyme Content and Acid Stability of Enteric-CoatedPancreatic Enzyme Products in vitro＂，Pancreas，30，pp.180-183(2005)；D.S.Borowitz等，J.Pediatr.，127，同上；C.J.Powell等，＂Colonic Toxicity from Pancreatine：aContemporary Safety Issue＂，Lancet，353，pp.911-915(1999)；E.Lebenthal等，＂Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency：Present Status and Future Needs＂，Pancreas，9，pp.1-12(1994)；P.Regan等，＂Comparative Effects of Antacids，Cimetidine andEnteric Coating on the Therapeutic Response to Oral EnzymesinSevere Pancreatic Insufficiency＂，N.Eng.J.Med.，297，pp.854-858(1977)]。这些因素包括酶活性的批次间差异，通过暴露在日光、热和潮湿中随着时间对活性损失的敏感性和难以限制的有害反应范围[D.S.Borowitz等，J.Pediatr.，127，同上]。其他使胰腺功能不全的治疗复杂化的因素包括胃液和/管内的蛋白酶对替代酶的破坏作用、酶补充物与食物营养物的不同步胃排空，以及酶从肠溶衣制剂中的延迟释放[P.G.Lankish，Digestion，54同上；P.Regan等，N.Eng.J.Med.，297，同上]。

由于常规胰酶补充物特征性的效力、稳定性和生物利用度的问题，已经建议使用来自微生物的酶作为来自胰的酶的替代品。例如美国专利6,051,220描述的组合物，包含一种或多种酸稳定性脂酶和一种或多种酸稳定性淀粉酶，二者都优选来自真菌。美国专利申请2004/0057944描述的组合物，包含Rhizopus delemar脂酶、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)蛋白酶和米曲霉淀粉酶。美国专利申请2001/0046493描述的组合物，包含交联结晶的细菌脂酶、真菌或植物的蛋白酶和真菌或细菌的淀粉酶。

尽管有了这些发展，仍然有需要优化的剂量制剂来进一步改善胰酶补充物的效力和患者的顺应性。胰酶补充物的目标是以最低的剂量得到最高的效力，其特征在于良好限制的安全谱，这对患有胰腺功能不全的所有患者，包括患有囊性纤维化病的那些都是极为重要的。

发明简述

本发明涉及治疗疾病包括胰腺功能不全的组合物和方法。根据一个优选的实施方案，本发明的组合物的特征在于交联的微生物的脂酶晶体、微生物的蛋白酶和微生物的淀粉酶，酶活性的比例为约1.0：1.0：0.15USP单位。有利地，这些组合物的特征在于稳定的酶组分，依次保证了活性酶在体内递送到胃肠道，因此可以有效的低剂量的治疗方法治疗胰腺功能不全。

附图简述

附图1说明的是在2期研究期间与基线相比，在根据本发明的组合物治疗的患者中平均的脂肪吸收系数(＂CFA＂)的变化。

附图2说明的是在2期研究期间与基线相比，在根据本发明的组合物治疗的患者中平均的氮吸收系数(＂CNA＂)的变化。

附图3说明的是在2期研究期间在根据本发明的组合物治疗的患者中，在基线时脂肪吸收系数(＂CFA＂)和氮吸收系数(＂CNA＂)之间的相关性。

附图4说明的是在2期研究期间在根据本发明的组合物治疗的患者中，在治疗水平时脂肪吸收系数(＂CFA＂)和氮吸收系数(＂CNA＂)之间的相关性。

附图5说明的是在2期研究期间在根据本发明的组合物治疗的患者中，在治疗和基线水平时脂肪吸收系数(＂CFA＂)和氮吸收系数(＂CNA＂)之间的相关性的不同。

附图6说明的是在1期研究期间与基线相比，在根据本发明的不同剂量治疗的囊性纤维化病患者中平均的脂肪吸收系数(＂CFA＂)的变化。

附图7说明的是在1期研究期间与基线相比，在根据本发明的不同剂量治疗的患者中平均的氮吸收系数(＂CNA＂)的变化。

发明详述

本发明涉及下列发现：包含酶活性的比例为约1.0：1.0：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物对于治疗疾病，包括胰腺功能不全是有效的。独特比例的脂酶、蛋白酶和淀粉酶可以低剂量治疗方法来治疗这些不可能用常规来自猪的胰酶补充物治疗的疾病。此外，该脂酶、蛋白酶和淀粉酶的比例避免了高浓度的蛋白酶，而在常规的酶补充物中认为蛋白酶需要为纤维性结肠病负责[D.S.Borowitz等，J.Pediatr.，127，同上]。

根据一个优选的实施方案，本发明的组合物包含交联的微生物的脂酶晶体、微生物的蛋白酶和微生物的淀粉酶，酶活性的比例为约1.0：1.0：0.15USP单位。

定义

除非另有说明，下列的术语应当理解为具有下列含义：

术语“无定形”是指晶体、晶质或半晶质状态以外的所有状态。无定形物质包括无定形固体和液体。

术语“晶体”或“晶质”是指一种固体状态的物质，包含三维上有规律地重复的样式排列的原子[参见，例如，Ba rrett，Structure of Methals，2^nded.，(1952)]。晶体或晶质形式的酶与其无定形或半晶质形式是不同的。晶体表现了特征性的特征，包括晶格结构、特征性的形状和光学性质，例如折射率。

术语“半晶体”是指具有晶质和无定形区域的物质的固体状态。

术语“受试者”、“患者”或“个体”是指任意的哺乳动物，包括任意分类为此的动物，包括人或其他灵长类。

术语“消化不良”是指营养物(例如脂肪、蛋白质和糖类)分解为其可吸收组分(单-、二、或低聚糖、氨基酸、寡肽、脂肪酸和甘油一酯)的过程受损。消化不良可以导致多种疾病，包括胰腺功能不全。

术语“吸收不良”是指消化的营养物包括维生素和微量元素从小肠或大肠吸收的受损。吸收不良可以是由于肠内层或消化的异常情况导致的粘膜摄取缺陷而导致的。很多营养物或者特别地是大量营养物，即脂肪、蛋白质、糖类以及微量营养物，例如钙、镁、铁和维生素都会发生小肠吸收不良。吸收不良可以导致多种疾病，包括胰腺功能不全。蛋白质吸收不良也称作“氮溢”。脂类的吸收不良也称作“脂肪痢”。

术语“脂酶”是指催化脂类水解(即通过加入水将化合物的羟基和氢原子分离成片段)成甘油和简单的脂肪酸的酶。该酶反应通常需要钙离子(Ca²⁺)。胰分泌的脂酶对于在小肠上端环路中脂(甘油三酯)的消化是极其重要的。根据一个优选的实施方案，在本发明的组合物和方法中有用的脂酶是非胰脂酶，即，它们不是从人或动物的胰组织中纯化的。根据本发明一个更优选的实施方案，该脂酶是微生物的脂酶。根据一个进一步优选的实施方案，该脂酶是细菌的脂酶。细菌的脂酶例如包括假单细胞菌(Pseudomonas)的脂酶和/或伯克霍尔德氏菌的脂酶。

微生物的脂酶可以是从它们天然的微生物来源分离的，或它们可以是经重组DNA技术，通过适当的宿主细胞产生的重组微生物的脂酶，其中宿主细胞是选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞中的任一种，优选细菌。重组脂酶包括或者是由来自天然的脂酶序列的核酸编码的。进一步地，重组脂酶包括与天然序列是同源的或基本上相同的，以及由与编码天然脂酶的核酸同源或基本上相同的核酸编码的那些脂酶。可替代的，在本发明的组合物和方法中有用的脂酶可以是通过常规的肽合成技术合成的。

术语“蛋白酶”涉及蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶，其是一种催化蛋白质内酰胺肽键***的酶。具体地，蛋白酶通过断裂一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间的酰胺键将蛋白质转变成它们的组成氨基酸。一般通过它们的催化类型将蛋白质分类，例如门冬氨酸肽酶、半胱氨酸(硫醇)肽酶、金属肽酶、丝氨酸肽酶、苏氨酸肽酶、碱性或半碱性蛋白酶、中性和催化机制未知的肽酶(见http://merops. sanger.ac.uk)。根据一个优选的实施方案，在本发明的组合物和方法中有用的蛋白酶是非胰蛋白酶，即它们不是从人或动物的胰组织中纯化的。根据本发明一个更优选的实施方案，该蛋白酶是微生物的蛋白酶。根据本发明进一步优选的实施方案，该蛋白酶是真菌的蛋白酶。根据本发明进一步优选的一个实施方案，该蛋白酶是蜂蜜曲霉蛋白酶。

微生物的蛋白酶可以是从它们天然的微生物来源分离的，或它们可以是经重组DNA技术，通过适当的宿主细胞产生的重组微生物的蛋白酶，其中宿主细胞是选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞中的任一种，优选真菌。重组蛋白酶包括或者是由来自天然的蛋白酶序列的核酸编码的。进一步地，重组蛋白酶包括与天然序列是同源的或基本上相同的，以及由与编码天然蛋白酶的核酸同源或基本上相同的核酸编码的那些蛋白酶。可替代的，在本发明的组合物和方法中有用的蛋白酶可以是通过常规的肽合成技术合成的。

术语“淀粉酶”是指在胰中产生的酶，而且也在人但不是所有哺乳动物的唾液腺中产生。人唾液淀粉酶称作涎液素。淀粉酶是负责消化糖例如多糖的主要消化酶，在小肠中催化淀粉(直链淀粉和支链淀粉)的两个组分转变成简单的糖。更具体地，淀粉酶水解淀粉、糖原和糊精而形成葡萄糖、麦芽糖和有限的糊精。在临床上，血液淀粉酶水平通常在急性，有时在慢性胰腺炎的情况中升高。术语“非胰淀粉酶”是指不能够在人或动物的胰组织中纯化的淀粉酶。根据本发明一个更优选的实施方案，该淀粉酶是微生物的淀粉酶。根据本发明一个进一步的实施方案，该淀粉酶是真菌淀粉酶。根据本发明一个进一步的实施方案，该淀粉酶是曲霉(Aspergillus)淀粉酶，优选是米曲霉淀粉酶。

微生物的淀粉酶可以是从它们天然的微生物来源分离的，或它们可以是经重组DNA技术，通过适当的宿主细胞产生的重组微生物的淀粉酶，其中宿主细胞是选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞中的任一种，优选真菌。重组淀粉酶包括或者是由来自天然的蛋白酶序列的核酸编码的。进一步地，重组淀粉酶包括与天然序列是同源的或及基本上相同的，以及由与编码天然淀粉酶的核酸同源或基本上相同的核酸编码的那些淀粉酶。可替代的，在本发明的组合物和方法中有用的淀粉酶可以是通过常规的肽合成技术合成的。

术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是指组合物的量预防、延迟了症状的发生，或改善了要治疗的疾病的症状。治疗有效量足以治疗、预防、降低严重度，延迟发病，或减少要治疗的疾病的一种或多种症状的发生。用本发明的组合物可以治疗的疾病包括，例如胰腺功能不全、吸收不良和消化不良。

术语“USP单位”是指在每种试剂或组合物中存在酶活性的美国药典单位。一个USP单位的脂酶、蛋白酶或淀粉酶定义参见Pancrelipase，USP，U.S.Pharmacopeia National Formulary，USP24，pp.1254-1255(2000)。在该文献中公开了脂酶、蛋白酶和淀粉酶的分析，将其通过参考引入本文。

本发明的组合物的特性

有利地，本发明的组合物在患有疾病例如胰腺功能不全的患者中改善了脂肪、蛋白质和淀粉的吸收，改善了营养和生长。该组合物在酸性-胃蛋白酶环境中保持了较高水平的特定活性。出现这种情况，是因为它们的酶组分能够抵抗胃肠道较上端(包括较低pH的胃和较高蛋白酶水平的胃肠道)的酸性环境；允许酶以活性形式递送到肠中。结果，与猪的胰酶补充物相比，它们可以按每剂量较低量和通过更少的施用方法施用。这样，依次地，调节了患者改善的顺应性。

此外，本发明的组合物可以施用于患者，而不需要肠溶衣或者加入抑酸剂。出现这种情况，是因为在本发明的各个实施方案中使用的来自微生物的酶组分比猪的胰酶对胃酸更稳定。

脂酶组分

本发明的组合物的脂酶组分优选是微生物的脂酶。更优选地，该脂酶是细菌的，而不是真菌或植物来源的。

该脂酶优选是在酸性pH环境中稳定的和/或对蛋白水解降解耐受的。该脂酶也可以能增强其对酸性pH稳定和/或其对蛋白水解降解耐受的形式使用。所以，该脂酶优选是交联晶体的形式。任何上述的脂酶可以用于形成本发明的组合物的交联脂酶晶体组分。

脂酶的晶化作用

在本发明的组合物中有用的脂酶晶体可以用常规方法例如分批结晶来生长。参见，例如，US专利6,541,606。可替代地，可以通过控制水溶液或包含有机溶剂的水溶液外的蛋白质的沉淀来使脂酶晶体生长。参见例如美国专利5,618,710和美国专利申请2003/0017144。本领域技术人员将会认识到，在结晶期间要控制的条件包括，例如溶剂的蒸发速率、适当的共溶质和缓冲液的存在、pH和温度。

脂酶晶体可以通过将要结晶的脂酶与适当的溶剂或包含适当的沉淀剂例如盐或有机试剂的水性溶剂混合来制备。该溶剂与脂酶混合，并任选在实验确定的温度下搅拌，其中该温度适合诱导结晶并且是维持蛋白质稳定性和活性可接受的。溶剂任选可以包括共溶质，例如二价阳离子，辅助因子或促溶剂，以及控制pH的缓冲物质。可以通过实验确定其对共溶质的需要和其浓度，以促进结晶。为了工业规模的方法，导致结晶的控制沉淀法最好是通过在批次过程中简单混合蛋白质、沉淀剂、共溶质、和任选地，缓冲液来进行。可替代地，也可以使用实验室结晶方法，例如透析或蒸汽扩散。McPherson等，MethodsEnzymol.，114，pp.112-120(1985)和Gilliland，J. Crystal Growth，90，pp.51-59(1988)包括了在结晶类文献中适当条件的综合性列表。偶然地，结晶介质和交联剂之间的不相容性可能需要在交联前更换缓冲液或溶剂。

脂酶在很多条件下包括pH范围约4-9时结晶。为了制备本发明的组合物的脂酶组分，有用的沉淀剂包括异丙醇、叔丁醇、2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)、硫酸铵、氯化钠、氯化镁和其他本领域已知的那些。有用的盐包括二价或一价阳离子和它们的盐。

在本发明的组合物中有用的脂酶最大尺度可以在约0.01μm到约500μm之间，可替代地在约0.1μm到约50μm，或在约0.1μm到约10μm之间。它们的形状可以选自球形、针状、杆状、板状，例如六角形和方形、菱形、立方体、双锥体和棱镜状。

脂酶晶体的交联

当晶体已经在适当的介质中生长时，可以将它们交联。通过在晶体的组成蛋白质分子之间引入共价键，交联使得晶格稳定化。这就使酶转移到交互环境中成为可能，其中对于给定的酶，交互环境可以是与晶格或完整的酶的存在不相容的。

脂酶晶体的交联的结果是，可以变化酶的稳定性(例如，pH、温度、机械和/或化学稳定性)、脂酶活性的pH范围、溶解性、晶体大小或体积的均一性、脂酶从晶体中的释放速率、和/或在下列晶格中个体酶分子之间的孔径和形状。

有利地，交联是以这样一种方式进行的，以使得与未修饰的脂酶相比，所得到的交联晶体中包含的脂酶显示至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.7％，或99.9％或更高的脂酶活性。与未修饰的脂酶相比，稳定性提高了至少约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％，250％，300％或更高。稳定性可以在贮存条件下测定，例如pH稳定性、温度稳定性、对蛋白酶包括胃肠蛋白酶和Pronase^TM的稳定性、溶解稳定性或体内生物稳定性。

在一些情况中，脂酶晶体的交联减缓了脂酶溶解到溶液中，有效地将酶分子固定在了微晶颗粒中。当暴露在交联脂酶晶体周围的环境，例如使用条件而不是贮存条件中的触发剂时，脂酶晶体溶解，释放出脂酶多肽和/或增强了脂酶的活性。溶解速率可以通过一种或多种下列因素来控制：例如，交联的程度、脂酶晶体暴露在交联剂中的时间长度、向脂酶晶体中加入交联剂的速率、交联剂的性质、交联剂的链长、pH、温度、含硫羟基试剂例如半胱氨酸或谷胱甘肽的存在、交联的脂酶晶体的表面积、交联的脂酶晶体的大小或交联的脂酶晶体的形状。

脂酶晶体可以同时(并联)或按顺序用一种交联剂或交联剂的组合来交联，包括多功能交联剂，包括双功能试剂。在各种实施方案中，当暴露在周围环境中的触发剂中或暴露超过了给定时间时，会减小或弱化脂酶晶体之间的交联；因此导致脂酶溶解或释放活性。可替代的，可以在连接点使交联断裂，导致蛋白质溶解或释放活性。参见例如，美国专利5,976,529和6,140,475。可以根据任意的常规交联技术进行交联。

在交联的脂酶晶体中交联剂的最终浓度的范围应当是在约0.001mM到300mM之间，优选约1.0mM到约50mM之间，最优选约2.0mM到约5.0mM之间。

根据本发明一个优选的技术方案，交联剂是二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(＂BS³＂)。其他有用的交联剂包括戊二醛、琥珀醛、辛-二醛和乙二醛。其他的多功能交联剂包括卤素-三嗪类，例如氰脲酰氯；卤素-嘧啶类，例如2，4，6-三氯/溴-嘧啶；脂肪或芳香单或二羧酸的酐或卤化物，例如马来酸酐、(甲基)丙烯酰氯、氯乙酰氯；N-羟甲基化合物，例如，N-羟甲基-氯乙酰胺；二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，例如次苯基-1，4-二异氰酸酯和氮丙啶。其他的交联剂包括环氧化物，例如二-环氧化物、三-环氧化物和四-环氧化物。作为其他可用的交联剂的代表性列表，可以参见2003-2004版的the Pierce ChemicalCompany Catalog。交联剂的其他例子包括：二甲基3，3′-二硫代二丙亚胺酸酯·HCl(DTBP)；二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)；二马来酰亚胺己烷(BMH)；1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)；二甲辛二亚胺酸酯·2HCl(DMS)；二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)；二琥珀酰亚胺酒石酸酯(Sulfo-DST)；盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)；乙二醇二[磺基-琥珀酰亚胺琥珀酸酯](Sulfo-EGS)；N-[γ-马来酰亚胺-丁酰基氧]琥珀酰亚胺酯(GMBS)；N-羟基磺基-琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(Sulfo-HSAB)；磺基-琥珀酰亚胺-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺]己酸酯(Sulfo-LC-SMPT)；二[β-(4-叠氮基-水杨胺)乙基]二硫化物(BASED)；和NHS-PEG-乙烯基砜(NHS-PEG-VS)。

可以使用可逆的交联剂。这些可逆的交联剂是在其中掺入了触发剂作为分离基团的多功能交联剂。反应官能团包括在与蛋白质的反应性氨基酸侧链的连接中。触发剂包括可以通过变化一种或多种周围环境中的条件(例如，pH、还原剂的存在、温度或热力学水活性)而断裂的键。

交联剂可以是同功能的或多功能的。反应的官能团(或部分)可以是，例如选自一种或多种下列的官能团(其中R、R′、R＂和R＂′可以是烷基、芳基或氢)：

I.反应性酰基供体，例如：羧酸酯RCOOR′、酰胺RCONHR′、酰叠氮RCON₃、碳二亚胺R-N＝C＝N-R′、N-羟基酰亚胺酯、RCO-O-NR′、亚氨酸酯R-C＝NH2⁺(OR′)、酐RCO-C-COR′、碳酸酯RO-CO-O-R′、氨基甲酸乙酯RNHCONHR′、酸的卤化物RCOHa1(其中Ha1＝卤素)、酰基肼RCONNR＂R＂、和O-酰基异脲RCO-O-C＝NR′(-NR＂R＂′)。

II.反应性羰基，例如：醛RCHO和酮RCOR′、缩醛RCO(H₂)R′、和缩酮RR′CO₂R′R＂(反应性羰基包含蛋白质固定化和交联领域已知的官能团(Pierce Catalog and Handbook，Pierce Chemical Company2003-2004：S.S.Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，(1991)。

III.烷基或芳基供体，例如烷基或芳基卤化物R-Ha1、叠氮R-N₃、硫酸酯RSO₃R′、磷酸酯RPO(OR′₃)、烷基氧鎓盐R₃O⁺、锍R₃S⁺、硝酸酯RONO₂、Michael受体RCR′＝CR＂′COR＂、芳基氟ArF、异腈RN⁺≡C-、卤代胺R₂N-Ha1、烯烃和炔。

IV.包含硫的基团，例如二硫化物RSSR′、巯基RSH、和环氧化物R₂COCR′₂。

V.盐，例如烷基或芳基铵盐R₄N⁺、羧酸盐RCOO-、硫酸盐ROSO₃-、磷酸盐ROPO₃＂、和胺R₃N。

可逆的交联剂，例如包含触发剂。触发剂包括含有可以与蛋白质反应交联的活化基团的烷基、芳基或其他链。这些反应性基团可以是各种基团，例如对亲核、自由基或亲电子置换敏感的那些，包括卤化物、醛、碳酸盐、氨基甲酸酯、苍耳烷和环氧化物。例如，反应性基团可以是对酸、碱、氟化物、酶、还原、氧化、硫醇、金属、光解、自由基或加热不稳定的。

交联的脂酶晶体可以通过例如冻干或喷雾干燥成为粉末形式。冻干或冷冻干燥，从组合物中分离出了水，产生了可以在非-冷藏(室)温下贮存较长时间的晶体，然后也易于在所选择的水性、有机或水性-有机混合溶剂中再生，而不会形成无定形混悬液而且使变性的危险降到最低。Carpenter等，Pharm.Res.，14，pp.969-975(1997)。可以如美国专利5,618,710所述或通过本领域已知的其他任意方法进行冻干。例如，首先将交联的脂酶晶体冷冻，然后放置到高真空下，其中晶体中水升华，剩下包含只紧密结合的水分子的脂酶晶体。

交联的脂酶晶体的特性

交联的脂酶晶体的酶活性可以用任何常规方法来测定。例如可以如美国专利5,618,710的实施例6所述通过分光光度法测定。脂酶活性可以通过检测底物乙酸对硝基苯酯的水解来评价。用初始底物浓度0.005％和起始酶浓度1.5x10^-8M通过400nm处的吸收增强来检测底物的断裂。在室温下取脂酶加入到包含底物的0.2 M Tris pH7.0液的5ml反应体积中。在测定吸收度前通过离心分离从反应混合物中移出晶质脂酶。

可替代地，可以在体外通过如美国专利5,614,189的实施例2-4所述的橄榄油的水解来测定脂酶的活性。

也可以在体内测定脂酶活性。例如，可以用⁹⁹Tc-(V)硫氰酸酯标记小体积的(约3ml)的橄榄油或玉米油，可以用¹¹¹In标记晶体脂酶。将标记的脂肪与已经在其上喷洒了标记的晶体脂酶的动物食物混合。得到近端和远端胃和小肠的闪烁法图像，直至胃中剩余的活性<5％。然后确定同位素的排空曲线(例如在胃中随着时间的滞留百分比)和从感兴趣的区域进入近端、中间和远端小肠的同位素的量。

优选地，本发明的组合物的交联的脂酶组分具有很高的特异性活性。很高的特异性活性脂酶活性典型地是对三油精(橄榄油)显示的特异性活性大于500、1,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或更大单位/mg蛋白质的脂酶。

优选地，本发明的组合物的交联的脂酶组分也可以在较长时间内在胃肠区域即胃、十二指肠和肠区域的严苛环境中是稳定的。例如，脂酶优选在酸性pH中，例如在pH小于7，6，5，4.5，4，3.5，3，2.5，2，1.5或更低的环境中在至少一小时是稳定的。此处使用的“稳定”是指在给定条件和时间内，脂酶晶体比脂酶的溶解形式更有活性。因此，稳定的脂酶晶体比脂酶相应的可溶形式保留了更高比例的初始活性。在一些实施方案中，在暴露在给定条件和时间后，脂酶晶体保留了其活性的至少10％。在其他的实施方案中，酯酶保留了其活性的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。

可替代地，或此外，本发明的组合物的交联的脂酶晶体组分是耐热的。例如在各种实施方案中，其在30℃，37℃或40℃稳定至少1小时。

蛋白酶组分

本发明的组合物的蛋白酶组分是微生物的蛋白酶。优选地，该蛋白酶是真菌的，而不是细菌或植物来源的。更优选地，该蛋白酶是曲霉的蛋白酶。最优选地，该蛋白酶是蜂蜜曲霉蛋白酶。根据一个优选的实施方案，本发明的组合物的蛋白酶组分是结晶的、非交联形式。可以根据上述脂酶的结晶技术，用例如乙醇作为沉淀剂来制备蛋白酶晶体。可替代地，本发明的组合物的蛋白酶组分可以是非晶体形式，交联的晶体形式或包衣，或包封胶囊或以其他方式配制，以使得它不会消化组合物中的其他蛋白质组分。

淀粉酶组分

本发明的组合物的淀粉酶组分是微生物的淀粉酶。优选地，该蛋白酶是真菌的，而不是细菌或植物来源的。更优选地，该淀粉酶是曲霉的淀粉酶。最优选地，该淀粉酶是米曲霉。根据一个优选的实施方案，本发明的组合物的淀粉酶组分是无定形形式。可替代地，本发明的组合物的淀粉酶组分可以是晶体形式，包括交联和非晶体的形式或包衣，或包封胶囊或以其他方式配制，以使得在口服后它保留了活性。

包含交联的脂酶晶体、蛋白酶和淀粉酶的组合物

根据本发明的组合物包括那些包含酶活性的比例约1.0：1.0：0.15USP单位的交联的微生物的脂酶晶体、微生物的蛋白酶和微生物的淀粉酶，和一种或多种赋形剂的组合物。优选地，脂酶是细菌的脂酶，蛋白酶和淀粉酶是真菌来源的。最优选地，该组合物包含与BS-3交联剂交联的细菌的脂酶、蜂蜜曲霉蛋白酶晶体和可溶的米曲霉淀粉酶；酶活性的比例是约1.0：1.0：0.15USP单位。

本发明的组合物的脂酶组分的交联在pH极限中提供了更大的稳定性并在蛋白质水解下起保护作用，同时蛋白酶和淀粉酶组分保持了最大的溶解性以有效地溶解。更特别地，脂酶组分的结晶和交联有助于提供一种在低剂量下具有增强的酶活性的组合物。蛋白酶的晶体形式也有助于提供增强的酶稳定性、纯度和效力。

在本发明一个可替代的实施方案中，酯酶可以是任意的稳定形式，蛋白酶和脂酶组分中任一或两者可以是晶体、无定形或半晶体形式。可替代地，其中一种或都是冻干形式。而且，无论其为何种形式，其中一种或都是交联的。

本发明的组合物有利地在用它们治疗的患者中导致脂肪吸收系数和氮吸收系数的相关性提高。此外，本发明的组合物包含的淀粉酶的水平在这些患者中增加了淀粉的消化和糖类的吸收。由于本发明，我们已经发现，用与酯酶和蛋白酶相关的比猪的胰补充物少得多的淀粉酶就可以实现这种对淀粉消化和糖类吸收的效应。这个发现与本领域所确信的淀粉酶对于胰腺功能不全的治疗，特别是在囊性纤维化病患者中不是必需的正好相反。

在根据本发明的组合物中有用的赋形剂具有填充剂或填充剂的组合，例如在药物组合物中所使用的那些的作用。在本发明一个优选的实施方案中，赋形剂包含微晶纤维素、Maltrin、交聚维酮、胶体二氧化硅、硬脂酸镁和滑石。进一步优选的一组赋形剂包括下列的一种或其混合物：蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨糖醇、拉克替醇、甘露醇、肌醇、钠和钾盐例如醋酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐和硼酸盐、甘氨酸、精氨酸、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、聚赖氨酸和聚精氨酸。

其他优选的赋形剂可以是下列的任一种或其混合物：1)氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸；2)糖类，例如，单糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、***糖、木糖、核糖；3)二糖，例如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；4)多糖，例如麦芽糊精、葡聚糖、淀粉、糖原；5)糖醇，例如甘露醇、木糖醇、拉克替醇、山梨糖醇；6)葡糖醛酸、半乳糖醛酸；7)环糊精，例如甲基环糊精、羟丙基-β-环糊精等；8)无机分子，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸钠和钾、硼酸、碳酸铵和磷酸铵；9)有机分子，例如乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；10)乳化或增溶/稳定剂例如***胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酯、月桂硫酸钠、硬脂酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、和其他的脱水山梨醇衍生物、聚乙二醇衍生物、蜡、聚氧乙烯衍生物、山梨醇衍生物；和11)粘度提高剂，例如琼脂、海藻酸及其盐、瓜尔胶、果质、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纤维素及其衍生物、碳酸丙烯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊。也可以使用这些化合物的盐。

赋形剂的其他例子在the American PharmaceuticalAssociation和the Pharmaceutical Society of Great Britain共同出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients中进行了描述。关于该组合物，根据本发明，赋形剂是非活性成分，脂酶、蛋白酶和淀粉酶是活性成分。在本发明的组合物中，活性与非活性成分的重量比是约1：9到约9：1，优选约1：6到约6：1。

在本发明一个可替代的实施方案中，脂酶、蛋白酶或淀粉酶组分的任一种可以与聚合物载体结合存在于组合物中。这就提供了一种耐酸的控释组合物，其在口服摄取后以有效量和低剂量将酶递送到肠中，即远端肠。

有用的聚合物载体包括，例如用于蛋白质晶体的包囊来递送蛋白质的聚合物，其中该递送包括控释的生物学递送。这些聚合物包括生物相容性的和生物可降解的聚合物或其混合物。优选地，该聚合物载体是生物可降解的聚合物。通过特定的包囊技术、聚合物组成、聚合物交联、聚合物稠度、聚合物稳定性、酶晶体几何形状和如果交联的话，还包括酶交联度来确定酶的溶解速率，并由此确定酶的递送。根据本发明的组合物的一个实施方案是在聚合物载体的基质中包囊；因此，保护脂酶、蛋白酶和淀粉酶组分免受胃肠道的严苛环境的损害。

组合物给药途径、形式、方法和治疗方法

根据一个优选的实施方案，本发明的组合物在治疗任意患者包括患囊性纤维化病的患者胰腺功能不全的方法中是有用的。根据一个可替代的实施方案，本发明的组合物在治疗患者吸收不良的方法中是有用的。本发明的进一步实施方案包括本发明的组合物在提高患者脂肪吸收系数，或在提高患者氮吸收系数中的应用。本发明的另一个实施方案包括这些组合物在提高患者脂肪吸收系数和氮吸收系数中的应用，任选是提高了相等的量。在进一步的实施方案中，本发明的组合物在增加患者糖类吸收中是有用的。

使用根据本发明的组合物治疗的方法，包含给患者施用治疗有效量的该组合物的步骤。本发明的任意方法可以用于治疗任意患胰腺功能不全的患者，包括任意囊性纤维化病的患者。类似的，任意这些方法可以用于治疗任意的囊性纤维化病患者。

根据本发明的治疗方法包括那些包括给患者施用治疗有效量的本发明的组合物的步骤的方法，其中，当在所述患者中脂肪吸收的基线系数小于或等于40％时，治疗有效量在患者中将脂肪吸收系数相对于基线提高了约30％到约35％。优选地，在患者中脂肪吸收系数相对于基线提高了约30％。在一个可替代的实施方案中，该治疗方法包括给患者施用治疗有效量的本发明的组合物的步骤，其中当在所述患者中脂肪吸收的基线系数大于40％但小于85％时，治疗有效量在患者中将脂肪吸收系数相对于基线提高了约10％到约25％。优选地，在患者中脂肪吸收系数相对于基线提高了约15％。

此外，根据本发明的治疗方法包括那些包括给患者施用治疗有效量的本发明的组合物的步骤的方法，其中，当在所述患者中氮吸收的基线系数小于或等于40％时，治疗有效量在患者中将氮吸收系数相对于基线提高了约30％到约35％。优选地，在患者中氮吸收系数相对于基线提高了约30％。在一个可替代的实施方案中，该治疗方法包括给患者施用治疗有效量的本发明的组合物的步骤，其中当在所述患者中氮吸收的基线系数大于40％但小于85％时，治疗有效量在患者中将氮吸收系数相对于基线提高了约10％到约25％。优选地，在患者中氮吸收系数相对于基线提高了约15％。

在另一个实施方案中，根据本发明的治疗方法包括那些包括给患者施用治疗有效量的本发明的组合物的步骤的方法，其中，治疗有效量在患者中将糖吸收相对于基线提高了大于或等于约10％的程度。在另一个实施方案中，该治疗方法包括了其中治疗有效量的本发明的组合物是将糖吸收相对于基线提高了大于或等于约20％的程度的方法，如此处测定，糖吸收增加10％就会每天多提供90卡路里。在365天后，每天将总共多吸收32,850卡路里。由于约3,500卡路里等于一磅，因此患者糖吸收增加10％就是每年增加了将近9磅。

根据本发明的组合物可以配制以用于任意的常规递送途径，包括经胃肠道上段施用，例如口(例如在胶囊、片剂、混悬液中或与食物一起)，或胃，或肠的上段(例如，通过管或输注)、口腔途径。优选地，该组合物配制成用于口腔递送。因此，本发明可以是任意的形式，包括固体、液体、混悬液或分散液，例如胶囊、片剂、锭、囊剂或糖衣片。对于婴儿和儿童，或不能服用片剂或胶囊的任何成年人，该组合物可以液体、混悬液或囊剂的形式施用，可以与其他相容的食物或产品施用。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的组合物在进餐或吃点心的时候，以一种或多种的胶囊、混悬液或囊剂的形式施用于患者。优选地，本发明的组合物以每餐或每个点心含一到两种胶囊、混悬液或囊剂的形式施用于患者。该组合物可以在用餐或点心半小时后施用。根据本发明，治疗胰腺功能不全的治疗有效量的组合物包含酶活性比例约1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，每剂量包含约5,000USP单位到约100,000USP单位的活性脂酶水平；约5,000USP单位到约100,000USP单位的活性蛋白酶水平；和约750USP单位到约15,000USP单位的活性淀粉酶水平。更优选地，这些组合物包含酶活性比例约1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，每剂量包含包含约25,000USP单位到约100,000USP单位的活性脂酶水平；约25,000USP单位到约100,000USP单位的活性蛋白酶水平；和约3,750USP单位到约15,000USP单位的活性淀粉酶水平。最优选地，这些组合物包含酶活性比例约1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，每剂量包含包含约25,000USP单位的活性脂酶水平；约25,000USP单位的活性蛋白酶水平；和约3,750USP单位的活性淀粉酶水平。

对于儿童，根据本发明的组合物包含酶活性比例约1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，每剂量包含包含约12,500USP单位到约25,000USP单位的活性脂酶水平；约12,500USP单位到约25,000USP单位的活性蛋白酶水平；和约1,875USP单位到约3,750USP的活性淀粉酶水平。对于婴儿，该组合物包含酶活性比例约1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶，每剂量包含包含约500USP单位到约1,000USP单位的活性脂酶水平；约500USP单位到约1,000USP单位的活性蛋白酶水平；和约75USP单位到约150USP单位的活性淀粉酶水平。对于此处所讨论的所有酶活性单位数据和范围，根据上述所列的对各种酶的分析，定义为1单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶。上述的量分别也是在成人、儿童或婴儿中治疗吸收不良或消化不良的治疗有效量；或对于在成人、儿童或婴儿中提高任意的脂肪吸收系数、氮吸收系数、糖吸收或淀粉消化的治疗有效量。

根据本发明的组合物的最有效的施用方式或给药方法将取决于所希望的效果、先前的疗法(如果有)、患者的健康情况或其本身的情况、对治疗的应答和治疗医生的判断。

如果患者的情况改善，可以采用维持疗法。随后，可以根据症状的功能将施用的剂量或频率降低到保持改善的情况的水平。但是，一旦病症或其症状复发，患者可以要求基于长期的间歇疗法，

为了更好地理解本发明，列出下列的实施例。这些实施例仅仅是用于解释说明，而不应当解释为是以任何方式限制本发明的范围。

实施例

下列的实施例涉及本发明的组合物，以及评估其安全性和对治疗胰腺功能不全效力的临床研究。这些研究包括在患胰腺功能不全的囊性纤维化病的患者中的1期和2期临床试验。

2期研究评估本发明的组合物的效力，包括测定下列的变化：脂肪吸收系数(＂CFA＂)、氮吸收系数(＂CNA＂)、口服糖吸收、每天的粪便重量、每天排便次数和生活质量，这些都与胃肠道症状有关，根据囊性纤维化病调查表(＂CFQ＂)测定。该研究也评价所述组合物的剂量，以提供在要治疗的哺乳动物中相对于基线(不含酶)最高程度的临床有意义的脂肪吸收系数改善。

如2期研究所述，根据本发明的组合物为患胰腺功能不全的囊性纤维化病患者的治疗期提供了相对于基线的平均CFA和CNA的统计学显著的变化。我们发现，根据本发明的组合物在最小剂量为每胶囊25,000USP单位的脂酶，25,000USP单位的蛋白酶和3,750USP单位的淀粉酶是有效的(研究的“中剂量”或“臂2”)；导致了在大多患者中CFA和CNA的显著提高(≥10％)。当用每个胶囊包含酶活性为比例100,000：100,000：15,000USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶的治疗剂量(研究的“较高剂量”或“臂3”)CFA和CNA也会提高。但是，在中剂量和较高剂量之间CFA和CNA没有统计学差异。根据本发明并在2期研究中使用的组合物也包括以每个胶囊5,000USP单位的脂酶、5,000USP单位的蛋白酶和750USP单位的淀粉酶的剂量施用的那些(研究的“低剂量”或“臂1”)。

有利地，在控制CFA和CNA的基线值和所治疗患者的性别后，根据本发明的组合物对于CFA和CNA的效应保持是统计学显著的(对于中和较高剂量治疗组分别为p＝0.0003和<0.0001)。当CFA和CNA作为单独的四分位数检查时(附图1和2)，在基线值<40％的那些患者中观察到最大的变化，而在基线CFA和CNA>40％的患者中为成比例的较小变化。对于CFA，在基线CFA≤40％的8名患者的中剂量治疗组的平均提高为35.3％。在基线CFA≤40％的12名患者的较高剂量治疗组的平均提高为30.4％。对于中和较高剂量治疗组，在基线≤40％的20名患者中CFA的总的提高是32.3％。

根据本发明的组合物也会如所治疗的患者中所测定的每天排便的次数和重量的变化，产生显著的治疗效果。接受较高剂量的患者在基线到治疗期显示了排便次数的显著将杜，同时在中剂量和较好剂量组中粪便重量统计学显著地降低。事实上，脂肪吸收和粪便重量之间呈高度显著性的负相关(R＝-0.7283；p<0.0001)。在这个方面，因此，研究的较高剂量(臂3)与中剂量(臂2)并没有显著的差异。

在所有所研究的患者中，尽管在淀粉激发试验含有和不含酶中所示不是全部都有统计学显著的变化，但在较高剂量的患者中观察到的对最大葡萄糖变化和曲线下面积(＂AUC＂)的效果(p<0.057)倾向于暗示淀粉酶活性的方向。此外，用Fischer Exact Test进行的专门分析表明，基于不含和含有酶治疗期的比较，相对于低剂量治疗组，在中剂量和较高剂量组中有更多患者在淀粉激发试验后在最大葡萄糖变化中有≥10％的提高(p＝0.0138)。这些结果表明，淀粉酶作为组合物的重要组分发挥功能，导致淀粉消化和糖吸收改善。

在用本发明的组合物治疗的患者中没有报告严重的不利事件，在2期研究中在所有剂量水平时都是良好耐受的。在整个研究过程中没有患者死亡。

实施例1    研究组合物的制备

在此处讨论的1期和2期研究中使用的组合物包含脂酶、蛋白酶、和淀粉酶，其中每一种都是从不同的微生物菌株在可控条件下单独制备的，然后分离、纯化和干燥。以这样的方式进行该制备，以提供在小肠内稳定并保留特有的酶活性的组合物。

脂酶：从细菌制备和纯化脂酶的方法是本领域技术人员公知的。例如，组合物的脂酶组分是通过细菌洋葱伯克霍尔德菌(以前称作洋葱假单胞菌)的发酵来产生。发酵是在25,000升的发酵罐中进行的。从低压冻干的肥大细胞库中取出菌株，在斜面上生长，在8升的种子培养基中培养，进一步在25，00升的种子发酵罐中发酵，最后在25,000升的发酵罐中产生出来。在发酵后，通过热处理并离心分离除去以杀死活的生物体。蒸发浓缩蛋白质，然后用乙醇沉淀并在篮式离心机中用乙醇洗涤。

通过硫酸铵沉淀，用DEAE纤维素吸收并稀释，随后提纯、浓缩并通过超滤脱盐。所得到的物质通过丙酮处理和CM-纤维素进一步纯化，然后加入甘氨酸作为稳定剂。通过膜过滤过滤所得到的物质，然后冻干。然后将物质过筛，并分析其具体的活性、纯度和是否含病原体。

通过透析过滤进一步处理所得到的纯化的脂酶，以除去甘氨酸稳定剂。然后沉淀之，并在25％叔丁醇中结晶，然后优选在上述浓度范围内用BS³交联，以使得在交联的脂酶晶体中交联剂的最终浓度范围是约2.0mM到约5.0mM。用5倍体积的15％乙醇缓冲液洗涤交联的脂酶晶体，然后再加入5倍体积的15％乙醇缓冲液(含1.5mM乙酸钙，pH5.0)洗涤，以减少残留的交联剂和叔丁醇。冻干所得到的物质，并包装在带子封闭的HDPE瓶中装运，包装在含硅胶干燥剂的PE袋中。特别地分析每个批次的洋葱伯克霍尔德菌而不是其他微生物的微生物污染，在释放用于临床前，其对洋葱伯克霍尔德菌和病原体必须是阴性的。

蛋白酶：制备和纯化蛋白酶的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过蜂蜜曲霉的固态发酵产生蛋白酶。在溶液中进行种子培养，然后转移到麸皮上。当无菌的麸包被了种子时，将该固体载到盘上以在发酵室中发酵。在完成发酵后，通过将水灌注通过较大的提取槽以从固态生物菌体中提取酶。

然后将包含蛋白酶的提取物通过木炭珠，并过滤除去悬浮的颗粒。然后浓缩该液体，并用木炭二次处理。用乙醇沉淀蛋白酶，然后真空干燥以最后纯化。

溶解该蛋白酶，然后将其通过离子交换树脂。然后过滤该物质，然后转移到结晶池中，其中用多次加入的乙醇使其结晶。当完成结晶时，在篮式离心机中复原该晶体，用另外的乙醇洗涤。从篮式离心机中复原该晶体，并用强力气体干燥，然后真空干燥。当干燥时，该粉末转移到较大的容器中用于最终的过筛和包装。

淀粉酶：制备和纯化淀粉酶的方法是本领域技术人员公知的。例如，通过米曲霉的固态发酵来产生。在溶液中进行种子培养，然后转移到麸皮上。当无菌的麸包被了种子时，将该固体载到盘上以在发酵室中发酵。在完成发酵后，通过将水灌注通过较大的提取槽以从固态生物菌体中提取酶。然后浓缩过滤后的提取液并透析过滤。透析过滤后进行热处理和调节pH，然后再透析过滤并浓缩。然后向该物质中加入鱼明胶作为稳定剂，然后喷雾干燥，并高达至产品总重量的30％。当干燥后，将物质过筛，与糊精混合，并包装。用糊精作为长期贮存的稳定剂，可以最多占最终产物总重量的30％。通过SEC HPLC在280nm处检测，在所得到的活性药物成分中蛋白质大于90％纯。该90％并不包括存在明胶或糊精作为赋形剂；这两种赋形剂在280nm处均无显著的吸收。当纯化和处理后，将脂酶、蛋白酶和淀粉酶配制在一起成为胶囊。更特别地，(与赋形剂)混合干燥后的酶，并填入到明胶胶囊中。该组合物称作TheraCLEC^TM。

实施例  2-2期研究治疗的剂量

在2期研究中使用的组合物包含活性成分：交联的洋葱伯克霍尔德菌的脂酶晶体、蜂蜜曲霉的蛋白酶晶体和可溶的米曲霉淀粉酶；和下列的非活性成分：微晶纤维素、Maltrin、交聚维酮、胶体二氧化硅、硬脂酸镁和滑石。它们包含酶活性比例为1：1：0.15USP单位的脂酶、蛋白酶和淀粉酶。

该组合物以两种不同强度的胶囊的形式递送。以20,000USP单位的脂酶、20,000USP单位的蛋白酶、和3,000USP单位的淀粉酶的强度将更高强度的制剂，称作“TCT20”填充到2号白色不透明的硬明胶胶囊中。以5,000USP单位的脂酶、5,000USP单位的蛋白酶、和750USP单位的淀粉酶的强度将较低强度的制剂，称作“TCT5”填充到5号白色不透明的硬明胶胶囊中。活性与非活性成分的w/w比是3：4(TCT20)和2：5(TCT5)。

在2期研究中使用2号和5号安慰剂胶囊来使TheraCLEC^TM剂量成盲。安慰剂胶囊包含与TheraCLEC^TM胶囊相同的非活性成分并具有与The raCLEC^TM胶囊相同外观，以使得胶囊的鉴别(活性与安慰剂)是未知的。给定Ther aCLEC^TM胶囊与安慰剂胶囊的适当数量和类型，以实现随机给患者双盲的剂量水平。

在2期研究中，在28天治疗期间的适当的每次进餐或点心的中间时刻，患者服用了总共6粒胶囊，该胶囊是Ther aCLEC^TM胶囊与安慰剂胶囊的组合，1粒是5号胶囊，5粒是2号胶囊，如下所述：

表1.通过治疗臂，研究的治疗剂与安慰剂的分布比较

剂量的选择和时间

100,000USP单位的脂酶/每餐的2期研究的最高固定剂量，对于80kg的患者相当于每kg1,250脂酶USP单位，对于40kg的患者相当于每kg2,500脂酶USP单位。

表2.所研究的药物—TheraCLEC^TM的剂量

2期研究的其他参数

2期研究是随机的、双盲的，和平行剂量范围的试验。该研究登记了总共129名来自美国约26个地区的男性和女性患者，分为3个TheraCLEC^TM剂量水平(每臂约42名患者)。该研究分为4个不同的观测和评估阶段：筛选、基线、治疗和随访。

2期研究的人群

在3个患者群中试验如上述制备的组合物。修正的试图治疗(“mITT”)人群包括所有经过基线期(不含酶)测定、接受至少一种随机剂量、治疗期对安全性进行了评估、和进行了标记物-对-标记物的粪便收集的适当患者。试验其他的患者群并且其结果与mITT群相一致。

筛选期(S1-基线日)

在筛选就诊的当天(S1日)，与患者会面以确定是否适合包括在该研究中。患者也经过了全面的身体检查。

要求患者在整个研究期间食用高脂肪的饮食。允许患者服用药物来治疗和处理它们潜在的囊性纤维化病或相关疾病。在研究的住院基线(B1-B3日)和治疗(T1-T28日)期患者不能接受酶补充品或属于酶补充物的饮食助剂。

患者随机服用3种中的一种双盲剂量的TheraCLEC^TM。

基线期(B1-B3日)

在筛选访问的10-14天内，要求随机的患者在禁食状态下和每天的第一餐(早饭前)进入住院试验室。在B1日从该天的第一餐(早饭)开始基线期。在早饭前，得到体重。然后患者开始72小时的控制饮食期而不服用胰酶补充物。在B1日的第一餐开始前服用粪便标记物(500mg FD&C DyeBlue#2)。根据实际的消耗量纪录脂肪和蛋白质的摄取。在第一标记物通过后(***出了包含第一标记物的粪便)开始评估所收集粪便中的脂肪和氮，当在粪便中首次发现第二标记物时(收集到包含第一标记物的粪便)停止。

在基线期的每一天，评估患者的不利事件和伴随药物，记录生命体征，进行简单的身体检查。

治疗期(T1-T28日)

在治疗期的第一天(T1)，在T1日预剂量过程和淀粉激发试验完成后第一餐(午饭)的中间时刻给每个患者提供第一剂量的所研究的药物。然后在施用第一剂量后观测患者至少30分钟。如果药物是良好耐受的，然后患者在整个治疗期的T1至28天3餐和2次点心的每一次的中间时刻服用相同剂量的所研究的药物。在该研究中，进餐的中间时刻定义为患者进餐或点心约一半时的时刻。

在T29日，患者中断所研究的药物。在T29日/ET诊所就诊期间，进行全面的身体检查。也评价患者的不利事件。

随访期(Day F7±2)

在随访期中，患者维持高脂肪的饮食，并通常根据他们的医生的处方服用酶。随访期结束时，预定好诊所就诊(F7±2日)以在治疗期(T29日)就诊完成后存在7±2天。在该次就诊中，患者经过简单的身体检查，并评估不利事件和伴随药物。

分析粪便中的脂肪和氮

在筛选就诊期间收集用于污点的粪便弹性酶试验的粪便以评估是否适合该研究。在研究期间由于存在隐血和白细胞，每个患者在不同时间进行粪便试验。

在住院基线期和住院治疗期中，在控制饮食的第一餐(早饭)开始时给予指示性标记物(500mg的FD & C Blue#2)，其中第一餐包含每天每kg体重约100g的脂肪和少量即约2g的蛋白质。根据食物消耗量纪录实际的脂肪和蛋白质摄取。

在控制饮食72小时后，用试验餐给予禁食患者第二蓝色的指示性标记物，以进行开始激发试验。在第一蓝色标记物已经通过后开始评估所收集粪便的脂肪和氮，当第二蓝色标记物通过时结束。测定所收集粪便的粪便重量并分析脂肪和氮含量。Seligson，D(ed)，Standard Methods of Clinical Chemistry，Volume II，Fatty AcidsinStool，1985，Academic Press，pp34-39；Veldee MS，NutritionalAssessment，Therapy，and Monitoring in BurtisCA，AshwoodER(eds).Tietz Textbook ofClinicalChemistry，3^rdEd.，1999，W.B.Sanders Co，pp1385-86。

用两个数据点通过位点手算脂肪吸收系数(％CFA)：

(1)中央研究营养学家提供的以g/24小时为单位的脂肪消耗量，和

(2)Mayo Clinical Laboratory Services提供的以g/24小时为单位的脂肪***量。

手算CFA如下：

(脂肪消耗量g/24小时的平均克数-脂肪***量g/24小时的平均 克数)x100脂肪消耗量g/24小时的平均克数

用两个数据点通过位点手算氮吸收系数(％CNA)

(1)中央研究营养学家提供的以g/24小时为单位的氮消耗量，和

(2)Mayo Clinical Laboratory Services提供的以g/24小时为单位的氮***量。

手算CNA如下：

(氮消耗量g/24小时的平均克数-氮***量g/24小时的平均克数)    氮消耗量g/24小时的平均克数x100

效力评价-脂肪吸收系数

通过治疗组概述在基线时，在治疗时，在从基线到治疗变化时的脂肪吸收系数。用一个粪便收集物的两个***物脂肪结果的两个独立的CFA计算值的平均数作为所报告的脂肪吸收系数。用单项方差分析法分析治疗期中三个治疗组之间平均脂肪吸收系数之间的差异。为了评估3组可能的配对比较，控制总的5％I类误差率，使用Tukey′s studentized range检验。因变量包括治疗时的测定值。

也进行线性回归分析来检验治疗组的同时效应和平均的基线CFA。因变量也包括治疗期的测定值。在该模型中测定的其他因素包括下列的基线测定：年龄、性别、种族和BMI。对于这些其他的因素，用逐渐降低法从该模型中清除非显著性因素(p>0.10)。在该线性回归分析中也使用Tukey′s studentized range检验来进行配对比较。

在下表3中通过治疗组概述了mITT人群在基线时，在治疗时，和在从基线到治疗变化时的脂肪吸收系数(CFA)。在所有三个治疗人群中，从基线到治疗期平均CFA有显著的提高。在治疗中，在臂2(中剂量)和治疗臂3(较高剂量)中CFA显著大于治疗臂1(低剂量)。此外，与臂1相比，臂2和3显示了CFA从不含酶到含酶的平均提高更大。尽管治疗臂3显示了超过治疗臂2的数值一致性的益处，但该差异并不是统计学显著的。

表3：平均脂肪吸收系数-方差分析

 

	臂1(N＝39)	臂2(N＝41)	臂3(N＝37)	总共(N＝117)	p-值*
						基线
N	39	41	36	116
						平均(SD)	55.0(17.54)	55.6(20.29)	52.2(19.14)	54.4(18.94)
治疗**
						N	39	41	37	117
平均(SD)	56.2(18.16)	67.0(18.08)	69.7(17.86)	64.3(18.81)	0.0032
						从基线到治疗的变化
N	39	41	36	116
						平均(SD)	1.2(14.77)	11.4(19.10)	17.3(18.37)	9.8(18.59)	0.0005
从基线到治疗的变化百分比％
						N	39	41	36	116
平均(SD)	5.6(32.15)	42.7(95.46)	45.9(53.51)	31.2(68.69)	0.0153

*方差分析的总的p-值

**治疗结果(用Tukey′s studentized range检验分析配对比较)：

治疗臂1 vs治疗臂2，mITT p-值＝0.0229.

治疗臂2 vs治疗臂3，mITT p-值＝0.7874.

治疗臂1 vs治疗臂3，mITT p-值＝0.0041。

如果把基线CFA分解成从0-100％的五分线，清楚地，与如果基线CFA在40％以上相比，所有治疗臂在0-40％CFA的基线之上有更高程度的提高(见附图1)。此外，基线CFA越低，对治疗的应答越大。

效力评价-氮吸收系数

通过治疗组下表4概述mITT人群在基线时(B1到B3)，在治疗时的氮吸收系数(CNA)。用一个粪便收集物的两个***物氮结果的两个独立的CNA计算值的平均数作为所报告的氮吸收系数。用与CFA相同的方式分析三个治疗组之间平均CNA之间的差异。

与CFA的测定值类似，在全部三个治疗群中，从基线到治疗期的平均CNA有显著的提高。在所有三个治疗群中，治疗臂2和治疗臂3中治疗的CNA显著大于治疗臂1。此外，治疗臂2和臂3在从不含酶到含酶中CNA的平均提高比治疗臂1大得多。尽管治疗臂3显示了超过治疗臂2的数值一致性的益处，但该差异并不是统计学显著的。

表4：平均氮吸收系数-方差分析

 

	臂1(N＝39)	臂2(N＝41)	臂3(N＝37)	总共(N＝117)	p-值*
						基线
N	39	41	36	116
						平均(SD)	60.6(16.38)	58.8(17.88)	56.8(16.36)	58.8(16.84)
治疗**
						N	39	41	37	117
平均(SD)	61.6(15.46)	71.3(16.38)	74.6(13.51)	69.1(16.05)	0.0009
						从基线到治疗的变化
N	39	41	36	116
						平均(SD)	1.1(14.89)	12.5(18.37)	17.5(18.00)	10.2(18.33)	0.0002
从基线到治疗的变化百分比％
						N	39	41	36	116
平均(SD)	9.0(48.83)	37.6(96.72)	40.6(45.04)	29.0(69.74)	0.0883

*方差分析的总的p-值

**治疗结果(用Tukey′s studentized range检验分析配对比较)：

治疗臂1 vs治疗臂2，mITT p-值＝0.0145。

治疗臂2 vs治疗臂3，mITT p-值＝0.6130。

治疗臂1 vs治疗臂3，mITT p-值＝0.0009。

如果把基线CNA分解成从0-100％的五分线，在附图2中清楚地，如果基线CNA是40％或更低，所有治疗组比如果基线CNA在40％以上的情况有更大的提高。治疗臂2和3仍比治疗臂1更有效。此外，基线CFA越低，对治疗的应答越大。

CFA和CNA的改善以及它们之间的相关性

该研究反映了在所有三个治疗群中在中和较高剂量治疗组中从基线到治疗期平均CFA和CNA的显著提高。此外，治疗臂3(较高剂量组)在此段时间显示了最大的CFA和CNA的平均提高，尽管中和较高剂量之间的差异不是统计学显著的。甚至在控制CFA和CNA的基线值和性别后，对CFA和CNA的治疗效果保持了统计学显著性(分别为p＝0.0003和<0.0001)。

CFA和CFA提高之间的相关性也是统计学显著的。附图3和4显示了分别在基线谁拼和治疗水平时用所有剂量的本发明的组合物治疗的mI TT患者中CFA和CNA之间的相关性。附图5显示了在那些患者中在治疗和基线水平时CFA和CNA相关性之间的差异。

效力评价——对粪便样本从基线变化的分析

分别在表5和表6中独立地显示了每个研究治疗组中相对于相关的治疗期终点值的排便次数和粪便重量从基线到治疗期间的平均变化。

在所有三个治疗臂中，从基线到治疗期排便次数减少(分别为p＝0.0968，p＝0.0975，和p＝0.1807)。特别是治疗臂3在从基线到治疗的排便次数上显示了最大的平均减少(在mITT中减少了2.6)(p＝0.0003)。但是，在治疗臂之间排便次数的变化的组间差异并未显示出统计学显著差异。

在所有三个治疗群的中和较高剂量治疗组中从基线到治疗的粪便重量有显著的降低(p＝0.0001)。尽管所有三个人群的治疗臂3在粪便重量从基线到治疗的最大平均降低(p<0.0001)，但用Tukey′sstudentized range检验并未显示在中和较高治疗臂之间有统计学显著的差异。

表5：从基线到治疗的排便次数的变化

 

	臂1(N＝39)	臂2(N＝41)	臂3(N＝37)	总共(N＝117)	p-值*
						基线
N	39	41	37	117
						平均(SD)	7.7(3.04)	8.2(3.49)	8.8(4.56)	8.3(3.73)
治疗
						N	39	41	37	117
平均(SD)	6.9(3.06)	7.4(4.37)	6.2(3.01)	6.9(3.56)
						从基线到治疗的变化					0.0968
N	39	41	37	117
						平均(SD)	-0.8(3.39)	-0.9(4.52)	-2.6(4.04)	-1.4(4.07)
配对t-检验**	0.1393	0.2211	0.0003	0.0003

*方差分析的总的p-值

**配对t-检验.

注意：从基线变化的结果(用Tukey′s studentized range检验分析配对比较)：

治疗臂1 vs治疗臂2，mITT，p-值＝0.5502。

治疗臂2 vs治疗臂3，mITT，p-值＝0.4842。

治疗臂1 vs治疗臂3，mITT，p-值＝0.2040。

表6：从基线到治疗的粪便重量(g)的变化

 

	臂1(N＝39)	臂2(N＝41)	臂3(N＝37)	总共(N＝117)	p-值*
						基线
N	38	41	36	115
						平均(SD)	1234.0(529.46)	1251.8(474.14)	1396.8(613.79)	1291.3(539.16)
治疗
						N	38	41	37	116
平均(SD)	1174.1(565.34)	937.3(539.91)	869.2(448.92)	993.2(533.10)
						从基线到治疗的变化					0.0001
N	38	41	36	115
						平均(SD)	-59.9(399.46)	-314.5(455.89)	-514.2(428.37)	-292.9(463.44)
配对t-检验**	0.3612	<0.0001	<0.0001	<0.0001

*方差分析的总的p-值

**配对t-检验.

注意：从基线变化的结果(用Tukey′s studentized range检验分析配对比较)：

治疗臂1 vs治疗臂2，mITT，p-值＝0.8842.

治疗臂2 vs治疗臂3，mITT，p-值＝0.2415.

治疗臂1 vs治疗臂3，mITT，p-值＝0.1971.

效力评价-通过血糖应答测定淀粉消化和糖吸收

在淀粉激发试验中，禁食过夜至少8小时的患者在住院基线期和住院治疗期摄取了包含100g白面面包(50g糖)的标准试验餐。在开始淀粉激发试验前让患者休息30分钟，在评价中限制其活动。用血糖测计仪(Accucheck，Bayer)测定血糖水平。在试验餐前立即得到测定值。在面包餐的约中间时刻施用TheraCLEC^TM。在4小时中进行一系列的血糖测计仪测定。计算值包括从禁食水平的最大葡萄糖变化和含-不含酶时的最大葡萄糖变化(T17-T1)。如果患糖尿病的患者的禁食葡萄糖测定值小于75mg/dL，则其不能进行淀粉激发试验。

在mITT人群中通过下列变量测定血糖应答：

从时间0开始的葡萄糖变化：从时间0开始在每个时间点葡萄糖的变化。

最大葡萄糖应答：时间0后最大的葡萄糖值

葡萄糖应答的最大变化：定义为最大应答减时间0时的葡萄糖值。

时间对峰值葡萄糖应答(T _max )：定义为从时间0开始的各小时对最大葡萄糖变化。

通过治疗组的各个变量提出的描述统计学，如下：

1.  不含TheraCLEC^TM

2.  含TheraCLEC^TM

3.  含TheraCLEC^TM减不含TheraCLEC^TM

4.  含TheraCLEC^TM：不含TheraCLEC^TM比值(R)

这些描述统计学呈现的是所有患者和仅仅不患糖尿病的患者。如果有未知的糖尿病的病史、服用胰岛素或与糖尿病有关的口服药物或者如果禁食葡萄糖水平≥126mg/dL或餐后葡萄糖≥200mg/dL，就认为该患者患有与囊性纤维化病相关的糖尿病。

在表7中，患有与囊性纤维化病相关的糖尿病的25名患者退出分析，以减少高基线葡萄糖和在“淀粉激发试验”中早晨注射胰岛素后降低葡萄糖的变异性。与TCT25相比，TCT5有显著(p＝0.0053)更少数量的患者在含-不含酶时最大葡萄糖的提高≥10mg/dL。此外，表7的结果表明，在治疗臂2中间范围的淀粉酶与治疗臂3最高剂量具有同样的有效性。

表7：在患囊性纤维化病的非糖尿病患者中的淀粉激发试验—观察含-不含酶治疗时最大葡萄糖的变化

 

△含-不含酶治疗时最大葡萄糖	治疗臂1：TCT5	治疗臂2：TCT25	治疗臂3：TCT100
				<10mg/d1	21	14	15
>10mg/d1	4	16	11
				>20mg/d1	3	8	8

*Fisher′s Exact(总)：p＝.0138

TCT5 vs.TCT25，p＝0.0053

TCT5 vs.TCT100，p＝0.0644

TCT25 vs.TCT100，p＝0.4357

总的来说，该研究表明，如通过血糖应答所测定，用根据本发明的组合物治疗的患者实现了淀粉消化和糖吸收的增加，较高剂量治疗组的患者要完成这一点需要的时间较短。

实施例3-1期研究

在2期研究前，也可以在患胰腺功能不全的囊性纤维化病的患者中在1期研究中评估根据本发明的组合物的安全性和初步效力。

在23名患胰腺功能不全的囊性纤维化病的患者中进行标签公开、系列剂量的研究来确定The raCLEC^TM的急性安全性、耐受性和临床活性。患者在3天中服用100、500、1,000、2,500或5,000脂酶单位/kg/餐的TCT。监测临床和试验安全性参数和不利事件。

在1期研究中没有严重的不利事件或死亡。尽管通常有胃肠道症状，但大多数不利事件是轻度的。除了接受100脂酶单位/kg/餐的患者，在所有组中TheraCLEC^TM都提高了脂肪吸收系数和氮吸收系数。对于在其他剂量水平的所有患者，平均CFA提高＝20.6±23.5，平均CNA提高＝19.7±12.2％，平均粪便重量降低＝425±422g。

在剂量高达5,000脂酶单位/kg/餐的短时间暴露研究中，TheraCLEC^TM是耐受性良好的。初步效力数据表明了对脂肪和氮吸收的有益效果。有利地，这些效果在500脂酶单位/kg/餐的剂量下能观察到，并显示出不需要增加剂量超过该水平即可达到这些结果。这些数据支持了较大的随机化2期试验。

1.1期研究设计

进行标签公开、多中心、系列剂量的研究，主要目的是在患有囊性纤维化病的胰腺功能不全的患者中确定5种剂量水平的TheraCLEC^TM的急性安全性和耐受性。次要目的是确定TheraCLEC^TM对于口腔摄取的脂肪和氮的吸收、胃肠症状、排便的次数和重量的影响。TheraCLEC^TM是固定份数的脂酶、淀粉酶和蛋白酶。如表8所示，剂量组是基于每餐每kg的脂酶剂量。

表8：剂量组

(提供的胶囊中，含有固定比例的下列的酶：脂酶20,000USP单位+蛋白酶20,000USP单位+淀粉酶3,000USP单位/胶囊)。

根据11个CF-基金会-公认的中心，向该研究中补充患囊性纤维化病的患者。所有个体都签署了当地Institutional ReviewBoard承认的承诺书，在儿科患者的情况中，也获得了许可。如果患者年龄≥13并≤45岁，则包括在内，患者根据标准诊断患有囊性纤维化病[B.J.Rosenstein等，＂TheDiagnosis of Cystic Fibrosis：A Consensus Statement＂，J.Pediatr.，132，pp.589-595(1998)]，并且用ScheBo单克隆ELISA分析(BioTech USA)在门诊筛选中根据***物中弹性酶<100mg/gm其患有胰腺功能不全，并且在住院筛选中测定的脂肪吸收系数≤80％，一秒钟用力呼气量(FEV₁)≥预计的30％，体重指数>10百分位数，并且是临床稳定的，没有证据表明有急性上端或下端呼吸道感染。如果有下列情况，则排除该患者：她们怀孕或正在人乳喂养，在先前6个月远端肠梗阻症状发作而需要在急诊室或医院中介入，在前一周服用调节胃pH的药物(例如，组胺-2受体拮抗剂、质子泵抑制剂或抗酸剂)并在研究期间不能中断这些药物，有下列的病史：纤维性结肠病、过敏性支气管肺曲霉病或通过下列定义的肝病：2倍于正常的丙氨酸氨基转移酶(AST)、天冬氨酸氨基转移酶(ALT)、或碱性磷酸酶；有静脉曲张出血的病史；在肝活组织检查中有肝硬化或显著的肝病的迹象；肝移植；患者在前一年服用了熊去氧胆酸。不能在研究方案的住院部分中断肠管饲法，具有已知的食物添加剂过敏性，或在前一个月参加了其他任意的当前未批准的药物、生物、或装置的研究的患者也都排除在外。

如果患者在开始筛选就诊时满足条件，就让他们进入临床研究中心。中断患者按处方进行的酶疗法，口服给予指示性色素标记物(FD & C Blue#2500mg)，将患者置于特殊饮食中，该特殊饮食包含每天每kg体重100g的脂肪和最少2g的蛋白质，分为3餐和2次点心。根据消耗的食物的量记录实际的脂肪和蛋白质摄取量。在特殊饮食72小时后，中断该饮食，给予第二指示性标记物。在此时，患者恢复他们正常的酶疗法。在观察到蓝色标记物的第一次粪便后开始评估粪便收集物中的脂肪和氮，当第二标记物通过时(即在收集物中包括该粪便)结束。计算CFA，如果其≤80％，该患者就认为是适合该研究的治疗期的。

患者再次进入临床研究的中心，中断常规的胰酶补充。提供色素标记物和特殊饮食，患者在72小时中在3餐和2次进食点心时服用所研究的药物，每组的剂量如上所述。在每餐前指示患者服用所研究的药物。72小时后，中断该特殊饮食，给予第二指示性标记物。在此时，患者恢复他们正常的酶疗法。粪便收集的方法与上述相同。在离开临床研究中心3天内进行随访电话访问，在离开后3到7天进行随访。

安全性监测包括，通过在门诊就诊和住院看护和计划好的电话访问中对所研究患者的不断闻询确定的不利事件的发生率、异常实验室实验(包括常规血液学、血清化学和凝固情况、尿液分析、尿中尿酸***、粪便中血红素和白细胞分析)的频率。同时监测胃肠症状的频率，如GI-特异性变化的囊性纤维化病调查表(CFQ)[A.Quittner等，＂CFQ Cystic Fibrosis Questionnaire，a Health Related Qualityof Life Measure＂，English Version 1.0.(2000)]测定。

CF Foundation′s Therapeutics Development NetworkData Safety和Monitoring Board(DSMB)为该实验提供了监督。DSMB在整个实验中监测了增高剂量组的安全性数据，在患者加入到5,000脂酶单位/kg/餐之前需要正式的安全性评价，因为这超出了当前的推荐剂量。可以在关注患者安全性的任何时间用中断该试验来中止DSMB。

2.1期组合物

Ther aCLEC^TM中的这三种酶组分—脂酶、蛋白酶和淀粉酶是独立地制备的。通过细菌洋葱伯克霍尔德菌(以前称作洋葱假单胞菌)发酵来产生脂酶，然后处理该脂酶以形成脂酶晶体，随后交联，成为对酸和无肠溶衣的蛋白酶稳定的酶形式(称作TheraCLEC^TM-脂酶)。蛋白酶组分是来自蜂蜜曲霉，淀粉酶组分是来源于米曲霉的发酵。特别地培养每一个批次以用于洋葱伯克霍尔德菌的微生物学污染，其对于洋葱伯克霍尔德菌必须是阴性的，以进行批次的释放用于临床应用。类似地，这些产品经过多个纯化步骤，然后培养成总的霉菌和酵母。

包含TheraCLEC^TM的这三种酶组分配制成包含粉末的胶囊。临床前效力研究表明，在胰腺功能不全的狗模型中≥500脂酶单位/kg/餐和≥1000蛋白酶单位/kg/餐的剂量时脂酶和蛋白酶是有效的。用USP和FCC(食用化学品集)的方法(其相当于用于试验药物的USP法)进行The raCLEC^TM中来自曲霉的淀粉酶的体外分析。真菌的淀粉酶与来自猪的淀粉酶具有不同的pH谱。在pH4.8时真菌的淀粉酶比猪的淀粉酶的活性大20倍。因此，发现了比在标准胰酶胶囊中脂酶的剂量低20倍的剂量的淀粉酶，选择该淀粉酶用于TheraCLEC^TM。

3.在1期研究中的数据分析

如下计算脂肪吸收系数：

用氮的克数用相同的算式计算氮吸收系数(CNA)。

我们计划概述人口统计和预后的特性，包括剂量组和全部的年龄、性别、种族、肺功能和污点的***物弹性酶。预计1期研究的样本大小是20名患者，每剂量组4名患者。该研究对于正常的统计检验并不是有力的。我们计划用标准的分类***将不利事件分组。通过研究期、时间点、和剂量组用表列出异常实验室值的频率。

4.1期研究的结果

在11个囊性纤维化病中心中招入了23名患者(14M)。患者的平均年龄是23.5±7.8(SD)(范围＝15.2-44.5岁)(表9)。在分别在组1，3和5中再招入1名患者，以同时向几个中心中补充患者。

表9：研究的人口统计学

5.安全性

在所有剂量水平时TheraCLEC^TM都是耐受性良好的。证明了没有严重的不利事件或死亡，在研究中没有患者退出。在治疗前的时间里，不含酶的疗法最常见的受影响的身体***是胃肠，14名患者报告了总共23个预治疗不利事件。最常见的预治疗胃肠不利事件是腹部不适(4名患者报告了5个事件)，上腹痛(4名患者报告了4个事件)，和胃气胀(4名患者报告了4个事件)。第二最常见的受影响的身体***是呼吸***，5名患者报告了总共8个预治疗不利事件。最常见的预治疗呼吸***不利时间是咳嗽(4名患者报告了4个事件)。

在第2天开始的由于治疗而出现的不利事件在23名患者中18人(78.3％)中发生。在各组中由于治疗而出现的不利事件没有统计学显著的差异(p＝0.6196)。有11名(47.8％)患者具有相关的不利事件(定义为研究者定义的可能或很可能与所研究的药物有关的事件)。

在研究中，6名患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)升高。4名患者在用所研究的药物治疗后酶水平升高。1名患者(1组)在研究访问结束时具有较高的ALT水平，1名患者(5组)在随访的随访评估时具有较高的AST。

6.效力

如表10和附图6和7概述，组1-4的初步临床活性数据表明，当与整个时期都不用胰酶补充相比，用TheraCLEC^TM治疗提高了CFA和CNA。对于组1-4的所有患者，CFA的平均提高是20.6±23.5％，而CNA平均提高了19.7±12.2％。在这些组中用Ther aCLEC^TM治疗也降低了粪便重量，平均降低了425±422g。在最低剂量的TheraCLEC^TM水平(组5：100USP单位脂酶/kg/餐，100USP单位蛋白酶/kg/餐，和15USP单位淀粉酶/kg/餐)时CFA和CNA起码超过了不含酶时的水平。

表10：TheraCLEC^TM的临床活性-从筛选期到治疗期的变化

 

从基线的变化	组1(N＝5)	组2(N＝4)	组3(N＝5)	组4(N＝4)	组5(N＝5)	总共(N＝23)
							平均CFA<sup>1</sup>(SD)	22.7％(19.4)	17.7％(25.9)	18.9％(11.9)	17.2％(42.3)	1.2％(20.3)	15.4％(23.8)
平均CNA<sup>2</sup>(SD)	20.3％(14.2)	14.4％(18.0)	15.8％(5.7)	20.6％(16.5)	0.1％(4.1)	14.0％(13.7)
							排便的平均次数(SD)	-1.2(1.5)	-0.8(1.7)	-2.6(1.7)	-2.8(2.6)	0.2(3.3)	-1.4(2.4)
粪便的平均重量(g)(SD)	-311.4(371.7)	-308.8(367.5)	-613.2(423.3)	-836.0(284.7)	-116.8(373.2)	-425.5(422.2)

SD＝标准差

¹脂肪吸收系数＝100*(脂肪消耗量的克数-脂肪***量的克数)/(脂肪消耗量的克数)

氮吸收系数＝100*(氮消耗量的克数-氮***量的克数)/(氮消耗量的克数)

1期研究的结果

在三天的暴露研究中TheraCLEC^TM表现是安全的和耐受性良好的。在由于治疗而出现的不利事件中没有剂量相关性。在该研究中经常发生胃肠症状，而不管是否患者是进行常规护理、不含酶的治疗还是服用TheraCLEC^TM，尽管当患者处于常规护理时在门诊期发生的频率最低。在研究的住院部分，患者接受有规律的关于GI症状方面的问询，该研究不是双盲的，因此有一定的偏倚。当患者服用TheraCLEC^TM时肝酶的升高和粪便中血红素和白细胞的存在并没有比他们在不含酶的治疗中和常规护理中更常见。

与基线相比，在TheraCLEC^TM中脂肪和氮吸收指数的改善证明了TheraCLEC^TM的脂酶和蛋白酶的效力。在500脂酶单位/kg/餐的剂量以上其不显示剂量响应曲线。尽管有随着剂量增加粪便重量降低的趋势，但该范围较大。在该研究中CFA的值低于在公开文献中的那些。可能的解释包括选择的偏倚、饮食、完全地收集和酶的持续时间。

在该研究中所有患者都患胰腺功能不全，可以通过筛选***物中的弹性酶和通过不含酶的CFA来确证。其他研究包括胰脏功能健全的患者，这将会使平均CFA′s更高[R.C.Stern等，＂AComparison of the Efficacy and Tolerance of Pancrelipase andPlacebo in the Treatment of Steatorrhea in Cystic FibrosisPatients with Clinical Exocrine Pancreatic Insufficiency＂，Am J.Gasteroenterol.，pp.1932-1938(2000)；M.P Francisco等，＂Ranitidine and Omeprazole as Adjuvant Therapyto Pancrealipaseto Improve Fat Absorption in Patients with Cystic Fibrosis＂，J.Pediatr.Gastrenterol.Nutr.，35，pp.79-83(2002)].

在该研究中，患者每天至少摄取100g的脂肪。在可能基于患者的常规饮食的文献中报道的CFA是基于较低的脂肪摄取，因为很多非卧床患者每天摄取小于100g的脂肪[P.Durie等，＂UsesandAbuses of Enzyme TheraDy in Cystic Fibrosis＂，J.Royal Soc.Med.，91，suppl.34，pp.2-3(1998)；D.A.Kawchak等，＂Longitudinal，Prospective Analysis of Dietary Intake in Children with CysticFibrosis＂，J.Pediatr.，129，pp.119-129(1996)]。通过在患囊性纤维化病的患者中观察到的残留、补偿的舌脂肪酶可以更容易地处理较低的脂肪负载[B.Fredrikzon等，＂Lingual lipase：anImportant Li pase in the Digestion of Dietary Lipids in CysticFibrosis？＂，Pediatr.Res.，14，pp.1387-1390(1980)]。

使用蓝色的食物色素来标记粪便收集物。有趣地，临床研究中心的护士报告说胭脂红或木炭标记物难以在粪便中区分。当在粪便中通过时口服500mg剂量的FD&C Blue#2是容易看到的，并且可以在粪便收集物的开始和终点清楚地分辨出来。较短时间的粪便收集将会导致总的粪便收集物中脂肪较少，导致CFA虚高。由于难以在收集的开始和终点辨别，以前的研究已经有虚高的CFAs。由于收集粪便是令人厌恶的，因此人们有尽可能快地结束收集的倾向。

尽管通过解释和实施例的方式在一些详述中描述了上述的发明，以用于澄清和理解的目的，但本发明所属领域的技术领域的普通技术人员将会容易地意识到，可以做出一些变化或修饰而不脱离本文公开的精神和范围，包括附属的权利要求。

Claims (35)

1.一种包含脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物，其中在所述组合物中脂酶，蛋白酶和淀粉酶的比例是1∶1∶0.15 USP单位。

2.根据权利要求1的组合物，其中该脂酶是交联的脂酶晶体的形式。

3.根据权利要求2的组合物，其中该脂酶晶体是用多功能交联剂交联的。

4.根据权利要求3的组合物，其中该多功能交联剂是二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯。

5.根据权利要求1的组合物，其中该蛋白酶是蛋白酶晶体的形式。

6.根据权利要求1的组合物，其中该淀粉酶是无定形淀粉酶的形式。

7.根据权利要求1的组合物，其中该脂酶是微生物的脂酶，蛋白酶是微生物的蛋白酶和淀粉酶是微生物的淀粉酶。

8.根据权利要求7的组合物，其中该微生物的脂酶是细菌的脂酶。

9.根据权利要求8的组合物，其中该细菌的脂酶是假单胞菌的脂酶。

10.根据权利要求8的组合物，其中该细菌的脂酶是伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)脂酶。

11.根据权利要求7的组合物，其中该微生物的蛋白酶是真菌的蛋白酶。

12.根据权利要求11的组合物，其中该真菌的蛋白酶是曲霉的蛋白酶。

13.根据权利要求12的组合物，其中该曲霉的蛋白酶是蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)蛋白酶。

14.根据权利要求7的组合物，其中该微生物的淀粉酶是真菌的淀粉酶。

15.根据权利要求14的组合物，其中该真菌的淀粉酶是曲霉的淀粉酶。

16.根据权利要求15的组合物，其中该曲霉的淀粉酶是米曲霉淀粉酶。

17.根据权利要求7的组合物，其中该脂酶选自交联的假单胞菌的脂酶晶体和交联的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)脂酶晶体，其中所述晶体是用二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯交联的。

18.根据权利要求7的组合物，其中脂酶是选自交联的假单胞菌的脂酶晶体和交联的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)脂酶晶体的交联的脂酶晶体的形式，蛋白酶是蜂蜜曲霉蛋白酶晶体的形式和淀粉酶是无定形米曲霉淀粉酶的形式。

19.根据权利要求1的组合物，进一步包含药学可接受的赋形剂。

20.根据权利要求1的组合物，其中该组合物是选自片剂、胶囊、浆剂、囊剂、混悬液和糖衣片的口服剂型。

21.治疗有效量的权利要求1的组合物在生产用于治疗哺乳动物吸收不良的药物中的用途。

22.治疗有效量的权利要求1的组合物在生产用于治疗哺乳动物胰腺功能不全的药物中的用途。

23.治疗有效量的权利要求1的组合物在生产用于提高哺乳动物脂肪吸收系数和氮吸收系数的药物中的用途。

24.根据权利要求23的用途，其中在所述哺乳动物中脂肪吸收系数和氮吸收系数提高了相等的量。

25.治疗有效量的权利要求1的组合物在生产用于提高哺乳动物糖吸收的药物中的用途。

26.根据权利要求21，22，23和25任一的用途，其中哺乳动物患有囊性纤维化病。

27.根据权利要求21，22，23和25任一的用途，其中所述治疗有效量的组合物是给所述哺乳动物提供25,000 USP单位的脂酶、25,000 USP单位的蛋白酶和3,750 USP单位的淀粉酶。

28.根据权利要求21，22，23和25任一的用途，其中所述治疗有效量的组合物是给所述哺乳动物提供100,000 USP单位的脂酶，100,000 USP单位的蛋白酶和15,000 USP单位的淀粉酶。

29.根据权利要求27或28的用途，其中所述药物是与每餐或点心一起施用于所述哺乳动物的。

30.根据权利要求21，22和23任一的用途，其中当所述基线小于或等于40％时，治疗有效量的所述组合物在哺乳动物中将脂肪吸收系数相对于所述哺乳动物的脂肪吸收的基线系数提高了30％到35％。

31.根据权利要求21，22和23任一的用途，其中当所述基线小于或等于40％时，治疗有效量的所述组合物在哺乳动物中将氮吸收系数相对于所述哺乳动物的氮吸收的基线系数提高了30％到35％。

32.根据权利要求21，22和23任一的用途，其中当所述基线大于40％但小于85％时，治疗有效量的所述组合物在哺乳动物中将脂肪吸收系数相对于所述哺乳动物的脂肪吸收的基线系数提高了10％到25％。

33.根据权利要求21，22和23任一的用途，其中当所述基线大于40％但小于85％时，治疗有效量的所述组合物在哺乳动物中将氮吸收系数相对于所述哺乳动物的氮吸收的基线系数提高了10％到25％。

34.根据权利要求21，22和25任一的用途，其中治疗有效量的所述组合物在所述哺乳动物中将糖吸收相对于所述哺乳动物的基线糖吸收提高了相当于或大于10％。

35.根据权利要求21，22，23，25和26任一的用途，其中所述治疗有效量的组合物给所述哺乳动物提供25,000到100,000 USP单位的脂酶，25,000到100,000 USP单位的蛋白酶和3,750到15,000 USP单位的淀粉酶。

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