DE3788088T2 - Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung. - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung.Info
- Publication number
- DE3788088T2 DE3788088T2 DE3788088T DE3788088T DE3788088T2 DE 3788088 T2 DE3788088 T2 DE 3788088T2 DE 3788088 T DE3788088 T DE 3788088T DE 3788088 T DE3788088 T DE 3788088T DE 3788088 T2 DE3788088 T2 DE 3788088T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- group
- amylase
- oligosaccharide
- formula
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 47
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims abstract description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 24
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 24
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 23
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 23
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 13
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 8
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical class O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 6
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 6
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 claims description 5
- HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N (Dimethoxymethyl)benzene Chemical compound COC(OC)C1=CC=CC=C1 HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CKMNPXWFAZLBNK-QOFYEYOWSA-N OC[C@H]1O[C@@H]2O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]4[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]5[C@@H](CO)O[C@H](O[C@H]1[C@H](O)[C@H]2O)[C@H](O)[C@H]5O)[C@H](O)[C@H]4O)[C@H](O)[C@H]3O Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H]2O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]4[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]5[C@@H](CO)O[C@H](O[C@H]1[C@H](O)[C@H]2O)[C@H](O)[C@H]5O)[C@H](O)[C@H]4O)[C@H](O)[C@H]3O CKMNPXWFAZLBNK-QOFYEYOWSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- -1 benzyloxymethyl group Chemical group 0.000 abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 125000004970 halomethyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 13
- GJASCJZEBANVKX-CQZBUOJGSA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)-2,3-bis[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy]-5-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(phenylmethoxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-4-yl]oxyoxa Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COCC=2C=CC=CC=2)O1 GJASCJZEBANVKX-CQZBUOJGSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 10
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 8
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 8
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102400000471 Isomaltase Human genes 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010026867 Oligo-1,6-Glucosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N (e)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazine Chemical compound C1=CC=C2S\C(=N\N)N(C)C2=C1 PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N 0.000 description 5
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 5
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N indoxyl Chemical group C1=CC=C2C(O)=CNC2=C1 PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 3
- 101000935015 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) N-acetyl-6-hydroxytryptophan oxidase ivoB Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 3
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 3
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000649 benzylidene group Chemical group [H]C(=[*])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 4-nitrophenyl alpha-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003377 acid catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 description 2
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 2
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical compound FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N boron;n-methylmethanamine Chemical compound [B].CNC RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N gamma-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N 0.000 description 2
- 229940080345 gamma-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N glymidine Chemical compound N1=CC(OCCOC)=CN=C1NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisilazane Chemical compound C[Si](C)(C)N[Si](C)(C)C FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- RBXVOQPAMPBADW-UHFFFAOYSA-N nitrous acid;phenol Chemical class ON=O.OC1=CC=CC=C1 RBXVOQPAMPBADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- YXGBAQKCCMQLGH-VQSBMGSQSA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-dih Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](OC2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](OC=5C=CC(=CC=5)[N+]([O-])=O)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O YXGBAQKCCMQLGH-VQSBMGSQSA-N 0.000 description 1
- RRVAKISBQSPFQT-YVECIDJPSA-N (3r,4s,5r,6r)-3,4,5,6,7-pentahydroxy-1-phenylheptan-2-one Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 RRVAKISBQSPFQT-YVECIDJPSA-N 0.000 description 1
- PDVFSPNIEOYOQL-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)sulfonyl 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)OS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 PDVFSPNIEOYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYHRLWMNMMXIHF-UHFFFAOYSA-N (tert-butylamino)boron Chemical compound [B]NC(C)(C)C JYHRLWMNMMXIHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOLHYSJJBXSLMV-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C=CC=C1Cl HOLHYSJJBXSLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 2-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Cl ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNGVNLMMEQUVQK-UHFFFAOYSA-N 4-n,4-n-diethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=CC=C(N)C=C1 QNGVNLMMEQUVQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBXRGISCDMNDSD-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-3-hydroxyindole Chemical group C1=C(Br)C=C2C(O)=CNC2=C1 LBXRGISCDMNDSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 102100033770 Alpha-amylase 1C Human genes 0.000 description 1
- 229910015900 BF3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000178960 Paenibacillus macerans Species 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010026386 Salivary alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N borane;n,n-dimethylmethanamine Chemical compound B.CN(C)C WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000002304 glucoses Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011968 lewis acid catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004780 naphthols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005691 oxidative coupling reaction Methods 0.000 description 1
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N p-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960002816 potassium chloride Drugs 0.000 description 1
- 125000000075 primary alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M sodium;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SUBJHSREKVAVAR-UHFFFAOYSA-N sodium;methanol;methanolate Chemical compound [Na+].OC.[O-]C SUBJHSREKVAVAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003459 sulfonic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000005147 toluenesulfonyl group Chemical group C=1(C(=CC=CC1)S(=O)(=O)*)C 0.000 description 1
- 238000006227 trimethylsilylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof
- C08B37/0015—Inclusion compounds, i.e. host-guest compounds, e.g. polyrotaxanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
- G01N2400/18—Cyclodextrin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase in einer Probe unter Verwendung eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
- Bis her wurden zahlreiche Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase unter Verwendung eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat vorgeschlagen. Beispielsweise offenbart die US-P-4 649 108 von Blair ein Verfahren zur Messung der Menge von α-Amylase in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte der Schaffung eines Oligosaccharid-Substrats für α-Amylase, wobei das Substrat mindestens drei Glucoseeinheiten enthält, das reduzierende Ende des Glucoserests (Einheit) über eine durch α- oder β- Glucosidase an einem Marker gebunden ist, der beim Spalten dieser Bindung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und das nichtreduzierende Ende (Terminal) des Glucoserests über eine blockierende Gruppe gebunden ist, welche die Aufspaltung der Bindung zwischen dem nichtreduzierenden Ende des Glucoserests und dem angrenzenden Glucoserest inhibiert; inkontaktbringen der Probe mit dem Oligosaccharid-Substrat mit einem ersten zugesetzten Exoenzym, welches die Bindung zwischen dem reduzierenden Ende des Glucoserests und dem Marker spalten kann, und einem zweiten zugesetzten Exoenzym, welches die Bindungen zwischen Glucoseeinheiten spalten kann, um eine Mischung zu bilden, die das Substrat, das erste Exoenzym und das zweite Exoenzym aufweist; und Messen der besagten optisch meßbaren Änderung. Nach dieser US- Patentschrift können die blockierenden Gruppen Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Sulfonsäureester, Ether (wie beispielsweise Benzyl-, Silyl- und Triphenylmethyl-), Monosaccharide außer alpha-1,4-verknüpfte Glucose und acetal- oder ketalblockierende Gruppen sein, wie beispielsweise Benzyliden (Spalte 4, Zeilen 37-67). Allerdings sind die esterblockierenden Gruppen unstabil, da sie in einer wäßrigen Lösung leicht hydrolysiert werden. Außerdem wird die Löslichkeit in Wasser in unerwünschter Weise herabgesetzt, wenn die Größe der blockierenden Gruppen größer wird, wie das bei Toluolsulfonyl, Methansulfonyl, Silyl oder Triphenylmethyl der Fall ist. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Probleme bei der Einführung einer blockierenden Gruppe in einen Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende, wobei die vorgenannten Ester- und Ether-Gruppen nach dem entsprechend Spalte 5, Zeile 63 bis Spalte 7, Zeile 58 der genannten US-Patentschrift offenbarten Verfahren nicht in den Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende eingeführt werden können. Daher verfügt das Substrat nach der genannten US-Patentschrift vorzugsweise über 8 oder weniger Glucoseeinheiten und besonders bevorzugt 6 oder 7, wobei die bevorzugten blockierenden Substituenten Acetale oder Ketale sind, z. B. Benzyliden (Spalte 2, Zeilen 4-7).
- Wenn als Substrat zum Messen der α-Amylase das am meisten bevorzugte Oligosaccharid entsprechend der genannten US-Patentschrift, d. h. ein Oligosaccharid mit 6 oder 7 Glucoseeinheiten und Benzyliden als die blockierende Gruppe, verwendet wird, gibt es insofern zahlreiche Probleme, daß die Hydrolysegeschwindigkeit durch α-Amylase gering ist, daß aufgrund der vielen zu hydrolysierenden Positionen zahlreiche Arten von hydrolysierten Produkten erzeugt werden, daß die Reaktion zum Freisetzen der farberzeugenden Gruppe aufgrund der vielen hydrolysierten Produkte kompliziert wird, und die Menge der zu verwendenden koppelnden Enzyme größer wird und somit die Zuverlässigkeit für die Messung unzureichend wird. Die Behebung dieser Nachteile wird seit langem angestrebt.
- Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Bestimmen der Aktivität von α-Amylase in einer Probe, welches umfaßt:
- Verwenden eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat für α-Amylase, welches Oligosaccharid die Formel hat:
- worin sind: R¹ ein Halogenatom und R² eine Gruppe der Formel:
- worin R³ bis R&sup6; voneinander unabhängig Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe, eine niedere Alkoxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Halogenatom sind und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6; zur Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können; R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder ein Halogenatom ist,
- Inkontaktbringen der Probe mit dem Substrat in Gegenwart mindestens eines Exoenzyms und Messen einer optisch meßbaren Änderung als Maß der α- Amylaseaktivität in der Probe.
- Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines durch die Formeln (I) oder (II) dargestellten Oligosaccharids, welches umfaßt: Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit Cyclomaltodextringlucontransferase in Gegenwart eines Akzeptors, der ausgewählt wird aus Glucose, Maltose und Maltotriose, worin dio- Glucose, Maltose und Maltotriose jede einen Substituenten aufweisen, der an dem Zucker-Bruchstück über eine glykosidische Bindung verknüpft ist, das bei der Aufspaltung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und sodann Umsetzen mit Glucoamylase oder α-Glucosidase.
- Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines durch die Formel (I) dargestellten Oligosaccharids, welches umfaßt: Umsetzen eines einen Substituenten aufweisenden Oligosaccharids, welcher Substituent eine optisch meßbare Änderung bei Spaltung an dem reduzierenden Ende des Glucoserests zeigt, und zwar entweder mit Benzaldehyd oder Benzaldehyddimethylacetal, um das 4,6- O-cyclische Acetal an dem nichtreduzierenden Ende des Glucoserests zu bilden; und Reduzieren des 4,6-O-cyclischen Acetals.
- Es zeigen:
- Fig. 1 ein iR-Diagramm des nach Beispiel 1 erhaltenen Oligosaccharids,
- Fig. 2 und 3 'H-NMR-Diagramme der nach den Beispielen 1 bzw. 2 erhaltenen Oligosaccharide,
- Fig. 4 und 5 in den Beispielen 4 bzw. 6 erhaltene Eichkurven.
- Das als ein Substrat für α-Amylase verwendete modifizierte Oligosaccharid wird durch die Formel dargestellt:
- darin sind R¹ ein Halogenatom, wie beispielsweise Brom, Chlor, Iod, usw.; und R² eine Gruppe der Formel:
- worin R³ bis R&sup6; unabhängig Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine niedere Alkoxygruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Halogenatom sind, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw., und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6; unter Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können; R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw., oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder ein Halogenatom ist, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw.
- Die Oligosaccharide der Formel (I) und (II) haben die Vorteile, daß die Hydrolysegeschwindigkeit hoch ist, d. h. die Empfindlichkeit als ein Substrat ist hoch, die Michaelis-Konstante (Km) klein ist, welche Konstante definiert ist als eine Substratkonzentration und die halbe Maximalgeschwindigkeit (Vmax) von α-Amylase angibt, d. h. die Selektivität als ein Substrat ist hoch und die erforderliche Substratkonzentration zum Messen der Aktivitäten von α- Amylase niedrig (normalerweise verwendet in einer Konzentration mit dem Wert Km · 5 . . . 10), wobei die Hydrolyse zumeist an einer Stelle erfolgt, d. h. die Farbbildungsreaktion von den hydrolysierten Produkten kann einfach und mühelos ausgeführt werden.
- Die vorgenannten Vorteile können unter Verwendung der folgenden Oligosaccharide gezeigt werden:
- n = 2: BG4P
- n = 3: BG5P (die vorliegende Erfindung)
- n = 4: BG6P
- n = 5: BG7P
- n = 2: G4P
- n = 3: G5P (Standard)
- n' = 4: G6P
- n = 5: G7P
- n = 2: BDG4P
- n = 3: BDG5P
- n = 4: BDG6P
- n = 5: BDG7P
- Die Hydrolysegeschwindigkeit wird unter Verwendung von Human-Pancreatin-α-Amylase (HPA) oder Human-Speichel-α- Amylase (HSA) für das jeweilige Substrat (1,0 mM) bei pH 7 gemessen und mit Hilfe der relativen Werte ausgewertet, indem der Wert von G5P gleich 1 gesetzt wird.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Substrat α-Amylase
- Die Km-Werte wurden entsprechend einer graphischen Darstellung nach Lineweaver und Burk mit Hilfe der Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Die Mengen der Produkte wurden mit Hilfe der HPLC gemessen.
- Es wurde eine Mischung von 20 ul einer α-Amylaselösung und 200 ul einer 1,2 mM Substratlösung in 50 mM BES [N,N- bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure]/NaOH-Puffer (pH 7,6), die 20 mM Natriumchlorid und 2 mM Calciumchlorid enthielt, bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Sodann wurden 25 ul der Reaktionsmischung zu 500 ul 5%iger Essigsäure zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Die Probe (100 ul) wurde mit Hilfe der HPLC analysiert, um die Mengen der Produkte zu untersuchen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Substrat Km-Wert
- Die Bindungsart des jeweiligen Substrats wurde mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) entsprechend der vorstehenden Beschreibung gemessen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 α-Amylase Hydrolyseprodukt Substrat nicht hydrolysiert
- Aus den Ergebnissen der Tabellen 1-3 wird offensichtlich, daß lediglich BG5P den drei Bedingungen genügt, d. h. hohe Hydrolysegeschwindigkeit, niedriger Km- Wert und Hydrolyse überwiegend an einer Stelle, bei der hauptsächlich G2P erzeugt wird. Da G3P oder G4P nicht durch die Hydrolyse erzeugt werden, ist es möglich, die α- Amylaseaktivität unter bloßer Verwendung von α-Glucosidase als Exoenzym zu messen, durch die G2P ausreichend, G3P oder G4P jedoch nichtausreichend hydrolysiert werden.
- Die Aktivität von α-Amylase kann gemessen werden, indem das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) wie folgt verwendet wird:
- Exoenzym(e):
- (i) α-Glucosidase
- (ii) α-Glucosidase Glucoamylase
- (iii) α-Glucosidase β-Glucosidase
- (iv) α-Glucosidase β-Glucosidase Glucoamylase
- (v) isomaltase α-Glucosidase
- (vi) Isomaltase Glucoamylase
- Der Substituent R&sup0; ist an der C&sub6;-Stelle des nichtreduzierenden Endes des Glucoserests und der Substituent OR² an der C&sub1;-Stelle des reduzierenden Endes des Glucoserests angebracht und wird beispielsweise dargestellt durch eine Phenoxygruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann, eine Naphthoxygruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann, eine Umbelliferylgruppe mit festgelegten Substituentengruppen oder eine indoxylgruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann.
- Das bedeutet, daß die α-Amylase einer Probe zuerst auf das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) wirkt, um
- zu erzeugen, worin die primäre Alkoholgruppe G¹G-G (-CH&sub2;OH) an der C&sub6;-Stelle des Glucoserests mit nichtreduziertem Ende aus gewechselt wird durch den Substituenten R&sup0; und G-G-OR², worin OR² wie voranstehend festgelegt ist. Sodann wird G-G-OR² mit koppelndem/n Enzym/en, wie beispielsweise Glucöamylase, α-Glucosidase, S-Glucosidase u. dgl. umgesetzt wird, um 2G und R²-OH zu erzeugen, welches eine optisch meßbare' Änderung zeigt. Wenn R²-OH ein Nitrophenol ist, wie beispielsweise p-Nitrophenol, kann die Aktivität von α-Amylase in einer Probe durch direkte Messung ihres Absorptionsspektrums (z. B. Absorption bei 405 nm) erhalten werden. Wenn R²-OH Phenol oder Naphthol ist, ohne eine Nitrogruppe zu haben (oder mit der Fähigkeit eine Nitrogruppe haben zu können), wie beispielsweise Phenol, o- Chlorphenol, 2,6-Dichlorphenol oder p-Methoxyphenol, wird es mit einem Koppler umgesetzt, wie beispielsweise 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH), und zwar in Gegenwart einer Oxidase, wie beispielsweise Catecholoxidase, Laccase, Tyrosinase oder Monophenoloxidase, oder ein Oxidationsmittel, wie beispielsweise Iodsäure oder Periodsäure, oder Peroxidase und Wasserstoffperoxid, um einen Farbstoff zu erzeugen, dessen Absorptionsspektrum gemessen wird. Wenn R²-OH eine Fluoreszenzstrahlung emittierende Verbindung ist, wie beispielsweise Umbelliferon oder 4-Methylumbelliferon, wird die Intensität der Fluoreszenzstrahlung gemessen. Wenn ferner R²-OH Indoxyl ist, wird das Absorptionsspektrum von durch Oxidation erzeugten Indigofarbstoffen gemessen.
- Die Konzentration des als ein Substrat bei der Bestimmung der Aktivität von α-Amylase verwendeten modifizierten Oligosaccharids ist nicht ausdrücklich begrenzt, beträgt in der Regel jedoch 0,1 bis 10 mM.
- Als eine zu messende Probe kann jede verwendet werden, die α-Amylase enthält. Beispielsweise können als biologische Flüssigkeiten Blut, Serum, Urin und Speichel verwendet werden.
- Als das Exoenzym, bei dem es sich um ein koppelndes Enzym handelt, kann α-Glucosidase verwendet werden, eine Mischung von α-Glucosidase und Glucoamylase, eine Mischung von α-Glucosidase und β-Glucosidase, eine Mischung von α- Glucosidase, β-Glucosidase und Glucoamylase, eine Mischung von α-Glucosidase und Isomaltase sowie eine Mischung von Isomaltase und Glucoamylase. Diese Exoenzyme können von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen. Die Menge der verwendeten Exoenzyme beträgt in der Regel 0,5 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 2 bis 50 Einheiten/ml.
- Die Reaktionstemperatur ist im wesentlichen nicht beschränkt und beträgt vorzugsweise 25ºC bis 40ºC. Die Reaktionsdauer kann je nach den Aufgaben in geeigneter Weise gewählt werden.
- Der pH-Wert der Reaktion ist im wesentlichen nicht beschränkt und beträgt vorzugsweise 6 bis 8. Als eine Pufferlösung zur Aufrechterhaltung des korrekten pH-Werts können ein Phosphatpuffer, ein Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCL-Puffer und ein Good-Puffer verwendet werden.
- Als ein Aktivierungsmittel für α-Amylase können Natriumchlorid, Calciumchlorid, Kaliumchlorid und Calciumacetat verwendet werden.
- Als der Koppler zum Koppeln (Oxidation-Kondensation) des Phenols oder Naphthols, die durch die Wirkung des(der) Exoenzyms(Exoenzyme) freigesetzt werden, kann 4-Aminoantipyrin, 3-Methyl-2-Benzothiazolinonhydrazon (MBTH) und p- Amino-N,N-diethylanilin verwendet werden.
- Als die Oxidase zum Koppeln (Oxidation-Kondensation) des Phenols oder Napthols mit dem Koppler kann Laccase, Catecholoxidase, Tyrosinase und Monophenoloxidase verwendet werden, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen, und zwar in einer Menge von normalerweise 0,2 bis 10 Einheiten/ml, vorzugsweise 0,5 bis 4 Einheiten/ml.
- Als das Oxidationsmittel zum Koppeln (Oxidation- Kondensation) kann Iodsäure und/oder eines ihrer Salze verwendet werden, wie beispielsweise das Natrium- und Kaliumsalz, Periodsäure und/oder deren Salze, wie beispielsweise das Natrium- und Kaliumsalz, sowie Wasserstoffperoxid.
- Da der primäre Alkohol (-CH&sub2;OH) an der C&sub6;-Stelle des Glucoserests mit nichtreduzierendem Ende des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) durch -CH2OCH2- oder -CH&sub2;X (X: Halogen) ausgewechselt wird, kann das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) nicht als ein Substrat für Glucoamylase, α-Glucosidase, β-Glucosidase oder Isomaltase, in der Form wie es ist, verwendet werden. Da das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) in Wasser jedoch leicht löslich ist und zur α-Amylase eine hervorragende Affinität aufweist, kann es für α-Amylase ein gutes spezifisches Substrat sein. Dadurch bewirkt das Verfahren der α-Amylasebestimmung unter Verwendung des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) als ein Substrat keine Nebenreaktionen und hat einen sehr kleinen Blindwert. Ferner ist die Reagenslösung für die Messung sehr stabil. Darüber hinaus wird, da Humanα-Amylase überwiegend nur eine der glycosidischen Bindungen des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) hydrolysiert, die Stöchiometrie hergestellt, was zur Folge hat, daß die kinetische Bestimmung der α-Amylase möglich wird.
- Darüber hinaus kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase die Dauer der Lag-Phase, da das Hauptprodukt durch das Reagieren mit α- Amylase G2P ist, durch Umsetzen mit mindestens einem koppelnden Enzym (Exoenzym), wie beispielsweise Glucoamylase, α-Glucosidase, Isomaltase oder β-Glucosidase, in der Reaktion nach der α-Amylasereaktion verkürzt werden. Somit kann die Bestimmung der α-Amylaseaktivität mit hoher Empfindlichkeit und guter Linearität durchgeführt werden.
- In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase kann die Messung einer optisch meßbaren Änderung durch Messen der Absorptionsspektren von freigesetzten Nitrophenolen oder Indigofarbstoffen durchgeführt werden, indem die Absorptionsspektren von durch oxidative Kopplung von Phenolen gebildeten Farbstoffen oder mit 4-Aminoantipyrin oder MBTH freigesetzten Naphtholen gemessen werden oder durch Messen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung von freigesetztem Umbelliferon, so daß das Meßverfahren durch Zuckerstoffe, wie beispielsweise Glucose und Maltose, und reduzierende Substanzen, wie beispielsweise Ascorbinsäure, und in den zu messenden Proben vorhandenes Bilirubin kaum beeinflußt werden kann.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase kann entweder bei einer Geschwindigkeitsbestimmung angewendet werden, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit unter bestimmten Bedingungen gemessen wird, oder bei einer Endpunktbestimmung, bei der ein Reaktionsterminator verwendet wird.
- Ferner eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase gut für ein automatisches Analysengerät und kann im Bedarfsfall in einer manuellen Betriebsart angewendet werden.
- Da durch die Verwendung des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) eine sogenannte kolorimetrische Methode angewendet werden kann (bei der die Farbe eines Entwicklungsfarbstoffes gemessen wird), kann das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich auch bei einer Teststreifenmethode angewendet werden, bei der es sich um eine sehr einfache Methode und ein sogenanntes Trockenbestimmungsverfahren handelt, bei welchem mehrschichtige Analysenbögen verwendet werden, die Reaktionsreagentien enthalten (mehrschichtige, einteilige Streifen für quantitative Analyse).
- Die modifizierten Oligosaccharide der Formeln (I) und (II) können durch Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit Cyclomaltodextrin-Glucontransferase in Gegenwart eines speziellen Akzeptors und nachfolgendem Umsetzen mit Glucoamylase oder α-Glucosidase hergestellt werden.
- Als das modifizierte Cyclodextrin werden solche verwendet, die einen modifizierten Glucoserest pro Molekül aufweisen.
- Als der modifizierte Glucoserest kann substituierte Glucose verwendet werden, bei der die primäre Hydroxylgruppe in der Glucose durch einen Substituenten ersetzt ist, der eine Benzyloxygruppe oder ein Halogenatom aufweist, wie beispielsweise Chlor und Brom.
- Als der Akzeptor kann Glucose, Maltose oder Maltotriose verwendet werden, die als einen Substituenten z. B. p- Nitrophenyl, Phenyl, Umbelliferyl, Naphthyl aufweist. Wenn die Glucosekette länger wird, wird ebenfalls die Glucosekette des Hauptprodukts in der Anfangsreaktion länger. Daher wird geeigneterweise die Glucosekettenlänge von 1 bis 3 gewählt und als der Akzeptor verwendet.
- Als der Substituent der Hydroxylgruppe an der C&sub1;-Stelle des modifizierten Glucoserests des Akzeptors kann die Gruppe verwendet werden, die durch die Formel dargestellt wird: -OR², worin R² wie vorstehend definiert ist.
- Konkrete Beispiele für die -OR²-Gruppen sind eine p-Nitrophenoxygruppe, eine m-Nitrophenoxygruppe, eine o-Chlorphenoxygruppe, eine p-Chlorphenoxygruppe, eine 2,6-Dichlorphenoxygruppe, eine o-Methoxyphenoxygruppe, eine p-Methoxyphenoxygruppe, eine o-Methylphenoxygruppe, eine o-Carboxyphenoxygruppe, eine o-Sulfophenoxygruppe, eine 1-Naphthoxygruppe, eine 2-Sulfo-1-Naphthoxygruppe, eine 2-Carboxy-1- Naphthoxygruppe, eine Umbelliferylgruppe, eine 4-Methylumbelliferylgruppe und eine Indoxylgruppe.
- Die Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase (nachfolgend bezeichnet als "CGTase") ist nicht auf ihre Herkunft und Quelle beschränkt. Es können solche verwendet werden, die vom Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Klebsiella pneumoniae und Alcaligenes abstammen.
- Das modifizierte Cyclodextrin kann leicht durch Verwendung von α-, β- oder γ-Cyclodextrin als Ausgangsmaterial und Umsetzen mit verschiedenen Reaktionsteilnehmern zum Einführen der gewünschten modifizierenden Gruppen entsprechend den Verfahren zur Herstellung verschiedener modifizierter Glucosen erhalten werden, die beispielsweise beschrieben werden in: "Method in Carbohydrate Chemistry", I (1962) bis V (1965), veröffentlicht bei Academic Press. Die Auswahl von α-, β- oder γ-Cyclodextrin kann in Abhängigkeit von der Glucosekettenlänge des gewünschten modifizierten Oligosaccharidderivats und seiner maximalen Ausbeute bestimmt werden.
- Der pH-Wert der Reaktion des modifizierten Cyclodextrins mit CGTase in Gegenwart eines Akzeptors verändert sich leicht je nach der Herkunft der CGTase, liegt normalerweise aber bei 6 bis 8. Zur Aufrechterhaltung des geeigneten pH-Werts kann jedes Pufferungsmittel verwendet werden, das die enzymatische Reaktion nicht verzögert. Beispiele des Pufferungsmittels sind Good-Puffer, Amoniumacetat-Puffer, Carbonat-Puffer und Phosphat-Puffer.
- Das modifizierte Cyclodextrin wird in einer Konzentration von vorzugsweise 1 bis 50 mM/l und der Akzeptor in einer Konzentration von 1 mM/l oder darüber bis zur Löslichkeitsgrenze verwendet.
- Der Akzeptor wird vorzugsweise in einer Menge von 5 Molen oder darüber pro Mol des modifizierten Cyclodextrins verwendet.
- Die CGTase wird vorzugsweise in einer Menge von 50 bis 5.000 U/ml verwendet. Die Reaktion wird vorzugsweise bei 20ºC bis 50ºC ausgeführt. Nach der enzymatischen Reaktion wird die CGTase durch Erhitzen, z. B. bei 90ºC oder darüber, für 10 Minuten oder mehr oder durch Änderung des pH-Werts, z. B. pH 4,0 oder weniger, desaktiviert.
- Die Reaktion unter Verwendung von Glucoamylase oder α- Glucosidase kann vorzugsweise bei dem am besten geeigneten pH-Wert ausgeführt werden, z. B. pH 4 bis 6, und unter Verwendung von Glucoamylase oder α-Glucosidase in einer Menge von vorzugsweise 5 bis 100 U/ml.
- Wahlweise kann das modifizierte Oligosaccharid der Formel (i) durch Umsetzen eines Oligosaccharids mit einem Substituenten hergestellt werden, der eine optisch meßbare Änderung bei Abspaltung an dem Glucoserest mit reduzierendem Ende entweder mit Benzaldehyd oder Benzaldehyd-Dimethylacetal zeigt, um das 4,6-0-cyclische Acetal an dem Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende zu bilden und das 4,6-0- cyclische Acetal zu reduzieren.
- Das Oligosaccharidderivat wird zunächst mit dem vorbestimmten Aldehyd oder Acetal zur Bildung eines cyclischen Acetals zwischen den Stellen C&sub4; und C&sub6; des Glucoserests mit nichtreduzierendem Ende umgesetzt. Das Oligosaccharidderivat ist kommerziell verfügbar oder kann nach einem Verfahren synthetisch hergestellt werden, das beispielsweise in der JP-A-54-51892 ("A-Schrift") beschrieben wird.
- Das vorbestimmte Aldehyd oder Acetal oder Ketal wird in einer Menge von vorzugsweise 1 bis 100 Molen pro Mol des Oligosaccharidderivats verwendet.
- Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart einer Lewis-Säure als Katalysator durchgeführt, wie beispielsweise p-Toluolsulfonsäure oder Zinkchlorid, und zwar in einem geeigneten Lösemittel, wie beispielsweise N,N-Dimethylformamid (DMF), bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis einer Rückflußtemperatur und einer Zeit von 0,5 bis 12 Stunden.
- Das resultierende Zwischenprodukt mit dem cyclischen Acetal wird normalerweise einer Modifikation von anderen Hydroxylgruppen durch Acylierung, gefolgt von einem Reduktionsschritt, unterzogen.
- Die Acylierung kann nach einem konventionellen Verfahren ausgeführt werden, beispielsweise in Gegenwart einer Base wie Pyridin und unter Verwendung eines Acylierungsmittels, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid, Benzoylchlorid, usw.
- Der Acylierungsschritt ist nicht entscheidend, wird jedoch zur Erhöhung der Löslichkeit in einem in dem nächsten Schritt (Reduktionsschritt) verwendeten Reaktionslösemittel bevorzugt.
- Der Reduktionsschritt wird normalerweise unter Verwendung eines Reduktionsmittels in Gegenwart eines Säurekatalysators durchgeführt, wie beispielsweise Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Zinkchlorid, p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Chlorwasserstoffgas (oder Einleiten in Ether) usw., und zwar in einem geeigneten Lösemittel (z. B. Tetrahydrofuran (THF), usw.) in der Regel bei 0ºC bis 50ºC für einige 10 Minuten bis mehrere Stunden.
- Als das Reduktionsmittel können Natriumcyanborhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Pyridinboran, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran, t-Butylaminboran oder Diboran verwendet werden. Das Reduktionsmittel wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 1.000 Molen pro Mol des Oligosaccharidderivats verwendet.
- Der Säurekatalysator wird vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 5 Molen pro Mol Reduktionsmittel verwendet.
- Sofern ein Acylschutz vorgenommen wird, erfolgt die Deacylierung nach einem konventionellen Verfahren, beispielsweise durch Behandeln mit 0,01 bis 1,0 n Natriummethoxid-Methanollösung für eine Dauer von mehreren 10 Stunden bei Raumtemperatur bis zu leicht erhöhten Temperaturen, um mühelos das modifizierte Oligosaccharid zu ergeben.
- Einzelne Nachbehandlungen nach einzelnen Schritten können nach den konventionellen Verfahren ausgeführt werden. Das Endprodukt kann nach einem konventionellen Verfahren gereinigt werden, wie beispielsweise der Säulenchromatographie.
- Da die α-1,4-Bindung des Oligosaccharids der sauren Hydrolyse unter sauren Bedingungen oder der Methanolyse unter wasserfreien Methanol-HCl-Bedingungen ausgesetzt war und die Stabilität der glycosidischen Bindung (die Bindung zwischen dem Glucoserest mit reduzierendem Ende und der -OR²-Gruppe) unter sauren Bedingungen unbekannt war, war unbekannt, ob das von dem Oligosaccharid der Formel stammende modifizierte Oligosaccharid einer solchen Reduktionsbehandlung standhalten konnte. Die Erfinder haben jedoch zum ersten Mal überraschend festgestellt, daß Ringöffnung des cyclischen Acetalteils möglich war und die vorliegende Erfindung ausgeführt wird.
- Die Gruppe der Formel -OR² ist an dem Glucoserest mit reduzierendem Ende gebunden und kann, wie bereits erwähnt, durch die Wirkung von Glucoamylase-[E.C.3.2.1.3.], α- Glucosidase [E.C.3.2.1.20.], β-Glucosidase [E.C.3.2.1.21.], isomaltase-[E.C.3.2.1.10.] oder β-Amylase [E.C.3.2.1.2.], hydrolysiert werden, um Nitrophenole zu bilden, die im sichtbaren Bereich selbst Absorptionen aufweisen, um schließlich Farbstoffe durch Koppeln mit Kopplern infolge der Wirkung von Oxidasen zu bilden, wie beispielsweise Catechol-Oxidase, Laccase, Tyrosinase und Monophenol- Oxidase, oder um schließlich Farbstoffe durch Koppeln mit Kopplern unter Wirkung von Oxidationsmitteln zu bilden.
- Weitere Beispiele für die Gruppe der Formel -OR² sind eine 2-Chlor-4-nitrophenoxygruppe, eine 4-Trifluormethylumbelliferylgruppe, eine 5-Bromindoxylgruppe und eine 4-Chlor- 3-bromindoxylgruppe.
- Das modifizierte Oligosaccharid der vorliegenden Erfindung kann wirksam als ein Substrat für eine fraktionelle Meßmethode von α-Amylase verwendet werden, die von den Speicheldrüsen stammt, und für α-Amylase die vom Pankreas stammt, d. h. eine fraktionelle Meßmethode von α-Amylaseisoenzymen, bei der zersetzte Produkte, die durch Hydrolyse von α-Amylase erzeugt wurden, umgesetzt werden mit zwei oder mehreren koppelnden Enzymen, die unterschiedliche Substratselektivitäten aufweisen, wobei die erzeugten Produkte gemessen werden, um fraktionelle Messungen von α-Amylase auszuführen, die von Human-Pankreas stammt, und α-Amylase, die von Human-Speicheldrüsen stammt.
- Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
- Synthese von Mono-6-0-p-toluolsulfonyl-β-cyclodextrin in 100 ml Pyridin wurden 5,0 g β-Cyclodextrin aufgelöst und 0,8 g p-Toluolsulfonylchlorid zugesetzt und danach bei 4ºC für 15 Stunden gerührt. Nach dem Konzentrieren unter reduziertem Druck wurde die Reaktionslösung in eine mit Aktivkohle gefüllte Säule (5 cm · 60 cm) gegeben und mit Wasser, 30% Ethanol, 25% n-propanol, in Mengen von jeweils 3 Litern eluiert. Die Fraktionen des 25%igen n-Propanols wurden aufgenommen und unter reduziertem Druck konzentriert, um 0,7 g 6-O-p-Toluolsulfonyl-β-cyclodextrin zu ergeben.
- Synthese von p-Nitrophenyl-O-(6-O-benzyl)-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D- glucopyranosid (nachfolgend bezeichnet als "BG5P")
- In 120 ml Wasser wurden 15 g β-Cyclodextrin und 13,5 g Natriumhydroxid aufgelöst und dazu 15 ml Benzylchlorid zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 10ºC für 2 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach der Reaktion wurde der pH-Wert auf 7,0 mit Hilfe von 6 n HCl eingestellt und dazu 1 Liter Aceton zugegeben. Der ausgefällte Niederschlag wurde filtriert und 5 g Benzyl-β-CD erhalten (eine Mischung von substituierten Massen mit Substituenten an den Stellen C&sub2;, C&sub3; und C&sub6;).
- in 1 Liter von 10 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 6,5) wurden 10 g Benzyl-β-CD und 10 g p-Nitrophenyl-α-D- Glucopyranosid aufgelöst und dazu 1.000 kU CGTase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC für 5 Stunden unter Rühren durchgeführt. Nach der Einstellung des pH-Werts auf 4,0 mit Hilfe von Essigsäure wurden 20 kU Glucoamylase zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC für 10 Stunden ausgeführt. Nach dem Gefriertrocknen der Reaktionslösung wurde mit Hilfe einer mit Bio-Gel P-2 (hergestellt von Bio-Rad Co.) gefüllten Säule (30 mm · 1.500 mm), äquilibriert mit 50 mM Essigsäure,eine Reinigung ausgeführt, um 1,6 g rohes BG5P (eine Mischung von Verbindungen mit Substituenten an den Stellen C&sub2;, C&sub3; und C&sub6;) zu erhalten. Dieses wurde abgetrennt und gereinigt mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), um 180 mg Masse zu erhalten, die an der Stelle C&sub6; substituiert war (700 mg Masse mit Substitution an der Stelle C&sub2; und 650 mg Masse mit Substitution an der Stelle C&sub3;).
- HPLC: Inhalt 96% [Säule: Silica-Gel Z-ODS, 5C&sub1;&sub8; (eine Handelsbezeichnung, hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 10 mm · 300 mm); Eluat: linearer Gradient von 10% CH&sub3;CN - 0,1% AcOH und 90% CH&sub3;CN - 0,1% AcOH; Durchflußrate: 3 ml/min, gemessen bei 305 nm]
- IR: entsprechend Fig. 1.
- ¹H-NMR: entsprechend Fig. 2.
- GLC-Analysen: Glucoserest und Benzylglucoserest in BG5P wurden mit Hilfe der GLC (Säule: 2% OV-17 auf Chromosorb, hergestellt von der Wako Pure Chem. ind., Ltd., 0,4 cm · 200 cm) nach Methanolyse (1,4 M HCl-Methanol, 90ºC für 2 Stunden) analysiert, gefolgt von einer Trimethylsilylierung mit Hexamethyldisilazan und Trimethylsilylchlorid in Pyridin. Die Temperatur war auf 110ºC bis 250ºC in Schritten von 4ºC pro Minute programmiert. Die Konzentration der p-Nitrophenylgruppe wurde gleich 1 gesetzt und der Gehalt anhand der Absorption bei 305 nm in 0,1 Mol Essigsäurelösung bestimmt.
- Anhand der vorgenannten Ergebnisse und der Tatsache, daß BG5P durch Glucoamylase nicht angegriffen wurde, wurde für BG5P die folgende Struktur geschätzt:
- Synthese von p-Nitrophenyl-O-(6-brom-6-deoxy)-α-D- glucopyranosyl-(1-4)O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranosid (nachfolgend bezeichnet als "BrG5P")
- In 250 ml DMF wurden 5 g Mono-6-O-p-toluolsulfonyl-βcyclodextrin aufgelöst, das entsprechend dem Herstellungsbeispiel synthetisch hergestellt wurde, und dazu 15 g Lithiumbromid gegeben. Die Reaktion wurde für 2 Stunden am Rückfluß ausgeführt. Nach dem Konzentrieren unter reduziertem Druck wurden 500 ml Aceton dazu zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen, der filtriert wurde und 2,3 g Mono-6-brom-6-deoxy-β-cyclodextrin ergab.
- In 100 ml von 10 mM Axnmoniumacetat-Pufferlösung (pH 6,5) wurden 1 g Br-β-CD und 1 g p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranosid aufgelöst und dazu 100 kU CGTase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC für 5 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 4,0 mit Hilfe von Essigsäure, wurden 2.000 U Glucoamylase zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC für 10 Stunden unter Rühren ausgeführt. Die Reaktionslösung wurde konzentriert und mit Hilfe einer Säule (30 mm · 1.500 mm) gereinigt, die mit Bio- Gel P-2 (hergestellt von Bio-Rad Co.) gefüllt und mit 50 mM Essigsäure äquilibriert war, um 0,16 g BrG5P zu erhalten.
- HPLC: Gehalt 97% (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben),
- ¹H-NMR: entsprechend Fig. 3
- Das Verhältnis von Glucose/p-Nitrophenol von BrG5P, das in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, betrug 3,6.
- Anhand der vorgenannten Ergebnisse und der Tatsache, daß BrG5P durch Glucoamylase nicht angegriffen wurde, wurde für BrG5P die folgende Struktur bestimmt:
- Nach dem Auflösen von 3 g p-Nitrophenyl-α-D-Maltopentaosid in 50 ml D-F, wurden 15 ml Benzaldehyddimethylacetal und 1 g p-Toluolsufonsäure (Anhydrid) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 50ºC für 3 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach der Reaktion wurden 100 ml Pyridin zugesetzt und 60 ml Benzoylchlorid tropfenweise zur Ausführung der Reaktion zugegeben. Die Reaktionslösung wurde in eine Lösung von gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gegossen, um die Reaktion zu stoppen. Die Reaktionslösung wurde mit 200 ml Chloroform extrahiert und zweimal mit gesättigter Salzlösung gewaschen und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Der resultierende Sirup wurde in einen 1-1-Vierhalskolben übertragen und in 250 ml THF aufgelöst, dem ein Zusatz und Auflösen von 3 g Dimethylaminboran folgte. Zu dieser Lösung wurden 10 ml einer Lösung von 0,5 M HCl (Gas) in Diethylether tropfenweise unter Rühren zugesetzt und die Reaktionslösung in 200 ml gesättigtem Natriumhydrogencarbonat zum Stoppen der Reaktion gegossen, wonach Extraktion mit 200 ml Chloroform folgte. Nach zweimaligem Waschen mit gesättigter Salzlösung wurde das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Zu der resultierenden Lösung wurden 500 ml Methanollösung gegeben, die 0,1 n Natriummethoxid enthielt, bei 25ºC für 4 Stunden gerührt, gefolgt durch Zusatz von Essigsäure zur Neutralisation. Nach der Entfernung des Lösemittels im Vakuum wurden 20 ml einer 50 mM Essigsäurelösung zugesetzt und auf eine Bio-Gel-p-2-Säule gegeben (hergestellt von Bio-Rad Co., 2 cm Durchmesser · 150 cm), äquilibriert mit 50 mM Essigsäure, wonach die BG5P-Fraktionen aufgenommen und gefriergetrocknet wurden.
- Ausbeute: 450 mg
- IR-Diagramm: entsprechend Fig. 1
- ¹H-NMR: entsprechend Fig. 2
- HPLC: Gehalt 95% (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben)
- GC-Analyse der Zusammensetzung: Glucose/6-O- Benzylglucose/p-Nitrophenylgruppe = 3,8/0,9/1,0 (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben).
- Es wurde durch Auflösen von 30 mg des in Beispiel 1 erhaltenen BG5P in 30 ml von 50 mM/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-NaOH-Pufferlösung (pH 6,9) mit einem Gehalt von 400 Einheiten Glucoamylase, 300 Einheiten α-Glucosidase und 20 mM/l Calciumchlorid eine Meßreagenslösung hergestellt.
- Zu 2 ml der Meßlösung wurden 100 ul eines Probeserums zugegeben und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
- Andererseits wurde unter Verwendung einer Standardprobe, die bekannte Aktivitäten von α-Amylasen enthielt, die Eichkurve in der gleichen Weise aufgenommen, wie voranstehend beschrieben. Aus dieser Eichkurve wurde die α- Amylaseaktivität eines Probeserums erhalten. Fig. 4 zeigt eine Beziehung zwischen der Aktivität von α-Amylase in den einzelnen Verdünnungsstufen einer Standardprobe (Somogyi- Einheit/dl) und dem Zuwachs der Absorption (ΔA) pro Minute bei einer Wellenlänge von 405 nm.
- Wie aus Fig. 4 ersichtlich, verläuft die Eichkurve, die durch Auftragen der Werte mit steigender Absorption (ΔA/min) entsprechend der α-Amylaseaktivität (Somogyi Einheit/dl) erhalten wurde, linear und geht durch den Nullpunkt. Dieses bedeutet, daß die Eichkurve ein gutes qualitatives Verhalten zeigt.
- Es wurde durch Auflösen von 2,1 g N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 230 mg NaCl, 58 mg CaCl&sub2;, 500 mg NaOH in destilliertem Wasser mit einer Gesamtmenge von 100 ml (pH 7,3) und Auflösen darin von 125 mg des in Beispiel 3 erhaltenen BG5P eine Meßreagenslösung hergestellt.
- Lösung (A): Zu 50 ml der resultierenden Lösung wurden 25.000 Einheiten von α- Glucosidase zugesetzt;
- Lösung (B): Zu 20 ml der Lösung (A) wurden 1.000 Einheiten Glucoamylase zugesetzt.
- Zu 2 ml der Reagenslösung (A) oder (B) wurden 50 ul Serumprobe zugesetzt und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
- In Tabelle 4 sind die Absorption (ΔA) pro Minute mit steigenden Werten bei Messung unter Verwendung von 5 Arten von Human-Serum bei einer Wellenlänge von 405 nm dargestellt. Tabelle 4 Human-Serum Nr. Reagenslösung
- Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wird die Meßempfindlichkeit durch Zusatz von Glucoamylase kaum beeinflußt.
- Es wurde durch Auflösen von 30 mg des in Beispiel 2 erhaltenen BrG5P in 30 ml von 50 mM/l MES-NaOH-Pufferlösung (pH 6,9) mit einem Gehalt von 400 Einheiten Glucoamylase, 300 Einheiten α-Glucosidase und 20 mM/l Calciumchlorid eine Meßreagenslösung hergestellt.
- Es wurden zu 2 ml der Meßlösung 100 ul einer Serumprobe zugesetzt und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
- Andererseits wurde unter Verwendung einer Standardprobe, die bekannte Aktivitäten von α-Amylase enthielt, die Eichkurve in der gleichen Weise erzeugt, wie voranstehend beschrieben. Aus dieser Eichkurve wurde die α-Amylaseaktivität erhalten. Fig. 5 zeigt eine Beziehung zwischen der Aktivität von α-Amylase bei einzelnen Verdünnungsstufen einer Standardprobe (Somogyi-Einheit/dl) und den Zuwachs der Absorption (ΔA) pro Minute bei einer Wellenlänge von 405 nm.
- Aus Fig. 5 wird offensichtlich, daß die durch Auftragen der steigenden Werte der Absorption (ΔA/min) entsprechend der α-Amylaseaktivität (Somogyi-Einheit/dl) erhaltene Eichkurve linear verläuft und durch den Nullpunkt geht. Dieses bedeutet, daß die Eichkurve ein gutes quantitatives Verhalten zeigt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von alpha-
Amylase in einer Probe, welches umfaßt:
Verwenden eines modifizierten Oligosaccharids als ein
Substrat für alpha-Amylase, welches Oligosaccharid die
Formel hat:
worin sind: R¹ ein Halogenatom und R² eine Gruppe der Formel:
worin R³ bis R&sup6; voneinander unabhängig Wasserstoff, eine
niedere Alkylgruppe, eine niedere Alkoxygruppe, eine
Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe
oder ein Balogenatom sind und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6;
zur Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können;
R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe, ein Halogenatom
oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe
oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder
ein Halogenatom ist,
Inkontaktbringen der Probe mit dem Substrat in
Gegenwart mindestens eines Exoenzyms und
Messen einer optisch meßbaren Änderung als Maß der
alpha-Amylaseaktivität in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte
Oligosaccharid dargestellt wird durch die Formel:
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte Oligosaccharid dargestellt wird durch die Formel:
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte
Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) hergestellt wird
durch Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit
Cyclomaltodextrin-gluconotransferase in Gegenwart eines
Akzeptors, der ausgewählt wird aus Glucose, Maltose und
Maltotriose, worin die Glucose, Maltose und Maltotriose jede
einen Substituenten aufweisen, der an dem Zucker-Bruchstück
über eine glykosidische Bindung verknüpft ist, das bei der
Aufspaltung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und sodann
Umsetzen mit Glucoamylase oder alpha-Glucosidase.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte
Oligosaccharid der Formel (I) hergestellt wird durch
Umsetzen eines Oligosaccharids, das einen Substituenten
aufweist, der eine optisch meßbare Änderung bei Aufspaltung
an dem reduzierenden Ende des Glucoserests zeigt, mit
entweder Benzaldehyd oder Benzaldehyddimethylacetal, um das
4,6-O-cyclische Acetal an dem nichtreduzierenden Ende des
Glucoserests zu binden, und Reduzieren des 4,6-O-cyclischen
Acetals.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16305486 | 1986-07-11 | ||
JP62002730A JPH0630602B2 (ja) | 1986-07-11 | 1987-01-09 | 非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の新規な製造法 |
JP1577687 | 1987-01-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3788088D1 DE3788088D1 (de) | 1993-12-16 |
DE3788088T2 true DE3788088T2 (de) | 1994-05-19 |
Family
ID=27275493
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3788088T Expired - Fee Related DE3788088T2 (de) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung. |
DE3752216T Expired - Fee Related DE3752216T2 (de) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Oligosaccharids |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3752216T Expired - Fee Related DE3752216T2 (de) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Oligosaccharids |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0530850B1 (de) |
AT (1) | ATE170925T1 (de) |
DE (2) | DE3788088T2 (de) |
ES (1) | ES2060584T3 (de) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2592260B2 (ja) * | 1987-07-30 | 1997-03-19 | オリエンタル酵母工業株式会社 | α−アミラーゼアイソザイムの分別定量法 |
US4932871A (en) * | 1987-11-20 | 1990-06-12 | Miles Inc. | Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields |
DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
FI905402A (fi) * | 1990-11-01 | 1992-05-02 | Alko Ab Oy | Oligosackaridblandning och foerfarande foer dess efterbehandling. |
JP2770891B2 (ja) * | 1991-06-26 | 1998-07-02 | キッコーマン株式会社 | マルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 |
CA2089228A1 (en) * | 1992-02-14 | 1993-08-15 | Akira Hasegawa | Oligosaccharide derivatives suitable for .alpha.-amylase determination |
CN101831011B (zh) * | 2010-05-25 | 2012-07-18 | 李晓辉 | 一种作为药物传输载体的pH响应性环糊精衍生物及其合成方法 |
CN110747245B (zh) * | 2019-11-29 | 2021-07-27 | 江南大学 | 一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4649109A (en) * | 1984-02-16 | 1987-03-10 | Brandeis University | Methods for isolating mutant microorganisms from parental populations |
US4649108A (en) * | 1984-07-26 | 1987-03-10 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
JPS6183195A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-04-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 |
-
1987
- 1987-07-10 ES ES87110023T patent/ES2060584T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 DE DE3788088T patent/DE3788088T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-10 EP EP92116958A patent/EP0530850B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 AT AT92116958T patent/ATE170925T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 EP EP87110023A patent/EP0252525B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 DE DE3752216T patent/DE3752216T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3752216D1 (de) | 1998-10-15 |
DE3788088D1 (de) | 1993-12-16 |
ATE170925T1 (de) | 1998-09-15 |
EP0252525A3 (en) | 1990-08-29 |
EP0530850A2 (de) | 1993-03-10 |
DE3752216T2 (de) | 1999-04-22 |
ES2060584T3 (es) | 1994-12-01 |
EP0530850A3 (en) | 1996-01-10 |
EP0530850B1 (de) | 1998-09-09 |
EP0252525A2 (de) | 1988-01-13 |
EP0252525B1 (de) | 1993-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3752015T2 (de) | Durch Aromaten substituiertes Glykosid | |
DE3526829A1 (de) | Verfahren und reagenzeinheit zum bestimmen von alpha-amylase | |
DE3788088T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung. | |
EP0031941A1 (de) | Indoxylmaltodextrine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
US4762917A (en) | Oligosaccharide derivatives and their use as substrate for measuring .alpha. | |
DE2705859A1 (de) | Verfahren und reagenzsysteme zur analyse, insbesondere zur kinetischen analyse, von alpha- und beta-amylase, anorganischem phosphat sowie saurer phosphatase | |
DE3889718T2 (de) | Maltooligosaccharid-Derivate und -Reagenzien für die Bestimmung von Amylase-Aktivität. | |
US5319078A (en) | α-amylase assay using modified oligosaccharide and process for producing said modified oligosaccharide | |
EP0416514B1 (de) | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase | |
DE4338375C2 (de) | Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität | |
US5043436A (en) | Substrate for measurement of alpha-amylase activity | |
DE69315721T2 (de) | Oligosaccharidderivate für die Alpha-Amylasebestimmung | |
DE69219855T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivität | |
DE2752501A1 (de) | Mit indikatorgruppen substituierte alpha-d-maltodextrine, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur bestimmung von glukosidasen und amylasen | |
DE69023710T2 (de) | Verfahren zur bestimmung von enzymatischer wirksamkeit. | |
JP2770891B2 (ja) | マルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 | |
JPS5913198B2 (ja) | アミラ−ゼ活性測定方法 | |
JPS6087297A (ja) | α,β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環状アセタ−ル誘導体,その製造方法並びに該基質を用いるアミラ−ゼ活性の測定方法 | |
DE2755803A1 (de) | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha-amylase | |
DE2760138C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Maltoheptaosederivaten | |
JP2770892B2 (ja) | アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 | |
JP3901990B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 | |
DE2741192A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von alpha- amylase | |
JPH0630602B2 (ja) | 非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の新規な製造法 | |
JPS60997B2 (ja) | アミラ−ゼ活性測定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |