CN104017809A

CN104017809A - 改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法

Info

Publication number: CN104017809A
Application number: CN201410247746.2A
Authority: CN
Inventors: 毕玉平; 郑玲; 彭振英; 边斐; 焦其庆; 陈高
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2014-09-03

Abstract

本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法。在花生油体蛋白***中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造：将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。本发明采用油体蛋白***在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了Insulin蛋白的高水平积累。

Description

改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法

技术领域

本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法，尤其涉及Insulin序列的改造、密码子优化和利用油体蛋白表达***在花生种子中表达人Insulin的方法，属于生物技术领域。

背景技术

“糖尿病”是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病，四十岁以上的中年人染患率特别高。据统计2010年我国的糖尿病患者人数居全球之冠，达到了9240万。Insulin是机体内唯一降低血糖的激素，在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位。我国有近亿人的糖尿病患者，所以对Insulin的需求量巨大。

临床用Insulin最早主要从动物胰脏中提取，存在人畜共患病原菌和朊病毒污染的风险。随着DNA重组技术研究深入，已成功在大肠杆菌和酵母如毕赤酵母中表达了重组Insulin，不过，原核大肠杆菌和低等真核生物酵母表达重组Insulin存在内毒素污染和无法完成蛋白修饰等***固有缺陷，而用植物***表达Insulin具有易于规模化安全和低成本优势，可以弥补原核和酵母***的不足。

植物生物反应器成本低，不存在转基因动物细胞或微生物发酵中存在的细胞培养困难、培养基昂贵、在规模化生产时需要严格的培养条件避免污染、成本加大等问题(Liu and Jia,2003；Gomord et al,2004)；安全性高，不存在病原菌的污染的风险(Commandeur et al,2003；Caiet al,2004)；生产的产品一般含有较高的生物活性及免疫活性(Daniell et al,2001)；遗传稳定性高，通过自交和分离能很快获得转基因纯合体(Verwoerd et al,1995；Liu et al,2000)；并且植物转基因技术成熟。利用植物反应器生产有用蛋白，即为“分子农业(molecular farming)”(Commandeur et al,2003)，是一种非常安全的生产方式。目前已有多种植物用作生物反应器，如烟草(McCormick et al,1999；Ma et al1995)、大豆(Giddings et al,2000)、拟南芥(Potera,1999)、玉米、油菜(Arakawa et al,1998；Witcher et al,1998).、马铃薯(Richter et al,2000；Artsaenko et al,1998)、番茄(Chen et al,2009)等，其表达产物也是多种多样的，如具有重要价值的药物蛋白、疫苗、抗体等(Yang et al，2009)。

国际上在转基因马铃薯块茎中表达人Insulin的融合蛋白，Insulin只占马铃薯块茎中可溶性蛋白的0.022％。SemBioSys生物工程公司利用油体蛋白表达***在红花中表达人Insulin，每亩红花所产的红花籽中能提取到165克Insulin，

油体蛋白***比其他表达***Insulin的含量高，可能由于油体蛋白在种子中高水平表达并大量积累(Yi-hui and Shi-rong,2003)，并且利用油体蛋白脂溶性的特点很容易将融合蛋白分离纯化，长时间的贮存仍能保持结构稳定(Frandsen et al,2001)，其应用前景非常广泛。目前利用油体蛋白***已经成功获得了有生物活性的水蛭素、纳豆激酶、β-葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生长因子等多种蛋白(Zhao et al,2009)。

花生(Arachis hypogaea)作为我国最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，而且花生产量高，如果在花生中生产Insulin，按照每亩600斤花生，如果Insulin占种子总蛋白的1％算，每亩花生生产的Insulin约900克，为红花的5倍多。人Insulin蛋白具有广阔的临床应用前景，经检索，目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达***表达人Insulin蛋白的方法的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法，实现Insulin在花生种子中高水平的表达积累。

本发明技术方案如下：

一种在花生油体蛋白***中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造：将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。

根据本发明优选的，上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

胰岛素原(Insulin蛋白)是一个含21个氨基酸的A链和30个氨基酸B链以及C连接肽，共86个氨基酸，由N端至C端的连接顺序为B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A；将人Insulin的序列将编码区改造成花生偏好的密码子，并将A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31、Arg32两个氨基酸残基，使Insulin的结构更稳定，作用效果更持久。改造以后可以交给生物公司合成Insulin的编码序列。

一种利用油体蛋白***在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，步骤如下：

(1)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成，制得改造后表达基因片段；

(2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物如下：

正向引物：GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；

反向引物：TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；

将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后，与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接，制得植物表达载体；

(3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生，获得转基因植株，经育繁后，收获第二代转基因花生纯合体的花生种子，经纯化，制得人Insulin蛋白。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下：

模板1μl，2×LA Taq mix10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，ddH₂O8.0μl。

PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的载体为pCAMBIA2301-AhOleosin载体，通过在载体pCAMBIA2301上***序列如SEQ ID NO.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID NO.3所示的终止子获得。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中纯化的步骤如下：

将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。

有益效果

1、本发明采用油体蛋白***在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了Insulin蛋白的高水平积累；

2、由于花生种子便于贮藏，运输方便，而且重组蛋白在种子中的稳定性高，能在种子中长期保持活性，从而解决了人Insulin蛋白储存、运输的问题；

3、花生适应性强，种植面积广，融合表达的Insulin分离纯化简单易操作，成本低，增加了农产品的附加值，为分子农业和生物制药的发展提供了技术支持；与微生物和动物反应器相比，植物表达***在免疫原性、安全性、来源和成本等方面都更具有潜在的优势。

附图说明

图1、本发明构建的载体pCAMBIA2301-Aholeosin-Insulin的构建示意图；

图2、Western检测转基因花生种子中Insulin蛋白的表达结果照片；

其中：1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT：野生型，3，4：转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生；

图3、转基因花生Western检测Insulin蛋白的柱状分析图；

其中：1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT：野生型，3，4：转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、人Insulin序列进行改造和合成

根据NCBI中人Insulin的编码序列(基因登录号：BT006808.1)，将编码序列改造成花生偏好密码子，同时将Insulin A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31，Arg32两个氨基酸残基，优化改造后的人Insulin蛋白表达基因片段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将人Insulin蛋白表达基因片段由生物公司合成。

实施例2、构建pCAMBIA2301-Aholeosin-Insulin植物表达载体

构建过程如图1所示，其中Insulin序列的扩增和获得如下：

以正向引物primer1：GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA，和反向引物primer2：TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA，用合成的序列如SEQ ID NO.1所示的人Insulin蛋白表达基因片段为模板，进行PCR反应，PCR反应体系为：模板1μl，2×LA Taq mix10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，ddH₂O8.0μl。

PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸10min。

PCR产物经1.5wt％的琼脂糖凝胶电泳，胶回收300bp左右条带，连接到T载体上(pEASYT3，购自Transgen Biotech公司)，连接体系为：

回收产物4μl，T载体1μl，25℃连接15min，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

(1)取-70℃冰冻E.coli DH5α菌种，用划线法接种细菌于LB培养基，37℃培养过夜。

(2)取一环新鲜的菌落于装有3ml LB试管中，在37℃振荡培养约16h。

(3)取1ml上述菌液转接到装有30ml LB三角烧瓶中(接种量按菌液浓度而定，一般在1％左右)，剧烈振荡培养至OD₆₀₀值0.2-0.4。

(4)将菌液冰浴10min，倒入冰上遇冷50ml的离心管中。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。

(5)用50mmol/L预冷的CaCl₂中约10ml，轻轻的悬浮细胞，冰浴10min，4℃，4000rpm，离心5min，弃上清收集菌体。

(6)将菌体悬浮在1-2ml的50mmol/L冷CaCl₂中。置冰上作为转化用的感受态细胞。

(7)用预冷的枪头，取100μl分装到预冷的EP管中，加入等体积的30％(体积百分比)的甘油，放入液氮速冻，-70℃保存。

大肠杆菌的转化：将上述5μl的连接产物加入100μl DH5α感受态细胞中混匀。冰上放置30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入800μl液体LB(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃100rpm振荡培养1h，将菌液均匀涂抹布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L)，37℃培养过夜。挑取单菌落到1mL液体LB中，37℃摇菌4-6h，用primer1和primer2进行PCR检测，对阳性克隆用通用引物进行测序验证(见序列表SEQ ID No.1)，得到克隆载体T-insulin质粒。

将人Insulin蛋白基因连接到pCAMBIA2301-AhOleosin表达载体：

将花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因(序列如SEQ ID No.2所示)以及tRUBP终止子(序列如SEQ ID NO.3所示)连接到pCAMBIA2301(Cambia公司有售)的植物表达载体，构建成pCAMBIA2301-AhOleosin。将pCAMBIA2301-AhOleosin和T-insulin质粒同时用Xba I和BamH I双酶切，回收载体和Insulin蛋白表达基因片段，T4连接酶将两个片段连接：10×T4DNA ligase buffer2μl，Insulin蛋白表达基因片段6μl，pCAMBIA2301-AhOleosin2μl，T4DNA ligase1μl，H₂O9μl，16℃连接过夜。

连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α，同样挑取单菌落PCR验证，测序验证表达载体构建成功。

表达载体的农杆菌转化：

制备农杆菌LBA4404的感受态细胞：

(1)将-80℃保存的根癌农杆菌LBA4404划板，28℃培养两天；

(2)挑取单克隆，接种于5ml YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜；

(3)取1ml稀释50ml YEP(NaCl5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L)培养基中，28℃250rpm震荡培养至OD600值0.6；

(4)将培养物置于冰上20min，并不时的轻摇，保证内容物充分的冷却；

(5)将菌液转移至预冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清液；

(6)菌体用10ml预冷的0.15M的NaCl重悬；4℃，5000rpm离心10min；

(7)弃上清，用1ml预冷的20mM CaCl₂(含15％的甘油)(250μl60％的甘油加750μlCaCl₂)重悬；分装到预冷的eppendorf管中(200μl/管)；

重组质粒转化农杆菌：200μl感受态细胞中加入1μl重组质粒，冰浴30min；液氮冷冻1min；37℃水浴融化细胞2-3min；加入1ml YEP，28℃轻轻震荡2-4h，低速离心1min，用0.1ml YEP悬浮沉淀，将细胞悬浮液涂布于含50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的YEP(NaCl5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉15g/L)平板上28℃培养2-3天，挑取单菌落，1mlYEP摇菌，菌液用primer1和primer2PCR验证，阳性菌株-80℃保存。

实施例3、花生的遗传转化和转基因花生种子的获得：

(1)花生胚轴的遗传转化

外植体的制备：将成熟荚果去果皮，先后浸于浓度为75％的酒精中1min，在质量浓度为0.1％HgCl₂溶液中浸泡15min，进行表面消毒，再用无菌水漂洗3次。将种皮剥离，放入MS₀培养基，于光下培养。培养4天左右取胚轴作为外植体。

MS₀培养基按如下步骤配制：

取母液Ⅰ50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各5mL；再取2，4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)1mL一起放入烧杯中，无菌水定容到1L。固体培养基再加入9g琼脂。

母液Ⅰ组分如表1所示：

表1

NH₄NO₃

KNO₃

CaCl₂·2H₂O

MgSO₄·7H₂O

KH₂PO₄

3.3g/L

3.8g/L

8.8g/L

7.4g/L

3.4g/L

母液Ⅱ组分如表2所示：

表2

KI

H₃BO₃

MnSO₄·4H₂O

ZnSO₄·7H₂O

N a₂MoO₄·2H₂O

CoCl₂·6H₂O

CuSO₄·5H₂O

0.166g/L

1.24g/L

4.46g/L

1.72g/L

0.05g/L

0.005g/L

母液Ⅲ组分如表3所示：

表3

FeSO₄·7H₂O	Na₂-EDTA·2H₂O
		5.56g/L	7.46g/L

母液Ⅳ组分如表4所示：

表4

花生胚轴外植体的侵染：

胚轴放入新鲜的转化后的农杆菌LBA4404菌液(OD₆₀₀0.5～0.8)中浸泡20min，期间不断摇晃。取出并在滤纸上晾干，然后移到共培养基中，于黑暗条件下共培养2天。

共培养基组分如下：

MS添加0.7mg/L的NAA，8.0mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)。

转化植株的再生：暗培养2天后，用质量百分比为1％头孢水溶液浸泡侵染好的胚轴10min，用无菌水冲洗3-4遍，取出并在滤纸上晾干，然后移到分化培养基中，于光下培养。大约2-5周后，丛生芽长到1-2cm切下转入伸长培养基，于光下培养。待小芽生长到一定长度时，将其转到生根培养基上，促其生根。待根系发育好后，将苗洗根移入盛有无菌土的花盆中，盖地膜3-5天。温室培养，长至一定程度移到大盆中，常规管理。

分化培养基组分如下：

MS基本培养基添加NAA0.7mg/L，6-BA8.0mg/L。另加入250mg/L的头孢噻肟钠(Cef)和75mg/L的Kan。

伸长培养基组分如下：

MS基本培养基添加GA₃(赤霉素)2.0mg/L，6-BA8.0mg/L。加入250mg/L的Cef和75mg/L的Kan。

生根培养基组分如下：

MS基本培养基添加蔗糖20g、IBA(吲哚丁酸)0.7mg/L、NAA0.7mg/L、GA₃2.0mg/L，pH5.4。

(2)转基因花生种子的获得

转基因花生植株提取DNA：

(1)预先把CTAB提取液(CTAB2％，PVP404％，Tris-Cl(pH8.0)100mM，EDTA(pH8.0)20mM，NaCl，β-巯基乙醇(V/V)2％)65℃预热。

(2)将所取植物样品用液氮充分研碎至细粉末状，用液氮预冷的小勺迅速转入预冷的1.5ml eppendorf管，立即加入600μl CTAB提取液并立刻剧烈震荡混匀后马上放于65℃水浴至少1h。

(3)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液(体积比25：24：1)，充分温和混匀后，静置10min，12000rpm离心15min。

(4)取上清转到新管，加入等体积的氯仿/异戊醇溶液(体积比24：1)，充分温和混匀后，12000rpm离心15min。

(5)加0.8倍体积预冷的异丙醇，混匀常温下静置3～5min，用自制玻璃钩或枪头将絮状DNA挑出(也可离心得到)。

(6)弃上清，沉淀用70％酒精洗涤2-3遍，再用无水乙醇洗1-2遍，去净所有液体，抽干或者吹干DNA，用适量无菌水溶解过夜。经电泳、测浓度后，备用。

提取的DNA用primer1和primer2PCR验证，PCR产物经1.5wt％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，阳性植物收取种子，种植后提取DNA进行PCR检测和Southern杂交，验证转基因植株，收获第二代转基因花生种子。

实施例4、Western Blot检测转基因花生种子中Insulin蛋白的表达

从转基因花生种子中提取油体蛋白：

1.取种子0.1g放入研钵中，加入0.6mL的BufferA(10mM PBS，2mM二硫苏糖醇，0.6M蔗糖)，充分研磨成匀浆后，转入2mL离心管中，液面上覆以等体积BufferB(10mMPBS，0.4M蔗糖)，10000g4℃离心30min。

2.小心收集上层油体重新悬浮于0.6mL的BufferC(5mM PBS，0.1M蔗糖)中，液面上覆以等体积BufferD(10mM PBS，0.25蔗糖，2M NaCl)，10000g4℃离心30min。

3.小心收集上层油体重新悬浮于0.6mL9M尿素溶液中，室温60rpm振荡10min，液面覆以等体积的10mM的PBS，10000g4℃离心30min。

4.小心收集上层油体，悬浮于少量BufferA，于4℃保存备用。

Western杂交：

1、将得到的样品上样利用BCA法测定蛋白浓度，等浓度的油体蛋白进行15wt％的SDS-PAGE凝胶电泳；

2、电泳结束后，去掉积层胶，用剪刀剪下与分离胶大小相同的滤纸6-8张、PVDF膜1张；

3、PVDF膜在甲醇中浸泡30s，滤纸、PVDF膜、凝胶及海绵在转移缓冲液(25mM Tris-Cl，192mM甘氨酸，20％V/V甲醇，PH8.3)中浸泡5min后，按负极板、海绵、三张滤纸、凝胶、PVDF膜、三张滤纸、海绵、正极板的顺序组装成“三明治”结构；然后，在100mA的电流下转膜30min(胶在负极，膜在正极)；卸下转膜装置；

4、PVDF膜用含5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜上的空白位点，1h；

5、TBST(Tris Base3.028g,NaCl29.25g,Tween-200.05％)洗膜3次，每次10min；

6、一抗反应液与PVDF膜温育2h；

7、TBST溶液洗PVDF膜3次，每次10min；

8、二抗反应液与PVDF膜温育1h；

9、TBST溶液洗PVDF膜三次，每次15min；

10、等体积A液B液(生工试剂盒)混合，PVDF膜在混合液中孵育5min，压胶片20min显影定影。结果如图2和图3所示。

图2和图3的结果可以看出，经过优化的胰岛素序列在花生中表达后，表达量明显高于未经优化的胰岛素序列，经过软件分析得出其表达量比未经优化的胰岛素基因平均高4倍。

实施例5、从转基因花生种子中大规模分离并回收人Insulin蛋白

人Insulin蛋白分离并回收，将转基因花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀(种子纤维等)，回收上层的油相，清洗后、离心再取上层的油相；加入肠肽酶进行酶消化反应,离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。

Claims

1.一种在花生油体蛋白***中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造：将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。

2.如权利要求1所述的人Insulin蛋白表达基因片段，其特征在于，上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种利用油体蛋白***在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，其特征在于，步骤如下：

正向引物：GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；

反向引物：TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下：

模板1μl，2×LA Taq mix10μl，10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，ddH₂O8.0μl。

PCR反应程序如下：

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的载体为pCAMBIA2301-AhOleosin载体，通过在载体pCAMBIA2301上***序列如SEQ ID NO.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID NO.3所示的终止子获得。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌为LBA4404。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中纯化的步骤如下：将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。