JPS63283599A - α−アミラ−ゼの活性測定法 - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたα−アミラ
ーゼの活性測定法に関する。
ーゼの活性測定法に関する。
(従来の技術)
膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性
を測定することにより、各種疾患の診断が行われている
。α−アミラーゼの活性測定法には、例えばマルトオリ
ゴ糖(マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トテトラオースなど)を基質とする方法がある。この方
法では、a−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖と
α−グルフシダーゼとを作用させて基質からグルコース
を遊離させ、グルコースの量を測定することにより、α
−アミラーゼの活性値を知る。マルトオリゴ糖としてマ
ルトペンタオースを用いた例を次に示す。
を測定することにより、各種疾患の診断が行われている
。α−アミラーゼの活性測定法には、例えばマルトオリ
ゴ糖(マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トテトラオースなど)を基質とする方法がある。この方
法では、a−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖と
α−グルフシダーゼとを作用させて基質からグルコース
を遊離させ、グルコースの量を測定することにより、α
−アミラーゼの活性値を知る。マルトオリゴ糖としてマ
ルトペンタオースを用いた例を次に示す。
α−アミラーゼ
■ マルトペンタオース マルトース
+マルトトリオース生成したグルコースは、例えば、グ
ルコースオキシダーゼ/パーオキシダーゼ/色素系を利
用する定量法;へキソキナーゼ/ホス7オグルコムター
ゼ/グルフース−6−ホス7エートデヒド四ゲナーゼ1
NkDH系を利用する測定法などにより測定される。α
−グルコシダーゼはマルトペンタオースなどの四糖以上
のオリゴ糖に作用しにくくマルトースやマルトトリオー
スなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に作用するため、上
記基質を使用してグルコースを測定することによりα−
アミラーゼの活性を測定することができる。しかし、α
−グルコシダーゼはわずかではあるが基質であるマルト
ペンタオースに作用するため、測定のブランク値が上昇
し、その結果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が
ある。α−グルコシダーゼの基質分解作用のため、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは、試薬とし
ての安定性が損なわれるため好ましくない。
+マルトトリオース生成したグルコースは、例えば、グ
ルコースオキシダーゼ/パーオキシダーゼ/色素系を利
用する定量法;へキソキナーゼ/ホス7オグルコムター
ゼ/グルフース−6−ホス7エートデヒド四ゲナーゼ1
NkDH系を利用する測定法などにより測定される。α
−グルコシダーゼはマルトペンタオースなどの四糖以上
のオリゴ糖に作用しにくくマルトースやマルトトリオー
スなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に作用するため、上
記基質を使用してグルコースを測定することによりα−
アミラーゼの活性を測定することができる。しかし、α
−グルコシダーゼはわずかではあるが基質であるマルト
ペンタオースに作用するため、測定のブランク値が上昇
し、その結果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が
ある。α−グルコシダーゼの基質分解作用のため、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは、試薬とし
ての安定性が損なわれるため好ましくない。
マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基
、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた
基質を用いる方法も提案されている。例えば、基質とし
てp−二トロフェニルマルトペンタオシド(特公昭57
−!530’19号公報)、p−ニトロフェニルマルト
へキサオシド(特公昭57−153079号公報)、p
−ニトロフェニルマルトへブタオシド(特開昭54−5
1892号公報)、z、4−ジクロロフェニルマルトペ
ンタオシド(特開昭36−359913号公報)などが
利用されている。これらの基質を用いると、アグリコン
が遊離し、遊離したアグリコン、例えばp−ニトロフェ
ノールを光学的に測定することにより、α−アミラーゼ
の活性を容易に測定することができる。
、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた
基質を用いる方法も提案されている。例えば、基質とし
てp−二トロフェニルマルトペンタオシド(特公昭57
−!530’19号公報)、p−ニトロフェニルマルト
へキサオシド(特公昭57−153079号公報)、p
−ニトロフェニルマルトへブタオシド(特開昭54−5
1892号公報)、z、4−ジクロロフェニルマルトペ
ンタオシド(特開昭36−359913号公報)などが
利用されている。これらの基質を用いると、アグリコン
が遊離し、遊離したアグリコン、例えばp−ニトロフェ
ノールを光学的に測定することにより、α−アミラーゼ
の活性を容易に測定することができる。
代表的な基質を用いた場合の反応式を次に示す。
(I) p−二トロフェニルーα−マルトペンタオシ
ドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■ p−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシドp−
ニトロフェニル−α−マルトシド+マルトトリオース■
p−ニトロフェニル−α−マルトシド+マルトトリオ
ースα−グルコシダーゼ p−ニトロフェノール+グルコース (Z)a、4−ジクロロフェニル−β−マルトペンタオ
シドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■ 2 e 4−ジクロロフェニル−β−マルトヘンタ
オシトーーーーー→2.4−ジクロロフェニル−β−マ
ルトシド+マルトトリオース■ 2,4−ジクロロフェ
ニル−β−マルトシド+マルトトリオースα−グルコシ
ダーゼ 、4−ジクロロフェニル−β−グルコシドグルコースβ
−グルフシターゼ ■ 2,4−ジクロロフェニル−β−グルコシド2.4
−ジクロロフェノール+グルコース乳化剤 ■ 2.4−ジクロロフェノール+4−アミノアンチピ
リ≧−−−ラキノン色素 上記(I)および(2)のいずれの方法においても、α
−グルコシダーゼがわずかではあるが基質に作用するた
め、ブランク値が上昇する欠点がある。α−グルコシダ
ーゼの基質分解作用のため、前記グルコースを測定する
方法と同様にα−グルコシダーゼと基質とを一液化する
ことは難しい。
ドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■ p−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシドp−
ニトロフェニル−α−マルトシド+マルトトリオース■
p−ニトロフェニル−α−マルトシド+マルトトリオ
ースα−グルコシダーゼ p−ニトロフェノール+グルコース (Z)a、4−ジクロロフェニル−β−マルトペンタオ
シドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■ 2 e 4−ジクロロフェニル−β−マルトヘンタ
オシトーーーーー→2.4−ジクロロフェニル−β−マ
ルトシド+マルトトリオース■ 2,4−ジクロロフェ
ニル−β−マルトシド+マルトトリオースα−グルコシ
ダーゼ 、4−ジクロロフェニル−β−グルコシドグルコースβ
−グルフシターゼ ■ 2,4−ジクロロフェニル−β−グルコシド2.4
−ジクロロフェノール+グルコース乳化剤 ■ 2.4−ジクロロフェノール+4−アミノアンチピ
リ≧−−−ラキノン色素 上記(I)および(2)のいずれの方法においても、α
−グルコシダーゼがわずかではあるが基質に作用するた
め、ブランク値が上昇する欠点がある。α−グルコシダ
ーゼの基質分解作用のため、前記グルコースを測定する
方法と同様にα−グルコシダーゼと基質とを一液化する
ことは難しい。
このような欠点を解消するため、マルトオリゴ糖の非還
元性末端のグルコースの6位のヒドロキシル基が修飾さ
れたタイプの基質を用いる方法が提案されている。例え
ば、特開昭60−237998号公報には非還元性末端
のグルコースの6位のOH基を例えば、ハロゲン原子、
−0R1−00OR,−0802R。
元性末端のグルコースの6位のヒドロキシル基が修飾さ
れたタイプの基質を用いる方法が提案されている。例え
ば、特開昭60−237998号公報には非還元性末端
のグルコースの6位のOH基を例えば、ハロゲン原子、
−0R1−00OR,−0802R。
−HHR(Rはアルキル、フェニル、ピリジルなど)で
置換し、還元性末端のグルコースに置換または未置換の
フェニル基がアグリコンとして結合したマルトトリオー
スが基質として開示されている。
置換し、還元性末端のグルコースに置換または未置換の
フェニル基がアグリコンとして結合したマルトトリオー
スが基質として開示されている。
非還元性末端グルコースの6位のOH基が置換されてい
るとα−グルコシダーゼによる基質の分解が起こらない
。
るとα−グルコシダーゼによる基質の分解が起こらない
。
しかし、このように6位のみに置換基が導入された基質
は、合成が困難であり、収率も悪いという欠点がある。
は、合成が困難であり、収率も悪いという欠点がある。
また特開昭60−54395号公報には非還元性末端の
グルコースの4位および6位のOH基をアルキル基又は
アルコイル基又はフェニル基で置換し、還元性末端のグ
ルコースにアグリコンを結合させたマルトオリゴシトを
基質として用いることが開示されている。非還元性末端
グルコースの4位および6位のOH基が置換されている
とα−グルコシダーゼによる基質の分解が生じ難い。し
かし、このような基質は、2つのOH基が置換されてい
るため、水溶性が悪く高濃度溶液の調製が不可能であり
、α−アミラーゼ活性測定に十分な濃度を溶解すること
ができないという欠点がある。
グルコースの4位および6位のOH基をアルキル基又は
アルコイル基又はフェニル基で置換し、還元性末端のグ
ルコースにアグリコンを結合させたマルトオリゴシトを
基質として用いることが開示されている。非還元性末端
グルコースの4位および6位のOH基が置換されている
とα−グルコシダーゼによる基質の分解が生じ難い。し
かし、このような基質は、2つのOH基が置換されてい
るため、水溶性が悪く高濃度溶液の調製が不可能であり
、α−アミラーゼ活性測定に十分な濃度を溶解すること
ができないという欠点がある。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明は上記従来の欠点を解消しようとするものであり
、その目的とするところは、基質と追随酵素の一液化条
件において、α−グルコシダーゼ等の追随酵素の作用を
受けず、合成が容易であり、かつ水溶性に優れた基質を
用いて体液中のα−アミラーゼ活性を精度よく簡単な操
作で測定する方法を提供することにある。
、その目的とするところは、基質と追随酵素の一液化条
件において、α−グルコシダーゼ等の追随酵素の作用を
受けず、合成が容易であり、かつ水溶性に優れた基質を
用いて体液中のα−アミラーゼ活性を精度よく簡単な操
作で測定する方法を提供することにある。
(問題点を解決するための手段および作用)本発明は、
非還元性末端グルコースの4位および6位のヒドロキシ
ル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドおよび
/または非還元性末端グルコースの4位および6位のヒ
ドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリゴシ
ドである次式(I)で示される基質に、α−グルコシダ
ーゼおよび/またはグルフアミラーゼおよび必要により
β−グルコシダーゼの共存下でα−アミラーゼ含有試料
を作用させ、遊離するフェノール系化合物を測定するこ
とを特徴とするα−アミラーゼの活性測定法である。
非還元性末端グルコースの4位および6位のヒドロキシ
ル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドおよび
/または非還元性末端グルコースの4位および6位のヒ
ドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリゴシ
ドである次式(I)で示される基質に、α−グルコシダ
ーゼおよび/またはグルフアミラーゼおよび必要により
β−グルコシダーゼの共存下でα−アミラーゼ含有試料
を作用させ、遊離するフェノール系化合物を測定するこ
とを特徴とするα−アミラーゼの活性測定法である。
(式中、R1およびR8の少なくとも一方は水酸基、カ
ルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数1〜6の
置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又は
スルホン酸基を有する置換フェニル基を示し、残された
基は水素、炭素数1〜6のアルキル基あるいは7エエル
基を示す。R3は置換又は未置換のフェニル基を示す。
ルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数1〜6の
置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又は
スルホン酸基を有する置換フェニル基を示し、残された
基は水素、炭素数1〜6のアルキル基あるいは7エエル
基を示す。R3は置換又は未置換のフェニル基を示す。
n = 1〜8である。)
本発明に用いる基質の骨格となるマルトオリゴ糖は3〜
10個の糖(式(I)のn = 1〜8に相当)から形
成される。マルトオリゴ糖としては、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオース、マルトヘプタオースなどがある。特にマル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオースが好適である。
10個の糖(式(I)のn = 1〜8に相当)から形
成される。マルトオリゴ糖としては、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオース、マルトヘプタオースなどがある。特にマル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオースが好適である。
マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの置換基であ
るR1およびR2は同一の基であっても異なる基であっ
てもよい。R1およびR1の少なくとも一方は水酸基、
カルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数1〜6
の置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又
はスルホン酸基を有する置換フェニル基であり、残され
た基は水素、炭素数1〜6のアルキル基あるいはフェニ
ル基を示す。水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基は
同一のアルキル基、又はフェニル基に置換してもよく、
また複数個置換してもよい。
るR1およびR2は同一の基であっても異なる基であっ
てもよい。R1およびR1の少なくとも一方は水酸基、
カルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数1〜6
の置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又
はスルホン酸基を有する置換フェニル基であり、残され
た基は水素、炭素数1〜6のアルキル基あるいはフェニ
ル基を示す。水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基は
同一のアルキル基、又はフェニル基に置換してもよく、
また複数個置換してもよい。
このような置換アルキル基としては、ヒドロキシメチル
、スルホメチル、カルボキシメチル、ヒドロキシエチル
、スルホエチル、カルボキシエチル、ヒドロキシプロピ
ル、スルホプロピル、ヒドロキシブチル、スルホブチル
、カルボキシブチルなどがある。
、スルホメチル、カルボキシメチル、ヒドロキシエチル
、スルホエチル、カルボキシエチル、ヒドロキシプロピ
ル、スルホプロピル、ヒドロキシブチル、スルホブチル
、カルボキシブチルなどがある。
置換フェニル基としては、4−ヒドロキシフェニル、4
−スルホフェニル、4−カルボキシフェニル、3−ヒド
ロキシフェニル、3−スルホ7エ二ル、3−カルボキシ
フェニル、2−ヒドロキシフェニル、2−スルホフェニ
ル、2−カルボキシフェニル、2,4−ジヒドロキシフ
ェニル、2 、 a−ジカルボキシフェニル12,4−
ジスルホフェニルS2−ヒドロキシ−4−カルボキシフ
ェニル、2−ヒドロキシ−4−スルホフェニル、3.5
−ジヒドロキシフェニル、3.5−ジカルボキシ7工二
ル、3.5−ジスルホフェニル、2,4.6−トリヒド
ロキシフエニル、4−ヒドロキシメチルフェニル、4−
スルホメチルフェニル、4−カルボキシメチルフェニル
、4−ヒドロキシエチルフェニル、4−スルホエチルフ
ェニル、4−カルボキシエチルフェニル、4−ヒドロキ
シプロピルフェニル、4−スルホプロピルフェニル、4
−カルボキシプロピルフェニル、4−(2−ヒドロキシ
プロピル)フェニル、4−(2−スルホプロピル)フェ
ニル、4−(2−カルボキシプロピル)フェニル、4−
(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)フェニル、4
−(2−ヒドロキシ−3−カルボキシプロピル)フェニ
ル、3−ヒドロキシメチルフェニル、3−スルホメチル
フェニル、3−カルボキシメチルフェニル、3−ヒドロ
キシエチルフェニル、3−スルホエチルフェニル、3−
カルポキシエチルフエニル、3−ヒドロキシプロピルフ
ェニル、3−スルホプロピルフェニル、3−カルボキシ
プロピルフェニル、s−(g−ヒドロキシプロピル)フ
ェニル、3−(g−スルホプロピル)フェニル、3”(
2−カルボキシプロピル)フェニル、3−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)フェニル、3−(2−ヒド
ロキシ−3−カルボキシプロピル)フェニルなどがある
。
−スルホフェニル、4−カルボキシフェニル、3−ヒド
ロキシフェニル、3−スルホ7エ二ル、3−カルボキシ
フェニル、2−ヒドロキシフェニル、2−スルホフェニ
ル、2−カルボキシフェニル、2,4−ジヒドロキシフ
ェニル、2 、 a−ジカルボキシフェニル12,4−
ジスルホフェニルS2−ヒドロキシ−4−カルボキシフ
ェニル、2−ヒドロキシ−4−スルホフェニル、3.5
−ジヒドロキシフェニル、3.5−ジカルボキシ7工二
ル、3.5−ジスルホフェニル、2,4.6−トリヒド
ロキシフエニル、4−ヒドロキシメチルフェニル、4−
スルホメチルフェニル、4−カルボキシメチルフェニル
、4−ヒドロキシエチルフェニル、4−スルホエチルフ
ェニル、4−カルボキシエチルフェニル、4−ヒドロキ
シプロピルフェニル、4−スルホプロピルフェニル、4
−カルボキシプロピルフェニル、4−(2−ヒドロキシ
プロピル)フェニル、4−(2−スルホプロピル)フェ
ニル、4−(2−カルボキシプロピル)フェニル、4−
(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)フェニル、4
−(2−ヒドロキシ−3−カルボキシプロピル)フェニ
ル、3−ヒドロキシメチルフェニル、3−スルホメチル
フェニル、3−カルボキシメチルフェニル、3−ヒドロ
キシエチルフェニル、3−スルホエチルフェニル、3−
カルポキシエチルフエニル、3−ヒドロキシプロピルフ
ェニル、3−スルホプロピルフェニル、3−カルボキシ
プロピルフェニル、s−(g−ヒドロキシプロピル)フ
ェニル、3−(g−スルホプロピル)フェニル、3”(
2−カルボキシプロピル)フェニル、3−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)フェニル、3−(2−ヒド
ロキシ−3−カルボキシプロピル)フェニルなどがある
。
修飾マルトオリゴシトのアグリコンに相当するR3は置
換または未置換のフェニル基である。式は還元性末端の
グルコースの1位のOH基にα型で結合していてもよく
、β型で結合していてもよい。
換または未置換のフェニル基である。式は還元性末端の
グルコースの1位のOH基にα型で結合していてもよく
、β型で結合していてもよい。
置換フェニル基とは、ハロゲン原子、とドロキシ基、炭
素原子数1〜6のアルキル基、アルコキシ基、アルコキ
シカルボニル基、ニトロ基なトラ有するフェニル基であ
る。このような基を形成しうる置換フェノール類として
は、例えばクロロフェノール、ジクロロフェノール、ヒ
ドロキシフェノール、アルキルフェノール、アルコキシ
フェノール、ヒドロキシ安息香酸、ニトロフェノール、
ハロゲン化ニトロフェノール、アルキル化ニトロフェノ
ール、アルコキシ化ニトロフェノール、ニトロ化ヒドロ
キシ安息香酸、ジニトロフェノールなどが挙げられる。
素原子数1〜6のアルキル基、アルコキシ基、アルコキ
シカルボニル基、ニトロ基なトラ有するフェニル基であ
る。このような基を形成しうる置換フェノール類として
は、例えばクロロフェノール、ジクロロフェノール、ヒ
ドロキシフェノール、アルキルフェノール、アルコキシ
フェノール、ヒドロキシ安息香酸、ニトロフェノール、
ハロゲン化ニトロフェノール、アルキル化ニトロフェノ
ール、アルコキシ化ニトロフェノール、ニトロ化ヒドロ
キシ安息香酸、ジニトロフェノールなどが挙げられる。
特に少なくとも1個のニトロ基を有する7エ/−ル類、
例えば4−ニトロフェノール、2−クロロ−4−二トロ
フェノール、2゜6−ジクロロ−4−二トロフェノール
、2.6−ジプロモー4−二トロフェノール、2−ブロ
モ−4−ニトロフェノール、2−ニトロフェノール、2
−ヒドロキシ−4−ニトロフェノール、3−ヒドロキシ
−4−二トロフェノールなどが好適である0 上記修飾a−(またはβ−)フェニルマルトオリゴシド
は新規化合物である。このような化合物としては、例え
ば次の化合物がある。〔〕内は略称である。
例えば4−ニトロフェノール、2−クロロ−4−二トロ
フェノール、2゜6−ジクロロ−4−二トロフェノール
、2.6−ジプロモー4−二トロフェノール、2−ブロ
モ−4−ニトロフェノール、2−ニトロフェノール、2
−ヒドロキシ−4−ニトロフェノール、3−ヒドロキシ
−4−二トロフェノールなどが好適である0 上記修飾a−(またはβ−)フェニルマルトオリゴシド
は新規化合物である。このような化合物としては、例え
ば次の化合物がある。〔〕内は略称である。
(I)2−クロロ−4−二トロフェニル 4.6−o−
4a−スルホベンジリデン)−〇−α−り一グルコビラ
ノシルー((I−4)−0−α−D−グルフピラノシル
ー)s−0−β−D−グルコピラノシド 〔4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロフ
ェニルーβ−マルトペンタオシド〕(2)4−ニトロフ
ェニル 4.6−0−(3゜6−ジヒドロキシベンジリ
デン)−〇−α−D−グルコピラノシルー((I−4)
−0−α−D−グルコピラノシル−)s−0−α−D−
グルフビラノシド (3,5−ジヒドロキシベンジリデン 4−ニトロフェ
ニル−α−マルトヘプタオシド〕(8)2−クロロ−4
−二ト℃フェニル 4.6−〇−ヒドロキシイソプロピ
リデンー〇−α−D−グルコビラノシル−((I,4)
−0−α−り一グルコピラノシルー)3−o−α−D−
グルコピラノシド 〔ヒドロキシイソプロピリデン 2−クロロ−4−ニト
ロフェニル−α−マルトペンタオシド〕(4) 2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル 4,6−O−(3−ヒドロ
キシ−4−カルボキシベンジリデン)−〇−α−D−グ
ルコピラノシルー((I→4)−〇−α−D−グルコピ
ラノシルー)3−〇−α−D−グルコピラノシド 〔3−ヒドロキシ−4−カルボキシベンジリデン2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシド〕 (5)2−クロロ−4−ニトロフェニル 4,6−O−
(2−ヒドロキシ−4−スルホベンジリデン)−o−α
−D−グルフピラノシル−((I→4)−〇−α−D−
グルコピラノシル)−〇−α−D−グルコピラノシド 〔2−ヒドロキシ−4−スルホベンジリデン 2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル−α−マルトヘンタオシド〕 本発明の基質(I)は新規な化合物であり、化合物α)
にカルボニル化合物またはそのアセタール@)を反応さ
せることによって製造することができる。
4a−スルホベンジリデン)−〇−α−り一グルコビラ
ノシルー((I−4)−0−α−D−グルフピラノシル
ー)s−0−β−D−グルコピラノシド 〔4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロフ
ェニルーβ−マルトペンタオシド〕(2)4−ニトロフ
ェニル 4.6−0−(3゜6−ジヒドロキシベンジリ
デン)−〇−α−D−グルコピラノシルー((I−4)
−0−α−D−グルコピラノシル−)s−0−α−D−
グルフビラノシド (3,5−ジヒドロキシベンジリデン 4−ニトロフェ
ニル−α−マルトヘプタオシド〕(8)2−クロロ−4
−二ト℃フェニル 4.6−〇−ヒドロキシイソプロピ
リデンー〇−α−D−グルコビラノシル−((I,4)
−0−α−り一グルコピラノシルー)3−o−α−D−
グルコピラノシド 〔ヒドロキシイソプロピリデン 2−クロロ−4−ニト
ロフェニル−α−マルトペンタオシド〕(4) 2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル 4,6−O−(3−ヒドロ
キシ−4−カルボキシベンジリデン)−〇−α−D−グ
ルコピラノシルー((I→4)−〇−α−D−グルコピ
ラノシルー)3−〇−α−D−グルコピラノシド 〔3−ヒドロキシ−4−カルボキシベンジリデン2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシド〕 (5)2−クロロ−4−ニトロフェニル 4,6−O−
(2−ヒドロキシ−4−スルホベンジリデン)−o−α
−D−グルフピラノシル−((I→4)−〇−α−D−
グルコピラノシル)−〇−α−D−グルコピラノシド 〔2−ヒドロキシ−4−スルホベンジリデン 2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル−α−マルトヘンタオシド〕 本発明の基質(I)は新規な化合物であり、化合物α)
にカルボニル化合物またはそのアセタール@)を反応さ
せることによって製造することができる。
上記反応は一般に非反応性溶媒中で行なわれ該非反応性
溶媒としては、ジメチルホルムアミド・ジメチルスルホ
キサイド、エチレングリコールジメチルエーテル等が例
示され、必要により上記化合物l自体を溶媒として用い
る場合もある0反応温度は特に制限されないが、通常0
°Cから溶媒の沸点までの範囲で行なうことが推奨され
・更に好ましい範囲は40〜100°Cである。更に減
圧下還流加熱したり、あるいは副生アルコール類を蒸発
除去しながら反応させるのも効果的である。反応の促進
のために触媒たとえば少量の純硫酸、塩酸ガス、’O−
)ルエンスルホン酸あるいは無水塩化亜鉛などが用いら
れることもある。
溶媒としては、ジメチルホルムアミド・ジメチルスルホ
キサイド、エチレングリコールジメチルエーテル等が例
示され、必要により上記化合物l自体を溶媒として用い
る場合もある0反応温度は特に制限されないが、通常0
°Cから溶媒の沸点までの範囲で行なうことが推奨され
・更に好ましい範囲は40〜100°Cである。更に減
圧下還流加熱したり、あるいは副生アルコール類を蒸発
除去しながら反応させるのも効果的である。反応の促進
のために触媒たとえば少量の純硫酸、塩酸ガス、’O−
)ルエンスルホン酸あるいは無水塩化亜鉛などが用いら
れることもある。
前記製造方法によれば、マルトオリゴ糖の非還元性末端
グルコース残基に環状アセタール保護基を選択的に結合
させることが可能である。長谷用らの糖製状アセタール
に関する研究報@(Oarbohyd。
グルコース残基に環状アセタール保護基を選択的に結合
させることが可能である。長谷用らの糖製状アセタール
に関する研究報@(Oarbohyd。
R@II 29209 (Iet3))及びその他の
研究報告によれば単糖類のグルコースの4位および6位
のOH基に対し選択的に環状アセタールを結合させる方
法が発表されている。しかしより高分子量の核置換フエ
ニA・マルトオリゴサイドについて非還元性末端グルコ
ース残基の4位又は6位のOH基に環状アセタールを選
択的に結合させる方法は全く新規な発明であってその有
用性は大きい。
研究報告によれば単糖類のグルコースの4位および6位
のOH基に対し選択的に環状アセタールを結合させる方
法が発表されている。しかしより高分子量の核置換フエ
ニA・マルトオリゴサイドについて非還元性末端グルコ
ース残基の4位又は6位のOH基に環状アセタールを選
択的に結合させる方法は全く新規な発明であってその有
用性は大きい。
原料物質である核置換フェニルマルトオリゴシト(I)
は、核置換芳香族化合物とマルトオリゴ糖を通常の方法
に従って合成する。化学的にはマルトオリゴ糖をアセチ
ル化し、このアセチル化マルトオリゴ糖と核置換芳香族
化合物を結合させた後、脱アセチル化することにより合
成できる(実験化学講座第24巻第304頁、1958
年参照)。生化学的にはサイクロデキストリン、グリコ
ジルトランス7工ラーゼル置換芳香族化合物と可溶性デ
ンプン(またはα−サイクロデキストリンまたは白色デ
キストリン)を反応させて、核置換フェニルマルトオリ
ゴシトを合成することができる。例えば、4−スルホベ
ンジリデン 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−マ
ルトペンタオシドハ2−クロロー4−ニトロフェニルマ
ルトペンタオシドに4−スルホベンズアルデヒドを作用
させて得られる。
は、核置換芳香族化合物とマルトオリゴ糖を通常の方法
に従って合成する。化学的にはマルトオリゴ糖をアセチ
ル化し、このアセチル化マルトオリゴ糖と核置換芳香族
化合物を結合させた後、脱アセチル化することにより合
成できる(実験化学講座第24巻第304頁、1958
年参照)。生化学的にはサイクロデキストリン、グリコ
ジルトランス7工ラーゼル置換芳香族化合物と可溶性デ
ンプン(またはα−サイクロデキストリンまたは白色デ
キストリン)を反応させて、核置換フェニルマルトオリ
ゴシトを合成することができる。例えば、4−スルホベ
ンジリデン 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−マ
ルトペンタオシドハ2−クロロー4−ニトロフェニルマ
ルトペンタオシドに4−スルホベンズアルデヒドを作用
させて得られる。
本発明に用いられるα−グルコシダーゼの起源は、特に
限定されない。動物、植物、微生物などから得られるα
−グルコシダーゼが利用され得る。
限定されない。動物、植物、微生物などから得られるα
−グルコシダーゼが利用され得る。
特に、酵母起源のα−グルコシダーゼは、マルトトリオ
シト以下のグリコシドによく作用し、かつマルトテトラ
オシド以上のグルコシドには作用しにくい点、およびア
グリコンの特異性が広い点から好適に利用されうる。
シト以下のグリコシドによく作用し、かつマルトテトラ
オシド以上のグルコシドには作用しにくい点、およびア
グリコンの特異性が広い点から好適に利用されうる。
β−グルフシダーゼおよびグルコアミラーゼの起源も特
に限定されない。例えば、アーモンドから得られるβ−
グルコシダーゼやりシブスプレマーから得られるグルコ
アミラーゼが好適に利用されつる。
に限定されない。例えば、アーモンドから得られるβ−
グルコシダーゼやりシブスプレマーから得られるグルコ
アミラーゼが好適に利用されつる。
本発明方法によりα−アミラーゼの活性を測定するには
、上記基質、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼお
よびβ−グルコシダーゼを適宜組み合わせた酵素系(追
随酵素系)、および必要に応じてその他の添加物を含有
する試薬にα−アミラーゼを含む試料を作用させる。例
えば、アグリコンがα型に結合した基質(α型基質)を
用いる場合には、追随酵素系としてはα−グルコシダー
ゼおよび/またはグルコアミラーゼが使用される。
、上記基質、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼお
よびβ−グルコシダーゼを適宜組み合わせた酵素系(追
随酵素系)、および必要に応じてその他の添加物を含有
する試薬にα−アミラーゼを含む試料を作用させる。例
えば、アグリコンがα型に結合した基質(α型基質)を
用いる場合には、追随酵素系としてはα−グルコシダー
ゼおよび/またはグルコアミラーゼが使用される。
アグリコンがβ型に結合した基質(β型基質)を用いる
場合には、追随酵素系としては、α−グルコシダーゼお
よび/ま〆はグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダー
ゼが使用される。
場合には、追随酵素系としては、α−グルコシダーゼお
よび/ま〆はグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダー
ゼが使用される。
本発明方法による基質分解の反応式を4−スルホ−ベン
ジリデン 2−クロロ−4−二トロ7二二ルーα(また
はβ)−マルトペンタオシドを例に挙げて説明する。
ジリデン 2−クロロ−4−二トロ7二二ルーα(また
はβ)−マルトペンタオシドを例に挙げて説明する。
(I) 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−
二トロフェニルーa−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■ 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロ
フェニルーαα−アミラーゼ ーマル)ぺ/タrシY z−クロロ
−4−二トロフェニルーα−マルトシド+4−スルホベ
ンジリデントリオース■ 2−クロロ−4−二トロフェ
ニルーa−マルトシド+4−スルホベンジリデントリオ
ース 4−ニトロフェノール+グルコース+4−スルホベンジ
リデングルコース (2) 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■ 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロ
フェニルーβα−アミラーゼ ーマルトヘンタオシトーー→2−クロロ−4−二トロフ
ェニルーβ−マルトシド+4−スルホベンジリデントリ
オース■ 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−マル
トシド+4−スルホベンジリデントリオース 4−ニトロフェニル−β−グルコシド+グルコース+4
−スルホベンジリデングルコース ■ 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−グルコシド
β−グルフシダーゼ 2−クロロ一番−二トロフェノール+グルコース上記反
応にて遊離したフェノール系化合物(上記例においては
2−クロロ−4−ニトロフェノール)を適当な手段によ
り測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定す
ることができる。遊離するフェノール系化合物が基質と
は異なるスペクトル吸収を示す場合には、反応混合物の
スペクトルを直接測定する。基質から遊離したフェノー
ル系化合物が基質とほぼ同じスペクトル吸収を示す場合
には、該フェノール化合物を呈色試薬、例えば4−アミ
ノアンチピリンなどの色原体と過酸化水素とをペルオキ
シダーゼの存在下に酸化縮合させ、その発色強度を測定
する。
二トロフェニルーa−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■ 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロ
フェニルーαα−アミラーゼ ーマル)ぺ/タrシY z−クロロ
−4−二トロフェニルーα−マルトシド+4−スルホベ
ンジリデントリオース■ 2−クロロ−4−二トロフェ
ニルーa−マルトシド+4−スルホベンジリデントリオ
ース 4−ニトロフェノール+グルコース+4−スルホベンジ
リデングルコース (2) 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■ 4−スルホベンジリデン 2−クロロ−4−二トロ
フェニルーβα−アミラーゼ ーマルトヘンタオシトーー→2−クロロ−4−二トロフ
ェニルーβ−マルトシド+4−スルホベンジリデントリ
オース■ 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−マル
トシド+4−スルホベンジリデントリオース 4−ニトロフェニル−β−グルコシド+グルコース+4
−スルホベンジリデングルコース ■ 2−クロロ−4−二トロフェニルーβ−グルコシド
β−グルフシダーゼ 2−クロロ一番−二トロフェノール+グルコース上記反
応にて遊離したフェノール系化合物(上記例においては
2−クロロ−4−ニトロフェノール)を適当な手段によ
り測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定す
ることができる。遊離するフェノール系化合物が基質と
は異なるスペクトル吸収を示す場合には、反応混合物の
スペクトルを直接測定する。基質から遊離したフェノー
ル系化合物が基質とほぼ同じスペクトル吸収を示す場合
には、該フェノール化合物を呈色試薬、例えば4−アミ
ノアンチピリンなどの色原体と過酸化水素とをペルオキ
シダーゼの存在下に酸化縮合させ、その発色強度を測定
する。
フェノール系化合物の測定方法としては、’a −アミ
ラーゼの反応を連続的に追跡するレート法又は一定時間
反応させた後、反応を止めて測定するエンドポイント法
のいずれもが使用されうる。
ラーゼの反応を連続的に追跡するレート法又は一定時間
反応させた後、反応を止めて測定するエンドポイント法
のいずれもが使用されうる。
本発明方法における酵素反応時には、グルコアミラーゼ
はα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを有する。ただ
し、α−グルコシダーゼがマルトトリオシト以下の低分
子グリコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド
以上のグルコシドには作用しにくいのに対して、グルコ
アミラーゼはマルトテトラオシド以上のグルコシドにも
作用する。例えば、基質としてマルトヘプタオシド以上
の高分子グルコシドを用いると、α−アミラーゼの作用
によりマルトテトラオシド以上のグルコシドが生成する
ことがある。このようなマルトテトラオシド以上のグル
コシドは、α−グルコシダーゼでは分解されにくいが、
グルコアミラーゼを用いるとグルツース単位にまで容易
に分解される。
はα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを有する。ただ
し、α−グルコシダーゼがマルトトリオシト以下の低分
子グリコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド
以上のグルコシドには作用しにくいのに対して、グルコ
アミラーゼはマルトテトラオシド以上のグルコシドにも
作用する。例えば、基質としてマルトヘプタオシド以上
の高分子グルコシドを用いると、α−アミラーゼの作用
によりマルトテトラオシド以上のグルコシドが生成する
ことがある。このようなマルトテトラオシド以上のグル
コシドは、α−グルコシダーゼでは分解されにくいが、
グルコアミラーゼを用いるとグルツース単位にまで容易
に分解される。
そのため測定系の感度が上昇する。α−グルコシダーゼ
およびグルコアミラーゼを共存させた追随酵素系が好適
に利用される。
およびグルコアミラーゼを共存させた追随酵素系が好適
に利用される。
本発明方法によれば非還元性末端グルコースの4位およ
び6位のOR基が修飾されたα−又はβ−マルトオリゴ
シトを基質として利用するため、α−グルコシダーゼや
グルコアミラーゼなどの追随酵素系と基質を一液化した
試薬を調製、保存してもこれらの酵素が基質を分解する
ことがほとんどない。そのため、試薬ブランク値の上昇
が抑制され、精度よくα−アミラーゼ活性を測定するこ
とができる。
び6位のOR基が修飾されたα−又はβ−マルトオリゴ
シトを基質として利用するため、α−グルコシダーゼや
グルコアミラーゼなどの追随酵素系と基質を一液化した
試薬を調製、保存してもこれらの酵素が基質を分解する
ことがほとんどない。そのため、試薬ブランク値の上昇
が抑制され、精度よくα−アミラーゼ活性を測定するこ
とができる。
本発明の基質は、式(I)で示される化合物のR1およ
びR2が水溶性基であり、水に対する溶解性が優れてい
る。また合成が容易であるため安価に提供され得る。本
発明方法は自動分析機を用いての連続測定も可能であり
、簡便かつ安価にα−アミラーゼ活性の測定がなされう
る。
びR2が水溶性基であり、水に対する溶解性が優れてい
る。また合成が容易であるため安価に提供され得る。本
発明方法は自動分析機を用いての連続測定も可能であり
、簡便かつ安価にα−アミラーゼ活性の測定がなされう
る。
(実施例)
以下に本発明を実施例で説明する。
実施例1および比較例1−1〜1−2
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(pH’7.0)α−グルコ
シダーゼ 80ルー β−グルコシダーゼ lO坂− 基質(表1参照) 2 mM試薬調製直後、
10分後、20分後および30分後にこの試薬の400
nmにおける吸光度を測定した(試薬3m137°C
)。吸光度の変化(ブランク値の経時変化)を表1に示
す。
シダーゼ 80ルー β−グルコシダーゼ lO坂− 基質(表1参照) 2 mM試薬調製直後、
10分後、20分後および30分後にこの試薬の400
nmにおける吸光度を測定した(試薬3m137°C
)。吸光度の変化(ブランク値の経時変化)を表1に示
す。
表 1
表1から、本発明方法に用いられる非還元性末端が修飾
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
aomuグツドバッファー(I)H’7.0)α−グル
コシダーゼ aoU廓 グルコアミラーゼ 10麹 基質(表2参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例1と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬3−を試料血清50μl に添加し、37℃にて
5〜6分間放置した後、400nmにおける吸光度の変
化を測定し、1分間あたりの吸光度の変化(アミラーゼ
活性の指標となる)を算出した。試薬ブランク値の経時
変化および1分間あたりの吸光度の変化を表2に示す。
コシダーゼ aoU廓 グルコアミラーゼ 10麹 基質(表2参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例1と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬3−を試料血清50μl に添加し、37℃にて
5〜6分間放置した後、400nmにおける吸光度の変
化を測定し、1分間あたりの吸光度の変化(アミラーゼ
活性の指標となる)を算出した。試薬ブランク値の経時
変化および1分間あたりの吸光度の変化を表2に示す。
一夾!二」−
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(pH7,0)α−グルコシ
ダーゼ 80ルー 基質(表2参照) z mMこの試薬を用い
、実施例11−1と同様に操作を繰り返した。その結果
を表2に示す。
ダーゼ 80ルー 基質(表2参照) z mMこの試薬を用い
、実施例11−1と同様に操作を繰り返した。その結果
を表2に示す。
比較例2
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(pI−17,0)α−グル
コシダーゼ 800廓 グルコアミラーゼ l OU/1基質(表2参照
) 2 mMこの試薬を用い、実施例3−1
と同様に操作を繰りかえした。その結果を表2に示す。
コシダーゼ 800廓 グルコアミラーゼ l OU/1基質(表2参照
) 2 mMこの試薬を用い、実施例3−1
と同様に操作を繰りかえした。その結果を表2に示す。
表2から、本発明試薬(実施例!−1,3−2)は非還
元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比較
例3)に比べてブランク値が低く、その経時的上昇の度
合も極めて小さい。実施例3−1においてはグルコアミ
ラーゼが試薬中に含有されているため、実施例3−2に
比べて測定感度が高くなっているのが確認される。
元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比較
例3)に比べてブランク値が低く、その経時的上昇の度
合も極めて小さい。実施例3−1においてはグルコアミ
ラーゼが試薬中に含有されているため、実施例3−2に
比べて測定感度が高くなっているのが確認される。
実施例8−1〜8−3.および比較例3下記組成の試薬
を調製した。
を調製した。
試薬組成:
50mMP工PICSバッファー(m 7.0)α−グ
ルコシダーゼ 80U〜 基質(表3参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例t−1と同様に操作を繰りかえした。その結果
を表3に示す。
ルコシダーゼ 80U〜 基質(表3参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例t−1と同様に操作を繰りかえした。その結果
を表3に示す。
表3から、本発明試薬(実施例δ−1〜8−3)は、非
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比
較例8)に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比
較例8)に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。
実施側番および比較例4−1〜4−2
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(pi(7,0)α−グルコ
シダーゼ 80U廓 β−グルコシダーゼ l OU/j基質(表3参照
) 2 mM試薬調製直後、10分後、11
0分後および30分後にこの試薬の400 nmにおけ
る吸光度を測定した(試薬3mg+37°C)。吸光度
の変化(ブランク値の経時変化)を表4に示す。
シダーゼ 80U廓 β−グルコシダーゼ l OU/j基質(表3参照
) 2 mM試薬調製直後、10分後、11
0分後および30分後にこの試薬の400 nmにおけ
る吸光度を測定した(試薬3mg+37°C)。吸光度
の変化(ブランク値の経時変化)を表4に示す。
表4から、本発明方法に用いられる非還元性末端が修飾
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。
’!i二り
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(pH7,0)α−グルコシ
ダーゼ 80 tT/sZグルコアミラーゼ
10ルー 基質(表4参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例1と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬3−を試料血清50μlに添加し、37°Cにて
5〜6分間放置した後、400 mmにおける吸光度の
変化を測定し、1分間あたりの吸光度の変化(アミラー
ゼ活性の指標となる)を算出した。試薬ブランク値の経
時変化および1分間あたりの吸光度の変化を表5に示す
。
ダーゼ 80 tT/sZグルコアミラーゼ
10ルー 基質(表4参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例1と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬3−を試料血清50μlに添加し、37°Cにて
5〜6分間放置した後、400 mmにおける吸光度の
変化を測定し、1分間あたりの吸光度の変化(アミラー
ゼ活性の指標となる)を算出した。試薬ブランク値の経
時変化および1分間あたりの吸光度の変化を表5に示す
。
遺」E皿ノー二主
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成;
50mMグツドバッファー(pH7,0)α−グルフシ
ダーゼ 80 TJ/を基質(表5参照)
2 mMこの試薬を用い、実施例!−1と同様に操
作を繰り返した。その結果を表5に示す0 比較例6 下記組成の試薬を調製した。
ダーゼ 80 TJ/を基質(表5参照)
2 mMこの試薬を用い、実施例!−1と同様に操
作を繰り返した。その結果を表5に示す0 比較例6 下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMグツドバッファー(田7.0)α−グルコシダ
ーゼ 80麹 。
ーゼ 80麹 。
グルコアミラーゼ 10欧−
基質(表4参照) 2 mMこの試薬を用い
、実施例!−1と同様に操作を繰り返した。その結果を
表5に示す。
、実施例!−1と同様に操作を繰り返した。その結果を
表5に示す。
表5から、本発明試薬(実施例5−1〜Is−2)は、
非還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(
比較例S)に比べてブランク値が低く、その経時的な上
昇の度合も極めて小さい。実施例6−1においてはグル
コアミラーゼが試薬中に含有されるため、実施例6−2
に比べて、測定感度が高くなっているのが確認される。
非還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(
比較例S)に比べてブランク値が低く、その経時的な上
昇の度合も極めて小さい。実施例6−1においてはグル
コアミラーゼが試薬中に含有されるため、実施例6−2
に比べて、測定感度が高くなっているのが確認される。
下記組成の試薬を調製した。
試薬組成:
50mMP工PIOSバッファー(田7.0)α−グル
コシダーゼ 80ン讐 基質(表6参照) 2mM この試薬を用い、実施例z−1と同様に操作を繰りかえ
した。その結果を表6に示す。
コシダーゼ 80ン讐 基質(表6参照) 2mM この試薬を用い、実施例z−1と同様に操作を繰りかえ
した。その結果を表6に示す。
表6から、本発明試薬(実施例6−1〜6−8)は、非
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比
較例6)に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬(比
較例6)に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。
、 (発明の効果)
本発明によれば、このように、特定の構造を有するα−
フェニルマルトオリゴシドを基質として簡便かつ精度良
くα−アミラーゼの測定が行われる。本発明に使用され
る基質は、水溶性が高く、追随酵素による分解を受けな
いのでα−アミラーゼの測定が安定して、精度高く測定
できる。本発明方法を用いた体液中のα−アミラーゼの
測定は、各種疾患の診断などに利用されうる。
フェニルマルトオリゴシドを基質として簡便かつ精度良
くα−アミラーゼの測定が行われる。本発明に使用され
る基質は、水溶性が高く、追随酵素による分解を受けな
いのでα−アミラーゼの測定が安定して、精度高く測定
できる。本発明方法を用いた体液中のα−アミラーゼの
測定は、各種疾患の診断などに利用されうる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 非還元性末端グルコースの4位および6位のヒドロキシ
ル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドおよび
/または非還元性末端グルコースの4位および6位のヒ
ドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリゴシ
ドである次式( I )で示される基質に、α−グルコシ
ダーゼおよび/またはグルコアミラーゼおよび必要によ
りβ−グルコシダーゼの共存下でα−アミラーゼ含有試
料を作用させ、遊離するフェノール系化合物を測定する
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。 ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、R_1およびR_2の少なくとも一方は水酸基
、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数1〜
6の置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、
又はスルホン酸基を有する置換フェニル基を示し、残さ
れた基は水素、炭素数1〜6のアルキル基あるいはフェ
ニル基を示す。R_3は置換又は未置換のフェニル基を
示す。n=1〜8である。)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11989187A JPH0779718B2 (ja) | 1987-05-15 | 1987-05-15 | α−アミラ−ゼの活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11989187A JPH0779718B2 (ja) | 1987-05-15 | 1987-05-15 | α−アミラ−ゼの活性測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63283599A true JPS63283599A (ja) | 1988-11-21 |
JPH0779718B2 JPH0779718B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=14772786
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11989187A Expired - Lifetime JPH0779718B2 (ja) | 1987-05-15 | 1987-05-15 | α−アミラ−ゼの活性測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0779718B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0319993A2 (en) * | 1987-12-11 | 1989-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Maltooligosaccharide derivatives and reagents for determination of amylase activity |
-
1987
- 1987-05-15 JP JP11989187A patent/JPH0779718B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0319993A2 (en) * | 1987-12-11 | 1989-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Maltooligosaccharide derivatives and reagents for determination of amylase activity |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0779718B2 (ja) | 1995-08-30 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
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