RU2680664C1 - Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа - Google Patents
Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2680664C1 RU2680664C1 RU2017144359A RU2017144359A RU2680664C1 RU 2680664 C1 RU2680664 C1 RU 2680664C1 RU 2017144359 A RU2017144359 A RU 2017144359A RU 2017144359 A RU2017144359 A RU 2017144359A RU 2680664 C1 RU2680664 C1 RU 2680664C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- time
- series
- laser scanning
- images
- signal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 abstract description 18
- 239000011575 calcium Substances 0.000 abstract description 18
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000007383 nerve stimulation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 102000038650 voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 1
- 108091023044 voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
- G01J1/58—Photometry, e.g. photographic exposure meter using luminescence generated by light
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Данный способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва. Технический результат изобретения заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых сигналов. Способ включает в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, при этом съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых смещается по времени сигнал от стимулятора относительно начала процесса сканирования конфокальным микроскопом, а полученные серии изображений собираются в одну серию. 2 ил.
Description
Предлагаемый способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва.
Известен способ сканирования флуоресцентных сигналов от биологических объектов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа (принцип впервые предложен М. Мински в 1957 г.), описанный в книге "Мухитова А.Р., Архиповой С.С, Никольского Е.Е., Современная световая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казанский гос. мед университет Росздрава. - М.: Наука, 2011. - 140 с. - ISBN 978-5-02-037483-6", в соответствие с которым препарат сканируют поточечно лазерным лучом и возбуждают флуоресцентный краситель, свет от которого через конфокальную диафрагму регистрируется фотоумножителем. Затем из зарегистрированных значений интенсивности света при помощи компьютера восстанавливается поточено изображение препарата. Для формирования серии изображений, циклы сканирования повторяются.
Смещения Стокса - разница длин волн максимумов спектров поглощения и испускания флуоресценции флуорохромом. Измеряется в обратных сантиметрах, реже нанометрах, в силу нелинейности зависимости энергии фотона от длинны волны. Назван в честь физика Джоджа Стокса.
Кальциевый транзиент - изменение интенсивности свечения кальциевого флуоресцентного красителя во времени в зависимости от концентрации ионов кальция в среде.
Вход кальция - вход в нервное окончание ионов кальция через кальциевые каналы, расположенные на мембране.
Кальциевый канал - семейство ионных каналов, избирательно проницаемых для ионов кальция.
Потенциал действия - волна возбуждения, перемещающаяся по мембране живой клетки в виде кратковременного изменения мембранного потенциала на небольшом участке возбудимой клетки, в результате которого наружная поверхность этого участка становится отрицательно заряженной по отношению к внутренней поверхности мембраны, в то время, как в покое она заряжена положительно. Потенциал действия является физиологической основой нервного импульса.
Конфокальная диафрагма - это диафрагма конфокального микроскопа, которая предназначена отсекать поток фонового рассеянного света. Диафрагма расположена после объективной линзы так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.
Недостатком имеющегося способа является низкая скорость сканирования. Ограничение скорости сканирования связано со временем, необходимым на механическое перемещение зеркал, которые позиционируют лазерный луч. Современные конфокальные микроскопы позволяют сканировать изображение с разверткой несколько десятков мс на кадр. Этого недостаточно для регистрации быстрых процессов. Возможно высокоскоростное сканирование одной линии изображения. Но при таком режиме сканирования, можно получить информацию только от ограниченной зоны объекта исследования.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, является улучшение временного разрешения при сканировании быстрых флуоресцентных сигналов в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на примере регистрации флуоресцентного кальциевого транзиента.
Технический результат предлагаемого способа регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых быстрых флуоресцентных сигналов.
Технический результат в предлагаемом способе регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа, включающий в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, достигается тем, что съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых сигнал от препарата смещается на некую константу времени при неизменных параметрах сканирования микроскопа, а полученные в ходе эксперимента серии изображений собираются в одну серию по определенному алгоритму.
Рассмотрим осуществление предлагаемого способа регистрации быстрого кальциевого флуоресцентного сигнала при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа на примере регистрации кальциевого транзиента.
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп - это микроскоп, получение изображения в котором осуществляется сканированием препарата, окрашенного флуоресцентным красителем, сфокусированным лазерным лучом определенной длины волны. Перемещение лазерного луча осуществляется за счет системы зеркал, которые осуществляют развертку лазерного луча при сканировании препарата. Во время сканирования препарата лазерный луч возбуждает флуоресцентный краситель, который согласно смещению Стокса испускает свет, длина волны которого выше длинны волны света от лазерного источника возбуждения. С помощью системы фильтров свет возбуждения задерживается, а свет эмиссии проходит через конфокальную диафрагму и регистрируется системой фотоумножителей. Из зарегистрированных интенсивностей свечения, соответствующих определенным точкам препарата, при помощи компьютера формируется интересующее нас видеоизображение.
В случае регистрации кальциевого транзиента одновременно со сканированием изображения осуществляется стимуляция препарата, которая вызывает изменение свечения флуоресцентного красителя. Регистрация входа кальция осуществляется при помощи флуоресцентных кальциевых красителей, которые меняют интенсивность своего свечения в зависимости от концентрации ионов кальция в среде (кальциевый транзиент). Вход ионов кальция в периферические нервные окончания является быстропротекающим биологическим процессом и для его регистрации необходимо высокоскоростное сканирование. Длительность кальциевого транзиента в зависимости от красителя и объекта исследования составляет 500-1000 мс а скорость нарастания переднего фронта кальциевого транзиента составляет около 6-12 мс. Соответственно для корректного анализа амплитуды флуоресцентного кальциевого транзиента необходимо временное разрешение системы регистрации порядка 1 миллисекунды на кадр. Существующие конфокальные сканирующие системы позволяют сканировать изображения размером 512 на 512 пикселей со скоростью 30-70 миллисекунд на кадр, что не позволяет оценивать корректно амплитудные и временные характеристики кальциевого транзиента.
Кальциевый транзиент инициируется входом кальция в нервное окончание через потенциал-чувствительные кальциевые каналы во время распространяющегося потенциала действия. Потенциал действия запускается раздражением двигательного нерва специализированным стимулятором биологических объектов. Стимулятор - это внешнее электронное устройство, которое выдает импульсы заданной амплитуды и длительности. Стимулятор синхронизируется с конфокальным сканирующим микроскопом через блок синхронизации, входящий в состав микроскопа.
Блок синхронизации осуществляет запуск стимулятора синхроимпульсом. В момент начала съемки видеоизображения блок синхронизации посылает импульсный сигнал на стимулятор, после чего стимулятор посылает импульсный сигнал на препарат. На стимуляторе можно настраивать задержку между синхроимпульсом от микроскопа и импульсом, стимулирующим препарат.
Разработанный способ позволяет зарегистрировать повторяющийся периодический флуоресцентный кальциевый сигнал с достаточным временным и пространственным разрешением посредством только программных операций, без конструктивного изменения существующей конфокальной системы. Суть метода заключается в том, что сигнал стимуляции можно смещать относительно начала процесса сканирования микроскопом. Это достигается посредством задержки этого сигнала стимулятором. Так как развертка микроскопа неизменна, то регистрировать сигнал при смещении микроскоп будет в других точках, отстоящих по времени от начала исходного сигнала на величину временной константы t. Величина t выбирается исходя из необходимого временного разрешения и зависит от временных параметров регистрируемого сигнала. Чтобы достичь необходимого результата, нужно смещать сигнал до тех пор, пока шаг времени смещения n*t не достигнет значения минимального времени между кадрами Т (n*t=Т), где n=1, 2, 3,.., N(Фигура 1). Длительность одной серии кадров k*T выбирается исходя из длительности интересующего сигнала флуоресценции и должна превышать его длительность на значение Т, где k - количество кадров одного регистрируемого сигнала. На фиг. 1 изображен сигнал без смещения и четыре смещенных сигнала. Так как микроскоп формирует кадры с периодом Т, то полученный сигнал будет далек от истинного. На изображении он представлен пятью соединенными между собой точками сигнала без смещения, попавшими в момент регистрации кадра. Таким образом, смещая сигнал по времени, можно собрать потерянные из-за низкой скорости сканирования кадры и соответственно потерянные точки сигнала. Восстановление флуоресцентного сигнала с высоким временным разрешением из зарегистрированных серий кадров осуществляется согласно следующему алгоритму (Фиг. 2): кадр из смещенной серии изображений вставляется за соответствующим кадром первой серии изображений в порядке смещения. Собранные кадры таким путем объединяются в порядке смещения в одно видеоизображение, которое будет обладать интересующей нас разверткой по времени. При этом развертка (время между кадрами) нового видеоизображения будет равна заданному шагу времени смещения сигнала t.
Claims (1)
- Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов, включающий получение временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, отличающийся тем, что съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых смещается по времени сигнал от стимулятора относительно начала процесса сканирования конфокальным микроскопом, а полученные серии изображений собираются в одну серию.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144359A RU2680664C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144359A RU2680664C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2680664C1 true RU2680664C1 (ru) | 2019-02-25 |
Family
ID=65479309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017144359A RU2680664C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2680664C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034613A (en) * | 1989-11-14 | 1991-07-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Two-photon laser microscopy |
| RU2005115052A (ru) * | 2005-05-18 | 2006-11-27 | Андрей Алексеевич Климов (RU) | Способ флуоресцентной наноскопии |
-
2017
- 2017-12-18 RU RU2017144359A patent/RU2680664C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034613A (en) * | 1989-11-14 | 1991-07-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Two-photon laser microscopy |
| RU2005115052A (ru) * | 2005-05-18 | 2006-11-27 | Андрей Алексеевич Климов (RU) | Способ флуоресцентной наноскопии |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Штейн Г.И. "Руководство по конфокальной микроскопии" - СПб: ИНЦ РАН, 2007, всего - 77 страниц. Митрошина Е.В. "Оптический имиджинг в приложении к исследованию нейробиологических систем мозга", Электронное учебно-методическое пособие - Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2012, всего - 40 страниц. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6338597B2 (ja) | 無線周波数多重励起を用いた蛍光イメージングのための装置及び方法 | |
| Lillis et al. | Two-photon imaging of spatially extended neuronal network dynamics with high temporal resolution | |
| Vicidomini et al. | STED nanoscopy with time-gated detection: theoretical and experimental aspects | |
| JP5776992B2 (ja) | 自然放出蛍光をパルス励起、連続脱励起、およびゲート記録するｓｔｅｄ顕微鏡法、ｓｔｅｄ蛍光相関分光法、およびｓｔｅｄ蛍光顕微鏡 | |
| CN109187459B (zh) | 一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置 | |
| Elson et al. | Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier | |
| CN111202499B (zh) | 快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像***和方法 | |
| US10041883B2 (en) | System and method for time-resolved fluorescence imaging and pulse shaping | |
| Becker et al. | Picosecond fluorescence lifetime microscopy by TCSPC imaging | |
| US20110031414A1 (en) | Device for microscopy having selective illumination of a plane | |
| US20130126755A1 (en) | Method and device for simultaneous multi-channel and multi-method acquisition of synchronized parameters in cross-system fluorescence lifetime applications | |
| JP7287961B2 (ja) | 同時複数平面撮像のためのシステム、装置および方法 | |
| Becker et al. | Multiwavelength TCSPC lifetime imaging | |
| CN111971606B (zh) | 具有高空间分辨率的时间分辨成像方法 | |
| Becker et al. | FRET measurements by TCSPC laser scanning microscopy | |
| US20110043619A1 (en) | Resolution-Enhanced Luminescence Microscopy | |
| US11944448B2 (en) | Adaptive illumination apparatus, method, and applications | |
| Talbot et al. | High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis | |
| CN212489863U (zh) | 一种快速高效自适应光学补偿的受激拉曼散射成像*** | |
| Chen et al. | Spatial resolution enhancement in photon-starved STED imaging using deep learning-based fluorescence lifetime analysis | |
| RU2680664C1 (ru) | Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа | |
| CN108982445A (zh) | 多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像*** | |
| US11953440B2 (en) | Method and apparatus for simultaneous nonlinear excitation and detection of different chromophores across a wide spectral range using ultra-broadband light pulses and time-resolved detection | |
| US11009463B2 (en) | Fluorescence microscopy system and methods based on stimulated emission | |
| Fernandez et al. | Dynamic real-time subtraction of stray-light and background for multiphoton imaging |