JPS62258326A - ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は無細胞ワクチンを得ることを目的とするボルデ
テラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法の改良に関する。

ボルデテラ属細菌たとえば百日咳菌（ボルデテラ・パー
タッシス　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐａｒｔｕｓｉｓ）
、パラ百日咳菌（ボルデテラ・バラパータッシスＢｏｒ
ｄａｔｅｌｌａ　ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）及び気管
支敗血症菌（ボルデテラ・ブロンキセブチカ　Ｂｏｒｄ
ｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の培養によ
り、Ｆ−ＨＡ　（線状血液凝集素　Ｆｉｌａｍｅｎｔｏ
ｕｓ　Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を産生じ得ること
は公知である二また百日咳菌の培養により蛋白質外毒素
：パータッシス毒素（ＬＰＦ又はＬＰＦ−ＨＡ（白血球
増多症促進因千−血液凝集素：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉ
ｓ　　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｈａｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ）とも呼ばれる〕も生ずる。

ボルデテラ属細菌は公知の病原菌である。とくに百日咳
菌は百日咳の病原菌であることまたその工業的培養が百
日咳ワクチンの産生に利用されていることは公知である
。

また、パータッシス毒素抗原及びＦ−ＨＡが無細胞の百
日咳ワクチンの組成物中で有利に使用得ることも公知で
ある。

パータッシス毒素の精製は一般にアフィニティー・クロ
マ・トゲラフイーによる精製工程を包含している。

アフィニティー・クロマトグラフィーの担体からのパー
タッシス毒素の溶出は、一般に、高濃度の塩及び／又は
カオトロピック薬剤又は変性剤たとえば塩化マグネシウ
ム、尿素、チオシアン酸ナトリウム又はカリウム、グア
ニジン塩酸塩などを含んでいるＦｉ衝液によって行なわ
れる。しかしながら、これらの物質の存在下において得
られた有効成分はそのままではワクチンの調製に利用で
きない。従って毒素含有溶出液について、更にカオトロ
ピック薬剤の完全な除去及び／又は塩濃度の低減を目的
とする補足的工程を行わなければならない。この補足的
工程はたとえば徹底的な透析又はゲルによる濾過を行う
ことからなる（たとえば米国特許第４５００６３９号明
細書及び欧州特許出願第０１４０３８６号明細書参照）
。

そのほかにこれらの溶出方法の利用には一般に有効成分
の部分的かつ非可逆的な不溶化が伴なう。

本発明は特殊な緩衝溶液を利用するパータッシス毒素の
精製に関する。この特殊な緩衝液の利用により、アフィ
ニティー・クロマトグラフィー担体からパータッシス毒
素を溶出させ得る。該緩衝液を利用することにより単一
の工程でかつ高い収率でパータッシス毒素を溶出させ、
従ってまた精製し得る。更に、上記１１１衝液に界面活
性剤を添加したものを利用することにより、パータッシ
ス毒素及びＦ−）ＩＡの損失を伴うことなしに、これら
を可溶化ができる。この緩衝液はまたパータッシス毒素
の無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法において
溶媒の役割を果し、アナトキシンを溶液中に維持するこ
ともできる。

そのほか、通常用いられ゛る緩衝液とは異なって、本発
明の特殊な緩衝液はワクチン製剤と両立できる。換言す
ればこの緩衝液中に溶解している抗原は直接にワクチン
調製に利用できる。

従って本発明はボルデテラ属細菌のパータッシス毒素及
びＦ−ＨＡの精製、可溶化及び／又は無毒化するにあた
り、ｐＨ８，３乃至１１．６の炭酸塩緩衝液を使用する
方法を提供することを目的とする。この種の緩衝液は従
来の方法、たとえばアルカリ金属（アルカリ金属はナト
リウム又はカリウムである）の重炭酸塩（炭酸水素塩）
と炭酸塩との混合物の水溶液を調製するか又はアルカリ
金属（ナトリウム又はカリウム）水酸化物の水溶液とア
ルカリ金属炭酸水素塩の水溶液との混合により調製し得
る。

炭酸塩緩衝液のモル濃度は０．０２５〜０．５Ｍである
こと、またｐＨは８．３乃至１１．６であることが望ま
しい。

本発明により用いられる炭酸塩緩衝液はそのほか界面活
性剤たとえばトウィーン８０　（Ｔｗｅｅｎ８０１ポリ
オキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタンの商
品名）のごとき非イオン系界面活性剤を含むことができ
る。

一般的には、沈澱又は凍結乾燥品の形をしている生成物
（パータッシス毒素又はＦ−ＨＡ）を可溶化するために
は、必要ならば、界面活性剤を含んでいる緩衝液を用い
ることが望ましい。その場合、緩衝液中の界面活性剤の
濃度は通常、１重量％未満、多くの場合、０．５重量％
未満である。パータッシス毒素の溶出に関しては界面活
性剤を含有していない炭酸塩緩衝液を用いることが望ま
しい。

本発明に従って炭酸塩緩衝液を使用することにより以下
に述べるとおりの利点が得られる。

炭酸塩Ｎｉ街液はアフィニティー・クロマトグラフィー
担体からパータッシス毒素を溶出させることができる。

クロマトグラフィーにかける液体はボルデテラ属細菌培
地の上澄液でもパータッシス毒素が冨化されているフラ
クションでもよい。

無細胞ワクチンにおいてパータッシス毒素を使用する場
合には、予め無毒化処理たとえばホルモール又はグルタ
ルアルデヒドを用いる処理を行う必要があることは公知
である。無毒化はとくにマウスのリンパ球増多症導入の
効果、ヒスタミンに対する鋭敏化、へＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼ活性、ＣＩＯ（チャイニースハムスタ
卵巣）細胞に及ぼす細胞病原効果などを排除することを
目的とする。

この種の無毒化たとえばホルモールによる無毒化は毒素
を不溶化し、これが均質な精製された調剤の取得を困難
にする（たとえば米国特許第４４５５２９７号明細書参
照）。

炭酸塩緩衝液、場合により界面活性剤を添加したものを
使用することにより、溶液中での無毒化処理の実施及び
得られたアナトキシンを溶液中に維持することが可能に
なる。

最後に前述のとおりアナト・キシン・パータッシスの炭
酸塩緩衝液中の溶液は、直接、無細胞ワクチンの調製に
使用できる。

更に、炭酸塩１１衝液（場合によってはたとえばトウィ
ーン８０のごとき非イオン系界面活性剤を添加したもの
）はＦ−ＨＡを溶液とするのに有利に作用する。

本発明はまたボルデテラ属細菌の培地中で生成した蛋白
質抗原の精製方法も目的とする；この方法は培地上澄液
又はパータッシス毒素が冨化されているフラクションを
、パータッシス毒素を固定し得るクロマトグラフィー固
体担体と接触させ次に毒素を該固体担体からｐＨ　８．
３乃至１１．６の炭酸塩緩衝液によって溶出し、所望な
らば溶出液に無毒化処理を施こすことを特徴とする特 殊に実施形式においては、ｐＨを６乃至８望ましくは７
に調節した後に、培地上澄液を又はパータッシス毒素が
冨化されているフラクションを、パータッシス毒素に対
して親和力のあるグリコプロティンとくに、アシアロ−
グリコプロティン（たとえばアシアロフェチュイン）を
固体クロマトグラフィー担体に結合したものと接触させ
る。

使用するクロマトグラフィー担体の量は出発溶液の容積
及び／又は精製すべきフラクション中のパータッシス毒
素の濃度によって変動する。接触は２乃至３０℃のカラ
ム内温度において行なわれる。

パータッシス毒素に対して親和力のあるグリコプロティ
ンは公知である：たとえばハブトグロヒ：ン、フェチュ
インなどがあげられる。しかしながら、アフィニティー
・クロマトグラフィーを予め脱シアル酸（ｄｅｓｉａｌ
ｙｌａｔｉｏｎ）処理を施こしたこれらの蛋白質に行な
うことが好ましい；この脱シアル酸処理は公知の方法に
従って穏和な酸性加水゛分解によって行なわれる（たと
えば５ｐｉｒｏほか、Ｊ、Ｂｉｏｌ　ｃｈｅｍ、１９７
４，２旦、５７０４−５７１７参照）。

グリコプロティン又は脱シアル酸処理したグリコプロテ
ィン（アシアログリコプロティン）の結合（ｃｏｕｐ　
１　ｉｎｇ）は公知の方法に従って行なうことかできる
。担体はアフィニティー・クロマトグラフィーにおいて
通常用いられる、従来の任意の固体担体であることがで
きる。

担体はとくにセルロース説導体、架橋デキストラン、ア
ガロース・ゲル又はセファロース４Ｂ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　−４８）などの多糖類（ｐｏｌｙｏｓｉｄｉｑｕ
ｅ）訪導体又はＩＢＦ社（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｑｕｅ　Ｆｒａｎ　−ｃａｉｓｅ）から市販の
トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）などのアクリル
誘導体基質の担体である。

グリコプロティンはたとえばＣＮＢｒで活性化された担
体を用いて担体上に固定できる。

担体はまた架橋ＤＥＡＥデキストランで被覆した多孔質
シリカ担体であり得る。たとえばＤＥＡＥデキストラン
で被覆したスフェロシル（Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ）が使用
できる。

本発明の方法において用いられる炭酸塩Ｍ液液はモル濃
度０．０２５乃至０．５　Ｍ、　ｐＨ８，３乃至１１．
６の緩衝液であることが望ましい。

溶出後、パータッシス毒素はたとえば飽和の５０−１３
０％の硫酸アンモニウムにより沈澱させるか又は直接に
無毒化工程で処理することができる。

かくして精製した毒素は硫酸アンモモニウムを用いて生
成させた沈澱又は凍結乾燥品の形で保存できる。沈澱又
は凍結乾燥品はトウィーン８０のととぎ界面活性剤を約
０．０５−０．５％の最終濃度で含有し得る、ｐＨ８，
３乃至１１．６のかつモル濃度が２５ｍＭを超える炭酸
塩緩衝液、望ましくはトウィーン８０を０．０５％含有
する、ｐＨ９，８，１００ｍＭの炭酸塩ｍ衝液（以下緩
衝液ＣＴＷという）に溶解させることができる。

残存硫酸アンモニウム又は凍結乾燥担体を除去する目的
で、温度２乃至３０℃の数倍の容積の同じｌ！街衝液対
して、溶液の透析を４乃至７２時間の持続時間の間行な
う。緩衝液の組成により完全な可溶化ができる。溶液は
孔径０．２２戸の膜で濾過できる。これにより、無菌環
境中での無毒化工程又は有効成分の完全な可溶化が必要
であるか又はこれを容易にする化学的又は生物学的実験
の実施を行うことを可能にするという利点が得られる。

パータッシス毒素の無毒化が行なわれる場合には、一般
に毒素について用いられる方法と同様にして行なわれる
。本発明の別の態様によれば、無毒化の方法は上述した
とおりの炭酸塩緩衝液であって、望ましくは、毒素の可
溶化と無毒化工程の実施中、該毒素を溶液中に維持する
こととに有利に作用する界面活性剤を含有する炭酸塩緩
衝液中において行なわれる。かくして無毒化工程の収率
は１００％に近いものとなる。用いられる無毒化剤はた
とえばホルモール又はグルタルアルデヒドである。

たとえば温度４乃至４０℃において行なわれ得る無毒化
の後に、痕跡の無毒化剤の全てを除去する目的で、アナ
トキシン含有溶液を緩衝液ＣＴＷに対して透析にかける
ことができる、かくして得られたアナトキシンは溶液中
に残留し、孔径０，２２賜の滅菌膜で濾過でき、かくし
てワクチン製剤に包含させることができるものとなる。

上記のとおり、本発明において使用するための炭酸塩緩
衝液はボルデテラ属細菌の培地上澄液から単離される別
の蛋白質：　Ｆ−ＨＡの完全な可溶化を可能にする。Ｆ
−ＨＡの可溶化工程における該緩衝液の使用により、パ
ータッシス毒素の場合について述べた種々の利点、すな
わちとくに有効成分を損失することなしに０．０２戸膜
での滅菌濾過工程に着手し得るという利点が得られる。

この形でのＦ−ＨＡは直接にワクチン剤中に包含させる
ことができる。

たとえば硫酸アンモニムによる沈澱の形で保存されたＦ
−ＨＡはパータッシス毒素について前述した方法に従っ
て再溶解される。沈澱を遠心分離し、緩衝？１！ｉｃｒ
ｗに溶解し、室温又は４−８℃で４乃至７２時間透析す
る。緩衝液ＣＴＷは完全にＦ−ＨＡを可溶化できる。

本発明はまたアナトキシン　パータッシス及びＦ−）Ｉ
Ａから選ばれた有効成分の少なくとも１種を含みかつ該
有効成分が上記のとおりの炭酸塩緩衝液とくに緩衝液Ｃ
ＴＷのごとき、赤面活性剤を含有する炭酸塩緩衝液中に
溶解されている無細胞百日咳ワクチンにも関する。

アナトキシン　パータッシス及びＦ−ＨＡは炭酸塩緩衝
液中の溶液として直接ワクチン製剤中に包含させること
ができる。ワクチンはアナトキシンを単独で又はアナト
キシンとＦ−ＨＡとの所望の比率の混合物として含有で
きる。ワクチンの最終ｐＨ値を７乃至８に修正する目的
で緩衝生理学的食塩水（緩衝液ＰＢＳ）若干量を濃酸溶
液で酸性としたものを添加する。添加量は製剤中に存在
している炭酸塩緩衝液の量及びモル濃度により変動する
。

その場合、有効成分の濃度は必要量の緩衝液ＴＢＳを添
加して所望値に修正する。この段階において混合物に他
の抗原（ジフテリア抗原、破傷風抗原、小児麻痺抗原、
血有病抗原など）、メチルチオラート又はフェノキシエ
タノールのごとき防腐剤及びアルミナゲル又は燐酸カル
シウムのごとき添加物を加えることができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ アフィニティー・クロマトグラフィーによるパータッシ
ス毒素の精製 ａ）　パータッシス毒素のアフィニティー担体への吸着 ３０ｊ２醗酵槽中で培養した百日咳菌フェーズＩの細菌
稈屑液の遠心分離及び？Ｑ縮後に得られたパータッシス
毒素富化フラクションを、流量６　ｍ１２／　ｃｎｆ　
／時間で、アシアロフェチュインと結合させた５ｐｈｅ
ｐｈａｒｏｒｅ　４　Ｂクロマトグラフィー担体１２０
ｍ１ｌ収容している直径４ｃｍのカラム上へ通送した。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂは下記のようにしてアジア
はフェチュインと結合した： ＣＮＢｒで活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）３０ｇを１ｍＭ　　Ｈ（、ｆ！
、６ｆ！、中で約１５分間膨潤させた。ゲルは続いて１
ｍＭ　　ＨＣｆＬ　　６ＪＺで３回洗浄した。アシアロ
フェチュイン１ｍｇ／ｍｕ、ＮａＨＣＯ３０，Ｉ　Ｍ及
びＮａＣ１０，５Ｍを含んでいる溶液４００　＋ｎ５１
をゲルに添加した。

この混合物を＋４℃において穏和に攪拌しながら１夜間
反応させた。エタノールアミン５Ｍ溶液（ｐＨ８，０）
　　１２５ｍＭを混合物に加えた。室温に４時間保った
後、ゲルを順次、ＮａＣＩＬ　ＩＭを含有する０、１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）ｓ　ｏ　ｏ　＋ｎ
Ｒ１次にＮａＣｕ　　ＩＭを含有するｓｏｍｕトリス−
ＨＣＪ２緩衝？ｆＬ（ｐＨ７，５）　　５００　ｍｕで
洗浄した。この洗浄サイクルを３回反復した。

引続いてゲルを　１／１００００　（ｗ／ｖ）の７震度
のマージオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）のごとき
防腐剤の存在下で５０ｍＭトリス−ＨＣｆ１緩衝ン夜（
ｐＨ７，５）　　５００叔で３回洗浄した。

アフィニティー・クロマトグラフィーにおいて結合剤と
して用いるアシアルフェチュインは下記のようにして調
製した： フェチュイン（Ｓｉｇｍａ社フェチュインＩＩＩ型）の
水溶液をＯ，［］５Ｎ　　Ｈ２５０４により８０℃にお
いて１時間加水分解した。加水分解後、遊離シアル酸を
除去する目的で溶液を複数の蒸溜水浴に対して＋４℃に
おいて２４時間透析した。アシアロフェチュイン溶液は
排除限界が（Ｓｅｕｉｌ　ｄｅ　ｃｏｕｐｕｒｅ）が１
００００に等しい膜を備えた限外濾過により濃縮するこ
とができた。

シアル酸の除去は加水分解の前又は後の蛋白質上のシア
ル酸の特殊比色定量により検査した。

ｂ）　パータッシス毒素の溶出 ゲルをカラムの２倍の容積の５０ｍＭトリス−１１１緩
衝液（ｐ）ｌ　７．５）を用いて、すなわち２７８ｎｍ
の紫外線吸収が全く消失するまで洗浄し、次にカラムと
同容積のＩＭ　　ＮａＣρ含有の５０ｍＭ１−リスーＨ
Ｃｌ緩；ｊ液（ｐＨ７，５）で洗浄した。パータッシス
毒素は１００ｍＭ炭酸塩Ｍ街液（ｐＨ９，６）４ｏｏｍ
Ｒで溶出した。

炭酸塩緩衝液は下記のようにして調製した：０．１　　
Ｍ　　ＮａＨＣＯ３溶（夜５　ｏａｍｆｔ　に（１，Ｉ
　　Ｍ　　Ｎａ２　　ＣＱ３溶ン夜を最終ｐＨ９，６と
なるまで添カロした：　Ｎａ２　ＣＯ３Ｏ３溶液約２５
０奢Ａえることになる。

かくして得られた炭酸塩緩衝液を孔径０．２２ｇ゛ｍの
膜で濾過し、＋４℃で保存する。

カラム出口で集めたフラクションの光学的濃度及び赤血
球凝集活性を測定した。

有効成分含有フラクションすなわちコレステロールによ
り抑止されない強い赤血球凝集活性を有するものを集め
た。

パータッシス毒素は引き続いて最終濃度が飽和の７０％
に相当する硫酸アンモニウムにより沈澱させた。

かくして精製したパータッシス毒素は強いリンパ球増多
症を誘発し、マウス１匹あたり０．０４μｇの用薬量で
マウスＣＦＷをヒスタミンに対して鋭敏化させた。Ｃ）
ＩＱ細胞上にクラスター生成を誘発する毒素の性能は６
５０００乃至２ｅ０００ｏｃＰｕ、／μｇ程度の比活性
により特徴づけられる。

物理−化学的検査及び生物学活性（偶発的汚染物質、Ｄ
ＮＡ　、　ＲＮＡ　、糖類の比色法定量；内毒素比率の
定量：ＳＤＳ媒体中又は酸性媒体中の電気泳動なと）の
結果は、高度に精製された有効成分を含んでいる均質な
最終製剤に有利であることを示した。

初めの培地上澄液中及び最終沈澱中のパータッシス毒素
含有量の分析結果は９０％を超える精製収率を示した。

哀ＡＪユ 種々の緩衝液中のパータッシス毒素の溶解及びその後の
滅菌濾過の比較試験。

硫酸アンモニウムによる沈澱の形のパータッシス毒素を
２．６ｍｇ／ｍｕ含有する懸濁液１．２＋ｎＲを採取し
、１００００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離した。上澄液
を除き、残漬を＆１衝液ＣＴＷ４ＩＩＩ５１に溶解し、
同じ緩衝液に対して透析した。毒素溶液を孔径０．２２
戸の膜で濾過した。濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃厚
をロウリー（Ｌｏｗｒｙ）法の従った定量法により測定
した。測定結果は濾過収率（濾過後の毒素の濃度／濾過
前の毒素の濃度）Ｘ１００；又は緩衝液ＣＴＷ中の濾過
収率を任意に１００％としこれに対して算出した相対的
百分率で表わした。

結果を下表に示す： 表　　　！ 各種ｉＪｔ衝液中のパータッシス毒素の濾過収率の比較
試験 部品名 医１己１ユ パータッシス毒素の無毒化の例 ａ）　ホルモールによる無毒ヒ 硫酸アンモニウムによる沈澱の形のパータッシス毒素５
ｍｇ／ｍ５１の懸濁液２ｍ５１（すなわちパータッシス
毒素１０ｍｇ）を１００００　ｘ　ｇで１５分間遠心分
離した。上澄液を除き、残漬をｉ液液ｃＴｗｔｏｍＲに
溶解した。

溶液を緩衝液（：ＴＷ２Ｉｌに対して＋４℃において一
夜透析した。透析の終りに溶液を孔径０．２２−の膜で
濾過した。濾液についてＬｏｗｒｙの方法に従って蛋白
質定量を行ない緩衝液ＣＴＷを加えて蛋白質濃度を０　
、４　ｍｇ／ｍ１ｌｌとした。ｏ、４ｍｇ／ｒ＋ｄＪの
毒素溶液２３ＩＩＩＱに、緩衝液ＣＴＷ中のりシンの１
Ｍ溶液１．２２−及びホルモールの３７％溶液０．２６
５　ｍｕを加えた。たとえば２１時間４℃に保持した。

引続いて痕跡のホルモールの全てを除去する目的で反応
混合物を緩衝液ＣＴＷに対して、＋４℃において４８時
間透析した。引続いてアナトキシンを孔径０．２２戸の
膜で滅菌濾過した。この形でアナトキシン・パータッシ
スをワクチン製剤中に包含させることができる。

ｂ）　グルタルアルデヒドによる無毒化緩衝（Ｗ、ＣＴ
Ｗ中のパータッシス毒素５００　Ｂ／　ｍｕの溶液１５
ｍ１ｌを前述のとおり調製した。グルタルアルデヒド０
．１０％を含む緩衝液ＣＴＷＳｍ文を毒素溶液に加えた
。

無毒化は＋４℃乃至４０℃の種々の温度で実施できる；
グルタルアルデヒドの存在下における毒素の保温時間は
温度によって変動する。たとえば混合物を＋４℃に４８
時間保持することができる。

保温後に緩衝液ＣＴＷ中のりシンのＩＭ溶液１８０μｍ
を混合物に加え溶液を緩衝液ＣＴＷに対して４℃におい
て４８時間透析した。透析後にアナトキシンパータッシ
スを孔径０．２２μｍの膜で濾過した。この形でアナト
キシンをワクチン製剤中に配合することができる。

夫五■ユ 炭酸塩緩衝液によるＦ−ＨＡの可溶化の例この実施例で
使用するＦ−ＨＡは、５ＡＴＯＹ−、Ｃ０ＷＥＬＪ、Ｊ
、、５ＡＴＯ）Ｉ、ＢＵＲ５ＴＹＮ　Ｄ、Ｇ、及びＭＡ
ＮＣＬＡＲＫ　Ｃ，Ｒ，。

“５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅｍａｇｇ−１ｕｔｉｎｉｎ
ｓ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｒｄｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
”　、Ｉｎｆｅｃｔ。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、、　　１９８３．　４　ｆ、　　
１．　３１３−３２０に記載の方法に従って調製した。

Ｆ−ＨＡは飽和の７０％の硫酸アンモニウムによる沈澱
の形で保存した。

ａ）硫酸アンモニウムによる沈澱の形のＦ−ＨＡｌ、２
ｍｇ／ｍＪｌの懸濁液２５ｍ９を３００００　ｘ　ｇで
２０分間遠心分離した。上澄液を除き、残渣を緩衝液Ｃ
ＴＷ３０ｍ文に溶解した。

溶液を緩衝液ＣＴＷに対して＋４℃において１夜間透析
した。溶液を孔径０．２２−の膜で濾過した。

Ｆ−）ＩＡはこの形でワクチン製剤に配合することがで
きる。

ｂ）　孔径０．２２戸の膜での滅菌濾過収率の比較試験 硫酸アンモニウムにより沈澱させたＦ−ＨＡの５゜８８
ｍｇ／ｍ１２懸濁液４５０μｕを採取し１００００　Ｘ
　ｇで１０分間遠心分離した。上澄液を除去した。

残漬を緩衝液３　ｍ５１に溶解し、同じ緩衝液に対して
透析した。Ｆ−ＨＡ溶液を孔径０．２２−の膜で濾過し
た。濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃度をＬｏｗｒｙに
よる定量法により測定し、結果を濾過収率（濾過後の濃
度／濾過前の濃度）Ｘ１００；又はＭ衝液ＣＴＷ中の濾
過収率を任意に１００％としてこれに対し算出した相対
的収率で表わした。

結果を下記表ＩＩに示す。

表　　　■Ｉ 各種緩衝液中のに溶液としたＦ−ＨＡの濾過収率の比較
試験 実施例５ 無細胞の百日咳ワクチンの調製 精製した抗原−アナトキシン　パータッシス及びＦ−Ｈ
Ａを含んでいる無細胞百日咳ワクチンは下記のようにし
て調製した： 緩衝液ＣＴＷ中に溶解した両抗原を別個に孔径０．２２
ＪＡＩ＋１の膜で濾過して滅菌し、たとえばＬｏｗｒｙ
の方法に従って比色定量によりそれらの濃度を測定した
。

有効成分をそれぞれ５０μｇ／ｎｄＪ含んでいる無細胞
百日咳ワクチン１ｆ１．を調製する目的で、無菌状態で
下記の溶液を混合した。

一１１！街液ＣＴＷ中のアナトキシン パータッシス０．３８　ｍｇ／織の溶液　　　１３２威
−緩衝液ＣＴＷ中のＦ−ＨＡ １　、１　ｍｇ／叔の溶液　　　　　　　　　　４６緘
−５０ｍＭ　　ＨＣｆＬ含有、緩衝生理学的食塩水（Ｐ
ＢＳ）　　　　　　　　　　２０２　ｍＱ−水酸化アル
ミニウム溶液 （＾ｘ　　ｔｏｍｇ／ｍＡ）　　　　　　　　　　　　
２０　ｍＮ−マージオレート１％（Ｗ／Ｖ） 含有ＰＢＳ　　　　　　　　　　　　　　　１０　ｒｒ
ｒ又−ＰＢＳを加えて　　　　　　　　　　　　１℃こ
のワクチン調剤は下記の諸特性を示したニー　アナトキ
シンパータッシス　　　５０μｇ／ｒｎＱ−Ｆ−ＨＡ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５０　μ　ｇ／ｍｕ−アル
ミニウム　　　　　　　　　２００μｓ／叔−ｐＨ７，
８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製、可溶化及び
   ／又は無毒化を行うにあたり、ｐＨ８．３乃至１１．６
   の炭酸塩緩衝液を使用することを特徴とする、ボルデテ
   ラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法。 ２、該炭酸緩衝液はアルカリ金属炭酸水素塩及び炭酸塩
   の混合物である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、炭酸塩緩衝液は０．０２５−０．５Ｍのモル濃度で
   ある、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、該緩衝液は更に、濃度１重量％未満の界面活性剤を
   含んでいる、特許請求の範囲第１項乃至第３項の何れか
   に記載の方法。 ５、ボルデテラ属細菌培地中で生成する蛋白質抗原を精
   製するにあたり、培地の上澄液又はパータッシス毒素に
   富むフラクションを、パータッシス毒素を固定し得るク
   ロマトグラフィー固体担体と接触させ、次に毒素を該固
   体担体から、ｐＨ８．３乃至１１．６の炭酸塩緩衝液に
   より溶出し、ついで所望ならば溶出液に無毒化処理を施
   こすことを特徴とする、ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原
   の精製方法。 ６、炭酸塩緩衝液は０．０２５Ｍ〜０．５Ｍのモル濃度
   である、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、ボルデテラ属細菌の培地で生成する蛋白質抗原を可
   溶化するにあたり、上記蛋白質抗原を沈澱又は凍結乾燥
   品の形で、１重量％未満の表面活性剤を添加した、ｐＨ
   ８．３乃至１１．６の炭酸塩緩衝液中で可溶化すること
   を特徴とする、ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化
   方法。 ８、パータッシス毒素を通常の無毒化剤により無毒化す
   るにあたり、上記無毒化をｐＨ８．３乃至１１．６の炭
   酸塩緩衝液中において行なうことを特徴とするパータッ
   シス毒素の無毒化法。 ９、アナトキシン・パータッシス及びＦ−ＨＡから選ば
   れた有効成分の少なくとも１種を含んでおりかつ該有効
   成分はｐＨ８．３乃至１１．６の炭酸塩緩衝液中に溶解
   して存在していることを特徴とする無細胞百日咳ワクチ
   ン。