JPH05286998A - トリ−アルギニンインスリン - Google Patents
トリ−アルギニンインスリンInfo
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- JPH05286998A JPH05286998A JP4314836A JP31483692A JPH05286998A JP H05286998 A JPH05286998 A JP H05286998A JP 4314836 A JP4314836 A JP 4314836A JP 31483692 A JP31483692 A JP 31483692A JP H05286998 A JPH05286998 A JP H05286998A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 次式の化合物、並びに当該化合物含有糖尿病
治療剤。 〔ＸとＺはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｘ、
Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒまたは
Ｖａｌから、ＹはＨｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕから選択
される。〕 【効果】 pＨ６.１までの溶解特性を有するものとして
製剤化でき、長期の血糖低下活性を有する。
治療剤。 〔ＸとＺはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｘ、
Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒまたは
Ｖａｌから、ＹはＨｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕから選択
される。〕 【効果】 pＨ６.１までの溶解特性を有するものとして
製剤化でき、長期の血糖低下活性を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床薬物の分野に属し、
糖尿病の治療に有用な新しい型のインスリンを提供する
ものである。
糖尿病の治療に有用な新しい型のインスリンを提供する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】現在の糖尿病治療の大部分は、中および
長時間作用型のインスリン製品を用いる治療からなる。
これら製剤は、多くの患者の夜間のグルコース濃度を制
御し、１日１回の注射による治療を提供するように設計
されている。
長時間作用型のインスリン製品を用いる治療からなる。
これら製剤は、多くの患者の夜間のグルコース濃度を制
御し、１日１回の注射による治療を提供するように設計
されている。
【０００３】これら全ての製剤の共通した特徴は、それ
らがインスリンの不溶性懸濁液であるという事実であ
る。このため、注射量は幅広く変化し、皮下注射後のグ
ルコース制御が損なわれることがある[Skyler,J.S.: Me
dical Clinics of North America, 72, 1337-1354 (198
8)]。さらにこれら製剤の多くは、長時間の作用を得る
ためにかなり多量のプロタミンの添加を必要とする。プ
ロタミンは、患者の一部において抗体生成を惹起するこ
とが示されている魚類タンパク質である[Ellerhorst,J.
A.ら: The American Journal of the Medical Science
s, 299, 298-301 (1987)]。
らがインスリンの不溶性懸濁液であるという事実であ
る。このため、注射量は幅広く変化し、皮下注射後のグ
ルコース制御が損なわれることがある[Skyler,J.S.: Me
dical Clinics of North America, 72, 1337-1354 (198
8)]。さらにこれら製剤の多くは、長時間の作用を得る
ためにかなり多量のプロタミンの添加を必要とする。プ
ロタミンは、患者の一部において抗体生成を惹起するこ
とが示されている魚類タンパク質である[Ellerhorst,J.
A.ら: The American Journal of the Medical Science
s, 299, 298-301 (1987)]。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】組換えＤＮＡ技術の出
現により、製剤中で完全に溶解性のままであり、また、
天然のインスリンよりさらに迅速またはさらに長時間の
作用を有する数多くのインスリン類似体が合成されてい
る[Markussen,J.ら: Protein Engineering, 1, 215-223
(1987)]。より長時間作用型のインスリン類似体のため
の最も有望なアプローチは、低いpＨ(pＨ３〜４)で完全
に溶解性であるように製剤化することである。皮下注射
後、体内環境の自然pＨ(pＨ７.４)への瞬時の調節は、
これらの類似体の沈殿または結晶化をもたらす。pＨ７.
４でのそれらの緩やかな再溶解は、所望の作用の時間的
遅れをもたらす。
現により、製剤中で完全に溶解性のままであり、また、
天然のインスリンよりさらに迅速またはさらに長時間の
作用を有する数多くのインスリン類似体が合成されてい
る[Markussen,J.ら: Protein Engineering, 1, 215-223
(1987)]。より長時間作用型のインスリン類似体のため
の最も有望なアプローチは、低いpＨ(pＨ３〜４)で完全
に溶解性であるように製剤化することである。皮下注射
後、体内環境の自然pＨ(pＨ７.４)への瞬時の調節は、
これらの類似体の沈殿または結晶化をもたらす。pＨ７.
４でのそれらの緩やかな再溶解は、所望の作用の時間的
遅れをもたらす。
【０００５】このアプローチにおける２つの問題は以下
の通りである。まず第一に、強酸性の溶液の長期投与
は、疼痛、皮膚の壊死および腐肉を引き起こすことがあ
る[DeLuca,P.P.およびRapp,R.P.: Pharmaceutics an Ph
armacy Practice; Banker,G.S.およびChalmers,R.K.編;
238-278 (1982), J.B. Lippencott Co., Philadelphi
a, PA]。より中性に近い溶液(pＨ６〜７)が、この点に
おいて一層好ましいのは明らかであろう。第二に、イン
スリン類似体は体にとって自然のものではなく、非自己
として認識されることがあるため、これらインスリン類
似体に対する抗体が産生され、それらが患者のインスリ
ン治療に干渉したり他の問題を起こす可能性がある[Pat
terson, R.ら: Annals of Allergy, 64, 459-462 (199
0)]。そのようなタンパク質の構造における変化を最小
限にすることによりこの問題の可能性を回避することが
できるであろう。
の通りである。まず第一に、強酸性の溶液の長期投与
は、疼痛、皮膚の壊死および腐肉を引き起こすことがあ
る[DeLuca,P.P.およびRapp,R.P.: Pharmaceutics an Ph
armacy Practice; Banker,G.S.およびChalmers,R.K.編;
238-278 (1982), J.B. Lippencott Co., Philadelphi
a, PA]。より中性に近い溶液(pＨ６〜７)が、この点に
おいて一層好ましいのは明らかであろう。第二に、イン
スリン類似体は体にとって自然のものではなく、非自己
として認識されることがあるため、これらインスリン類
似体に対する抗体が産生され、それらが患者のインスリ
ン治療に干渉したり他の問題を起こす可能性がある[Pat
terson, R.ら: Annals of Allergy, 64, 459-462 (199
0)]。そのようなタンパク質の構造における変化を最小
限にすることによりこの問題の可能性を回避することが
できるであろう。
【０００６】中時間作用性かつpＨ４〜５で好ましい溶
解特性を有する１つのインスリン類似体、すなわちジ−
アルギニンインスリン(ジ−Ａrg−インスリン)は既に開
示されている[Zeuzem,S.ら: Diabetologia, 33, 65-71
(1990)]。しかし、ジ−Ａrg−インスリンは、pＨ６付近
で溶解性であるという本発明の利点の１つを欠いてい
る。さらに本発明の化合物は、ジ−Ａrg−インスリンよ
りも優れた時間作用特性を示す。
解特性を有する１つのインスリン類似体、すなわちジ−
アルギニンインスリン(ジ−Ａrg−インスリン)は既に開
示されている[Zeuzem,S.ら: Diabetologia, 33, 65-71
(1990)]。しかし、ジ−Ａrg−インスリンは、pＨ６付近
で溶解性であるという本発明の利点の１つを欠いてい
る。さらに本発明の化合物は、ジ−Ａrg−インスリンよ
りも優れた時間作用特性を示す。
【０００７】強酸性の製剤について既述した生理学的な
問題に加えて、天然のインスリン様分子は低pＨで他の
問題を有している。酸性条件下で、Ａ鎖の２１番目の位
置(Ａ２１)にあるアスパラギン残基は脱アミド化および
他の副反応を起こしやすく、これらが好ましくない二量
体およびポリマー形成を導き得る[Markussen,J.ら: Pro
tein Engineering, 2, 157-166 (1988)]。これらの反応
はpＨ４以下で最も進行し、pＨ５以上ではほとんど存在
しない[同上]。従って、ヒトの治療という点において
は、長期の血糖低下作用、低い免疫原性およびpＨ６以
上での製剤溶解性を有するインスリン様分子を用いるこ
とが最も好ましいであろう。
問題に加えて、天然のインスリン様分子は低pＨで他の
問題を有している。酸性条件下で、Ａ鎖の２１番目の位
置(Ａ２１)にあるアスパラギン残基は脱アミド化および
他の副反応を起こしやすく、これらが好ましくない二量
体およびポリマー形成を導き得る[Markussen,J.ら: Pro
tein Engineering, 2, 157-166 (1988)]。これらの反応
はpＨ４以下で最も進行し、pＨ５以上ではほとんど存在
しない[同上]。従って、ヒトの治療という点において
は、長期の血糖低下作用、低い免疫原性およびpＨ６以
上での製剤溶解性を有するインスリン様分子を用いるこ
とが最も好ましいであろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、本明細書中で
トリ−アルギニンインスリン(トリ−Ａrg−インスリン)
およびトリ−アルギニンインスリン類似体と称する特定
の型のインスリン類似体であって、インスリンの天然の
構造に加えて３つの付加的なアルギニン残基を有するイ
ンスリン類似体が、動物モデルにおいて長期の血糖低下
作用を有し、pＨ６.１までの溶液として製剤化し得ると
いう発見に基づいている。
トリ−アルギニンインスリン(トリ−Ａrg−インスリン)
およびトリ−アルギニンインスリン類似体と称する特定
の型のインスリン類似体であって、インスリンの天然の
構造に加えて３つの付加的なアルギニン残基を有するイ
ンスリン類似体が、動物モデルにおいて長期の血糖低下
作用を有し、pＨ６.１までの溶液として製剤化し得ると
いう発見に基づいている。
【０００９】本発明は以下の式：
【化２】 [式中、ＸおよびＺはＡla、Ａrg、Ａsx、Ｃys、Ｇlx、
Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ｌys、Ｍet、Ｐhe、Ｐro、Ｓ
er、Ｔhr、Ｔrp、ＴyrまたはＶalからなる群から選択さ
れ、ＹはＨis、ＡspまたはＧluからなる群から選択され
る]で示される化合物またはその薬学的に許容し得る非
毒性の塩に関する。最も好ましい化合物は、天然のアミ
ノ酸を可変位置に含有する化合物、すなわち上記式にお
いてＸがＡsn、ＹがＨis、そしてＺがＡsnである化合物
である。
Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ｌys、Ｍet、Ｐhe、Ｐro、Ｓ
er、Ｔhr、Ｔrp、ＴyrまたはＶalからなる群から選択さ
れ、ＹはＨis、ＡspまたはＧluからなる群から選択され
る]で示される化合物またはその薬学的に許容し得る非
毒性の塩に関する。最も好ましい化合物は、天然のアミ
ノ酸を可変位置に含有する化合物、すなわち上記式にお
いてＸがＡsn、ＹがＨis、そしてＺがＡsnである化合物
である。
【００１０】さらに本発明は、Ｂ鎖の３番目の残基(Ｂ
３)およびＡ鎖の２１番目の残基(Ａ２１)がＡla、Ａr
g、Ａsx、Ｃys、Ｇlx、Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ｌy
s、Ｍet、Ｐhe、Ｐro、Ｓer、Ｔhr、Ｔrp、Ｔyrまたは
Ｖalからなる群から選択され、Ｂ鎖の１０番目の残基
(Ｂ１０)がＨis、ＡspまたはＧluからなる群から選択さ
れ、かつ、Ｃ−ペプチドの６４番目の残基(Ｌys−６４)
とＣ−ペプチドの６５番目の残基(Ａrg６５)の間のアミ
ド結合(ペプチド結合)が壊されているヒトプロインスリ
ンからなるスプリット(６４)プロインスリン−トリ−ア
ルギニン−類似体またはその薬学的に許容し得る塩を包
含する。
３)およびＡ鎖の２１番目の残基(Ａ２１)がＡla、Ａr
g、Ａsx、Ｃys、Ｇlx、Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ｌy
s、Ｍet、Ｐhe、Ｐro、Ｓer、Ｔhr、Ｔrp、Ｔyrまたは
Ｖalからなる群から選択され、Ｂ鎖の１０番目の残基
(Ｂ１０)がＨis、ＡspまたはＧluからなる群から選択さ
れ、かつ、Ｃ−ペプチドの６４番目の残基(Ｌys−６４)
とＣ−ペプチドの６５番目の残基(Ａrg６５)の間のアミ
ド結合(ペプチド結合)が壊されているヒトプロインスリ
ンからなるスプリット(６４)プロインスリン−トリ−ア
ルギニン−類似体またはその薬学的に許容し得る塩を包
含する。
【００１１】さらに他の態様において、本発明は、Ｌys
−６４が除去されているスプリット(６４)プロインスリ
ン−トリ−アルギニン類似体からなるデス(６４)プロイ
ンスリン−トリ−アルギニン類似体またはその薬学的に
許容し得る塩を包含する。最も好ましい化合物は、天然
のアミノ酸を可変位置に含む化合物、すなわちＢ３およ
びＡ２１残基がＡsnであり、Ｂ１０残基がＨisである化
合物である。
−６４が除去されているスプリット(６４)プロインスリ
ン−トリ−アルギニン類似体からなるデス(６４)プロイ
ンスリン−トリ−アルギニン類似体またはその薬学的に
許容し得る塩を包含する。最も好ましい化合物は、天然
のアミノ酸を可変位置に含む化合物、すなわちＢ３およ
びＡ２１残基がＡsnであり、Ｂ１０残基がＨisである化
合物である。
【００１２】さらに他の態様において本発明は、以下の
工程からなるヒトのトリ−Ａrg−インスリンの製造方法
に関する： ａ)ヒトプロインスリンをトリプシンおよびカルボキシ
ペプチダーゼＢと接触させてデス(６４)ヒトプロインス
リンを得； ｂ)デス(６４)ヒトプロインスリンを単離し； ｃ)デス(６４)ヒトプロインスリンをトリプシンと接触
させ、そして； ｄ)トリ−Ａrg−インスリンを単離する。
工程からなるヒトのトリ−Ａrg−インスリンの製造方法
に関する： ａ)ヒトプロインスリンをトリプシンおよびカルボキシ
ペプチダーゼＢと接触させてデス(６４)ヒトプロインス
リンを得； ｂ)デス(６４)ヒトプロインスリンを単離し； ｃ)デス(６４)ヒトプロインスリンをトリプシンと接触
させ、そして； ｄ)トリ−Ａrg−インスリンを単離する。
【００１３】さらに別の態様において本発明は、以下の
工程からなるヒトトリ−Ａrg−インスリンの製造方法に
関する： ａ)ヒトプロインスリンのＬys−６４とＡrg−６５の間
のペプチド結合を選択的に破壊するような条件下で、ヒ
トプロインスリンをリジンエンドペプチダーゼと接触さ
せてスプリット(６４)ヒトプロインスリンを得； ｂ)スプリット(６４)ヒトプロインスリンを単離し； ｃ)スプリット(６４)ヒトプロインスリンをトリプシン
と接触させ、そして； ｄ)ヒトトリ−Ａrg−インスリンを単離する。
工程からなるヒトトリ−Ａrg−インスリンの製造方法に
関する： ａ)ヒトプロインスリンのＬys−６４とＡrg−６５の間
のペプチド結合を選択的に破壊するような条件下で、ヒ
トプロインスリンをリジンエンドペプチダーゼと接触さ
せてスプリット(６４)ヒトプロインスリンを得； ｂ)スプリット(６４)ヒトプロインスリンを単離し； ｃ)スプリット(６４)ヒトプロインスリンをトリプシン
と接触させ、そして； ｄ)ヒトトリ−Ａrg−インスリンを単離する。
【００１４】図１はトリ−Ａrg−インスリンおよびトリ
−Ａrg−インスリン類似体の１次アミノ酸配列を示し、
３つのジスルフィド架橋を示している。各残基の下の数
字はアミノ末端を起点とする配列中の残基位置に対応し
ている。Ｂ鎖の３番目の位置にあるＸという表示は、２
０の天然アミノ酸のいずれか１つを表している。Ｂ鎖の
１０番目の位置にある表示Ｙは、Ｈis、ＡspまたはＧlu
を表し、Ａ鎖カルボキシ末端の表示Ｚは天然に存在する
２０のアミノ酸のいずれか１つを表す。
−Ａrg−インスリン類似体の１次アミノ酸配列を示し、
３つのジスルフィド架橋を示している。各残基の下の数
字はアミノ末端を起点とする配列中の残基位置に対応し
ている。Ｂ鎖の３番目の位置にあるＸという表示は、２
０の天然アミノ酸のいずれか１つを表している。Ｂ鎖の
１０番目の位置にある表示Ｙは、Ｈis、ＡspまたはＧlu
を表し、Ａ鎖カルボキシ末端の表示Ｚは天然に存在する
２０のアミノ酸のいずれか１つを表す。
【００１５】図２は、ヒトプロインスリンの１次アミノ
酸配列を示す。黒で示された残基は天然のヒトインスリ
ンを示し、白で示された残基は天然ヒトプロインスリン
の結合ペプチド(Ｃ−ペプチド)を示す。
酸配列を示す。黒で示された残基は天然のヒトインスリ
ンを示し、白で示された残基は天然ヒトプロインスリン
の結合ペプチド(Ｃ−ペプチド)を示す。
【００１６】本明細書においては、天然に存在するタン
パク質に通常見られる２０のＬ−アミノ酸はＣode of
Ｆederal Ｒegulations §１.８２２の３７巻に記載さ
れている標準３文字省略形を用いて略す。さらに本明細
書においては、数多くの用語を以下の定義に従って用い
る。
パク質に通常見られる２０のＬ−アミノ酸はＣode of
Ｆederal Ｒegulations §１.８２２の３７巻に記載さ
れている標準３文字省略形を用いて略す。さらに本明細
書においては、数多くの用語を以下の定義に従って用い
る。
【００１７】"トリ−Ａrg−インスリン"という用語は、
Ｂ鎖のカルボキシ末端に２つの付加的なアルギニン残基
を有し(図１および２に示されるＡrg−３１およびＡrg
−３２)、Ａ鎖のアミノ末端に１つの付加的なアルギニ
ン残基を有する(図１に示されるＡ鎖のＡrg−０、また
は図２に示されるＡrg−６５)ヒトインスリンとして定
義される。
Ｂ鎖のカルボキシ末端に２つの付加的なアルギニン残基
を有し(図１および２に示されるＡrg−３１およびＡrg
−３２)、Ａ鎖のアミノ末端に１つの付加的なアルギニ
ン残基を有する(図１に示されるＡ鎖のＡrg−０、また
は図２に示されるＡrg−６５)ヒトインスリンとして定
義される。
【００１８】"トリ−Ａrg−インスリン類似体"という用
語は、２０の天然に存在するアミノ酸のうちいずれか１
つでＢ３またはＡ２１の位置のどちらか一方または両方
が置換され、さらにＨis、ＡspまたはＧluでＢ１０の位
置が置換されていることもあるトリ−Ａrg−インスリン
として定義される。
語は、２０の天然に存在するアミノ酸のうちいずれか１
つでＢ３またはＡ２１の位置のどちらか一方または両方
が置換され、さらにＨis、ＡspまたはＧluでＢ１０の位
置が置換されていることもあるトリ−Ａrg−インスリン
として定義される。
【００１９】"プロインスリン−トリ−アルギニン類似
体"という用語は、本発明に合致するように、可能なＢ
３、Ｂ１０およびＡ２１置換のいずれかを含むヒトプロ
インスリンを意味する。
体"という用語は、本発明に合致するように、可能なＢ
３、Ｂ１０およびＡ２１置換のいずれかを含むヒトプロ
インスリンを意味する。
【００２０】"スプリット(６４)プロインスリン"という
用語は、Ｌys−６４およびＡrg−６５(Ａrg−０、Ａ鎖)
の間のペプチド結合が分断されているヒトプロインスリ
ン（図１よび２を参照）として定義される。
用語は、Ｌys−６４およびＡrg−６５(Ａrg−０、Ａ鎖)
の間のペプチド結合が分断されているヒトプロインスリ
ン（図１よび２を参照）として定義される。
【００２１】"スプリット(６４)プロインスリン−トリ
−アルギニン類似体"という用語は、本発明に従う１ま
たはそれ以上のアミノ酸置換がＢ３、Ｂ１０またはＡ２
１の位置になされるスプリット(６４)プロインスリンと
して定義される。
−アルギニン類似体"という用語は、本発明に従う１ま
たはそれ以上のアミノ酸置換がＢ３、Ｂ１０またはＡ２
１の位置になされるスプリット(６４)プロインスリンと
して定義される。
【００２２】"デス(６４)プロインスリン"という用語
は、Ｌys−６４が除去されているスプリット(６４)プロ
インスリン(図１および２を参照)として定義される。
は、Ｌys−６４が除去されているスプリット(６４)プロ
インスリン(図１および２を参照)として定義される。
【００２３】"デス(６４)プロインスリン−トリ−アル
ギニン類似体"という用語は、本発明に従う１またはそ
れ以上のアミノ酸置換がＢ３、Ｂ１０またはＡ２１の位
置になされるデス(６４)プロインスリンとして定義され
る。
ギニン類似体"という用語は、本発明に従う１またはそ
れ以上のアミノ酸置換がＢ３、Ｂ１０またはＡ２１の位
置になされるデス(６４)プロインスリンとして定義され
る。
【００２４】"薬学的に許容し得る非毒性の酸付加塩"と
いう用語は、有機および無機の酸付加塩の両方を包含
し、例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル
酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン
酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコ
ルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ナフタリンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸などの
酸または重炭酸アンモニウムなどの塩から製造される塩
が含まれる。好ましい酸付加塩は、塩酸、酢酸または炭
酸から製造される塩である。上記のいずれの塩も常法に
より製造することができる。
いう用語は、有機および無機の酸付加塩の両方を包含
し、例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル
酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン
酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコ
ルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ナフタリンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸などの
酸または重炭酸アンモニウムなどの塩から製造される塩
が含まれる。好ましい酸付加塩は、塩酸、酢酸または炭
酸から製造される塩である。上記のいずれの塩も常法に
より製造することができる。
【００２５】"カルボン酸塩"の用語は、例えば亜鉛、ア
ンモニウムならびにナトリウム、マグネシウム、カリウ
ムおよびリチウムなどのアルカリ金属の塩を含む。好ま
しいカルボン酸塩は亜鉛およびナトリウム塩である。
ンモニウムならびにナトリウム、マグネシウム、カリウ
ムおよびリチウムなどのアルカリ金属の塩を含む。好ま
しいカルボン酸塩は亜鉛およびナトリウム塩である。
【００２６】本発明は数多くのヒトインスリン類似体お
よびそれらをプロインスリンおよびプロインスリン−ト
リ−アルギニン類似体から製造する方法に関する。本発
明の範囲内にある化合物の一般構造を図１に示し、アミ
ノ酸配列を配列番号：１〜４に記載する。それらの薬学
的に許容し得る非毒性酸付加塩および薬学的に許容し得
る非毒性カルボン酸塩は本発明の化合物に含まれる。
よびそれらをプロインスリンおよびプロインスリン−ト
リ−アルギニン類似体から製造する方法に関する。本発
明の範囲内にある化合物の一般構造を図１に示し、アミ
ノ酸配列を配列番号：１〜４に記載する。それらの薬学
的に許容し得る非毒性酸付加塩および薬学的に許容し得
る非毒性カルボン酸塩は本発明の化合物に含まれる。
【００２７】本発明の化合物にいくつかの予期しなかっ
た有益な性質を与える重要な特徴は、３つの付加的なア
ルギニン残基の存在である。これらの残基のうち２つは
Ｂ鎖のカルボキシ末端に見られ(図１および図２に示さ
れるＡrg−３１およびＡrg−３２)、３つ目の付加的な
アルギニン残基はＡ鎖のアミノ末端に位置する(図１に
示されるＡ鎖のＡrg−０、または図２に示されるＡrg−
６５)。これら３つのアルギニン残基は、天然のヒトプ
ロインスリンの構造に存在するが、天然に存在するヒト
インスリンには存在しない(図２を参照)。
た有益な性質を与える重要な特徴は、３つの付加的なア
ルギニン残基の存在である。これらの残基のうち２つは
Ｂ鎖のカルボキシ末端に見られ(図１および図２に示さ
れるＡrg−３１およびＡrg−３２)、３つ目の付加的な
アルギニン残基はＡ鎖のアミノ末端に位置する(図１に
示されるＡ鎖のＡrg−０、または図２に示されるＡrg−
６５)。これら３つのアルギニン残基は、天然のヒトプ
ロインスリンの構造に存在するが、天然に存在するヒト
インスリンには存在しない(図２を参照)。
【００２８】インスリンＢ鎖の３番目の位置(Ｂ３)は、
インスリン構造に悪影響を与えることなくまたはその生
物活性を破壊することなく他の天然に存在するアミノ酸
と置換して良いことは既知である。従って、この位置の
いかなる天然アミノ酸も本発明の意図するものである。
しかし、免疫原性の可能性を減少させるためにはＡsnが
好ましい。なぜならＡsnは天然のインスリンにおいてそ
の位置を占めるからである。
インスリン構造に悪影響を与えることなくまたはその生
物活性を破壊することなく他の天然に存在するアミノ酸
と置換して良いことは既知である。従って、この位置の
いかなる天然アミノ酸も本発明の意図するものである。
しかし、免疫原性の可能性を減少させるためにはＡsnが
好ましい。なぜならＡsnは天然のインスリンにおいてそ
の位置を占めるからである。
【００２９】上述のことはさらにＡ鎖のカルボキシ末端
の残基(Ａ２１)についても当てはまる。すなわち、Ａ２
１の位置のいかなる天然アミノ酸も本発明の意図するも
のである。しかし、Ａsnが天然のインスリンのＡ２１の
位置を占めるから免疫原性の可能性を低下させるために
はＡsnが好ましい。
の残基(Ａ２１)についても当てはまる。すなわち、Ａ２
１の位置のいかなる天然アミノ酸も本発明の意図するも
のである。しかし、Ａsnが天然のインスリンのＡ２１の
位置を占めるから免疫原性の可能性を低下させるために
はＡsnが好ましい。
【００３０】アミノ酸の置換があってもよい第３番目の
位置は、Ｂ鎖の１０番目の位置(Ｂ１０)である。Ｂ１０
の位置にＧluまたはＡspのどちらかを含むインスリン類
似体は文献に報告されており、増強された有効性を示す
［Burke,G.T.ら: Biochemical and Biophysical Resear
ch Communications, 173, 982-937 (1990)]。従って、
本発明においてはＧlu、ＡspおよびＨisがＢ１０の位置
を占めることもあることが意図されている。しかし、天
然のインスリンにおいてはＨisがＢ１０の位置を占める
から、免疫原性の可能性を低下させるためにＨisが好ま
しい。
位置は、Ｂ鎖の１０番目の位置(Ｂ１０)である。Ｂ１０
の位置にＧluまたはＡspのどちらかを含むインスリン類
似体は文献に報告されており、増強された有効性を示す
［Burke,G.T.ら: Biochemical and Biophysical Resear
ch Communications, 173, 982-937 (1990)]。従って、
本発明においてはＧlu、ＡspおよびＨisがＢ１０の位置
を占めることもあることが意図されている。しかし、天
然のインスリンにおいてはＨisがＢ１０の位置を占める
から、免疫原性の可能性を低下させるためにＨisが好ま
しい。
【００３１】天然ヒトインスリンについても当てはまる
ことであるが、トリ−Ａrg−インスリンおよびトリ−Ａ
rg−インスリン類似体は適切な４次構造のために３つの
ジスルフィド結合を必要とする。図１に示すように、２
つのジスルフィド結合がＡ鎖とＢ鎖を架橋しており(Ａ
７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９)、１つの鎖内ジスルフ
ィド結合がＡ鎖内に形成されている(Ａ６−Ａ１１)。
ことであるが、トリ−Ａrg−インスリンおよびトリ−Ａ
rg−インスリン類似体は適切な４次構造のために３つの
ジスルフィド結合を必要とする。図１に示すように、２
つのジスルフィド結合がＡ鎖とＢ鎖を架橋しており(Ａ
７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９)、１つの鎖内ジスルフ
ィド結合がＡ鎖内に形成されている(Ａ６−Ａ１１)。
【００３２】トリ−Ａrg−インスリンおよびトリ−Ａrg
−インスリン類似体は、周知のタンパク質化学および組
換えＤＮＡ法を用いる多数の方法により製造することが
できる。以下に説明するリストは、トリ−Ａrg−インス
リンおよびトリ−Ａrg−インスリン類似体を合成するた
めのいくつかの基本的な方法を概説するものである。こ
の基本的な方法に他の多くの変更が可能であるから、こ
のリストはそれらを網羅するものではない。 １)実施例１に記載のように、ヒトプロインスリンをト
リプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理する。 ２)実施例２に記載のように、ヒトプロインスリンのＬy
s−６４とＡrg−６５残基の間をリジン−切断エンドペ
プチダーゼにより選択的に切断し、次いで好ましいＡrg
−３２ Ｇlu−３３ペプチド結合を穏やかにトリプシン
切断する。 ３)Ａrg−０のＡ鎖およびＡrg−３１、３２のＢ鎖を組
換えＤＮＡ合成し、次いで既知のジスルフィド化学によ
ってそれらを結合させる。このようなジスルフィド化学
の詳細については、本明細書の一部を構成する米国特許
４,４２１,６８５を参照のこと。 ４)Ａrg−０のＡ鎖およびＡrg−３１、３２のＢ鎖を化
学合成し、次いで既知のジスルフィド化学によってそれ
らを結合させる。 ５)ペプチド配列：Ｂ鎖−Ａrg３１−Ａrg３２−Ａrg３
３−Ａ鎖からなる１本鎖ミニ−プロインスリン分子をr
ＤＮＡ技術によって製造する。ジスルフィド形成の後、
トリプシン様酵素によって選択的に、またはいくらか優
先的にＡrg３２とＡrg３３の間のペプチド結合を切断し
てトリ−Ａrg−インスリンを得る。 ６)構造：Ｘ−Ｂ鎖−Ａrg−Ａrg−Ｙ−Ａrg−Ａ鎖(構造
中、ＸおよびＹはＡrgまたはＬys以外の天然アミノ酸の
いずれかである)で示されるミニ−プロインスリン分子
をrＤＮＡ技術により製造し、正しいジスルフィド配置
で適切に折り畳む。この一本鎖ペプチドのトリプシンに
よる切断はＡrg−Ｙ間にまず生じると予想される。続い
てエドマン法によるＢおよびＡ鎖各々のアミノ末端から
のＸおよびＹの両方の除去により、トリ−Ａrg−インス
リンが生成する。
−インスリン類似体は、周知のタンパク質化学および組
換えＤＮＡ法を用いる多数の方法により製造することが
できる。以下に説明するリストは、トリ−Ａrg−インス
リンおよびトリ−Ａrg−インスリン類似体を合成するた
めのいくつかの基本的な方法を概説するものである。こ
の基本的な方法に他の多くの変更が可能であるから、こ
のリストはそれらを網羅するものではない。 １)実施例１に記載のように、ヒトプロインスリンをト
リプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理する。 ２)実施例２に記載のように、ヒトプロインスリンのＬy
s−６４とＡrg−６５残基の間をリジン−切断エンドペ
プチダーゼにより選択的に切断し、次いで好ましいＡrg
−３２ Ｇlu−３３ペプチド結合を穏やかにトリプシン
切断する。 ３)Ａrg−０のＡ鎖およびＡrg−３１、３２のＢ鎖を組
換えＤＮＡ合成し、次いで既知のジスルフィド化学によ
ってそれらを結合させる。このようなジスルフィド化学
の詳細については、本明細書の一部を構成する米国特許
４,４２１,６８５を参照のこと。 ４)Ａrg−０のＡ鎖およびＡrg−３１、３２のＢ鎖を化
学合成し、次いで既知のジスルフィド化学によってそれ
らを結合させる。 ５)ペプチド配列：Ｂ鎖−Ａrg３１−Ａrg３２−Ａrg３
３−Ａ鎖からなる１本鎖ミニ−プロインスリン分子をr
ＤＮＡ技術によって製造する。ジスルフィド形成の後、
トリプシン様酵素によって選択的に、またはいくらか優
先的にＡrg３２とＡrg３３の間のペプチド結合を切断し
てトリ−Ａrg−インスリンを得る。 ６)構造：Ｘ−Ｂ鎖−Ａrg−Ａrg−Ｙ−Ａrg−Ａ鎖(構造
中、ＸおよびＹはＡrgまたはＬys以外の天然アミノ酸の
いずれかである)で示されるミニ−プロインスリン分子
をrＤＮＡ技術により製造し、正しいジスルフィド配置
で適切に折り畳む。この一本鎖ペプチドのトリプシンに
よる切断はＡrg−Ｙ間にまず生じると予想される。続い
てエドマン法によるＢおよびＡ鎖各々のアミノ末端から
のＸおよびＹの両方の除去により、トリ−Ａrg−インス
リンが生成する。
【００３３】上記の方法の各々は多種多様の小さな変更
の対象である。最も重要な変更は、Ｂ３、Ｂ１０および
Ａ２１の位置の可能なアミノ酸置換の全てが関与する変
更である。
の対象である。最も重要な変更は、Ｂ３、Ｂ１０および
Ａ２１の位置の可能なアミノ酸置換の全てが関与する変
更である。
【００３４】例えば、方法１は化学的または組換えのど
ちらかによりまずヒトプロインスリン−トリ−アルギニ
ン類似体を合成することにより変更することができる。
３つの位置のそれぞれにおいて可能なアミノ酸置換の全
てを混合して組合わせることにより、ほぼ１２００の異
なるプロインスリン−トリ−アルギニン類似体が可能と
なり、これから方法１を用いてトリ−Ａrg−インスリン
類似体を製造することができる。
ちらかによりまずヒトプロインスリン−トリ−アルギニ
ン類似体を合成することにより変更することができる。
３つの位置のそれぞれにおいて可能なアミノ酸置換の全
てを混合して組合わせることにより、ほぼ１２００の異
なるプロインスリン−トリ−アルギニン類似体が可能と
なり、これから方法１を用いてトリ−Ａrg−インスリン
類似体を製造することができる。
【００３５】他の例として、リーダー配列を有するＢ鎖
コード化ＤＮＡ化合物をまず製造することにより方法１
を変更することができる。翻訳に続いて、得られたペプ
チドリーダー配列を酵素により切断することができ、そ
の方法を記載のようにして完結する。この方法の他の変
更には、切断可能なペプチドをもたらすトレイリング(t
railing)配列を加えてトリ−Ａrg−インスリンまたはト
リ−Ａrg−インスリン類似体を得ることが含まれる。
コード化ＤＮＡ化合物をまず製造することにより方法１
を変更することができる。翻訳に続いて、得られたペプ
チドリーダー配列を酵素により切断することができ、そ
の方法を記載のようにして完結する。この方法の他の変
更には、切断可能なペプチドをもたらすトレイリング(t
railing)配列を加えてトリ−Ａrg−インスリンまたはト
リ−Ａrg−インスリン類似体を得ることが含まれる。
【００３６】分子生物学における技術の現在の段階で
は、タンパク質配列中のある任意のアミノ酸を他のもの
に置換するための手段は容易に提供される。部位特異的
突然変異誘発などの周知の技術を用いて、プロインスリ
ンをコードしているＤＮＡ配列を随意に変化させて、選
択したアミノ酸置換を起こすことができる。すなわち、
現段階の技術により、プロインスリン−トリ−アルギニ
ン類似体を製造することが可能である。次いで、方法１
を用いて本発明に包含される１またはそれ以上の任意の
アミノ酸置換を含むトリ−Ａrg−インスリン類似体を製
造することができる。
は、タンパク質配列中のある任意のアミノ酸を他のもの
に置換するための手段は容易に提供される。部位特異的
突然変異誘発などの周知の技術を用いて、プロインスリ
ンをコードしているＤＮＡ配列を随意に変化させて、選
択したアミノ酸置換を起こすことができる。すなわち、
現段階の技術により、プロインスリン−トリ−アルギニ
ン類似体を製造することが可能である。次いで、方法１
を用いて本発明に包含される１またはそれ以上の任意の
アミノ酸置換を含むトリ−Ａrg−インスリン類似体を製
造することができる。
【００３７】さらに、３つの可変位置に所望のアミノ酸
置換を行うための他の方法が可能である。現段階の合成
ペプチド化学により、単一のアミノ酸から少なくとも３
２残基のペプチドを合成するためのメリフィールド(Ｍe
rrifield)法などの方法が提供される。従って、上に概
説した方法３を用いて、インスリンＡおよびＢ鎖を合成
し、可変位置に任意の可能なアミノ酸置換を含むように
することができる。
置換を行うための他の方法が可能である。現段階の合成
ペプチド化学により、単一のアミノ酸から少なくとも３
２残基のペプチドを合成するためのメリフィールド(Ｍe
rrifield)法などの方法が提供される。従って、上に概
説した方法３を用いて、インスリンＡおよびＢ鎖を合成
し、可変位置に任意の可能なアミノ酸置換を含むように
することができる。
【００３８】本発明の別の態様においてトリ−Ａrg−イ
ンスリンおよびトリ−Ａrg−インスリン類似体を製造す
るために用いられる方法および中間体が提供される。ア
セチル化されたトリプシンおよびカルボキシペプチダー
ゼＢの作用により、実施例１に記載された方法はデス
(６４)プロインスリンを中間体として与える。このデス
(６４)プロインスリンはそれ自体が低血糖活性を有する
ことがわかった。さらに、実施例１に記載の方法によ
り、対応するプロインスリン−トリ−アルギニン類似体
を出発原料としてデス(６４)プロインスリン−トリ−ア
ルギニン類似体中間体を製造することができる。
ンスリンおよびトリ−Ａrg−インスリン類似体を製造す
るために用いられる方法および中間体が提供される。ア
セチル化されたトリプシンおよびカルボキシペプチダー
ゼＢの作用により、実施例１に記載された方法はデス
(６４)プロインスリンを中間体として与える。このデス
(６４)プロインスリンはそれ自体が低血糖活性を有する
ことがわかった。さらに、実施例１に記載の方法によ
り、対応するプロインスリン−トリ−アルギニン類似体
を出発原料としてデス(６４)プロインスリン−トリ−ア
ルギニン類似体中間体を製造することができる。
【００３９】実施例２に記載の方法により、ヒトプロイ
ンスリンをリジンエンドペプチダーゼで処理することに
よって中間体としてスプリット(６４)プロインスリンを
製造する。さらにこの方法により、対応するプロインス
リン−トリ−アルギニン類似体を出発原料としてスプリ
ット(６４)プロインスリン−トリ−アルギニン類似体中
間体を製造することができる。スプリット(６４)プロイ
ンスリンは、それ自体が低血糖活性を有することが見い
だされている。
ンスリンをリジンエンドペプチダーゼで処理することに
よって中間体としてスプリット(６４)プロインスリンを
製造する。さらにこの方法により、対応するプロインス
リン−トリ−アルギニン類似体を出発原料としてスプリ
ット(６４)プロインスリン−トリ−アルギニン類似体中
間体を製造することができる。スプリット(６４)プロイ
ンスリンは、それ自体が低血糖活性を有することが見い
だされている。
【００４０】エンドペプチダーゼ−Ｌys−Ｃは種々の供
給源、例えばＬysobacter enzymogenes (Ｂoehringer−
Ｍannheim; Ｉndianapolis, ＩＮ)、Ｐseudomonas aeru
ginosa (Ｐromega; Ｍadison, ＷＩ)およびＡchromobac
ter lyticus (Ｗako ＰureＣhemical; Ｄallas, ＴＸ)
から市販品として入手可能なリジンエンドペプチダーゼ
である。これはリジン残基のカルボキシ末端で特異的に
切断する。プロインスリンからのスプリット(６４)プロ
インスリンのすぐれた収量を得るためにＬys−２９の位
置のカルボキシ末端での切断の前にＬys−６４の位置の
カルボキシ末端での選択的な切断が必要である。この目
的のためには、Ｐseudomonas aeruginosa由来のエンド
ペプチダーゼ−Ｌys−Ｃが好ましい供給源であり、Ｌys
obacterenzymogenes由来の該酵素が最も好ましい供給源
であることが見いだされた。
給源、例えばＬysobacter enzymogenes (Ｂoehringer−
Ｍannheim; Ｉndianapolis, ＩＮ)、Ｐseudomonas aeru
ginosa (Ｐromega; Ｍadison, ＷＩ)およびＡchromobac
ter lyticus (Ｗako ＰureＣhemical; Ｄallas, ＴＸ)
から市販品として入手可能なリジンエンドペプチダーゼ
である。これはリジン残基のカルボキシ末端で特異的に
切断する。プロインスリンからのスプリット(６４)プロ
インスリンのすぐれた収量を得るためにＬys−２９の位
置のカルボキシ末端での切断の前にＬys−６４の位置の
カルボキシ末端での選択的な切断が必要である。この目
的のためには、Ｐseudomonas aeruginosa由来のエンド
ペプチダーゼ−Ｌys−Ｃが好ましい供給源であり、Ｌys
obacterenzymogenes由来の該酵素が最も好ましい供給源
であることが見いだされた。
【００４１】
【実施例】以下に挙げる実施例は、本発明の思想および
本発明をどのように実施するかを理解するのに有用であ
る。これらの実施例は説明のために挙げるものであっ
て、いかなる意味においても本発明を限定するものと解
釈すべきではない。
本発明をどのように実施するかを理解するのに有用であ
る。これらの実施例は説明のために挙げるものであっ
て、いかなる意味においても本発明を限定するものと解
釈すべきではない。
【００４２】実施例１ デス(６４)ヒトプロインスリン
中間体からのトリ−Ａrg−インスリンの製造 Ｅ.coliにおいて製造された組換えヒトプロインスリン
を、ブタカルボキシペプチダーゼＢ(Ｐromega; Ｍadiso
n, ＷＩ)およびアセチル化されたウシトリプシン[Europ
ean J. Biochem., 2, 215-223 (1967)に記載のように製
造]を用い、酵素：基質の重量比を各々約１：１０００
および１：２０,０００として２０mＭグリシン緩衝液(p
Ｈ８)中で処理した。反応を約２７時間８℃で進行さ
せ、１容量の７Ｍ尿素の添加により終了させた。次いで
得られた溶液をＱ−Ｓepharose Ｆast ＦlowTM樹脂のカ
ラム[７Ｍ尿素、１０mＭトリス(トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン；Ｓigma；Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)、１mＭ
テトラチオネートカリウム中、pＨ８.１で予め平衡化]
にかけた。このカラムを２５mＭ塩化ナトリウムを含有
する同じ緩衝液で洗浄し、次いで平衡緩衝液中の２５〜
６５mＭ塩化ナトリウムからの直線勾配液で溶離した。
溶離画分を集め、その直後に氷酢酸を用いてpＨ約４.０
に滴定した。デス(６４)プロインスリンを含む画分(分
析ＨＰＬＣにより測定)をプールし、Ａmicon Ｓ１Ｙ３
らせん形カートリッジ(Ａmicon；Ｄanvers, ＭＡ)を用
いて濃縮した。保留物をpＨ約２.５の１Ｍ酢酸に対して
約５℃で透析濾過した。得られた溶液を等容量の水で希
釈し、０.２ミクロンフィルターで濾過し、真空下で凍
結乾燥させた。周囲温度で、デス(６４)ヒトプロインス
リン(２.９１mg)を０.０２Ｍ ＣaＣl2を含む０.０５Ｍ
トリス緩衝液(１Ｎ ＨＣlでpＨ８に調整)(２９１ml)に
溶解した。次いでこの溶液を５℃に冷却した。約３４６
μlのブタトリプシン(Ｓigma；Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)(水
中１mg/ml)を加え、酵素：基質の重量比を１：８０００
とした。混合の後、溶液を５℃で保存した。４.５時間
後に１Ｎ ＨＣl(１０ml)を加えることにより反応を停止
させた。完全な透明溶液を５.５×３０cm Ｃ−１８ Ｖy
dacTMＨＰＬＣカラム上にポンピングした。水で洗浄し
た後、タンパク質を０.５％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)
緩衝液中の２２.５〜４２.５％アセトニトリル勾配液
中、２４時間、２.５ml／分で溶離した。溶出液を２７
６nmでの吸光度によりモニターした。２０mlの画分を集
め、いくつかの画分を、Ｃ−８ ＺorbaxTMカラムを用い
たＨＰＬＣ(０.１Ｍ一塩基リン酸ナトリウムpＨ２.１緩
衝液中のアセトニトリル勾配液を使用)により分析的に
試験した。画分(１１６〜１２８)を含むトリ−Ａrg−イ
ンスリンをプールし、凍結乾燥して生成物(０.９４g；
ＨＰＬＣ純度８７％)を得た。この生成物の構造はアミ
ノ酸組成、Ｎ−末端配列分析および高速原子衝撃質量分
光学(ＦＡＢ−ＭＳ)により確認した。
中間体からのトリ−Ａrg−インスリンの製造 Ｅ.coliにおいて製造された組換えヒトプロインスリン
を、ブタカルボキシペプチダーゼＢ(Ｐromega; Ｍadiso
n, ＷＩ)およびアセチル化されたウシトリプシン[Europ
ean J. Biochem., 2, 215-223 (1967)に記載のように製
造]を用い、酵素：基質の重量比を各々約１：１０００
および１：２０,０００として２０mＭグリシン緩衝液(p
Ｈ８)中で処理した。反応を約２７時間８℃で進行さ
せ、１容量の７Ｍ尿素の添加により終了させた。次いで
得られた溶液をＱ−Ｓepharose Ｆast ＦlowTM樹脂のカ
ラム[７Ｍ尿素、１０mＭトリス(トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン；Ｓigma；Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)、１mＭ
テトラチオネートカリウム中、pＨ８.１で予め平衡化]
にかけた。このカラムを２５mＭ塩化ナトリウムを含有
する同じ緩衝液で洗浄し、次いで平衡緩衝液中の２５〜
６５mＭ塩化ナトリウムからの直線勾配液で溶離した。
溶離画分を集め、その直後に氷酢酸を用いてpＨ約４.０
に滴定した。デス(６４)プロインスリンを含む画分(分
析ＨＰＬＣにより測定)をプールし、Ａmicon Ｓ１Ｙ３
らせん形カートリッジ(Ａmicon；Ｄanvers, ＭＡ)を用
いて濃縮した。保留物をpＨ約２.５の１Ｍ酢酸に対して
約５℃で透析濾過した。得られた溶液を等容量の水で希
釈し、０.２ミクロンフィルターで濾過し、真空下で凍
結乾燥させた。周囲温度で、デス(６４)ヒトプロインス
リン(２.９１mg)を０.０２Ｍ ＣaＣl2を含む０.０５Ｍ
トリス緩衝液(１Ｎ ＨＣlでpＨ８に調整)(２９１ml)に
溶解した。次いでこの溶液を５℃に冷却した。約３４６
μlのブタトリプシン(Ｓigma；Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)(水
中１mg/ml)を加え、酵素：基質の重量比を１：８０００
とした。混合の後、溶液を５℃で保存した。４.５時間
後に１Ｎ ＨＣl(１０ml)を加えることにより反応を停止
させた。完全な透明溶液を５.５×３０cm Ｃ−１８ Ｖy
dacTMＨＰＬＣカラム上にポンピングした。水で洗浄し
た後、タンパク質を０.５％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)
緩衝液中の２２.５〜４２.５％アセトニトリル勾配液
中、２４時間、２.５ml／分で溶離した。溶出液を２７
６nmでの吸光度によりモニターした。２０mlの画分を集
め、いくつかの画分を、Ｃ−８ ＺorbaxTMカラムを用い
たＨＰＬＣ(０.１Ｍ一塩基リン酸ナトリウムpＨ２.１緩
衝液中のアセトニトリル勾配液を使用)により分析的に
試験した。画分(１１６〜１２８)を含むトリ−Ａrg−イ
ンスリンをプールし、凍結乾燥して生成物(０.９４g；
ＨＰＬＣ純度８７％)を得た。この生成物の構造はアミ
ノ酸組成、Ｎ−末端配列分析および高速原子衝撃質量分
光学(ＦＡＢ−ＭＳ)により確認した。
【００４３】実施例２ スプリット(６４)ヒトプロイン
スリン中間体からのトリ−Ａrg−インスリンの製造 ヒトプロインスリン(８００mg)を２５mＭトリスおよび
１mＭ ＥＤＴＡを含有するpＨ７.７緩衝液(８０ml)に溶
解した。Ｐseudomonas aeruginosa Ｅndopeptidase−Ｌ
ys−Ｃ(Ｐromega; Ｍadison, ＷＩ)を同じ緩衝液中、
０.１mg/mlに調製し、２００μlをプロインスリン溶液
に加えると、酵素：基質の重量比は１：４０,０００と
なった。反応溶液を良く混合し、次いで９.５時間３７
℃でインキュベートした。１Ｎ ＨＣlを加えることによ
り溶液をpＨ３.０の酸性にし、次いで０.５％ＴＦＡで
平衡化した５.５×３０cm ＶydacTMＣ−１８調製用ＨＰ
ＬＣカラム上に置いた。精製されたタンパク質を、ＴＦ
Ａ緩衝液中の０〜４０％アセトニトリルを含む勾配液を
用いて２０時間で溶離した。スプリット(６４)プロイン
スリンに対応する画分をプールして凍結乾燥し、生成物
(２３７mg)を得た。この生成物の同定は、アミノ酸分
析、ＦＡＢ−ＭＳおよびＮ−末端配列分析により確認し
た。スプリット(６４)プロインスリンの一部を、２５m
Ｍトリス、１mＭ ＥＤＴＡ緩衝液(pＨ７.７)中に１mg/m
lで調製し、ウシトリプシン(Ｓigma; Ｓt.Ｌouis,ＭＯ)
は同じ緩衝液中に０.１mg/mlで調製した。スプリット
(６４)プロインスリンの７００μlの容量にトリプシン
溶液(７μl)を加えると、酵素：基質重量比は１：１,０
００となった。反応物を周囲温度で３０分間撹拌した。
次いで、反応生成物のＨＰＬＣ分析を４.６×２５０mm
ＺorbaxTMＣ−８カラム(０.１Ｍリン酸ナトリウムpＨ
２.１緩衝液中の浅薄アセトニトリル勾配液を使用)上で
行った。この分析により本質的に全てのスプリット(６
４)プロインスリンが消化され、主生成物はトリ−Ａrg
−インスリンであることが示された。
スリン中間体からのトリ−Ａrg−インスリンの製造 ヒトプロインスリン(８００mg)を２５mＭトリスおよび
１mＭ ＥＤＴＡを含有するpＨ７.７緩衝液(８０ml)に溶
解した。Ｐseudomonas aeruginosa Ｅndopeptidase−Ｌ
ys−Ｃ(Ｐromega; Ｍadison, ＷＩ)を同じ緩衝液中、
０.１mg/mlに調製し、２００μlをプロインスリン溶液
に加えると、酵素：基質の重量比は１：４０,０００と
なった。反応溶液を良く混合し、次いで９.５時間３７
℃でインキュベートした。１Ｎ ＨＣlを加えることによ
り溶液をpＨ３.０の酸性にし、次いで０.５％ＴＦＡで
平衡化した５.５×３０cm ＶydacTMＣ−１８調製用ＨＰ
ＬＣカラム上に置いた。精製されたタンパク質を、ＴＦ
Ａ緩衝液中の０〜４０％アセトニトリルを含む勾配液を
用いて２０時間で溶離した。スプリット(６４)プロイン
スリンに対応する画分をプールして凍結乾燥し、生成物
(２３７mg)を得た。この生成物の同定は、アミノ酸分
析、ＦＡＢ−ＭＳおよびＮ−末端配列分析により確認し
た。スプリット(６４)プロインスリンの一部を、２５m
Ｍトリス、１mＭ ＥＤＴＡ緩衝液(pＨ７.７)中に１mg/m
lで調製し、ウシトリプシン(Ｓigma; Ｓt.Ｌouis,ＭＯ)
は同じ緩衝液中に０.１mg/mlで調製した。スプリット
(６４)プロインスリンの７００μlの容量にトリプシン
溶液(７μl)を加えると、酵素：基質重量比は１：１,０
００となった。反応物を周囲温度で３０分間撹拌した。
次いで、反応生成物のＨＰＬＣ分析を４.６×２５０mm
ＺorbaxTMＣ−８カラム(０.１Ｍリン酸ナトリウムpＨ
２.１緩衝液中の浅薄アセトニトリル勾配液を使用)上で
行った。この分析により本質的に全てのスプリット(６
４)プロインスリンが消化され、主生成物はトリ−Ａrg
−インスリンであることが示された。
【００４４】実施例３ Ａsp(Ａ２１)−トリ−Ａrg−イ
ンスリン類似体の製造 実施例１に従い製造したトリ−Ａrg−インスリン(４０m
g)を０.０１Ｎ ＨＣl(４ml)に溶解し、１２日間周囲温
度で保存した。次いで、溶液を３７℃でさらに１６日間
インキュベートした。最終溶液中の主成分を調製用ＨＰ
ＬＣにより精製した。溶液の５つの部分(各々０.５〜
１.０ml)を２１.５×２５０mm ＺorbaxTMＣ−８ＨＰＬ
Ｃカラム(２６％アセトニトリルを含む０.１Ｍ硫酸ナト
リウムpＨ２.３緩衝液中で平衡化)上に注入した。サン
プル成分は、硫酸ナトリウム緩衝液中の２６〜３０％ア
セトニトリルの勾配液で溶離された。５回全ての溶出か
ら得た主成分を含む溶離画分を合わせて、等量の水で希
釈し、Ｃ−１８ Ｓep−ＰakTMカートリッジ(Ｍillipor
e; Ｂedford, ＭＡ)上で脱塩した。精製されたペプチド
を溶離し、５０％アセトニトリルおよび５０％ＴＦＡ
(０.５％)緩衝液中で濃縮し、凍結乾燥した。精製され
た生成物の構造は、個々のＡおよびＢ鎖のアミノ酸分
析、ＦＡＢ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析により確認した。
分析ＨＰＬＣによりＡsp(Ａ２１)−トリ−Ａrg−インス
リン類似体の９５％純度が示された。
ンスリン類似体の製造 実施例１に従い製造したトリ−Ａrg−インスリン(４０m
g)を０.０１Ｎ ＨＣl(４ml)に溶解し、１２日間周囲温
度で保存した。次いで、溶液を３７℃でさらに１６日間
インキュベートした。最終溶液中の主成分を調製用ＨＰ
ＬＣにより精製した。溶液の５つの部分(各々０.５〜
１.０ml)を２１.５×２５０mm ＺorbaxTMＣ−８ＨＰＬ
Ｃカラム(２６％アセトニトリルを含む０.１Ｍ硫酸ナト
リウムpＨ２.３緩衝液中で平衡化)上に注入した。サン
プル成分は、硫酸ナトリウム緩衝液中の２６〜３０％ア
セトニトリルの勾配液で溶離された。５回全ての溶出か
ら得た主成分を含む溶離画分を合わせて、等量の水で希
釈し、Ｃ−１８ Ｓep−ＰakTMカートリッジ(Ｍillipor
e; Ｂedford, ＭＡ)上で脱塩した。精製されたペプチド
を溶離し、５０％アセトニトリルおよび５０％ＴＦＡ
(０.５％)緩衝液中で濃縮し、凍結乾燥した。精製され
た生成物の構造は、個々のＡおよびＢ鎖のアミノ酸分
析、ＦＡＢ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析により確認した。
分析ＨＰＬＣによりＡsp(Ａ２１)−トリ−Ａrg−インス
リン類似体の９５％純度が示された。
【００４５】実施例４ トリ−Ａrg−インスリンの生物
活性 ２〜４ml容量の４０Ｕ/mlトリ−Ａrg−インスリン溶液
を０.０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に最終タンパク質
濃度約２.０mg/mlで調製した。溶液を塩化亜鉛の形で様
々な量の亜鉛(０〜２.４mg/ml)を含むように調製した。
氷酢酸を用いて各溶液を最終pＨ範囲４〜６となるよう
溶解した。ヒトインスリンに比較して推定７０％の生物
学的能力(インスリンレセプター結合)およびヒトインス
リンに対する標準化値２８.８５Ｕ/mlに基づき、次式を
用いて試験溶液の調製を行った。
活性 ２〜４ml容量の４０Ｕ/mlトリ−Ａrg−インスリン溶液
を０.０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に最終タンパク質
濃度約２.０mg/mlで調製した。溶液を塩化亜鉛の形で様
々な量の亜鉛(０〜２.４mg/ml)を含むように調製した。
氷酢酸を用いて各溶液を最終pＨ範囲４〜６となるよう
溶解した。ヒトインスリンに比較して推定７０％の生物
学的能力(インスリンレセプター結合)およびヒトインス
リンに対する標準化値２８.８５Ｕ/mlに基づき、次式を
用いて試験溶液の調製を行った。
【数１】２mg/ml×２８.８５Ｕ/mg(タンパク質)×７０
％能力＝４０Ｕ/ml ニュージーランド白色家兎(大部分は雌、全ての体重は
２.７〜４kg、０.５〜４年齢およびサンプル投与前１６
時間絶食)を試験に用いた。４０Ｕ/mlのトリ−Ａrg−イ
ンスリン溶液、Ａsp(２１)−トリ−Ａrg−インスリン類
似体、スプリット(６４)プロインスリン(pＨ７.３５)、
デス(６４)プロインスリン(pＨ７.４６)、ジ−Ａrg−イ
ンスリン[Zeuzemら: Diabetologia, 33, 65-71, (1990)
に従い製造]、Ｈumulin ＬTM[レンテ(Ｌente)ヒトイン
スリン、中時間作用；Ｅli Ｌilly＆ Ｃo.,; Ｉndianap
olis, ＩＮ]またはＨumulin ＵTM[ウルトラレンテ(Ｕlt
ralente]ヒトインスリン、長時間作用；Ｅli Ｌilly ＆
Ｃo.,; Ｉndianapolis,ＩＮ)を各々１０匹の家兎に０.
２Ｕ/kgの用量で首の後ろに皮下注射した。様々な時間
に１００μl量の血液を辺縁耳静脈から採取し、９００
μl量の抗凝固剤(ＥＤＴＡ−フッ化ナトリウム)と混合
し、グルコース含量を分析した。グルコース値は、サン
プルを注射する前に測定した元の血中グルコースの百分
率で示されるように標準化した。結果を表１に示す。
％能力＝４０Ｕ/ml ニュージーランド白色家兎(大部分は雌、全ての体重は
２.７〜４kg、０.５〜４年齢およびサンプル投与前１６
時間絶食)を試験に用いた。４０Ｕ/mlのトリ−Ａrg−イ
ンスリン溶液、Ａsp(２１)−トリ−Ａrg−インスリン類
似体、スプリット(６４)プロインスリン(pＨ７.３５)、
デス(６４)プロインスリン(pＨ７.４６)、ジ−Ａrg−イ
ンスリン[Zeuzemら: Diabetologia, 33, 65-71, (1990)
に従い製造]、Ｈumulin ＬTM[レンテ(Ｌente)ヒトイン
スリン、中時間作用；Ｅli Ｌilly＆ Ｃo.,; Ｉndianap
olis, ＩＮ]またはＨumulin ＵTM[ウルトラレンテ(Ｕlt
ralente]ヒトインスリン、長時間作用；Ｅli Ｌilly ＆
Ｃo.,; Ｉndianapolis,ＩＮ)を各々１０匹の家兎に０.
２Ｕ/kgの用量で首の後ろに皮下注射した。様々な時間
に１００μl量の血液を辺縁耳静脈から採取し、９００
μl量の抗凝固剤(ＥＤＴＡ−フッ化ナトリウム)と混合
し、グルコース含量を分析した。グルコース値は、サン
プルを注射する前に測定した元の血中グルコースの百分
率で示されるように標準化した。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】 表１ 元の血中グルコースに対する割合(％ )，ｎ＝１０ 添加された亜鉛 サンプル注射後の時間インスリン (mg/ml) １ ２ ４ ６ Ｈumulin Ｌ 0 58.2 48.0 90.6 96.2 Ｈumulin Ｕ 0 53.4 55.3 85.3 92.5 トリ-Ａrg 0 51.1 56.0 86.9 95.3 Ａsp(A21)-トリ-Ａrg 0 67.4 84.2 94.8 89.8 デス(64)ＨＰＩ 0 63.1 70.5 90.6 90.0 スプリット(64)ＨＰＩ 0 61.7 83.8 94.8 94.1 ジ−Ａrg 0 60.6 85.4 98.1 99.8 トリ−Ａrg 0.014 43.3 50.3 90.5 94.9 トリ−Ａrg 0.05 51.4 57.7 88.2 95.1 トリ−Ａrg 0.14 61.6 52.1 76.1 96.5 トリ−Ａrg 0.33 76.2 67.7 88.5 91.9 トリ−Ａrg 0.5 71.8 65.0 88.4 86.9 トリ−Ａrg 1.4 83.7 71.1 75.3 91.4 トリ−Ａrg 2.4 79.2 71.1 74.5 70.1 Ａsp(A21)-トリ-Ａrg 2.4 84.2 70.3 84.4 91.9ジ−Ａrg 2.4 76.3 73.4 95.5 96.7
【００４７】実施例５ トリ−Ａrg−インスリンの溶解度(％)を２７６nm波長で
の光学密度(Ｏ.Ｄ.)に基づいてジ−Ａrg−インスリンの
溶解度と比較した。トリ−Ａrg−インスリンの１mg/ml
溶液(実施例１において製造)またはジ−Ａrg−インスリ
ン[Zeuzemら: Diabetologia, 33, 65-71, (1990)に従い
製造]を２mＭホウ酸−クエン酸−グリシン緩衝液(pＨ
９.５)中に調製した。５Ｎ ＨＣlまたは５Ｎ ＮaＯＨの
どちらかを滴下してデジタルpＨメーターで測定するこ
とにより、各溶液のサンプルを様々なpＨレベルに調整
した。次いで各サンプルを３０分間約１０,０００rpmで
遠心した。次いで上清を除去し、各々のＯ.Ｄ.を分光光
度計を用いて２７６nmで測定した。１mg/ml溶液に対す
る予測値を０.９８としてＯ.Ｄ.値から濃度を計算し
た。遠心後の濃度を元の濃度で割ることにより溶解物質
の百分率を算出した。結果を表２に示す。
の光学密度(Ｏ.Ｄ.)に基づいてジ−Ａrg−インスリンの
溶解度と比較した。トリ−Ａrg−インスリンの１mg/ml
溶液(実施例１において製造)またはジ−Ａrg−インスリ
ン[Zeuzemら: Diabetologia, 33, 65-71, (1990)に従い
製造]を２mＭホウ酸−クエン酸−グリシン緩衝液(pＨ
９.５)中に調製した。５Ｎ ＨＣlまたは５Ｎ ＮaＯＨの
どちらかを滴下してデジタルpＨメーターで測定するこ
とにより、各溶液のサンプルを様々なpＨレベルに調整
した。次いで各サンプルを３０分間約１０,０００rpmで
遠心した。次いで上清を除去し、各々のＯ.Ｄ.を分光光
度計を用いて２７６nmで測定した。１mg/ml溶液に対す
る予測値を０.９８としてＯ.Ｄ.値から濃度を計算し
た。遠心後の濃度を元の濃度で割ることにより溶解物質
の百分率を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】 ジ−Ａrg−インスリン トリ−Ａrg−インスリン pＨ 溶解度(％) pＨ 溶解度(％) ３.４６ ９５.２ − − ４.０８ ８２.９ − − ４.５１ ７３.０ ４.９４ ８７.４ ５.５６ １９.０ ５.５６ ５３.８ ５.９３ ８.１ ５.９２ ２５.３ ６.４７ １０.１ ６.５６ １０.５ ７.０２ ２２.２ ６.９９ ９.１ ７.５４ ４４.４ ７.５３ １０.７ ８.０６ １０２.０ ８.０５ ２１.２
【００４９】これらのデータによりトリ−Ａrg−インス
リンが所望の製剤化pＨ(pＨ５〜６)でより高い溶解性を
有するが、皮下注射後の生理的pＨ(pＨ７.４)ではより
低い溶解性をも有することが示される。故に、トリ−Ａ
rg−インスリンはジ−Ａrg−インスリンよりも、より高
くより好ましいpＨで製剤化することができる。従っ
て、皮下注射後のトリ−Ａrg−インスリンの溶解特性は
ジ−Ａrg−インスリンに比較して作用時間を長期化する
ものと期待される。
リンが所望の製剤化pＨ(pＨ５〜６)でより高い溶解性を
有するが、皮下注射後の生理的pＨ(pＨ７.４)ではより
低い溶解性をも有することが示される。故に、トリ−Ａ
rg−インスリンはジ−Ａrg−インスリンよりも、より高
くより好ましいpＨで製剤化することができる。従っ
て、皮下注射後のトリ−Ａrg−インスリンの溶解特性は
ジ−Ａrg−インスリンに比較して作用時間を長期化する
ものと期待される。
【００５０】
【００５１】配列番号：１ 配列の長さ：32 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：7..8 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys７はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＡ鎖のＣys８にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
−インスリンのＢ鎖)のＣys７はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＡ鎖のＣys８にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
【００５２】配列番号：2 配列の長さ：32 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：7..8 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys７はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＡ鎖のＣys８にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＡ鎖のＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
−インスリンのＢ鎖)のＣys７はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＡ鎖のＣys８にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＡ鎖のＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
【００５３】配列番号：3 配列の長さ：32 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：7..8 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖） のＣｙｓ７はトリ−Ａrg−インスリンのＡ鎖のＣys８に
ジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＡ鎖のＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
−インスリンのＢ鎖） のＣｙｓ７はトリ−Ａrg−インスリンのＡ鎖のＣys８に
ジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：19..20 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＢ鎖)のＣys１９はトリ−Ａrg−インス
リンのＡ鎖のＣys２１にジスルフィド結合している" 配列 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
【００５４】配列番号：4 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：disulfide-bonds 存在位置：7..12 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：8..9 他の情報：/ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａrg
−インスリンのＡ鎖)のＣys８はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＢ鎖のＣys７にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：２１．．２２ 他の情報：／ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａr
g−インスリンのＡ鎖) のＣys２１はトリ−Ａrg−インスリンのＢ鎖のＣys１９
にジスルフィド結合している" 配列 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 20
−インスリンのＡ鎖)のＣys８はトリ−Ａrg−インスリ
ンのＢ鎖のＣys７にジスルフィド結合している" 特徴を表す記号：cross-links 存在位置：２１．．２２ 他の情報：／ラベル＝架橋結合/注＝"本配列(トリ−Ａr
g−インスリンのＡ鎖) のＣys２１はトリ−Ａrg−インスリンのＢ鎖のＣys１９
にジスルフィド結合している" 配列 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 20
【図１】 図１はトリ−Ａrg−インスリンおよびトリ−
Ａrg−インスリン類似体の１次アミノ酸配列の模式図で
ある。
Ａrg−インスリン類似体の１次アミノ酸配列の模式図で
ある。
【図２】 図２はヒトプロインスリンの１次アミノ酸配
列の模式図である。
列の模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター・カール・ランブーイ アメリカ合衆国46256インディアナ州イン ディアナポリス、キャッスル・リッジ・レ イン8269番
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の式で示される化合物またはその薬
学的に許容し得る塩： 【化１】 [式中、ＸおよびＺはＡla、Ａrg、Ａsx、Ｃys、Ｇlx、
Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ｌys、Ｍet、Ｐhe、Ｐro、Ｓ
er、Ｔhr、Ｔrp、ＴyrまたはＶalからなる群から選択さ
れ、ＹはＨis、ＡspまたはＧluからなる群から選択され
る]。 - 【請求項２】 活性成分として請求項１に記載のトリ−
アルギニンインスリン類似体を、１もしくはそれ以上の
薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤と共に含
む糖尿病治療のための医薬製剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80116391A | 1991-11-26 | 1991-11-26 | |
| US801163 | 1991-11-26 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=25180362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31483692A Expired - Fee Related JP3304442B2 (ja) | 1991-11-26 | 1992-11-25 | トリ−アルギニンインスリン |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0544466A1 (ja) |
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| CN (1) | CN1072723A (ja) |
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| BR (1) | BR9204542A (ja) |
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| CZ (1) | CZ342492A3 (ja) |
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| HU (2) | HU9203688D0 (ja) |
| IL (1) | IL103849A0 (ja) |
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| NZ (1) | NZ245170A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| PT821006E (pt) * | 1996-07-26 | 2004-09-30 | Aventis Pharma Gmbh | Derivados de insulina com ligacao a zinco aumentada |
| US6444641B1 (en) | 1997-10-24 | 2002-09-03 | Eli Lilly Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
| US6933272B1 (en) | 1998-09-22 | 2005-08-23 | Erik Helmerhorst | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
| EP1265630B1 (en) | 2000-03-24 | 2006-06-07 | Genentech, Inc. | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
| KR20040070237A (ko) * | 2001-12-20 | 2004-08-06 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | 연장된 작용 시간을 갖는 인슐린 분자 |
| US20060217290A1 (en) * | 2003-04-29 | 2006-09-28 | Kohn Wayne D | Insulin analogs having protracted time action |
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| MX2009002999A (es) * | 2006-09-22 | 2009-04-01 | Novo Nordisk As | Analogos de insulina resistentes a proteasa. |
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