DE3788088T2 - Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung. - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von alpha-Amylase unter Anwendung von modifizierten Oligosacchariden und Verfahren zu deren Herstellung.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase in einer Probe unter Verwendung eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Bis her wurden zahlreiche Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase unter Verwendung eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat vorgeschlagen. Beispielsweise offenbart die US-P-4 649 108 von Blair ein Verfahren zur Messung der Menge von α-Amylase in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte der Schaffung eines Oligosaccharid-Substrats für α-Amylase, wobei das Substrat mindestens drei Glucoseeinheiten enthält, das reduzierende Ende des Glucoserests (Einheit) über eine durch α- oder β- Glucosidase an einem Marker gebunden ist, der beim Spalten dieser Bindung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und das nichtreduzierende Ende (Terminal) des Glucoserests über eine blockierende Gruppe gebunden ist, welche die Aufspaltung der Bindung zwischen dem nichtreduzierenden Ende des Glucoserests und dem angrenzenden Glucoserest inhibiert; inkontaktbringen der Probe mit dem Oligosaccharid-Substrat mit einem ersten zugesetzten Exoenzym, welches die Bindung zwischen dem reduzierenden Ende des Glucoserests und dem Marker spalten kann, und einem zweiten zugesetzten Exoenzym, welches die Bindungen zwischen Glucoseeinheiten spalten kann, um eine Mischung zu bilden, die das Substrat, das erste Exoenzym und das zweite Exoenzym aufweist; und Messen der besagten optisch meßbaren Änderung. Nach dieser US- Patentschrift können die blockierenden Gruppen Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Sulfonsäureester, Ether (wie beispielsweise Benzyl-, Silyl- und Triphenylmethyl-), Monosaccharide außer alpha-1,4-verknüpfte Glucose und acetal- oder ketalblockierende Gruppen sein, wie beispielsweise Benzyliden (Spalte 4, Zeilen 37-67). Allerdings sind die esterblockierenden Gruppen unstabil, da sie in einer wäßrigen Lösung leicht hydrolysiert werden. Außerdem wird die Löslichkeit in Wasser in unerwünschter Weise herabgesetzt, wenn die Größe der blockierenden Gruppen größer wird, wie das bei Toluolsulfonyl, Methansulfonyl, Silyl oder Triphenylmethyl der Fall ist. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Probleme bei der Einführung einer blockierenden Gruppe in einen Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende, wobei die vorgenannten Ester- und Ether-Gruppen nach dem entsprechend Spalte 5, Zeile 63 bis Spalte 7, Zeile 58 der genannten US-Patentschrift offenbarten Verfahren nicht in den Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende eingeführt werden können. Daher verfügt das Substrat nach der genannten US-Patentschrift vorzugsweise über 8 oder weniger Glucoseeinheiten und besonders bevorzugt 6 oder 7, wobei die bevorzugten blockierenden Substituenten Acetale oder Ketale sind, z. B. Benzyliden (Spalte 2, Zeilen 4-7).
  • Wenn als Substrat zum Messen der α-Amylase das am meisten bevorzugte Oligosaccharid entsprechend der genannten US-Patentschrift, d. h. ein Oligosaccharid mit 6 oder 7 Glucoseeinheiten und Benzyliden als die blockierende Gruppe, verwendet wird, gibt es insofern zahlreiche Probleme, daß die Hydrolysegeschwindigkeit durch α-Amylase gering ist, daß aufgrund der vielen zu hydrolysierenden Positionen zahlreiche Arten von hydrolysierten Produkten erzeugt werden, daß die Reaktion zum Freisetzen der farberzeugenden Gruppe aufgrund der vielen hydrolysierten Produkte kompliziert wird, und die Menge der zu verwendenden koppelnden Enzyme größer wird und somit die Zuverlässigkeit für die Messung unzureichend wird. Die Behebung dieser Nachteile wird seit langem angestrebt.
  • Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Bestimmen der Aktivität von α-Amylase in einer Probe, welches umfaßt:
  • Verwenden eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat für α-Amylase, welches Oligosaccharid die Formel hat:
  • worin sind: R¹ ein Halogenatom und R² eine Gruppe der Formel:
  • worin R³ bis R&sup6; voneinander unabhängig Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe, eine niedere Alkoxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Halogenatom sind und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6; zur Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können; R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder ein Halogenatom ist,
  • Inkontaktbringen der Probe mit dem Substrat in Gegenwart mindestens eines Exoenzyms und Messen einer optisch meßbaren Änderung als Maß der α- Amylaseaktivität in der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines durch die Formeln (I) oder (II) dargestellten Oligosaccharids, welches umfaßt: Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit Cyclomaltodextringlucontransferase in Gegenwart eines Akzeptors, der ausgewählt wird aus Glucose, Maltose und Maltotriose, worin dio- Glucose, Maltose und Maltotriose jede einen Substituenten aufweisen, der an dem Zucker-Bruchstück über eine glykosidische Bindung verknüpft ist, das bei der Aufspaltung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und sodann Umsetzen mit Glucoamylase oder α-Glucosidase.
  • Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines durch die Formel (I) dargestellten Oligosaccharids, welches umfaßt: Umsetzen eines einen Substituenten aufweisenden Oligosaccharids, welcher Substituent eine optisch meßbare Änderung bei Spaltung an dem reduzierenden Ende des Glucoserests zeigt, und zwar entweder mit Benzaldehyd oder Benzaldehyddimethylacetal, um das 4,6- O-cyclische Acetal an dem nichtreduzierenden Ende des Glucoserests zu bilden; und Reduzieren des 4,6-O-cyclischen Acetals.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Es zeigen:
  • Fig. 1 ein iR-Diagramm des nach Beispiel 1 erhaltenen Oligosaccharids,
  • Fig. 2 und 3 'H-NMR-Diagramme der nach den Beispielen 1 bzw. 2 erhaltenen Oligosaccharide,
  • Fig. 4 und 5 in den Beispielen 4 bzw. 6 erhaltene Eichkurven.
  • Das als ein Substrat für α-Amylase verwendete modifizierte Oligosaccharid wird durch die Formel dargestellt:
  • darin sind R¹ ein Halogenatom, wie beispielsweise Brom, Chlor, Iod, usw.; und R² eine Gruppe der Formel:
  • worin R³ bis R&sup6; unabhängig Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine niedere Alkoxygruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Halogenatom sind, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw., und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6; unter Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können; R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw., oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder ein Halogenatom ist, wie beispielsweise Chlor, Brom, Iod, usw.
  • Die Oligosaccharide der Formel (I) und (II) haben die Vorteile, daß die Hydrolysegeschwindigkeit hoch ist, d. h. die Empfindlichkeit als ein Substrat ist hoch, die Michaelis-Konstante (Km) klein ist, welche Konstante definiert ist als eine Substratkonzentration und die halbe Maximalgeschwindigkeit (Vmax) von α-Amylase angibt, d. h. die Selektivität als ein Substrat ist hoch und die erforderliche Substratkonzentration zum Messen der Aktivitäten von α- Amylase niedrig (normalerweise verwendet in einer Konzentration mit dem Wert Km · 5 . . . 10), wobei die Hydrolyse zumeist an einer Stelle erfolgt, d. h. die Farbbildungsreaktion von den hydrolysierten Produkten kann einfach und mühelos ausgeführt werden.
  • Die vorgenannten Vorteile können unter Verwendung der folgenden Oligosaccharide gezeigt werden:
  • n = 2: BG4P
  • n = 3: BG5P (die vorliegende Erfindung)
  • n = 4: BG6P
  • n = 5: BG7P
  • n = 2: G4P
  • n = 3: G5P (Standard)
  • n' = 4: G6P
  • n = 5: G7P
  • n = 2: BDG4P
  • n = 3: BDG5P
  • n = 4: BDG6P
  • n = 5: BDG7P
  • Die Hydrolysegeschwindigkeit wird unter Verwendung von Human-Pancreatin-α-Amylase (HPA) oder Human-Speichel-α- Amylase (HSA) für das jeweilige Substrat (1,0 mM) bei pH 7 gemessen und mit Hilfe der relativen Werte ausgewertet, indem der Wert von G5P gleich 1 gesetzt wird.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Substrat α-Amylase
  • Die Km-Werte wurden entsprechend einer graphischen Darstellung nach Lineweaver und Burk mit Hilfe der Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Die Mengen der Produkte wurden mit Hilfe der HPLC gemessen.
  • Es wurde eine Mischung von 20 ul einer α-Amylaselösung und 200 ul einer 1,2 mM Substratlösung in 50 mM BES [N,N- bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure]/NaOH-Puffer (pH 7,6), die 20 mM Natriumchlorid und 2 mM Calciumchlorid enthielt, bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Sodann wurden 25 ul der Reaktionsmischung zu 500 ul 5%iger Essigsäure zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Die Probe (100 ul) wurde mit Hilfe der HPLC analysiert, um die Mengen der Produkte zu untersuchen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Substrat Km-Wert
  • Die Bindungsart des jeweiligen Substrats wurde mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) entsprechend der vorstehenden Beschreibung gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 α-Amylase Hydrolyseprodukt Substrat nicht hydrolysiert
  • Aus den Ergebnissen der Tabellen 1-3 wird offensichtlich, daß lediglich BG5P den drei Bedingungen genügt, d. h. hohe Hydrolysegeschwindigkeit, niedriger Km- Wert und Hydrolyse überwiegend an einer Stelle, bei der hauptsächlich G2P erzeugt wird. Da G3P oder G4P nicht durch die Hydrolyse erzeugt werden, ist es möglich, die α- Amylaseaktivität unter bloßer Verwendung von α-Glucosidase als Exoenzym zu messen, durch die G2P ausreichend, G3P oder G4P jedoch nichtausreichend hydrolysiert werden.
  • Die Aktivität von α-Amylase kann gemessen werden, indem das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) wie folgt verwendet wird:
  • Exoenzym(e):
  • (i) α-Glucosidase
  • (ii) α-Glucosidase Glucoamylase
  • (iii) α-Glucosidase β-Glucosidase
  • (iv) α-Glucosidase β-Glucosidase Glucoamylase
  • (v) isomaltase α-Glucosidase
  • (vi) Isomaltase Glucoamylase
  • Der Substituent R&sup0; ist an der C&sub6;-Stelle des nichtreduzierenden Endes des Glucoserests und der Substituent OR² an der C&sub1;-Stelle des reduzierenden Endes des Glucoserests angebracht und wird beispielsweise dargestellt durch eine Phenoxygruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann, eine Naphthoxygruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann, eine Umbelliferylgruppe mit festgelegten Substituentengruppen oder eine indoxylgruppe, die eine oder mehrere festgelegte Substituentengruppen aufweisen kann.
  • Das bedeutet, daß die α-Amylase einer Probe zuerst auf das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) wirkt, um
  • zu erzeugen, worin die primäre Alkoholgruppe G¹G-G (-CH&sub2;OH) an der C&sub6;-Stelle des Glucoserests mit nichtreduziertem Ende aus gewechselt wird durch den Substituenten R&sup0; und G-G-OR², worin OR² wie voranstehend festgelegt ist. Sodann wird G-G-OR² mit koppelndem/n Enzym/en, wie beispielsweise Glucöamylase, α-Glucosidase, S-Glucosidase u. dgl. umgesetzt wird, um 2G und R²-OH zu erzeugen, welches eine optisch meßbare' Änderung zeigt. Wenn R²-OH ein Nitrophenol ist, wie beispielsweise p-Nitrophenol, kann die Aktivität von α-Amylase in einer Probe durch direkte Messung ihres Absorptionsspektrums (z. B. Absorption bei 405 nm) erhalten werden. Wenn R²-OH Phenol oder Naphthol ist, ohne eine Nitrogruppe zu haben (oder mit der Fähigkeit eine Nitrogruppe haben zu können), wie beispielsweise Phenol, o- Chlorphenol, 2,6-Dichlorphenol oder p-Methoxyphenol, wird es mit einem Koppler umgesetzt, wie beispielsweise 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH), und zwar in Gegenwart einer Oxidase, wie beispielsweise Catecholoxidase, Laccase, Tyrosinase oder Monophenoloxidase, oder ein Oxidationsmittel, wie beispielsweise Iodsäure oder Periodsäure, oder Peroxidase und Wasserstoffperoxid, um einen Farbstoff zu erzeugen, dessen Absorptionsspektrum gemessen wird. Wenn R²-OH eine Fluoreszenzstrahlung emittierende Verbindung ist, wie beispielsweise Umbelliferon oder 4-Methylumbelliferon, wird die Intensität der Fluoreszenzstrahlung gemessen. Wenn ferner R²-OH Indoxyl ist, wird das Absorptionsspektrum von durch Oxidation erzeugten Indigofarbstoffen gemessen.
  • Die Konzentration des als ein Substrat bei der Bestimmung der Aktivität von α-Amylase verwendeten modifizierten Oligosaccharids ist nicht ausdrücklich begrenzt, beträgt in der Regel jedoch 0,1 bis 10 mM.
  • Als eine zu messende Probe kann jede verwendet werden, die α-Amylase enthält. Beispielsweise können als biologische Flüssigkeiten Blut, Serum, Urin und Speichel verwendet werden.
  • Als das Exoenzym, bei dem es sich um ein koppelndes Enzym handelt, kann α-Glucosidase verwendet werden, eine Mischung von α-Glucosidase und Glucoamylase, eine Mischung von α-Glucosidase und β-Glucosidase, eine Mischung von α- Glucosidase, β-Glucosidase und Glucoamylase, eine Mischung von α-Glucosidase und Isomaltase sowie eine Mischung von Isomaltase und Glucoamylase. Diese Exoenzyme können von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen. Die Menge der verwendeten Exoenzyme beträgt in der Regel 0,5 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 2 bis 50 Einheiten/ml.
  • Die Reaktionstemperatur ist im wesentlichen nicht beschränkt und beträgt vorzugsweise 25ºC bis 40ºC. Die Reaktionsdauer kann je nach den Aufgaben in geeigneter Weise gewählt werden.
  • Der pH-Wert der Reaktion ist im wesentlichen nicht beschränkt und beträgt vorzugsweise 6 bis 8. Als eine Pufferlösung zur Aufrechterhaltung des korrekten pH-Werts können ein Phosphatpuffer, ein Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCL-Puffer und ein Good-Puffer verwendet werden.
  • Als ein Aktivierungsmittel für α-Amylase können Natriumchlorid, Calciumchlorid, Kaliumchlorid und Calciumacetat verwendet werden.
  • Als der Koppler zum Koppeln (Oxidation-Kondensation) des Phenols oder Naphthols, die durch die Wirkung des(der) Exoenzyms(Exoenzyme) freigesetzt werden, kann 4-Aminoantipyrin, 3-Methyl-2-Benzothiazolinonhydrazon (MBTH) und p- Amino-N,N-diethylanilin verwendet werden.
  • Als die Oxidase zum Koppeln (Oxidation-Kondensation) des Phenols oder Napthols mit dem Koppler kann Laccase, Catecholoxidase, Tyrosinase und Monophenoloxidase verwendet werden, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen, und zwar in einer Menge von normalerweise 0,2 bis 10 Einheiten/ml, vorzugsweise 0,5 bis 4 Einheiten/ml.
  • Als das Oxidationsmittel zum Koppeln (Oxidation- Kondensation) kann Iodsäure und/oder eines ihrer Salze verwendet werden, wie beispielsweise das Natrium- und Kaliumsalz, Periodsäure und/oder deren Salze, wie beispielsweise das Natrium- und Kaliumsalz, sowie Wasserstoffperoxid.
  • Da der primäre Alkohol (-CH&sub2;OH) an der C&sub6;-Stelle des Glucoserests mit nichtreduzierendem Ende des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) durch -CH2OCH2- oder -CH&sub2;X (X: Halogen) ausgewechselt wird, kann das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) nicht als ein Substrat für Glucoamylase, α-Glucosidase, β-Glucosidase oder Isomaltase, in der Form wie es ist, verwendet werden. Da das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) in Wasser jedoch leicht löslich ist und zur α-Amylase eine hervorragende Affinität aufweist, kann es für α-Amylase ein gutes spezifisches Substrat sein. Dadurch bewirkt das Verfahren der α-Amylasebestimmung unter Verwendung des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) als ein Substrat keine Nebenreaktionen und hat einen sehr kleinen Blindwert. Ferner ist die Reagenslösung für die Messung sehr stabil. Darüber hinaus wird, da Humanα-Amylase überwiegend nur eine der glycosidischen Bindungen des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) hydrolysiert, die Stöchiometrie hergestellt, was zur Folge hat, daß die kinetische Bestimmung der α-Amylase möglich wird.
  • Darüber hinaus kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase die Dauer der Lag-Phase, da das Hauptprodukt durch das Reagieren mit α- Amylase G2P ist, durch Umsetzen mit mindestens einem koppelnden Enzym (Exoenzym), wie beispielsweise Glucoamylase, α-Glucosidase, Isomaltase oder β-Glucosidase, in der Reaktion nach der α-Amylasereaktion verkürzt werden. Somit kann die Bestimmung der α-Amylaseaktivität mit hoher Empfindlichkeit und guter Linearität durchgeführt werden.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase kann die Messung einer optisch meßbaren Änderung durch Messen der Absorptionsspektren von freigesetzten Nitrophenolen oder Indigofarbstoffen durchgeführt werden, indem die Absorptionsspektren von durch oxidative Kopplung von Phenolen gebildeten Farbstoffen oder mit 4-Aminoantipyrin oder MBTH freigesetzten Naphtholen gemessen werden oder durch Messen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung von freigesetztem Umbelliferon, so daß das Meßverfahren durch Zuckerstoffe, wie beispielsweise Glucose und Maltose, und reduzierende Substanzen, wie beispielsweise Ascorbinsäure, und in den zu messenden Proben vorhandenes Bilirubin kaum beeinflußt werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase kann entweder bei einer Geschwindigkeitsbestimmung angewendet werden, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit unter bestimmten Bedingungen gemessen wird, oder bei einer Endpunktbestimmung, bei der ein Reaktionsterminator verwendet wird.
  • Ferner eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase gut für ein automatisches Analysengerät und kann im Bedarfsfall in einer manuellen Betriebsart angewendet werden.
  • Da durch die Verwendung des modifizierten Oligosaccharids der Formel (I) oder (II) eine sogenannte kolorimetrische Methode angewendet werden kann (bei der die Farbe eines Entwicklungsfarbstoffes gemessen wird), kann das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich auch bei einer Teststreifenmethode angewendet werden, bei der es sich um eine sehr einfache Methode und ein sogenanntes Trockenbestimmungsverfahren handelt, bei welchem mehrschichtige Analysenbögen verwendet werden, die Reaktionsreagentien enthalten (mehrschichtige, einteilige Streifen für quantitative Analyse).
  • Die modifizierten Oligosaccharide der Formeln (I) und (II) können durch Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit Cyclomaltodextrin-Glucontransferase in Gegenwart eines speziellen Akzeptors und nachfolgendem Umsetzen mit Glucoamylase oder α-Glucosidase hergestellt werden.
  • Als das modifizierte Cyclodextrin werden solche verwendet, die einen modifizierten Glucoserest pro Molekül aufweisen.
  • Als der modifizierte Glucoserest kann substituierte Glucose verwendet werden, bei der die primäre Hydroxylgruppe in der Glucose durch einen Substituenten ersetzt ist, der eine Benzyloxygruppe oder ein Halogenatom aufweist, wie beispielsweise Chlor und Brom.
  • Als der Akzeptor kann Glucose, Maltose oder Maltotriose verwendet werden, die als einen Substituenten z. B. p- Nitrophenyl, Phenyl, Umbelliferyl, Naphthyl aufweist. Wenn die Glucosekette länger wird, wird ebenfalls die Glucosekette des Hauptprodukts in der Anfangsreaktion länger. Daher wird geeigneterweise die Glucosekettenlänge von 1 bis 3 gewählt und als der Akzeptor verwendet.
  • Als der Substituent der Hydroxylgruppe an der C&sub1;-Stelle des modifizierten Glucoserests des Akzeptors kann die Gruppe verwendet werden, die durch die Formel dargestellt wird: -OR², worin R² wie vorstehend definiert ist.
  • Konkrete Beispiele für die -OR²-Gruppen sind eine p-Nitrophenoxygruppe, eine m-Nitrophenoxygruppe, eine o-Chlorphenoxygruppe, eine p-Chlorphenoxygruppe, eine 2,6-Dichlorphenoxygruppe, eine o-Methoxyphenoxygruppe, eine p-Methoxyphenoxygruppe, eine o-Methylphenoxygruppe, eine o-Carboxyphenoxygruppe, eine o-Sulfophenoxygruppe, eine 1-Naphthoxygruppe, eine 2-Sulfo-1-Naphthoxygruppe, eine 2-Carboxy-1- Naphthoxygruppe, eine Umbelliferylgruppe, eine 4-Methylumbelliferylgruppe und eine Indoxylgruppe.
  • Die Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase (nachfolgend bezeichnet als "CGTase") ist nicht auf ihre Herkunft und Quelle beschränkt. Es können solche verwendet werden, die vom Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Klebsiella pneumoniae und Alcaligenes abstammen.
  • Das modifizierte Cyclodextrin kann leicht durch Verwendung von α-, β- oder γ-Cyclodextrin als Ausgangsmaterial und Umsetzen mit verschiedenen Reaktionsteilnehmern zum Einführen der gewünschten modifizierenden Gruppen entsprechend den Verfahren zur Herstellung verschiedener modifizierter Glucosen erhalten werden, die beispielsweise beschrieben werden in: "Method in Carbohydrate Chemistry", I (1962) bis V (1965), veröffentlicht bei Academic Press. Die Auswahl von α-, β- oder γ-Cyclodextrin kann in Abhängigkeit von der Glucosekettenlänge des gewünschten modifizierten Oligosaccharidderivats und seiner maximalen Ausbeute bestimmt werden.
  • Der pH-Wert der Reaktion des modifizierten Cyclodextrins mit CGTase in Gegenwart eines Akzeptors verändert sich leicht je nach der Herkunft der CGTase, liegt normalerweise aber bei 6 bis 8. Zur Aufrechterhaltung des geeigneten pH-Werts kann jedes Pufferungsmittel verwendet werden, das die enzymatische Reaktion nicht verzögert. Beispiele des Pufferungsmittels sind Good-Puffer, Amoniumacetat-Puffer, Carbonat-Puffer und Phosphat-Puffer.
  • Das modifizierte Cyclodextrin wird in einer Konzentration von vorzugsweise 1 bis 50 mM/l und der Akzeptor in einer Konzentration von 1 mM/l oder darüber bis zur Löslichkeitsgrenze verwendet.
  • Der Akzeptor wird vorzugsweise in einer Menge von 5 Molen oder darüber pro Mol des modifizierten Cyclodextrins verwendet.
  • Die CGTase wird vorzugsweise in einer Menge von 50 bis 5.000 U/ml verwendet. Die Reaktion wird vorzugsweise bei 20ºC bis 50ºC ausgeführt. Nach der enzymatischen Reaktion wird die CGTase durch Erhitzen, z. B. bei 90ºC oder darüber, für 10 Minuten oder mehr oder durch Änderung des pH-Werts, z. B. pH 4,0 oder weniger, desaktiviert.
  • Die Reaktion unter Verwendung von Glucoamylase oder α- Glucosidase kann vorzugsweise bei dem am besten geeigneten pH-Wert ausgeführt werden, z. B. pH 4 bis 6, und unter Verwendung von Glucoamylase oder α-Glucosidase in einer Menge von vorzugsweise 5 bis 100 U/ml.
  • Wahlweise kann das modifizierte Oligosaccharid der Formel (i) durch Umsetzen eines Oligosaccharids mit einem Substituenten hergestellt werden, der eine optisch meßbare Änderung bei Abspaltung an dem Glucoserest mit reduzierendem Ende entweder mit Benzaldehyd oder Benzaldehyd-Dimethylacetal zeigt, um das 4,6-0-cyclische Acetal an dem Glucoserest mit nichtreduzierendem Ende zu bilden und das 4,6-0- cyclische Acetal zu reduzieren.
  • Das Oligosaccharidderivat wird zunächst mit dem vorbestimmten Aldehyd oder Acetal zur Bildung eines cyclischen Acetals zwischen den Stellen C&sub4; und C&sub6; des Glucoserests mit nichtreduzierendem Ende umgesetzt. Das Oligosaccharidderivat ist kommerziell verfügbar oder kann nach einem Verfahren synthetisch hergestellt werden, das beispielsweise in der JP-A-54-51892 ("A-Schrift") beschrieben wird.
  • Das vorbestimmte Aldehyd oder Acetal oder Ketal wird in einer Menge von vorzugsweise 1 bis 100 Molen pro Mol des Oligosaccharidderivats verwendet.
  • Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart einer Lewis-Säure als Katalysator durchgeführt, wie beispielsweise p-Toluolsulfonsäure oder Zinkchlorid, und zwar in einem geeigneten Lösemittel, wie beispielsweise N,N-Dimethylformamid (DMF), bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis einer Rückflußtemperatur und einer Zeit von 0,5 bis 12 Stunden.
  • Das resultierende Zwischenprodukt mit dem cyclischen Acetal wird normalerweise einer Modifikation von anderen Hydroxylgruppen durch Acylierung, gefolgt von einem Reduktionsschritt, unterzogen.
  • Die Acylierung kann nach einem konventionellen Verfahren ausgeführt werden, beispielsweise in Gegenwart einer Base wie Pyridin und unter Verwendung eines Acylierungsmittels, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid, Benzoylchlorid, usw.
  • Der Acylierungsschritt ist nicht entscheidend, wird jedoch zur Erhöhung der Löslichkeit in einem in dem nächsten Schritt (Reduktionsschritt) verwendeten Reaktionslösemittel bevorzugt.
  • Der Reduktionsschritt wird normalerweise unter Verwendung eines Reduktionsmittels in Gegenwart eines Säurekatalysators durchgeführt, wie beispielsweise Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Zinkchlorid, p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Chlorwasserstoffgas (oder Einleiten in Ether) usw., und zwar in einem geeigneten Lösemittel (z. B. Tetrahydrofuran (THF), usw.) in der Regel bei 0ºC bis 50ºC für einige 10 Minuten bis mehrere Stunden.
  • Als das Reduktionsmittel können Natriumcyanborhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Pyridinboran, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran, t-Butylaminboran oder Diboran verwendet werden. Das Reduktionsmittel wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 1.000 Molen pro Mol des Oligosaccharidderivats verwendet.
  • Der Säurekatalysator wird vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 5 Molen pro Mol Reduktionsmittel verwendet.
  • Sofern ein Acylschutz vorgenommen wird, erfolgt die Deacylierung nach einem konventionellen Verfahren, beispielsweise durch Behandeln mit 0,01 bis 1,0 n Natriummethoxid-Methanollösung für eine Dauer von mehreren 10 Stunden bei Raumtemperatur bis zu leicht erhöhten Temperaturen, um mühelos das modifizierte Oligosaccharid zu ergeben.
  • Einzelne Nachbehandlungen nach einzelnen Schritten können nach den konventionellen Verfahren ausgeführt werden. Das Endprodukt kann nach einem konventionellen Verfahren gereinigt werden, wie beispielsweise der Säulenchromatographie.
  • Da die α-1,4-Bindung des Oligosaccharids der sauren Hydrolyse unter sauren Bedingungen oder der Methanolyse unter wasserfreien Methanol-HCl-Bedingungen ausgesetzt war und die Stabilität der glycosidischen Bindung (die Bindung zwischen dem Glucoserest mit reduzierendem Ende und der -OR²-Gruppe) unter sauren Bedingungen unbekannt war, war unbekannt, ob das von dem Oligosaccharid der Formel stammende modifizierte Oligosaccharid einer solchen Reduktionsbehandlung standhalten konnte. Die Erfinder haben jedoch zum ersten Mal überraschend festgestellt, daß Ringöffnung des cyclischen Acetalteils möglich war und die vorliegende Erfindung ausgeführt wird.
  • Die Gruppe der Formel -OR² ist an dem Glucoserest mit reduzierendem Ende gebunden und kann, wie bereits erwähnt, durch die Wirkung von Glucoamylase-[E.C.3.2.1.3.], α- Glucosidase [E.C.3.2.1.20.], β-Glucosidase [E.C.3.2.1.21.], isomaltase-[E.C.3.2.1.10.] oder β-Amylase [E.C.3.2.1.2.], hydrolysiert werden, um Nitrophenole zu bilden, die im sichtbaren Bereich selbst Absorptionen aufweisen, um schließlich Farbstoffe durch Koppeln mit Kopplern infolge der Wirkung von Oxidasen zu bilden, wie beispielsweise Catechol-Oxidase, Laccase, Tyrosinase und Monophenol- Oxidase, oder um schließlich Farbstoffe durch Koppeln mit Kopplern unter Wirkung von Oxidationsmitteln zu bilden.
  • Weitere Beispiele für die Gruppe der Formel -OR² sind eine 2-Chlor-4-nitrophenoxygruppe, eine 4-Trifluormethylumbelliferylgruppe, eine 5-Bromindoxylgruppe und eine 4-Chlor- 3-bromindoxylgruppe.
  • Das modifizierte Oligosaccharid der vorliegenden Erfindung kann wirksam als ein Substrat für eine fraktionelle Meßmethode von α-Amylase verwendet werden, die von den Speicheldrüsen stammt, und für α-Amylase die vom Pankreas stammt, d. h. eine fraktionelle Meßmethode von α-Amylaseisoenzymen, bei der zersetzte Produkte, die durch Hydrolyse von α-Amylase erzeugt wurden, umgesetzt werden mit zwei oder mehreren koppelnden Enzymen, die unterschiedliche Substratselektivitäten aufweisen, wobei die erzeugten Produkte gemessen werden, um fraktionelle Messungen von α-Amylase auszuführen, die von Human-Pankreas stammt, und α-Amylase, die von Human-Speicheldrüsen stammt.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
    • Herstellungsbeispiel 1
  • Synthese von Mono-6-0-p-toluolsulfonyl-β-cyclodextrin in 100 ml Pyridin wurden 5,0 g β-Cyclodextrin aufgelöst und 0,8 g p-Toluolsulfonylchlorid zugesetzt und danach bei 4ºC für 15 Stunden gerührt. Nach dem Konzentrieren unter reduziertem Druck wurde die Reaktionslösung in eine mit Aktivkohle gefüllte Säule (5 cm · 60 cm) gegeben und mit Wasser, 30% Ethanol, 25% n-propanol, in Mengen von jeweils 3 Litern eluiert. Die Fraktionen des 25%igen n-Propanols wurden aufgenommen und unter reduziertem Druck konzentriert, um 0,7 g 6-O-p-Toluolsulfonyl-β-cyclodextrin zu ergeben.
    • Beispiel 1
  • Synthese von p-Nitrophenyl-O-(6-O-benzyl)-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D- glucopyranosid (nachfolgend bezeichnet als "BG5P")
    • (1) Synthese von Mono-o-benzyl-β-cyclodextrin (nachfolgend bezeichnet als "Benzyl-beta-CD")
  • In 120 ml Wasser wurden 15 g β-Cyclodextrin und 13,5 g Natriumhydroxid aufgelöst und dazu 15 ml Benzylchlorid zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 10ºC für 2 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach der Reaktion wurde der pH-Wert auf 7,0 mit Hilfe von 6 n HCl eingestellt und dazu 1 Liter Aceton zugegeben. Der ausgefällte Niederschlag wurde filtriert und 5 g Benzyl-β-CD erhalten (eine Mischung von substituierten Massen mit Substituenten an den Stellen C&sub2;, C&sub3; und C&sub6;).
    • (2) Synthese von BG5P
  • in 1 Liter von 10 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 6,5) wurden 10 g Benzyl-β-CD und 10 g p-Nitrophenyl-α-D- Glucopyranosid aufgelöst und dazu 1.000 kU CGTase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC für 5 Stunden unter Rühren durchgeführt. Nach der Einstellung des pH-Werts auf 4,0 mit Hilfe von Essigsäure wurden 20 kU Glucoamylase zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC für 10 Stunden ausgeführt. Nach dem Gefriertrocknen der Reaktionslösung wurde mit Hilfe einer mit Bio-Gel P-2 (hergestellt von Bio-Rad Co.) gefüllten Säule (30 mm · 1.500 mm), äquilibriert mit 50 mM Essigsäure,eine Reinigung ausgeführt, um 1,6 g rohes BG5P (eine Mischung von Verbindungen mit Substituenten an den Stellen C&sub2;, C&sub3; und C&sub6;) zu erhalten. Dieses wurde abgetrennt und gereinigt mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), um 180 mg Masse zu erhalten, die an der Stelle C&sub6; substituiert war (700 mg Masse mit Substitution an der Stelle C&sub2; und 650 mg Masse mit Substitution an der Stelle C&sub3;).
  • HPLC: Inhalt 96% [Säule: Silica-Gel Z-ODS, 5C&sub1;&sub8; (eine Handelsbezeichnung, hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 10 mm · 300 mm); Eluat: linearer Gradient von 10% CH&sub3;CN - 0,1% AcOH und 90% CH&sub3;CN - 0,1% AcOH; Durchflußrate: 3 ml/min, gemessen bei 305 nm]
  • IR: entsprechend Fig. 1.
  • ¹H-NMR: entsprechend Fig. 2.
  • GLC-Analysen: Glucoserest und Benzylglucoserest in BG5P wurden mit Hilfe der GLC (Säule: 2% OV-17 auf Chromosorb, hergestellt von der Wako Pure Chem. ind., Ltd., 0,4 cm · 200 cm) nach Methanolyse (1,4 M HCl-Methanol, 90ºC für 2 Stunden) analysiert, gefolgt von einer Trimethylsilylierung mit Hexamethyldisilazan und Trimethylsilylchlorid in Pyridin. Die Temperatur war auf 110ºC bis 250ºC in Schritten von 4ºC pro Minute programmiert. Die Konzentration der p-Nitrophenylgruppe wurde gleich 1 gesetzt und der Gehalt anhand der Absorption bei 305 nm in 0,1 Mol Essigsäurelösung bestimmt.
  • Anhand der vorgenannten Ergebnisse und der Tatsache, daß BG5P durch Glucoamylase nicht angegriffen wurde, wurde für BG5P die folgende Struktur geschätzt:
    • Beispiel 2
  • Synthese von p-Nitrophenyl-O-(6-brom-6-deoxy)-α-D- glucopyranosyl-(1-4)O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranosid (nachfolgend bezeichnet als "BrG5P")
    • (1) Synthese von Mono-6-brom-6-deoxy-β-cyclodextrin (nachfolgend bezeichnet als "Br-beta-CD")
  • In 250 ml DMF wurden 5 g Mono-6-O-p-toluolsulfonyl-βcyclodextrin aufgelöst, das entsprechend dem Herstellungsbeispiel synthetisch hergestellt wurde, und dazu 15 g Lithiumbromid gegeben. Die Reaktion wurde für 2 Stunden am Rückfluß ausgeführt. Nach dem Konzentrieren unter reduziertem Druck wurden 500 ml Aceton dazu zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen, der filtriert wurde und 2,3 g Mono-6-brom-6-deoxy-β-cyclodextrin ergab.
    • (2) Synthese von BrG5P
  • In 100 ml von 10 mM Axnmoniumacetat-Pufferlösung (pH 6,5) wurden 1 g Br-β-CD und 1 g p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranosid aufgelöst und dazu 100 kU CGTase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC für 5 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 4,0 mit Hilfe von Essigsäure, wurden 2.000 U Glucoamylase zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC für 10 Stunden unter Rühren ausgeführt. Die Reaktionslösung wurde konzentriert und mit Hilfe einer Säule (30 mm · 1.500 mm) gereinigt, die mit Bio- Gel P-2 (hergestellt von Bio-Rad Co.) gefüllt und mit 50 mM Essigsäure äquilibriert war, um 0,16 g BrG5P zu erhalten.
  • HPLC: Gehalt 97% (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben),
  • ¹H-NMR: entsprechend Fig. 3
  • Das Verhältnis von Glucose/p-Nitrophenol von BrG5P, das in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, betrug 3,6.
  • Anhand der vorgenannten Ergebnisse und der Tatsache, daß BrG5P durch Glucoamylase nicht angegriffen wurde, wurde für BrG5P die folgende Struktur bestimmt:
    • Beispiel 3 Synthese von BG5P
  • Nach dem Auflösen von 3 g p-Nitrophenyl-α-D-Maltopentaosid in 50 ml D-F, wurden 15 ml Benzaldehyddimethylacetal und 1 g p-Toluolsufonsäure (Anhydrid) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 50ºC für 3 Stunden unter Rühren ausgeführt. Nach der Reaktion wurden 100 ml Pyridin zugesetzt und 60 ml Benzoylchlorid tropfenweise zur Ausführung der Reaktion zugegeben. Die Reaktionslösung wurde in eine Lösung von gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gegossen, um die Reaktion zu stoppen. Die Reaktionslösung wurde mit 200 ml Chloroform extrahiert und zweimal mit gesättigter Salzlösung gewaschen und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Der resultierende Sirup wurde in einen 1-1-Vierhalskolben übertragen und in 250 ml THF aufgelöst, dem ein Zusatz und Auflösen von 3 g Dimethylaminboran folgte. Zu dieser Lösung wurden 10 ml einer Lösung von 0,5 M HCl (Gas) in Diethylether tropfenweise unter Rühren zugesetzt und die Reaktionslösung in 200 ml gesättigtem Natriumhydrogencarbonat zum Stoppen der Reaktion gegossen, wonach Extraktion mit 200 ml Chloroform folgte. Nach zweimaligem Waschen mit gesättigter Salzlösung wurde das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Zu der resultierenden Lösung wurden 500 ml Methanollösung gegeben, die 0,1 n Natriummethoxid enthielt, bei 25ºC für 4 Stunden gerührt, gefolgt durch Zusatz von Essigsäure zur Neutralisation. Nach der Entfernung des Lösemittels im Vakuum wurden 20 ml einer 50 mM Essigsäurelösung zugesetzt und auf eine Bio-Gel-p-2-Säule gegeben (hergestellt von Bio-Rad Co., 2 cm Durchmesser · 150 cm), äquilibriert mit 50 mM Essigsäure, wonach die BG5P-Fraktionen aufgenommen und gefriergetrocknet wurden.
  • Ausbeute: 450 mg
  • IR-Diagramm: entsprechend Fig. 1
  • ¹H-NMR: entsprechend Fig. 2
  • HPLC: Gehalt 95% (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben)
  • GC-Analyse der Zusammensetzung: Glucose/6-O- Benzylglucose/p-Nitrophenylgruppe = 3,8/0,9/1,0 (die Meßbedingungen waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben).
    • Beispiel 4 Messung der Aktivität von α-Amylase [Meßreagens]
  • Es wurde durch Auflösen von 30 mg des in Beispiel 1 erhaltenen BG5P in 30 ml von 50 mM/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-NaOH-Pufferlösung (pH 6,9) mit einem Gehalt von 400 Einheiten Glucoamylase, 300 Einheiten α-Glucosidase und 20 mM/l Calciumchlorid eine Meßreagenslösung hergestellt.
    • [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml der Meßlösung wurden 100 ul eines Probeserums zugegeben und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
  • Andererseits wurde unter Verwendung einer Standardprobe, die bekannte Aktivitäten von α-Amylasen enthielt, die Eichkurve in der gleichen Weise aufgenommen, wie voranstehend beschrieben. Aus dieser Eichkurve wurde die α- Amylaseaktivität eines Probeserums erhalten. Fig. 4 zeigt eine Beziehung zwischen der Aktivität von α-Amylase in den einzelnen Verdünnungsstufen einer Standardprobe (Somogyi- Einheit/dl) und dem Zuwachs der Absorption (ΔA) pro Minute bei einer Wellenlänge von 405 nm.
  • Wie aus Fig. 4 ersichtlich, verläuft die Eichkurve, die durch Auftragen der Werte mit steigender Absorption (ΔA/min) entsprechend der α-Amylaseaktivität (Somogyi Einheit/dl) erhalten wurde, linear und geht durch den Nullpunkt. Dieses bedeutet, daß die Eichkurve ein gutes qualitatives Verhalten zeigt.
    • Beispiel 5 Messung der Aktivität von α-Amylase [Meßreagens]
  • Es wurde durch Auflösen von 2,1 g N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 230 mg NaCl, 58 mg CaCl&sub2;, 500 mg NaOH in destilliertem Wasser mit einer Gesamtmenge von 100 ml (pH 7,3) und Auflösen darin von 125 mg des in Beispiel 3 erhaltenen BG5P eine Meßreagenslösung hergestellt.
  • Lösung (A): Zu 50 ml der resultierenden Lösung wurden 25.000 Einheiten von α- Glucosidase zugesetzt;
  • Lösung (B): Zu 20 ml der Lösung (A) wurden 1.000 Einheiten Glucoamylase zugesetzt.
    • [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml der Reagenslösung (A) oder (B) wurden 50 ul Serumprobe zugesetzt und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
  • In Tabelle 4 sind die Absorption (ΔA) pro Minute mit steigenden Werten bei Messung unter Verwendung von 5 Arten von Human-Serum bei einer Wellenlänge von 405 nm dargestellt. Tabelle 4 Human-Serum Nr. Reagenslösung
  • Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wird die Meßempfindlichkeit durch Zusatz von Glucoamylase kaum beeinflußt.
    • Beispiel 6 Messung der Aktivität von α-Amylase [Meßreagens]
  • Es wurde durch Auflösen von 30 mg des in Beispiel 2 erhaltenen BrG5P in 30 ml von 50 mM/l MES-NaOH-Pufferlösung (pH 6,9) mit einem Gehalt von 400 Einheiten Glucoamylase, 300 Einheiten α-Glucosidase und 20 mM/l Calciumchlorid eine Meßreagenslösung hergestellt.
    • [Meßverfahren]
  • Es wurden zu 2 ml der Meßlösung 100 ul einer Serumprobe zugesetzt und bei 37ºC inkubiert. Es wurde die Änderung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
  • Andererseits wurde unter Verwendung einer Standardprobe, die bekannte Aktivitäten von α-Amylase enthielt, die Eichkurve in der gleichen Weise erzeugt, wie voranstehend beschrieben. Aus dieser Eichkurve wurde die α-Amylaseaktivität erhalten. Fig. 5 zeigt eine Beziehung zwischen der Aktivität von α-Amylase bei einzelnen Verdünnungsstufen einer Standardprobe (Somogyi-Einheit/dl) und den Zuwachs der Absorption (ΔA) pro Minute bei einer Wellenlänge von 405 nm.
  • Aus Fig. 5 wird offensichtlich, daß die durch Auftragen der steigenden Werte der Absorption (ΔA/min) entsprechend der α-Amylaseaktivität (Somogyi-Einheit/dl) erhaltene Eichkurve linear verläuft und durch den Nullpunkt geht. Dieses bedeutet, daß die Eichkurve ein gutes quantitatives Verhalten zeigt.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von alpha- Amylase in einer Probe, welches umfaßt:
Verwenden eines modifizierten Oligosaccharids als ein Substrat für alpha-Amylase, welches Oligosaccharid die Formel hat:
worin sind: R¹ ein Halogenatom und R² eine Gruppe der Formel:
worin R³ bis R&sup6; voneinander unabhängig Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe, eine niedere Alkoxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Balogenatom sind und R³ und R&sup5; und/oder R&sup4; und R&sup6; zur Bildung eines aromatischen Ringes gebunden sein können;
R&sup7; Wasserstoff, eine niedere Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe ist; R&sup8; Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe ist und R&sup9; Wasserstoff oder ein Halogenatom ist,
Inkontaktbringen der Probe mit dem Substrat in Gegenwart mindestens eines Exoenzyms und
Messen einer optisch meßbaren Änderung als Maß der alpha-Amylaseaktivität in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte Oligosaccharid dargestellt wird durch die Formel:
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte Oligosaccharid dargestellt wird durch die Formel:
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) oder (II) hergestellt wird durch Umsetzen eines modifizierten Cyclodextrins mit Cyclomaltodextrin-gluconotransferase in Gegenwart eines Akzeptors, der ausgewählt wird aus Glucose, Maltose und Maltotriose, worin die Glucose, Maltose und Maltotriose jede einen Substituenten aufweisen, der an dem Zucker-Bruchstück über eine glykosidische Bindung verknüpft ist, das bei der Aufspaltung eine optisch meßbare Änderung zeigt, und sodann Umsetzen mit Glucoamylase oder alpha-Glucosidase.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das modifizierte Oligosaccharid der Formel (I) hergestellt wird durch Umsetzen eines Oligosaccharids, das einen Substituenten aufweist, der eine optisch meßbare Änderung bei Aufspaltung an dem reduzierenden Ende des Glucoserests zeigt, mit entweder Benzaldehyd oder Benzaldehyddimethylacetal, um das 4,6-O-cyclische Acetal an dem nichtreduzierenden Ende des Glucoserests zu binden, und Reduzieren des 4,6-O-cyclischen Acetals.
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