JP2848952B2 - ２光子レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

２光子レーザ走査顕微鏡

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は、国立保健機関によって与えられた認可番
号P41RR04224、国立科学財団によって与えられた認可番
号NSF−BBS−8714069およびNSF−DMB−8609084の政府援
助によりなされたものである。政府は本発明においてあ
る権利を有する。
フライイング・スポット・スキャナの原理は長い年月
知られているにもかかわらず、その顕微鏡における応用
は、必要な技術の開発に従ってここ２、３年活発になさ
れるようになっている。安定したレーザ光源および高速
の電子画像認識・格納技術は、走査顕微鏡にとって必須
の要素である。非共焦走査顕微鏡の画像化特性は、従来
の顕微鏡のそれと極めてよく似ているにもかかわらず、
新しい領域が共焦点走査顕微鏡によって拓かれた。この
種の装置によって得られる分解能は徐々にしか向上して
いないが、それらによって得られる飛躍的に改良された
深度分解能は、複雑な逆たたみ込み演算の必要なしに３
次元画像の生成を可能にした。深度分解は、バックグラ
ウンドを減少させ、このことは、ホトマルチプライヤ等
の単一高精度検出器の使用と相俟って高い空間分解能を
伴った定量的研究を可能とした。
共焦点走査顕微鏡の光軸に沿った分解能は、透明の目
的物内において焦点面の上下において発生する背景散乱
又は蛍光に対抗する有用な識別を可能とする。それは、
また、一連の断面から３次元の蛍光画像を構築する場合
や、定量的な蛍光インジケータ（指示薬）の使用或は非
平面表面のセル表面受容体の蛍光マーカのマップ化にと
って極めて有用である。この種の装置は僅かに良好な横
方向分解能、極めて優れた深度視野分解能および従来の
装置で理想的な条件下で得られるよりも倍率のオーダが
より優れた理想的条件下でのバックグラウンド識別を与
える。
走査は、静止ビームに対して試料ステージを移動させ
るか、照明と蛍光応答信号の両方を高精度に同調させて
光学走査のいずれかによって行われる。ステージの移動
方式が光学的観点からは好ましいが、サンプルの受入れ
および装填、収納容器の使用および微細電極を用いた電
気的記録に関する制限をもたらす。したがって、スポッ
ト移動方式が多くの場合好ましい。このような移動スポ
ットは、ガルバノメータ・スキャナに装着したミラーの
使用によって生成されるが、これは得ることができるフ
レーム周波数を制限する。音響−光学デフレクタの使用
は、その強い発散のゆえに蛍光顕微鏡における共焦点空
間フィルタとの干渉を惹起する。多角形ミラーはガルバ
ノメータ・スキャナより高速であるが、それ単独では、
操作のベクトルモードが不可能である。
従来のアーク光源は、回転ディスク照明器を利用する
共焦点走査顕微鏡の種々の応用に用いることができる
が、明らかに不可避な強度変動によって定量的な応用の
ための使用は制限される。かかる装置において、画像
は、ディスクの共焦ピンホールの２者一体のセットを通
して、或いは、最近の形式では、照明ピンホールそれ自
身を通して形成される。
レーザによって照明される単一点が移動する目的物を
横切って走査される共焦点走査顕微鏡は低走査速度にお
いて極めて良好に動作し、可視光を吸収・射出する蛍光
マーカを用いて優秀なレーザ走査顕微鏡が得られてい
る。しかしながら、スペクトルラムの紫外線部分によっ
て励起される蛍光光団及び蛍光化学指示薬を有する共焦
走査画像は、色収差が補正されなければならず、吸収及
び射出波長の両方に対して透明でなければならない適当
な顕微鏡用レンズがないために、そのうえ、紫外光によ
って生きている細胞に対して加えられるダメージのゆえ
に、実用に供されていない。さらに、紫外線レーザの諸
種の制限が、上記の用途を困難なものとしている。蛍光
顕微鏡法は、明白なことであるが、目的物内の蛍光光団
の光漂白によってさらに制限される。なぜならば、励起
光は、蛍光体を励起しながら、蛍光光団を徐々に光漂白
するからである。レーザ走査共焦蛍光顕微鏡法において
さえ、結焦された励起光は焦点面を走査するに従って、
ある時間平均では、目的試料の全体の深さに亘って均一
に照射するため、広視野顕微鏡において生ずるのと本質
的に同様の光漂白が惹起される。光漂白は、多数の２次
元画像が必要とされ、各２次元画像の検出が試料全体の
光漂白をもたらすために、３次元画像の再構成において
とりわけ問題となる。
発明の概要 上記の各種の困難は、本発明によれば、レーザ走査顕
微鏡法において蛍光体の２光子分子励起の使用によって
克服される。本発明によれば、２光子励起は、（ａ）直
径で１ミクロン以下の散乱が制限されたくびれ状にレー
ザが結像されるレーザ走査顕微鏡において可能な強力な
結像作用によって与えられる極めて高く局所的でかつ瞬
間的な強度と、（ｂ）パルス化されたレーザの一時的な
集中の組合によって可能となる。コライディング・パル
ス、モード・ロック型ダイレーザ（dye laser）のよう
に、回折限界まで結像可能な高強度、長波長、単色光源
は、各パルスが約80MHzの繰り返し率で約100フェムト秒
（100×10-15秒）の期間を有するパルスの流れを生成す
る。これらのサブピコ秒のパルスは、例えば２色ミラー
によって、顕微鏡に供給され、顕微鏡の対象面に位置す
る試料もしくは目的物に指向される。回折限界まで結像
されたごく短時間の強力なパルスによって与えられる瞬
間的な高いパワーのゆえに、目的物に含有され通常は典
型的に紫外線等の短い波長の高エネルギー単一光子によ
って励起される蛍光光団（蛍光染料）がレーザ光源から
の２つの長波長の光子を同時に吸収する相当の確率が存
在する。この吸収は、蛍光体分子内において２つの光子
のエネルギーを結合し、それによって、蛍光体をその励
起状態に遷移させる。蛍光体が正規状態に戻ると、それ
は光を放出し、この光は顕微鏡の光学系を逆方向に通過
して適当な検出器に至る。
高強度短時間の光パルスによる蛍光体の２光子励起
は、バックグラウンド判別の改善、蛍光体の光漂白の減
少を可能にし、かつ生きている細胞試料に対する光によ
るダメージを最小化する顕微鏡のための一般的な蛍光技
術を構成する。これは、顕微鏡内において生成され結像
化された照明は、試料内を通過する際収束円錐をなすか
らである。収束円錐の頂点において焦点面に達する光の
全ては、蛍光体に吸収される僅かな部分を除いて、発散
円錐となって試料の対向面側に出ていく。収束する円錐
と発散する円錐とによって形成されるくびれにおける対
象面上の焦点領域内においてのみ、強度試料中の蛍光体
内への２光子吸収を生成するに十分なものとなり、この
強度は依存性（分布）は、長い波長の光をして、試料の
焦点の廻りのごく局所的な体積内においてのみ短波長に
よる励起と同等の効果をもたらす。この吸収は試料の焦
点領域外の部分の全体にわたって長波長光の軟らかな平
均照明光強度を保持する比較的長波長の高速、高強度の
フェムト秒のパルス手段によって達成される。その結
果、焦点面外の蛍光体の光漂白は殆どなくなる。長波長
光の１光子吸収は無視でき、焦点面外では、時間平均の
照明が試料の全深さに亘って実際上にほぼ均一であった
としても、瞬間的な強度は相当の２光子吸収・励起をも
たらすには、あまりに低すぎる。この効果は、さらに、
生きている細胞へのダメージを大幅に減少させる。
本発明の２光子吸収は正確な空間的認識を可能とし、
３次元的に位置が定められた小さな体積から、蛍光の量
子化を可能とし、したがって、前述した如き共焦点レー
ザ走査顕微鏡において得られるものに匹敵する視野分解
能の深度が得られる。このことは、より厚い細胞層が研
究されるべき場所にはとりわけ重要である、さらに、２
光子励起は、背景蛍光を大幅に減少させる。
上で議論した２光子吸収技術は、デミトリ エイ・パ
ーセンノポーロス等（Dimitri Ａ・Parthenopoulos e
t al.）の“３次元光学格納メモリ”（Three−dimensi
onal Optical Storage Memory）と題する論文；サイ
エンス（Science）、Vol.245、pages 843−845、Augus
t 25、1989;に記述された型式の３次元光学メモリ装置
において選択された場所を励起するためにも使用可能で
ある。本発明によれば、単一レーザ光源又は共軸多重光
源からの比較的長い波長光の極めて短いが高強度のパル
スが、走査顕微鏡を通して、高分子組織内に埋込まれた
結晶、組成物もしくは発光団の如き、ホトクロミック或
いは光分解可能な（photolyzable）蛍光物質である格納
媒体内に指向される。入射光ビームは組織内の多くの層
のいずれか一つの上に高度に結像され、かつその強度
は、選択された層を横切って走査されるか或いは歩進さ
れるかにしたがって変調される。ビームはビームによっ
て表現されるコード化された情報が媒体内において２値
の形式で格納されるように、組織内において選択された
場所を励起する。高度に結像されたビームは、正確な格
納に必要な空間的分解能を与える。フェムト秒の高強度
パルスは、通常は紫外線領域の光による励起を必要とす
る物質内に情報を書込むために組織物質内に２光込吸収
を惹起させる。組織内の書込まれた点の励起レベルは上
記した分子内において蛍光を生成する長波長の読取りレ
ーザによって検出もしくは読取られる。
図面の簡単な説明 本発明の上記およびさらに別の目的、特徴および利点
は、添付の図面を参照した実施例の以下の詳細な説明か
ら明らかになるであろう： 第１図は本発明にしたがって実用化されたレーザ走査
共焦顕微鏡の図式的な図である； 第1A図は第１図の装置の目標面領域の拡大部分図であ
る； 第２図は赤色光の２光子吸収によって励起された青色
の蛍光を示す合成ステレオ画像対である； 第３図は蛍光ラテックスビードの内側の面積から平均
強度対印加された平均レーザパワーの比を示すグラフで
ある； 第４図はDNA色素で着色された豚の培養腎細胞の染色
体の２光子励起蛍光画像である； 第５図は焦点面に限って２光子光漂白を示すラテック
スビードの画像である； 第６図は蛍光的に着色されたラテックスビードの内側
の２光子光漂白されたパターンの画像である。
実施例の記述 第１図に示された本発明のより詳細な記述を以下に行
う。第１図には図式的な形で従来のレーザ走査顕微鏡10
が示されており、レーザなどの光源16から対物面18に入
射する入射光14を結像するための対物レンズ12を備えて
いる。第1A図に図示される如く対物面は移動可能なステ
ージ22によって搬送されうる試料もしくは目的物20の上
または内部に位置しうる。入射光ビームによる照射光は
24で示す収束円錐を満たし、該円錐は試料20の内部を通
って目標面18の焦点面に達し、さらに目標面上の試料に
よって吸収されるごく一部の光を除いて発散する円錐25
を通して外部に通過する、入射光は目標面18上において
くびれ即ち焦点26を形成する。焦点26の直径は光路内の
回折によって制限されるが、好ましくは１ミクロン以下
である。よく知られているように顕微鏡光学系の調整に
よって試料20内の焦点の垂直位置は選択することができ
る。さらにステージ22は水平面内において試料の選択さ
れた箇所に入射光を位置させるべくＸおよびＹ軸に沿っ
たラスターモーションのような方法で水平面内において
移動可能であり、したがって全体として試料の３次元的
な走査が得られる。しかしながら、機械的に走査される
ステージは種々の困難をもたらすので、静止ステージを
用いることが好ましく、例えば顕微鏡の光路内に配置し
た走査ミラーのごとき手段によって入射ビームをＸ−Ｙ
面内において光学的に走査することが好ましい。
レーザ16から目標面18に至る光路はレーザ16からの光
が指向される２色ミラー28を含む。以下により詳細に説
明するように、本発明によればレーザからの出力は比較
的長い波長、好ましくは可視の赤もしくは赤外に近いス
ペクトラル領域の光の短い高強度のパルスからなる。ミ
ラー28はこの長波長の光をミラー30に向けて下向きに偏
向させ、ミラー30は湾曲ミラー36および38を介して上記
光を走査ミラー32および34の対に指向させる。ミラー32
および34は互いに垂直な軸の回りで回転可能であり、目
標面上のＸおよびＹ軸に沿って入射光14を移動させ、そ
れによって静止した資料は走査される。走査ミラーから
の光はアイピース40を通過して対物レンズ12を通して目
標面18に結像される。
第1A図において点線の矢印42で示した資料20内で発生
された蛍光は顕微鏡を通して逆方向に伝達し、入射ビー
ム14の光路を逆方向に進み、したがって対物レンズ12、
アイピース40、走査ミラー34および32、湾曲ミラー38お
よび36を経由してミラー30により２色ミラー28に反射さ
れる。資料内の蛍光物質によって射出された光は資料内
に含まれた蛍光物質に固有の波長であり、したがって入
射光14の波長とは異なっている。この蛍光はレーザ16方
向に反射されることなしに、２色ミラー28を通過するこ
とができ、したがって44で示す光路を進む。このように
して蛍光42はバリアフィルタ46を通過し、平面ミラー4
8、50および52によって光増倍管54のごとき適当な検出
器に向けて反射される。本発明によれば共焦レーザ走査
顕微鏡が選択され、したがってそのような顕微鏡が図面
に図示されている。しかしながら、他の形式のレーザ走
査顕微鏡も使用可能であることは理解されるであろう。
共焦顕微鏡10内においては調節可能な共焦ピンホール56
が集光光学系44内に備えられており、結像面の上と下に
位置する収束および発散円錐24および25内において励起
される背景蛍光を最小化する。この共焦ピンホールは有
用であるが、本発明による２光子蛍光励起においては励
起が対物面の焦点26の領域に本質的に限られるので必要
ではない。従来の蛍光顕微鏡では可視光である蛍光光子
42は、励起状態から分子の弛緩の間に生成される蛍光42
より高いエネルギー、すなわちより短い波長を有する入
射光14の単一光子を吸収することによって励起される分
子によって生成される。このような従来の装置において
は、１分子あたりに放出される蛍光光子の数は吸収され
た励起光子の数に通常線形的に比例する。そのような従
来の装置では単一の光子のみが吸収される必要があるの
で、励起光14を吸収する分子の光分解（photolysis）
は、このプロセスは必ずしも強度に比例するものではな
いが、試料20内の二重の円錐ビーム24および25に沿った
すべての領域で起こる。二重の円錐ビームのすべてで蛍
光が発生されるため、励起光14の焦点面の内部、上側お
よび下側の試料内の各面から放出される蛍光の量は、ほ
ぼ各部分において同じとなり、したがって３次元的な分
解能を得るのは困難である。その結果試料全体を通して
入射光の高いエネルギーは試料にダメージを与え、この
ことはとりわけ生じた細胞を観察する場合には好ましい
ことではない。
走査顕微鏡において３次元的な分解能を得るととも
に、顕微鏡の焦点外の領域において試料に与えるダメー
ジを減少させるため、本発明は励起光の波長の1/2だけ
オーバーラップする波長に１光子吸収のピークを有する
蛍光体の２光子励起を利用する。これを実現するため、
レーザ16はたとえば可視の赤色もしくは赤外領域等の比
較的長い波長を有する高い瞬間パワーのごとく短いレー
ザビームパルスを生成する。この光は例えば紫外線等の
短い波長の領域の単一光子によって通常励起される蛍光
体を含む試料に向けて指向され、２つの低いエネルギー
（赤色）の光子は、単一の高いエネルギー（紫外）の光
子によって与えられると同じの試料の励起を発生するた
めには互いのエネルギーを結合する必要がある。励起お
よびしたがって試料の蛍光率の両方は入射光の強度の２
乗に比例する。結像された励起レーザビーム14では長波
長の入射光の強度は顕微鏡光学系の焦点面26の領域にお
いてのみ試料内の蛍光体を励起するに足る強度を有する
ものとなる。この焦点面は試料内において調節可能に位
置決めすることができ、試料の蛍光および光分解は焦点
の回りの選択された楕円状の体積においてのみ発生され
る。したがって本発明によれば長い波長の励起光のみが
試料内を通過し、かつこの長い波長の光はごく小さな領
域においてのみ蛍光を励起するに足る強度を与えるよう
に結像される。この蛍光は蛍光体が通常、紫外線領域の
みを吸収するような場合においても生成される。焦点は
試料内において選択的に位置決めすることができるの
で、３次元的な分解能は走査蛍光顕微鏡法および光分解
によって放出されうる光子活性化可能な試薬の光分解法
の両方において得ることができる。
本発明によれば必要な励起強度は例えば約630nmの赤
色領域の波長を有し、約80MHzの繰返率で100fsec以下の
幅の光パルスを発生する例えばコライディング・パルス
・モード・ロック・ダイレーザ等の光源16から顕微鏡の
焦点に与えられる。他の輝度の高いパルス化レーザも赤
外もしくは可視赤色領域における比較的長い波長の光を
発生させるために用いることができ、それによって入射
光の波長の約1/2の波長を有する単一光子の吸収によっ
て通常は励起されるような試料内の蛍光体によって要求
されるような適当な吸収エネルギーまで足さ合わされる
ような必要な励起光子エネルギーを発生させる。例えば
630nmの可視赤色領域の２つの光子は紫外領域の315nmの
光を通常は吸収する蛍光体を励起するために結合され、
また例えば赤色領域の1070nmの２つの光子は可視光領域
の535nmの光子を吸収する蛍光体を励起する。
本発明の変形例では単一波長の光源16が２つの異なる
長い波長のレーザ光源によって置き換えられ、入射光ビ
ーム14は高い瞬間パワーを有し、かつ波長の異なる２つ
の重畳されたパルス光ビームからなる。入射ビームの各
波長は短い波長での吸収体である蛍光体を励起するべく
選択され、それは以下のように表される。
1/λabs＝1/λ１＋1/λ２ λabsは吸収体の短い波長であり、λ1,λ２は入射レ
ーザビームの波長である。
２光子励起においては典型的な２光子断面積δ： δ＝10-58m4s/光子 …（式１） 上記のパルスパラメータ（100fsec.,反復率80MHz）： さらに開口数Ａ＝1.4のレンズによって結像されたビ
ーム： 約50mWの平均入射レーザパワー（p0）の条件で各パル
スあたり、各蛍光体あたり１つの光子が吸収される制限
において蛍光体の蛍光体出力が飽和する。蛍光体あた
り、パルスあたりに吸収される光子の数naは以下の関係
式によって与えられる。
ここでτはパルス幅;fは反復率;P0は平均入射レーザ
パワー；δは光子吸収断面積； はプランク常数;cは光の速度;Aは結像レンズの開口数。
蛍光輻射はパルス繰返周波数を典型的には以下の式で
表される蛍光の寿命の逆数まで増大することによって増
大される。
τf -1＝109S-1 …（式３） 比較のため１光子蛍光の飽和は約3mWの入射パワーで
生ずる。
第２図は本発明に係る２光子技術によって達成された
深度判別を示す。画像60および62のステレオ対が通常は
約365nmの波長を有する紫外線によって励起される９マ
イクロメートルの直径のラテックスビートの蛍光体のク
ラスターの画像の積み重ねから発生されたこれらの画像
は標準的なレーザ走査顕微鏡を用いて得られたが、連続
波アルゴンイオンレーザ照明器16を約630nmの波長で出
力パルスを生成する25mWのコライディング・パルス・モ
ード・ロック・ダイレーザによって置き換えた。顕微鏡
10について行われた測定の結果、目標面では約3mWに達
したことを示していた。380〜445nmの波長を通過させる
照射フィルタがバリアフィルタ46に設けられるととも
に、検出器開口54が小さな共焦開口に起因する光学的し
きり効果を減少させるために、その境界に開口された。
レーザ16からの入射ビーム14の強度はレーザ16と２色
ミラー26との間において励起ビーム中に中性濃度フィル
タを置くことによって調整され、個々のラテックスビー
ドによって生成される青色蛍光が特定された。第３図に
グラフ64で示されるように試料を合成するラテックスビ
ードからの蛍光の検出強度は励起レーザパワーの２乗に
比例して増大しており、このことは明らかにビード内で
の２光子励起の発生を示している。ポリサイエンシーズ
・コーポレイション製のフルオレスブライトBBビードを
用いたビードの励起断面積がビード内の染料濃度、レー
ザ走査顕微鏡の光学的スループット、パルス幅、反復
率、開口数および入射パワー等を考慮して、ファクタ３
の範囲の精度で５×10-58M4s/光子であると推定され
た。この値は同様の染料に対して以前に測定された値に
匹敵するものである。
第４図は分割された細胞（LLC−PK1;attc）内の染色
体の走査画像であり、紫外線で励起可能な蛍光染料（33
258;ヘキスト）でラベル付けされたセルーラDNAを用い
た。画像認識時間は13秒で、これは数分の漂白時間に比
して短いものである。さらに数分の間走査レーザによっ
て照射した後においても、これら生きた細胞内には何ら
の劣化も現れなかった。
第５図にビード72の光漂白による輝度の減少された水
平断面70によって示されるように長時間の蛍光ビードの
走査の間の光漂白は焦点面の回りの約２マイクロメータ
ーの厚みの薄片においてのみ発生している。このビード
は一定の焦点面において約６分間走査されたものであ
る。同様の漂白の局所化は蛍光で染色された細胞核にお
いても検出された。この局所化は単一光子励起の使用に
対して明らかな利点を示しており、単一光子励起では一
つの面が画像化される場合においてさえ、試料全体が漂
白されてしまう。このことは単一光子励起ゆえであっ
て、走査を広い視野の観察の両方における漂白は時間平
均の励起強度に依存し、その強度は軸方向すなわち第１
図のＺ方向に沿って変化しない。２光子励起においては
漂白は焦点面の上側もしくは下側においては大きく低下
する時間平均強度に依存する。
励起強度の２乗に依存する蛍光信号は２光子励起のい
ま一つの利点に対応するものであって、このような励起
は空間フィルタとして使用されるピンホールを用いる必
要なしに全視野を視覚する、例えばCCDアレイのような
検出器を用いた場合にさえ試料の光学的な裁断効果をも
たらす。第５図に図示されているように、この裁断効果
は対物レンズにおける色収差や従来の共焦レーザ走査顕
微鏡のスループット損失に関連する深刻な問題を回避す
ることができる。２光子光分解はケージド（caged）CA
++、H+、ヌクレオチドや神経伝達媒体などの生物学的に
活性な化学物質の高速かつ局所的な放出にも適用するこ
とができる。
例えばケージド神経伝達物質が、走査ビームによって
放出されたときに、発生された全細胞転移膜電流は、細
胞表面上のそれら神経伝達物質に対する受容体活動の分
布をマップ化するためのコントラスト発生機構として使
用することができる。本発明によれば、２光子かご閉込
光分解の実現可能性が、DMNPEでケージドATP（33mM）
［オレゴン・オイジーンのモレキュラー プローブス
（Molecular Probes）によって提供される］を照射す
ることによって、対物面において約10マイクロメータの
直径のくびれのビームに結像されるコライディング・パ
ルス・モード・ロック・ダイレーザ16によって証明され
た。ATP約10-11モルの光分解量が、カリホルニヤ、サン
ジエゴのカルバイオケム（Calbiochem）によって提供さ
れるルシフェリンバイオルミネッサンス検定を用いて測
定された。典型的には、約107（μｍ）３のアリコート
体積内のATPの約10％が約600秒の間に、約104（μｍ）
３の照射体積内において光分解された。
本発明による２光子励起は、単一紫外線光子の励起に
対応する励起エネルギーへの可視光によるアクセスをあ
たえるので、全く新しいクラスの蛍光体や蛍光指示薬が
３次元分解能を有するレーザ走査顕微鏡に受け入れ可能
となった。この種の指示薬として、Ca+2に対してはIndo
−１、Mg+2に対してはMag−Indo−１、Na+に対してはAB
F1、K+に対してはPBFI等がある。これら化合物の多くに
ついて２光子吸収断面積は未だ知られていないが、２光
子吸収には異なる選択則が適用され、分子の不整は同じ
励起状態への１光子および２光子遷移の両方を可能にす
る。Indo−１、FURA−２、Hoechst33258、Hoechst3334
2、DANSYLヒドラジン［Molecular Probes］、Stilbene
420［Exciton Chem.Co.,Dayton,OH］および複雑のクー
マリン染料の10mMの溶液から、直径25μｍのくびれに弱
く結像させたCMPを用いた励起に際して可視蛍光が観察
され、DANSYLとCoumarin440の微結晶の２光子励起LSM蛍
光画像が記録された。
本発明のいま一つの効用は書込みおよび読取り動作の
ための二つの横断ビームにおける多光子プロセスに依存
する３次元の光学メモリ装置である。単一ビームは二つ
の横断ビームより簡単であり、最大の情報綴じ込み密度
を可能にするであろう。多光子プロセスは焦点において
極めて高い強度の領域に局所化され、第５図に示す例で
は蛍光ビードの内側の顕微鏡パターンの漂白は現行の蛍
光体で約103回読取り可能な高密度書込み専用メモリを
構成する。
以上のように生物学的な或は他の応用のための実用的
な２光子レーザ走査顕微鏡が図示されて、かつ説明され
た。２光子励起の蛍光顕微鏡は共焦点レーザ走査顕微鏡
によって得られるものと匹敵するような視野深度を有す
る固有の３次元的な分解能を与える。２光子励起との関
係で共焦点ピンホールを用いると、３軸すべてに沿って
分解能を改善することができる。背景蛍光は異なった入
力パワーの下で記録された画像の定量化された減算によ
って取り除くことができる。この技術を用いると光漂白
ならびに光力学的なダメージは焦点面の近傍に限定する
ことができ、それによって、細胞や蛍光体に対する紫外
線によるダメージはエネルギが実際に集められる体積に
限定されることから、３次元的な再構成のためのデータ
の認識のための共焦点レーザ走査顕微鏡法および領域検
出画像化いずれに対しても相当な利点を与えることがで
きる。このことは光分解や光活性化などの光化学プロセ
スを結像体積内に鋭く局所化することを可能にする。本
発明は主として単一レーザを用いた２光子励起の利用に
ついて説明したが、足し合わすことによって目的物質の
励起波長になる二つの異なる波長を有する二つの光源か
らの二つの光子を用いることによっても目的物質の励起
を発生することができる。例えば二つの異なるレーザ光
源はそれらの出力ビームを顕微鏡の光路に共軸的に指向
させることによって用いることができる。さらには周波
数の２倍化手段を用いて二つの異なる波長を単一の光源
から発生することもできる。
以上のように本発明は好ましい実施例との関係で記述
したが、添付の請求の範囲において規定された本発明の
技術思想と範囲を逸脱することなく、種々の変形や修正
が当業者にとって可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェッブ、ウォット・ダブリュー アメリカ合衆国14850ニューヨーク州イ サカ、ハイランド・ロード409番 (56)参考文献 特開 昭63−131116（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−15746（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃ ｓ Ｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｖｏｌ．８（1975) ｐｐ．530−532 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ Ｖｏ ｌ．17 Ｎｏ．18（1978）ｐｐ．2879− 2882 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓ ｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄ ｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉ ｏｎ Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．３ ｐｐ. 230−234 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/64

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】目的物（20）のレーザ走査蛍光顕微鏡装置
    （10）は以下のものを含む： 特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発
    生する蛍光成分を含む目的物（20）を支持するステージ
    手段（22）； 光を上記ステージ手段に指向させるように配置されると
    ともに上記ステージ手段（22）における上記目的物（2
    0）内に目標面を有する結像手段（40,12）； 上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブ
    ピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（1
    6）；および 上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に
    沿って指向させる手段； 上記結像手段（40,12）は上記目標面上の結像体積（2
    6）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（2
    2）における目的物（20）に入射させ、複数の光子が組
    合さって上記蛍光成分内に蛍光を誘起する。
  2. 【請求項２】上記反復発生源（16）からの上記光は上記
    結像手段（40,12）によってサブミクロンの直径の結像
    体積（26）を形成するように結像される、請求項１の装
    置。
  3. 【請求項３】上記結像手段（40,12）は、上記目標面（1
    8）の相対向する側で収束し、発散する光を生成するた
    め上記光を円錐形状に結像し、それによって上記光は上
    記目標面（18）上の上記結像体積（26）に集中される、
    請求項１又は２の装置。
  4. 【請求項４】上記結像体積（26）とステージ手段（22）
    との相対位置は可変である、請求項１から３のいずれか
    １に記載の装置。
  5. 【請求項５】上記結像手段（40,12）は上記目的物（2
    0）内の上記結像体積（26）に上記光を結像させ、ある
    制限された楕円体積内において蛍光を励起する光強度を
    発生させる、請求項１から３のいずれか１に記載の装
    置。
  6. 【請求項６】特性エネルギの単一光子によって蛍光光子
    を発生するように励起される蛍光成分を含む目的物（2
    0）に対し２光子励起技術を用いたレーザ走査蛍光顕微
    鏡法は、以下のステップを有する： 上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなる単色
    コヒーレントレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビー
    ムで上記目的物（20）を反復して照射する；および 上記目的物（20）内の小さな結像体積（26）に上記照射
    光を結像して、上記結像体積においてのみ入射する２個
    の照射光子の同時吸収による分子励起を誘起するに十分
    な高い照射強度を生成し、上記蛍光成分内に蛍光を誘起
    するとともに誘起された蛍光を検出する。
  7. 【請求項７】入射光子のエネルギは特性エネルギの半分
    である、請求項６の方法。
  8. 【請求項８】上記結像手段（40,12）は上記目的物（2
    0）内において異なる深さの結像体積（26）を選択しう
    るように調節可能である、請求項１の装置。
  9. 【請求項９】既知の特性エネルギの光による単一光子励
    起に対応する分子励起を目的物（20）内に誘起するため
    の装置（１）は以下のものを備える： 目標面（18）； 上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（22）； サブピコ秒の光パルスを供給する手段（16）、上記光パ
    ルスは上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子
    からなる； 上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（40,1
    2）； 上記光子の光パルスを上記結像手段（40,12）を含む光
    路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上
    記結像手段（40,12）は上記光子を上記目的物内の結像
    体積（26）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射
    光子を上記結像体積（26）内において上記目的物内に分
    子励起を誘起するに十分なエネルギを生成する。
  10. 【請求項１０】上記生物学的目的物（20）に関して上記
    結像体積（26）を移動させる走査手段（32,34）をさら
    に含む、請求項９の装置。
  11. 【請求項１１】上記目的物は、既知の特性エネルギを持
    つ単一光子によって通常は励起されるとともに、上記特
    性エネルギより低いエネルギを有する少なくとも２つの
    光子に対して上記励起を生ずる生物学的細胞を含む、請
    求項1,9又は10に記載の装置。
  12. 【請求項１２】上記レーザ光源と光路は、生物学的に活
    性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結
    像点における励起に応答して目的物を走査するように適
    合されている、請求項11の装置。
  13. 【請求項１３】上記目的物は光子活性化試薬である、請
    求項９又は10の装置。
  14. 【請求項１４】上記目的物は光学メモリを有する、請求
    項９又は10の装置。
  15. 【請求項１５】上記目的物は、上記誘起された分子励起
    に応答して生物学的に活性な化学物質を放出する、請求
    項９の装置。
  16. 【請求項１６】上記誘起された分子励起は上記目的物内
    に対応する蛍光を発生し、上記装置は上記目的物内にお
    いて結像体積を移動させる走査手段および 上記蛍光に応答して上記目的物内の蛍光体を図解する検
    出手段とをさらに含む、請求項15の装置。
  17. 【請求項１７】上記目的物は、紫外光によって単一光子
    励起を生じ、上記光パルスは可視光である、請求項９の
    装置。
  18. 【請求項１８】上記サブピコ秒の光パルスを供給する手
    段が、少なくとも１つのレーザ光源を備える、請求項１
    又は９の装置。
  19. 【請求項１９】上記サブピコ秒の光パルスを供給する手
    段が、少なくとも２つの波長のパルスを生成し、各波長
    は上記既知の特性エネルギより低いエネルギの光子を含
    む、請求項１又は９の装置。
  20. 【請求項２０】上記目的物は、生物学的に活性な物質で
    ある、請求項１又は９の装置。
  21. 【請求項２１】上記目的物内において、上記結像体積を
    移動させて上記目的物の空間的に分解された分子励起を
    発生させる手段をさらに含む、請求項９の装置。
  22. 【請求項２２】特性エネルギを有する光子によって励起
    可能な分子を含む生物学的な目的物（20）の分子励起を
    発生させる方法は、以下のステップを備える； 上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレ
    ーザ光のサブピコ秒のパルスビームで上記目的物を照射
    する；および 上記照射を上記目的物（20）内の小さい結像体積に結像
    させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個
    の上記入射照射光子の同時吸収によって分子励起を生成
    するのに十分高い照射強度を生成する。
  23. 【請求項２３】上記入射光子は上記特性エネルギの少な
    くとも半分である、請求項22による方法。
  24. 【請求項２４】上記目的物は、生物学的に活性なケージ
    ド分子を含んでおり、上記結像体積内の照射強度は入射
    光子の同時吸収により生物学的に活性なケージド化合物
    を放出させるのに十分である、請求項22又は23の方法。
  25. 【請求項２５】上記目的物は、蛍光を発生する励起に応
    答する生物学的細胞を含み、さらに、上記蛍光を測定す
    ることを含む、請求項22又は23の方法。
  26. 【請求項２６】上記目的物は、光学メモリであり、さら
    に上記蛍光を測定することを含む、請求項22又は23の方
    法。
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