JPH05503149A - ２光子レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２光子レーザ走査顕微鏡 発明の背景 この発明は、国立保健機関によって与えられた認可番号Ｐ４１ＲＲＯ４２２４、 国立科学財団によって与えられた認可番号Ｎ５Ｆ−ＢＢＳ−８７１４０６９およ びＮＳＦ−ＤＭＢ−８６０９０８４の政府援助によりなされたものである。政府 は本発明においである権利を有する。

フライイング・スポット・スキャナの原理は長い年月知られているにもかかわら ず、その顕微鏡における応用は、必要な技術の開発に伴ってここ２．３年活発に なされるようになっている。安定したレーザ光源および高速の電子画像認識・格 納技術は、走査顕微鏡にとって必須の要素である。非共焦走査顕微鏡の画像化特 性は、従来の顕微鏡のそれと極めてよく似ているにもかかわらず、新しい領域が 共焦点走査顕微鏡によって拓かれた。この種の装置によって得られる分解能は徐 々にしか向上していないが、それらによって得られる飛躍的に改良された深度分 解能は、複雑な逆たたみ込み演算の必要なしに３次元画像の生成を可能にした。

深度分解は、バックグラウンドを減少させ、このことは、ホトマルチプライヤ等 の単一高精度検出器の使用と相俟って高い空間分解能を伴った定量的研究を可能 とした。

共焦点走査顕微鏡の光軸に沿った分解能は、透明の目的物内において焦点面の上 下において発生する背景散乱又は蛍光に対抗する有用な識別を可能とする。それ は、また、一連の断面から３次元の蛍光画像を構築する場合や、定量的な蛍光イ ンジケータ（指示薬）の使用或は非平面表面のセル表面受容体の蛍光マーカのマ ツプ化にとって極めて有用である。この種の装置は僅かに良好な横方向分解能、 極めて優れた深度視野分解能および従来の装置で理想的な条件下で得られるより も倍率のオーダがより優れた理想的条件下でのバックグラウンド識別を与える。

走査は、静止ビームに対して試料ステージを移動させるか、照明と蛍光応答信号 の両方を高精度に同調させて光学走査のいずれかによって行われる。ステージの 移動方式が光学的観点からは好ましいが、サンプルの受入れおよび装填、収納容 器の使用および微細電極を用いた電気的記録に関する制限をもたらす。したがっ て、スポット移動方式が多くの場合好ましい。このような移動スポットは、ガル バノメータ・スキャナに装着したミラーの使用によって生成されるが、これは得 ることができるフレーム周波数を制限する。音響−光学デフレクタの使用は、そ の強い発散のゆえに蛍光顕微鏡における共焦点空間フィルタとの干渉を惹起する 。多角形ミラーはガルバノメータ・スキャナより高速であるが、それ単独では、 操作のベクトルモードが不可能である。

従来のアーク光源は、回転ディスク照明器を利用する共焦点走査顕微鏡の種々の 応用に用いることができるが、明らかに不可避な強度変動によって定量的な応用 のための使用は制限される。かかる装置において、画像は、ディスクの共焦ピン ホールの２者一体のセットを通して、或いは、最近の形式では、照明ピンホール それ自身を通して形成される。

レーザによって照明される単一点が移動する目的物を横切ワて走査される共焦点 走査顕微鏡は低走査速度において極めて良好に動作し、可視光を吸収・射出する 蛍光マーカを用いて優秀なレーザ走査顕微鏡が得られている。しかしながら、ス ペクトラムの紫外線部分によって励起される蛍光先回及び蛍光化学指示薬を有す る共焦走査画像は、色収差が補正されなければならず、吸収及び射出波長の両方 に対して透明でなければならない適当な顕微鏡用レンズがないために、そのうえ 、紫外光によって生きている細胞に対して加えられるダメージのゆえに、実用に 供されていない。さらに、紫外線レーザの諸種の制限が、上記の用途を困難なも のとしている。蛍光顕微鏡法は、明白なことであるが、目的物内の蛍光先回の光 漂白によってさらに制限される。なぜならば、励起光は、蛍光体を励起しながら 、蛍光先回を徐々に光漂白するからである。レーザ走査共焦蛍光顕微鏡法におい てさえ、結焦された励起光は焦点面を走査するに従って、ある時間平均では、目 的試料の全体の深さに亘って均一に照射するため、広視野顕微鏡において生ずる のと本質的に同様の光漂白が惹起される。光漂白は、多数の２次元画像が必要と され、各２次元画像の検出が試料全体の光漂白をもたらすために、３次元画像の 再構成においてとりわけ問題となる。

発明の概要 上記の各種の困難は、本発明によれば、レーザ走査顕微鏡法において蛍光体の２ 光子分子励起の使用によって克服される。本発明によれば、２光子励起は、（ａ ）直径で１ミクロン以下の散乱が制限されたくびれ状にレーザが結像されるレー ザ走査顕微鏡において可能な強力な結像作用によって与えられる極めて高く局所 的でかつ瞬間的な強度と、（ｂ）パルス化されたレーザの一時的な集中の組合に よって可能となる。コライディング・パルス、モード・ロック型ダイレーザ（ｄ ｙｅ　１ａｓｅｒ）のように、回折限界まで結像可能な高強度、長波長、単色光 源は、各パルスが約８０ＭＨｚの繰り返し率で約１００フエムト秒（１００×１ ０−１５秒）の期間を有するパルスの流れを生成する。これらのサブピコ秒のパ ルスは、例えば２色ミラーによって、顕微鏡に供給され、顕微鏡の対象面に位置 する試料もしくは目的物に指向される。回折限界まで結像されたごく短時間の強 力なパルスによって与えられる瞬間的な高いパワーのゆえに、目的物に含有され 通常は典型的には紫外線等の短い波長の高エネルギー単一光子によって励起され る蛍光先回（蛍光染料）がレーザ光源からの２つの長波長の光子を同時に吸収す る相当の確率が存在する。この吸収は、蛍光体分子内において２つの光子のエネ ルギーを結合し、それによって、蛍光体をその励起状態に遷移させる。蛍光体が 正規状態に戻ると、それは光を放出し、この光は顕微鏡の光学系を逆方向に通過 して適当な検出器に至る。

高強度短時間の光パルスによる蛍光体の２光子励起は、バックグラウンド判別の 改善、蛍光体の光漂白の減少を可能にし、かつ生きている細胞試料に対する光に よるダメージを最小化する顕微鏡のための一般的な蛍光技術を構成する。これは 、顕微鏡内において生成され結像化された照明は、試料内を通過する際収束円錐 をなすからである。収束円錐の頂点において焦点面に達する光の全ては、蛍光体 に吸収される僅かな部分を除いて、発散円錐となって試料の対向面側に出ていく 。収束する円錐と発散する円錐とによって形成されるくびれにおける対象面上の 焦点領域内においてのみ、強度は試料中の蛍光体内への２光子吸収を生成するに 十分なものとなり、この強度依存性（分布）は、長い波長の光をして、試料の焦 点の廻りのごく局折的な体積内においてのみ短波長による励起と同等の効果をも たらす。この吸収は試料の焦点領域外の部分の全体にわたって長波長光の軟らか な平均照明光強度を保持する比較的長波長の高速、高強度のフェムト秒のパルス 手段によって達成される。その結果、焦点面外の蛍光体の光漂白は殆どな（なる 。長波長光の１光子吸収は無視でき、焦点面外では、時間平均の照明が試料の全 深さに亘って実際上はぼ均一であったとしても、瞬間的な強度は相当の２光子吸 収・励起をもたらすには、あまりに低すぎる。この効果は、さらに、生きている 細胞へのダメージを大幅に減少させる。

本発明の２光子吸収は正確な空間的認識を可能とし、３次元的に位置が定められ た小さな体積から、蛍光の量子化を可能とし、したがって、前述した如き共焦点 レーザ走査顕微鏡において得られるものに匹敵する視野分解能の深度が得られる 。このことは、より厚い細胞層が研究されるべき場所にはとりわけ重要である、 さらに、２光子励起は、背景蛍光を大幅に減少させる。

上で議論した２光子吸収技術は、デミトリ　エイ・パーセンノボ−ロス等（Ｄｉ ｍｉｔｒｉ　Ａ−Ｐａｒｔｈｅｎｏｐｏｕｌｏｓｅｔ　ａｌ、）の“３次元光学 格納メモリー　（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　０ｐｔｉｃａｌ　Ｓｔ ｏｒａｇｅ　Ｍｅｍｏｒｙ）と題する論文：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖ ｏｌ、２４５、ｐａｇｅｓ　８４３−８４５、Ａｕｇｕｓｔ　２５．１９８９： に記述された型式の３次元光学メモリ装置において選択された場所を励起するた めにも使用可能である。本発明によれば、単一レーザ光源又は共軸多重光源から の比較的長い波長光の極めて短いが高強度のパルスが、走査顕微鏡を通して、高 分子組織内に埋込まれた結晶、組成物もしくは発光団の如き、ホトクロミック或 いは光分解可能な（ｐｈｏｔｏｌｙｚａｂｌｅ）蛍光物質である格納媒体内に指 向される。入射光ビームは組織内の多くの層のいずれか一つの上に高度に結像さ れ、かつその強度は、選択された層を横切って走査されるか或いは歩進されるか にしたがって変調される。ビームはビームによって表現されるコード化された情 報が媒体内において２値の形式で格納されるように、組織内において選択された 場所を励起する。高度に結像されたビームは、正確な格納に必要な空間的分解能 を与える。フェムト秒の高強度パルスは、通常は紫外線領域の光による励起を必 要とする物質内に情報を書込むために組織物賃内に２光子吸収を惹起させる。組 織内の書込まれた点の励起レベルは上記した分子内において蛍光を生成する長波 長の読取りレーザによって検出もしくは読取られる。

図面の簡単な説明 本発明の上記およびさらに別の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照した 実施例の以下の詳細な説明から明らかになるであろう： 第１図は本発明にしたがって実用化されたレーザ走査共焦顕微鏡の図式的な図で ある： 第１Ａ図は第１図の装置の目標面領域の拡大部分図である；第２図は赤色光の２ 光子吸収によって励起された青色の蛍光を示す合成ステレオ画像対である： 第３図は蛍光ラテックスビードの内側の面積からの平均強度対印加された平均レ ーザパワーの比を示すグラフである；第４図はＤＮＡ色素で着色された豚の培養 腎細胞の染色体の２光子励起蛍光画像である： 第５図は焦点面に限って２光子光漂白を示すラテックスビードの画像である： 第６図は蛍光的に着色されたラテックスビードの内側の２光子光漂白されたパタ ーンの画像である。

実施例の記述 第１図に示された本発明のより詳細な記述を以下に行う。第１図には図式的な形 で従来のレーザ走査顕微鏡１０が示されており、レーザなどの光源１６から対物 面１８に入射する入射光１４を結像するための対物レンズ１２を備えている。第 １Ａ図に図示される如（対物面は移動可能なステージ２２によって搬送されうる 試料もしくは目的物２０の上または内部に位置しうる。入射光ビームによる照明 光は２４で示す収束円錐を満たし、該円錐は試料２０の内部を通って目標面１８ の焦点面に達し、さらに目標面上の試料によって吸収されるごく一部の光を除い て発散する円錐２５を通して外部に通過する。入射光は目標面１８上において（ びれ即ち焦点２６を形成する。焦点２６の直径は光路内の回折によって制限され るが、好ましくは１ミクロン以下である。よ（知られているように顕微鏡光学系 の調整によって試料２０内の焦点の垂直位置は選択することができる。さらにス テージ２２は水平面内において試料の選択された箇所に入射光を位置させるべ（ ＸおよびＹ軸に沿ったラスターモーションのような方法で水平面内において移動 可能であり、したがって全体として試料の３次元的な走査が得られる。しかしな がら、機械的に走査されるステージは種々の困難をもたらすので、静止ステージ を用いることが好ましく、例えば顕微鏡の光路内に配置した走査ミラーのごとき 手段によって入射ビームをＸ−Ｙ面内において光学的に走査することが好ましい 。

レーザ１６から目標面１８に至る光路はレーザ１６からの光が指向される２色ミ ラー２８を含む。以下により詳細に説明するように、本発明によればレーザから の出力は比較的長い波長、好ましくは可視の赤もしくは赤外に近いスペクトラル 領域の光の短い高強度のパルスからなる。ミラー２８はこの長波長の光をミラー ３０に向けて下向きに偏向させ、ミラー３０は湾曲ミラー３６および３８を介し て上記光を走査ミラー３２および３４の対に指向させる。ミラー３２および３４ は互いに垂直な軸の回りで回転可能であり、目標面上のＸおよびＹ軸に沿って入 射光１４を移動させ、それによって静止した資料は走査される。走査ミラーから の光はアイピース４０を通過して対物レンズ１２を通して目標面１８に結像され る。

第１Ａ図において点線の矢印４２で示した資料２０内で発生された蛍光は顕微鏡 を通して逆方向に伝達し、入射ビーム１４の光路を逆方向に進み、したがって対 物レンズ１２、アイピース４０、走査ミラー３４および３２、湾曲ミラー３８お よび３６を経由してミラー３０により２色ミラー２８に反射される。資料内の蛍 光物質によって射出された光は資料内に含まれた蛍光物質に固有の波長であり、 したがって入射光１４の波長とは異なっている。この蛍光はレーザ１６方向に反 射されることなしに、２色ミラー２８を通過することができ、したがって４４で 示す光路を進む。このようにして蛍光４２はバリアフィルタ４６を通過し、平面 ミラー４８．５０および５２によって光増倍管５４のごとき適当な検出器に向け て反射される。

本発明によれば共焦レーザ走査顕微鏡が選択され、したがってそのような顕微鏡 が図面に図示されている。しかしながら、他の形式のレーザ走査顕微鏡も使用可 能であることは理解されるであろう。共焦顕微鏡１０内においては調節可能な共 焦ピンホール５６が集光光学系４４内に備えられており、結像面の上と下に位置 する収束および発散円錐２４および２５内において励起される背景蛍光を最小化 する。この共焦ピンホールは有用であるが、本発明による２光子蛍光励起におい ては励起が対物面の焦点２６の領域に本質的に限られるので必要ではない。従来 の蛍光顕微鏡では可視光である蛍光光子４２は、励起状態から分子の弛緩の間に 生成される蛍光４２より高いエネルギー、すなわちより短い波長を有する入射光 １４の単一光子を吸収することによって励起される分子によって生成される。こ のような従来の装置においては、１分子あたりに放出される蛍光光子の数は吸収 された励起光子の数に通常線形的に比例する。そのような従来の装置では単一の 光子のみが吸収される必要があるので、励起光１４を吸収する分子の光分解（ｐ ｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）は、このプロセスは必ずしも強度に比例するものではない が、試料２０内の二重の円錐ビーム２４および２５に沿ったすべての領域で起こ る。二重の円錐ビームのすべてで蛍光が発生されるため、励起光１４の焦点面の 内部、上側および下側の試料内の各面から放出される蛍光の量は、はぼ各部分に おいて同じとなり、したがって３次元的な分解能を得るのは困難である。その結 果試料全体を通して入射光の高いエネルギーは試料にダメージを与え、このこと はとりわけ生きた細胞を観察する場合には好ましいことではない。

走査顕微鏡において３次元的な分解能を得るとともに、顕微鏡の焦点外の領域に おいて試料に与えるダメージを減少させるため、本発明は励起光の波長の１／２ だけオーバーラツプする波長に１光子吸収のピークを有する蛍光体の２光子励起 を利用する。これを実現するため、レーザ１６はたとえば可視の赤色もしくは赤 外領域等の比較的長い波長を有する高い瞬間パワーのごく短いレーザビームパル スを生成する。この光は例えば紫外線等の短い波長の領域の単一光子によって通 常励起される蛍光体を含む試料に向けて指向され、２つの低いエネルギー（赤色 ）の光子は、単一の高いエネルギー（紫外）の光子によって与えられると同じの 試料の励起を発生するためには互いのエネルギーを結合する必要がある。励起お よびしたがって試料の蛍光率の両方は入射光の強度の２乗に比例する。結像され た励起レーザビーム１４では長波長の入射光の強度は顕微鏡光学系の焦点面２６ の領域においてのみ試料内の蛍光体を励起するに足る強度を有するものとなる。

この焦点面は試料内において調節可能に位置決めすることができ、試料の蛍光お よび光分解は焦点の回りの選択された楕円状の体積においてのみ発生される。し たがって本発明によれば長い波長の励起光のみが試料内を通過し、かつこの長い 波長の光はごく小さな領域においてのみ蛍光を励起するに足る強度を与えるよう に結像される。この蛍光は蛍光体が通常、紫外線領域のみを吸収するような場合 においても生成される。焦点は試料内において選択的に位置決めすることができ るので、３次元的な分解能は走査蛍光顕微鏡法および光分解によって放出されつ る光子活性化可能な試薬の光分解法の両方において得ることができる。

本発明によれば必要な励起強度は例えば約６３０　ｎｍの赤色領域の波長を有し 、約８ＱＭＨｚの繰返率で１００ｆｓｅｃ以下の幅の光パルスを発生する例えば コライディング・パルス・モード・口・ツク・ダイレーザ等の光源１６から顕微 鏡の焦点に与えられる。他の輝度の高いパルス化レーザも赤外もしくは可視赤色 領域における比較的長い波長の光を発生させるために用いることができ、それに よって入射光の波長の約１／２の波長を有する単一光子の吸収によって通常は励 起されるような試料内の蛍光体によって要求されるような適当な吸収エネルギー まで足し合わされるような必要な励起光子エネルギーを発生させる。例えば６３ ０　ｎｍの可視赤色領域の２つの光子は紫外領域の３１５ｎｍの光を通常は吸収 する蛍光体を励起するために結合され、また例えば赤色領域の１１０７０ｎの２ つの光子は可視光領域の５３５ｎｍの光子を吸収する蛍光体を励起する。

本発明の変形例では単一波長の光源１６が２つの異なる長い波長のレーザ光源に よって置き換えられ、入射光ビーム１４は高い瞬間パワーを有し、かつ波長の異 なる２つの重畳されたパルス光ビームからなる。入射ビームの各波長は短い波長 での吸収体である蛍光体を励起するべく選択され、それは以下のように表される 。

１／λ、ｂ、＝１／λ１＋１／λ２ λ１６．は吸収体の短い波長であり、λ１．λ２は入射レーザビームの波長であ る。

２光子励起においては典型的な２光子断面積δ：δ＝１０−”ｍ’ｓ／光子　・ ・・（式１）上記ノハルスハラメータ（１００ｆｓｅｃ、、反復率ｇＱＭＨｚ） ：さらに開口数Ａ＝１．４のレンズによって結像されたビーム：約５０ｍＷの平 均入射レーザパワー（ｐｏ）の条件で各パルスあたり、各蛍光体あたり１つの光 子が吸収される制限において蛍光体の蛍光体出力が飽和する。蛍光体あたり、パ ルスあたりに吸収される光子の数ｎ、は以下の関係式によって与えられる。

ここでτはパルス幅；ｆは反復率：Ｐｏは平均入射レーザパワー：δは光子吸収 断面積：ｆｌはブランク常数：Ｃは光の速度：Ａは結像レンズの開口数。

蛍光輻射はパルス繰返周波数を典型的には以下の式で表される蛍光の寿命の逆数 まで増大することによって増大される。

τ、−１＝ＩＱ９Ｓ−１・・・（式３）比較のため１光子蛍光の飽和は約３ｍＷ の入射パワーで生ずる。

第２図は本発明に係る２光子技術によって達成された深度判別を示す。画像６０ および６２のステレオ対が通常は約３６５　ｎｍの波長を有する紫外線によって 励起される９マイクロメートルの直径のラテックスビードの蛍光体のクラスター の画像の積み重ねから発生されたこれらの画像は標準的なレーザ走査顕微鏡を用 いて得られたが、連続波アルゴンイオンレーザ照明器１６を約６３０ｎｍの波長 で出力パルスを生成する２５ｍＷのコライディング・パルス・モード・ロック・ ダイレーザによって置き換えた。顕微鏡１０について行われた測定の結果、目標 面では約３ｍＷに達したことを示していた。３８０〜４４５ｎｍの波長を通過さ せる射出フィルタがバリアフィルタ４６に設けられるとともに、検出器開口５４ が小さな共焦開口に起因□する光学的しきり効果を減少させるために、その境界 に開口された。

レーザ１６からの入射ビーム１４の強度はレーザ１６と２色ミラー２６との間に おいて励起ビーム中に中性濃度フィルタを置（ことによって調整され、個々のラ テックスビードによって生成される青色蛍光が特定された。第３図にグラフ６４ で示されるように試料を合成するラテックスビードからの蛍光の検出強度は励起 レーザパワーの２乗に比例して増大しており、このことは明らかにビード内での ２光子励起の発生を示している。ポリサイエンシーズ・コーポレイション製のフ ルオレスプライトＢＢビードを用いたビードの励起断面積がビード内の染料濃度 、レーザ走査顕微鏡の光学的スループット、パルス幅、反復率、開口数および入 射パワー等を考慮して、ファクタ３の範囲の精度で５　Ｘ　Ｉ　Ｑ−”Ｍ’ｓ　 ／光子であると推定された。

この値は同様の染料に対して以前に測定された値に匹敵するものである。

第４図は分割された細胞（ＬＬＣ−ＰＫＩ　：　ａ　ｔ　ｔ　ｃ）内の染色体の 走査画像であり、紫外線で励起可能な蛍光染料（３３２５８；ヘキスト）でラベ ル付けされたセルーラＤＮＡを用いた。画像認識時間は１３秒で、これは数分の 漂白時間に比して短いものである。

さらに数分の間走査レーザによって照射した後においても、これら生きた細胞内 には何らの劣化も現れなかった。

第５図にビード７２の光漂白による輝度の減少された水平断面７０によって示さ れるように長時間の蛍光ビードの走査の間の光漂白は焦点面の回りの約２マイク ロメーターの厚みの薄片においてのみ発生している。このビードは一定の焦点面 において約６分間走査されたものである。同様の漂白の局所化は蛍光で染色され た細胞核においても検出された。この局所化は単一光子励起の使用に対して明ら かな利点を示しており、単一光子励起では一つの面が画像化される場合において さえ、試料全体が漂白されてしまう。このことは単一光子励起ゆえであって、走 査を広い視野の観察の両方における漂白は時間平均の励起強度に依存し、その強 度は軸方向すなわち第１図のＺ方向に沿って変化しない。２光子励起においては 漂白は焦点面の上側もしくは下側においては大きく低下する時間平均強度に依存 する。

励起強度の２乗に依存する蛍光信号は２光子励起のいま一つの利点に対応するも のであって、このような励起は空間フィルタとして使用されるピンホールを用い る必要なしに全視野を視覚する、例えばＣＣＤアレイのような検出器を用いた場 合にさえ試料の光学的な裁断効果をもたらす。第５図に図示されているように、 この裁断効果は対物レンズにおける色収差や従来の共焦レーザ走査顕微鏡のスル ープツト損失に関連する深刻な問題を回避することができる。２光子光分解はか ご閉じ込みされたＣＡ←、Ｈ“、ヌクレオチドや神経伝達媒体などの生物学的に 活性な化学物質の高速かつ局所的な放出にも適用することができる。

例えばかご閉じ込め（ｃａｇｅｄ）神経伝達物質が、走査ビームによって放出さ れたときに、発生された全細胞転移膜電流は、細胞表面上のそれら神経伝達物質 に対する受容体活動の分布をマツプ化するためのコントラスト発生機構として使 用することができる。本発明によれば、２光子かご閉込光分解の実現可能性が、 ＤＭＮＰＥでかご閉じ込みＡＴＰ　（３３ｍＭ）［オレゴン・オイジーンのモレ キュラー　ブローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）によって提供され る］を照射することによって、対物面において約１０マイクロメータの直径のく びれのビームに結像されるコライディング・パルス・モード・ロック・ダイレー ザ１６によって証明された。ＡＴＰ約ＩＱ−１１モルの光分解量が、カリホルニ ャ、サンジエゴのカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって提供される ルシフェリンバイオルミネッセンス検定を用いて測定された。典型的には、約１ ０７（μｍ）３のアリコート体積内のＡＴＰの約１０％が約６００秒の間に、約 １０４（μｍ）３の照射体積内において光分解された。

本発明による２光子励起は、単一紫外線光子の励起に対応する励起エネルギーへ の可視光によるアクセスをあたえるので、全く新しいクラスの蛍光体や蛍光指示 薬が３次元分解能を有するレーザ走査顕微鏡に受入れ可能となった。この種の指 示薬として、Ｃａ’″２に対してはＩｎｄｏ−１、Ｍｇ’″２に対してはＭａｇ −４ｎｄｏ−１、Ｎａ４に対してはＡＢＦＩ、Ｋ′″に対してはＰＢＦＩ等があ る。これら化合物の多くについて２光子吸収断面積は未だ知られていないが、２ 光子吸収には異なる選択側が適用され、分子の不整は同じ励起状態への１光子お よび２光子遷移の両方を可能にする。Ｉｎｄｏ−１、ＦＵＲＡ−２、Ｈｏｅｃｈ ｓ　ｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｄ　Ａ、　Ｎ　Ｓ　Ｙ　Ｌヒド ラジン［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓコ　、Ｓｔ　ｉ　Ｉｂｅｎｅ４２０ 　［Ｅｘｃ　１ｔｏｎ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ。

、Ｄａｙｔｏｎ、ＯＨＩおよび複雑のクーマリン染料の１０ｍＭの溶液から、直 径２５ｍのくびれに弱く結像させたＣＭＰを用いた励起に際して可視蛍光が観察 され、ＤＡＮＳＹＬとＣｏｕｍａｒｉｎ４４０の微結晶の２光子励起ＬＳＭ蛍光 画像が記録された。

本発明のいま一つの効用は書込みおよび読取り動作のための二つの横断ビームに おける多光子プロセスに依存する３次元の光学メモリ装置である。単一ビームは 二つの横断ビームより簡単であり、最大の情報綴じ込み密度を可能にするであろ う。多光子プロセスは焦点において極めて高い強度の領域に局所化され、第５図 に示す例では蛍光ビードの内側の顕微鏡パターンの漂白は現行の蛍光体で約１０ ３回読取り可能な高密度書込み専用メモリを構成する。

以上のように生物学的な或は他の応用のための実用的な２光子レーザ走査顕微鏡 が図示されて、かつ説明された。２光子励起の蛍光顕微鏡は共焦点レーザ走査顕 微鏡によって得られるものと匹敵するような視野深度を有する固有の３次元的な 分解能を与える。２光子励起との関係で共焦点ピンホールを用いると、３軸すべ てに沿って分解能を改善することができる。背景蛍光は異なった入力パワーの下 で記録された画像の定量化された減算によって取り除くことができる。この技術 を用いると光漂白ならびに光力学的なダメージは焦点面の近傍に限定することが でき、それによって、細胞や蛍光体に対する紫外線によるダメージが情報が実際 に集められる体積に限定されることから、３次元的な再構成のためのデータの認 識のための共焦点レーザ走査顕微鏡法および領域検出画像化いずれに対しても相 当な利点を与えることができる。このことは光分解や光活性化などの光化学プロ セスを結像体積内に鋭く局所化することを可能にする。本発明は主として単一レ ーザを用いた２光子励起の利用について説明したが、足し合わすことによって目 的物質の励起波長になる二つの異なる波長を有する二つの光源からの二つの光子 を用いることによっても目的物質の励起を発生することができる。例えば二つの 異なるレーザ光源はそれらの出力ビームを顕微鏡の光路に共軸的に指向させるこ とによって用いることができる。さらには周波数の２倍化手段を用いて二つの異 なる波長を単一の光源から発生することもできる。

以上のように本発明は好ましい実施例との関係で記述したが、添付の請求の範囲 において規定された本発明の技術思想と範囲を逸脱することなく、種々の変形や 修正が当業者にとって可能である。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年５月１４日り匍

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のものを含むレーザ走査顕微鏡画像化されるべき目的物を受ける対象物 面；上記目的物は該目的物の蛍光特性を生成するため短波長スペクトラル領域の 光による励起に応答する蛍光手段を含んでいる、上記目標面に隣接して位置する レンズ手段；長波長スペクトラル領域のサブピコ秒の単色コヒーレント光パルス 源； 検出手段； 上記コヒーレント光を上記レンズ手段を含む光路に沿って上記目的物に入射させ るべく指向させるミラー手段；上記長波長の光パルスは上記目的物内で蛍光を発 生させるに十分な瞬間的パワーを与え、該蛍光は上記光路上を伝播して上記検出 手段に至る出力光を与える。
2. ２．請求項１の顕微鏡において、上記光源は高い繰返率で高い瞬間パワーのパル スを発生し、上記目的物は上記短波長の入射光によって供給されたエネルギーに 競り合って、少なくとも２つの長波長光入射パルスからエネルギーを吸収するも の。
3. ３．請求項２の顕微鏡において、上記光源からの長波長光は上記レンズ手段によ り上記目的物内にサブミクロンの直径にまで結焦され、上記目的物内に蛍光を発 生させるのに十分な高強度を生成するもの。
4. ４．請求項２の顕微鏡において、上記レンズ手段は上記目標面の対向面に収束し 発散する光を発生すべく、上記長波長光を円錐形状に結焦し、それによって上記 長波長光は上記目標面上の焦点に結焦されるもの。
5. ５．請求項２の顕微鏡において、上記目的物は紫外線波長スペクトラル領域に単 一の光子吸収ピークを有する蛍光発光団であり、赤色波長スペクトラル領域にお いて２個の光子を吸収することができるもの。
6. ６．請求項５の顕微鏡において、上記レンズ手段は、上記目的物内の焦点に上記 長波長光を結焦し、該焦点の周囲の限定された楕円体内に蛍光を励起する光強度 を発生するもの。
7. ７．以下のものを含むレーザ走査顕微鏡、所定の波長の光による単一光子励起に 対応する吸収ピークを有する目的物を受ける目標面； 上記目標面に隣接して位置するレンズ手段；長波長のサブピコ秒の光パルスのレ ーザ光源；該光は上記所定の波長の約２倍の波長を有する、上記光パルスを上記 目的物に入射させるべく、上記レンズ手段を含む光路に沿って上記光パルスを指 向させるミラー手段；上記レンズ手段は上記目的物内の焦点に上記光パルスを結 焦し、上記光パルスの強度は上記単一光子吸収ピークに対応する単一光子励起エ ネルギーレベルに等価な２光子励起エネルギーレベルを上記焦点領域に生成する 。
8. ８．請求項７の顕微鏡において、上記目的物は上記吸収ピークを有する蛍光発光 団を含むもの。
9. ９．請求項８の顕微鏡において、上記蛍光発光団は蛍光を発生する所定の強度を 与える入射光子に応答するもの。
10. １０．請求項９の顕微鏡において、上記入射光パルスは光エネルギー有する光子 を上記目的物に与えるとともに、上記入射光の２光子の結合されたエネルギーが 蛍光を発生させるために必要とされるもの。
11. １１．請求項１０の顕微鏡において、上記レンズ手段は目的物内において異なる 深さの焦点を選択しうるようになっているもの。
12. １２．請求項１１の顕微鏡において、目的物に関し、上記焦点を移動させるため の走査手段をさらに含むもの。
13. １３．請求項１２の顕微鏡において、上記目的物の蛍光を検出するための光路内 の光に感応する検出手段をさらに含むもの。
14. １４．請求項１３の顕微鏡において、上記検出手段は、上記蛍光に感応する光感 知アレイであるもの。
15. １５．請求項７の顕微鏡において、上記目的物は上記光パルスによって上記焦点 に生成される２光子励起エネルギーレベルに反応する生物細胞であるもの。
16. １６．請求項１５の顕微鏡において、上記目的物は生物学的に活性な化学物質の 局所的な放出を発生するために上記焦点における上記光パルスに反応するもの。
17. １７．請求項７の顕微鏡において、上記目的物は光子により活性化されうる試薬 であるもの。
18. １８．請求項７の顕微鏡において、上記目的物は単一光源からの２光子エネルギ ーに応答する光メモリであるもの。