JP2022507627A - ポリ-アラニンc-ドメインのサブセグメントを有する単鎖インスリンアナログ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 配列パターン[Asp/Glu]-Ala-An-Ala-Xaaに適合する長さ4-11の人工Cドメインセグメントを含む単鎖インスリンアナログであって、Anは0-7個のアラニン残基のサブセグメントを示し、Xaaはアミノ酸のアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基を示すものである。アナログは、ヒトインスリンなどの哺乳類インスリンのアナログであっても良く、(i)インスリンの安定性を増強する、(ii)等電点のシフトを引き起こして中性pHでのタンパク質の溶解性を高めるもしくは損なう、または(iii)I型IGF受容体へのタンパク質のクロスバインディングを低減する標準的または非標準的な修飾を選択的に含んでいても良い。本発明は、生理学的に有効な量のタンパク質またはその生理学的に許容される塩を患者に投与することを含む、糖尿病の患者を治療する方法である。【選択図】 図1A
Description
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号DK040949およびDK074176による政府の支援を受けて作製された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、対応する野生型ヒトホルモンの可溶性製剤に対して、熱力学的安定性の増加、室温以上での熱細動に対する抵抗性の増強、マイトジェニック性の減少、および/または薬物動態および薬力学的特性の変化、すなわち作用時間のより長期化または作用時間のより迅速な付与など、強化された医薬特性を示すポリペプチドホルモン類縁体に関する。より詳細には、本発明は、AドメインとBドメインの間に新規なクラスの前短縮された連結(C)ドメインを含む単一のポリペプチド鎖からなるインスリン類似体に関するものである。長さ4~11残基のこのクラスのCドメインは、N-末端の酸性要素と、少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を含むC-末端セグメントからなる。本発明の単鎖インスリン類縁体は、AまたはBドメインの他の部位に標準的または非標準的なアミノ酸置換を選択的に含むことができる。
治療薬やワクチンなどの非標準的なタンパク質を工学的に開発することは、医学的にも社会的にも大きな利益をもたらす可能性がある。天然に存在するタンパク質は、ヒト、他の哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、あるいは真核細胞のゲノムにおいてコード化されており、多くの場合、複数の生物活性を付与する。非標準的なタンパク質の利点は、室温またはそれ以上の温度での分解に対する耐性が増強され、輸送、流通、使用が容易になることである。治療用タンパク質の一例として、インスリンが挙げられる。野生型のヒトインスリンや他の哺乳類のゲノムにコードされているインスリン分子は、RNAスプライシングの代替モードや翻訳後のグリコシル化の代替パターンによって生成された受容体アイソフォームとは無関係に、複数の器官や多様なタイプの細胞のインスリン受容体に結合する。また、野生型インスリンは、相同性の高い1型インスリン様成長因子受容体(IGF-1R)と低い親和性で結合する。
医学的なメリットとしては、タンパク質の展開や分解に対する安定性を最適化することが挙げられる。このような社会的な利益は、室温以上での分解に関して標準的なタンパク質よりも抵抗性のあるタンパク質を工学的に開発することで、特に電気や冷蔵が一貫して利用できない発展途上国の地域での使用に適する。単一のポリペプチド鎖で構成され、選択的に非標準的なアミノ酸置換を含むインスリンの類似体は、熱劣化への耐性や***促進性の低下に関して優れた特性を示す可能性がある。インスリンの物理的劣化による問題は、アフリカやアジアでの糖尿病の流行により、さらに深刻化している。フィブリル化は室温以上での主な分解経路であるため、フィブリル化に耐性のある製剤を設計することで、このような問題を抱える地域でのインスリン補充療法の安全性と有効性を高めることができる。
インスリンの投与は、糖尿病の治療法として長い間確立される。糖尿病患者に対する従来のインスリン補充療法の主な目的は、血糖値が健康な人に特有の正常範囲を超えたり、下回ったりしないようにしっかりとコントロールすることである。正常範囲を下回ると、すぐにアドレナリン作動性症状や神経糖質減少性症状が現れ、重篤な場合には痙攣、昏睡、死に至ることもある。正常範囲を超えた場合は、網膜症、失明、腎不全などの微小血管障害の長期的なリスクが高まる。
インスリンは、脊椎動物の代謝に中心的な役割を果たす小型の球状タンパク質である。インスリンは、21残基のA鎖と30残基のB鎖の2つの鎖から構成される。ホルモンは、Zn2+で安定化された6量体として膵β内に貯蔵されるが、血流中ではZn2+を含まない単量体として機能する。インスリンは、B鎖のC末端残基(B30残基)とA鎖のN末端残基をつなぐ連結領域(35残基)を有する単鎖の前駆体であるプロインスリンの産物である(図1A)。様々な証拠から、インスリン様コアと無秩序な連結ペプチドから構成されることが示される(図1B)。3つの特異的なジスルフィド結合(A6-A11、A7-B7、A20-B19、図1Aおよび図1B)の形成は、粗面小胞体(ER)におけるプロインスリンの酸化的な折り畳みと連動すると考えられる。プロインスリンは、小胞体からゴルジ装置に輸送された直後に、可溶性のZn2+を配位した6量体に集合する。未熟な分泌顆粒では、エンドプロテアーゼによる消化とインスリンへの変換が行われ、その後、形態が凝縮される。成熟した貯蔵顆粒内のインスリン六量体亜鉛の結晶配列は、電子顕微鏡(EM)によって可視化される。インスリンの塩基配列を図1Cに模式的に示す。個々の残基は、アミノ酸の同一性(典型的には、標準的な1文字または3文字のコードを使用する)、鎖および配列位置(典型的には、上付き文字として)によって示される。本発明で重要なのは、ヒトプロインスリンに特徴的な36残基の野生型Cドメインの代わりに、長さ4~11残基の新規な前短縮型Cドメインを発明することである。
フィブリル化は、糖尿病治療用のインスリンおよびインスリンアナログの製造、保存、使用において深刻な問題であり、高温、低pH、撹拌、または尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、または疎水性表面の存在によって促進される。現在の米国の医薬品規制では、フィブリル化が1%以上発生した場合、インスリンを廃棄することが求められる。フィブリル化は温度が高くなると促進されるため、糖尿病患者はインスリンを使用する前に冷蔵保存することが望ましい。インスリンやインスリンアナログのフィブリル化は、外付けのインスリンポンプを使用している患者にとっては特に問題となる。このような使用方法では、インスリンまたはインスリンアナログはポンプ装置内で冷蔵保存されないため、インスリンのフィブリル化により、インスリンまたはインスリンアナログを体内に注入するためのカテーテルが閉塞し、予測できない血糖値の変動や、危険な高血糖を引き起こす可能性がある。インスリンは、25℃以上の温度で10℃上昇するごとに10倍以上の分解率になるため、<30℃での保存できれば冷蔵保存が望ましいとされる。pH5以下の可溶性溶液として製剤化された基礎インスリンアナログ製剤(ランタス(登録商標)(サノフィ・アベンティス社)など)のフィブリル化は、pH4のインスリン・グラルギンと亜鉛イオンの非緩衝溶液を含む。このような製剤に用いられる酸性条件は、インスリンの自己組織化を阻害し、亜鉛イオンの結合力を弱めるため、亜鉛とタンパク質の集合体の中に封じ込めることでインスリンアナログを保護することができる範囲が狭くなる。
インスリンは化学的に劣化しやすく、分子内の原子の再配列が失われて化学結合が切断されたり、異なるインスリン分子間で化学結合が形成されたりする。このような化学結合の変化は、通常、タンパク質の展開状態で起こるため、熱力学的安定性を高めるインスリンの改変は、化学的劣化を遅らせたり、防いだりする可能性がある。
また、インスリンは物理的に分解されやすい。現在のタンパク質フィブリル化理論では、フィブリル化のメカニズムは、部分的に折り畳まれた中間状態を経て、その中間状態が凝集してアミロイド原核を形成すると考えられる。この理論によると、ネイティブな状態を安定化させるアミノ酸置換は、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化させる場合とさせない場合があり、また、ネイティブな状態と中間状態の間の自由エネルギー障壁を増加させる場合とさせない場合があると考えられる。したがって、現在の理論では、2本鎖インスリン分子内のあるアミノ酸置換が細動のリスクを増加または減少させる傾向は、非常に予測不可能である。インスリン分子の構造モデルでは、(ネイティブな状態で見られるように)3αヘリックスがほぼ完全に展開し、B鎖の連続的な積み重ねとA鎖の連続的な積み重ねによってβシートが平行に配置され、鎖間およびA鎖内のネイティブなジスルフィドペアリングが維持されると考えられる。このような平行なβシートを形成するためには、A鎖のN末端とB鎖のC末端の間にかなりの距離(>30Å)が必要であり、通常、インスリンモノマーのネイティブな状態では、これらの末端は近接する(<10Å)。
前方に短縮されたCドメインを持つ単鎖インスリンアナログのフィブリル化に対する顕著な抵抗性は、当技術分野では知られており、インスリンのプロトフィラメントにおける平行なクロスベータシートのスプレイ構造と、前方に短縮されたCドメインがA鎖のN末端とB鎖のC末端の間の距離を制約するネイティブなジスルフィドペアリングを持つ単鎖インスリンアナログの構造との間のトポロジー的不適合を反映していると考えられる。図2に、CドメインGly-Gly-Pro-Arg-Arg(GGGPRR)を含む長さ57残基の活性で超安定な単鎖インスリンの3次元構造を、LysB29とGlyA1の間にペプチド結合を含む不活性な単鎖アナログ(すなわち長さ50残基のdes-B30 SCI)との関係で示す。
本発明は、A鎖とB鎖の間の化学的テザー(例えば、LysB29のε-アミノ基とGlyA1のα-アミノ基の間)および短縮されたCドメインによってインスリンに与えられる増大した安定性を最適化する必要がある。後者の類縁体は単鎖インスリン類縁体(SCI)と呼ばれる。B鎖のC末端付近の残基(B28、B29、B30残基)とGlyA1との直接のペプチド結合は、一般に生物学的活性を著しく低下させるが、長さ4-11の短縮型Cドメインは、少なくとも受容体結合親和性のかなりの部分を許容するのに十分なコンフォメーション上の「遊び」を提供する。このような長さの区別の構造的な基盤は、ホルモンとインスリン受容体のエクトドメインの2つの部分(N-末端断片L1-CRとC-末端断片αCT)との間の三元複合体を含む「マイクロ受容体」/インスリン複合体の結晶構造によって示唆される。一般的にSCIは、血流中でのシグナル伝達が長くなることがあり、インスリンポンプや食事時インスリン補充療法での使用には不利な薬力学的特性である。当技術分野で知られる超安定な単鎖または二本鎖のインスリン類似物質は、糖尿病ラットの静脈内ボーラス注射でテストしたところ、不可解な異常なシグナル伝達の延長を示した(図3)。我々の知る限り、あるBドメインのコンテキストでは二相性の薬力学特性を付与できるが、別のコンテキストでは付与できない混合配列のCドメイン(Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg[EEPRR]など)の薬力学的効果を予測できるルールは知られていない。
そのため、生物学的および生物物理学的特性が容易に最適化され、治療への応用が可能な、単純化されたCドメイン配列を有する単鎖インスリン類似体が必要とされる。このような治療法の例としては、(i)体外式または体内式インスリンポンプでの迅速な作用、(ii)発展途上国の困難な地域で使用するための超安定単成分可溶性製剤での二相性作用、などが挙げられる。AまたはBドメインにおける安定化置換の存在下で、および/または2鎖インスリンアナログの吸収を促進するために当技術分野で知られるBドメイン置換の存在下で、糖尿病の哺乳動物の皮下注射におけるSCIの迅速な作用が維持される、単純化されたCドメイン配列に対する特別な必要性があるだろう。
したがって、本発明は、内部にポリ-アラニンサブセグメントを有する簡略化されたC-ドメイン配列を含む単鎖インスリン類似体を提供することを目的とする。これらの配列は長さ4~11であり、N末端の酸性残基(アスパラギン酸またはグルタミン酸)と、アラニン、酸性残基または塩基性残基のいずれかであるC末端の残基を含む(グループX:アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジン、セリン)。したがって、これらのCドメイン配列は、[Asp/Glu]-Ala-An-Ala-[Xaa]のパターンに適合し、ここで、Anは、0~7個のアラニン残基のサブセグメントを指定し、Xaaは、上記のグループXから選択されたアミノ酸残基を指定する。本発明のもう一つの側面は、IR-AおよびIR-Bに対する単鎖インスリンアナログの絶対的なin vitro親和性が、野生型のヒトインスリンに対して5~150%の範囲であり、そのためホルモン-受容体複合体における滞留時間が著しく長くなる可能性が低いことである。このような最適化された類似体は、野生型ヒトインスリンよりも***を誘発するIGF-1R受容体に弱く結合するはずであり、これは哺乳類細胞培養における***誘発性の低下を示す傾向があるだろうというのが、本発明のさらに別の側面である。本発明は、単純化されたCドメイン配列を有する単鎖インスリン類縁体の有用性を示すものであり、治療用途に好ましい生物物理学的、生物学的および薬力学的特徴の共同最適化を容易にするものである。
本発明は、(i)簡略化された前短縮されたCドメイン(長さ4~11残基)の存在に起因する強化された安定性とフィブリル化に対する抵抗性、および(ii)生物学的、生物物理学的および薬力学的特性の容易で便利な共同最適化を提供する単鎖のインスリンアナログを対象とする。本発明の単鎖インスリンアナログは、4.0~6.0の間の等電点を有していても良く(従って、速効性インスリンアナログ製剤として中性pH条件下での製剤化に適する)、あるいは6.5から8.0の間の等電点を有していても良い(従って、基礎インスリンアナログ製剤として酸性pH条件下での製剤化に適する)。この戦略の分子的な実施形態は、酵母Pichia pastorisでの生合成発現によって調製され、SCI-4と名付けられ、その特性は当技術分野で知られるSCI(SCI-1、SCI-2、SCI-3と名付けられた)と関連する。
本発明の短縮されたCドメインを図5に模式的に示す。ネイティブインスリンのA1-A8 α-helix(下に配列がある円柱として示す)は、本発明に関連する静電的特徴を強調する。野生型の配列には中央に酸性の残基(GluA4)があり、その負電荷が(i,i-4)および(i,i+4)の静電相互作用に関与する可能性がある。前者にはCドメインのC末端側鎖が関与し、後者にはA8位置の変異型側鎖が関与する可能性がある。A4関連の静電相互作用の例としては、(a)CドメインのC末端位置にあるArg、HisまたはLys、または(b)A8位置にあるArg、HisまたはLysが挙げられる。CドメインのC末端位置のAsn、Asp、Glu、Serは、このヘリックスの好ましいN-Capを提供し、一方、A8位置のArg、His、Lysは、野生型ThrA8よりも好ましいC-Capを提供する可能性がある。CドメインのN-末端残基は、インスリン受容体アイソフォーム(IR-AおよびIR-B)に相対する***促進性のタイプ1IGF受容体(IGF-1R)への類似体の結合を損なうために、酸性(アスパラギン酸またはグルタミン酸)である。
CドメインのC末端残基は、アナログの等電点(ひいてはpH依存性溶解度)、熱力学的安定性、セグメントA1-A8ヘリカルダイナミクス、薬物動態特性、及び薬力学特性の共同最適化を容易にする「調整可能なノブ」を提供する。理論的な制約を意図しているわけではないが、このノブは、N-Cap残基としての可能性も含め、らせんの双極子軸(図5の横矢印)との静電的な相互作用や、(i,i-4)側鎖の相互作用を介してGluA4の負電荷と相互作用するように配置される。このα-ヘリカルセグメントの静電特性をさらに変化させるには、(i,i+4)側鎖相互作用を介したA8位の置換が有効である。ヒトインスリンのスレオニンであるA8位の野生型残基は、α-ヘリカル傾向とC-Cap傾向の両方に関して最適ではないβ分岐型の側鎖を含む。このようなCドメインは、最小のものでは4つの残基が中央にジ-アラニン要素([Asp/Glu-Ala-Ala-Xaa])を有し、最長のものでは11残基が9残基のポリ-アラニンサブセグメントを有する。
本発明の単鎖インスリン類縁体は、それぞれのAドメインおよびBドメイン内に置換を含んでいても良い。Bドメインの置換には、自己組織化を弱め、皮下注射時の迅速な吸収を可能にすることが知られる変異体が含まれる。その例としては、AspB28(Novolog(登録商標);insulin aspart)、LysB28-ProB29(Humalog(登録商標);insulin lispro)またはAspB28-ProB29が挙げられる。TyrA14をGluで置換することにより、熱力学的安定性を向上させる逆疎水性効果を緩和し、同時に化学的分解の可能性のある芳香族部位を取り除くことができる。本発明の類縁体は、細胞培養での有糸***性やラット実験での発癌性の増加に関連するHisB10→Aspの置換を除外する。
ヒトと動物のインスリンが類似することや、過去に動物のインスリンがヒトの糖尿病患者に使用されたことを考慮すると、インスリンの配列に他のマイナーな変更が導入されることも想定され、特に「保守的」と考えられる置換が導入されることも想定される。例えば、本発明から逸脱することなく、類似した側鎖を持つアミノ酸のグループ内で、アミノ酸の追加的な置換を行っても良い。中性の疎水性アミノ酸としては、アラニン(AlaまたはA)、バリン(ValまたはV)、ロイシン(LeuまたはL)、イソロイシン(IleまたはI)、プロリン(ProまたはP)、トリプトファン(TrpまたはW)、フェニルアラニン(PheまたはF)、及びメチオニン(MetまたはM)などが挙げられる。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン(GlyまたはG)、セリン(SerまたはS)、スレオニン(ThrまたはT)、チロシン(TyrまたはY)、システイン(CysまたはC)、グルタミン(GluまたはQ)、およびアスパラギン(AsnまたはN)のそれらのグループ内で互いに置換されていても良い。塩基性アミノ酸としては、リジン(LysまたはK)、アルギニン(ArgまたはR)、及びヒスチジン(HisまたはH)などが考えらレル。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸(AspまたはD)およびグルタミン酸(GluまたはE)である。別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合は、本明細書に記載されたアミノ酸はL-アミノ酸であると考えるべきである。標準的なアミノ酸は、同じ化学的クラスに属する非標準的なアミノ酸で置換することもできる。非限定的な例として、塩基性側鎖Lysは、より短い側鎖長の塩基性アミノ酸(オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸)で置き換えられても良い。また、Lysは中性脂肪族イソステアのノルロイシン(Nle)で置換されていても良く、その場合、より短い脂肪族側鎖を含む類似体(アミノ酪酸、アミノプロピオン酸)で置換されていても良い。
本発明の代表的なアナログは、記載されているように、酵母Pichia pastorisの人工株から精製された(Glidden,M.D.,et al.2017ab,"Solution structure of an ultra-stable single-chain insulin analog connects protein dynamics to a novel mechanism of receptor binding.".J.Biol.Chem.pii:jbc.M117.808667.doi:10.1074/jbc.M117.808667[Epub ahead of print])に記載される。この類似体は長さ57残基で、配列Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala(EAAAAA)のCドメインを含んでおり、したがって、n=2(上記の下線)でXaaもアラニンであるテンプレートGlu-Ala-An-Xaaに適合する。類似品(SCI-4と命名)は、インスリン部分に4つの置換基を含んでいた。インスリン部分にはThrA8→HisとTyrA14→Glu、BドメインにはProB28→AspとLysB29→Proの4つの置換があった。これらの置換基の理由は以下の通りである。HisA8は受容体結合親和性と熱力学的安定性を高めるために、GluA14は安定性を高め、等電点を下げるために(HisA8の部分電荷によって上昇する)、AspB28-ProB29は二量体化を弱め、等電点をさらに下げるために導入されたものである。
SCI-4の連結ドメインまたはCドメインは、N-末端の[Asp/Glu]-Ala要素からなる一般的な構造を有しており、SCIの***促進性のタイプ1IGF受容体(IGF-1R)への結合を損なうように機能する。C末端のAla-Xaa(ここでXaaは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジン、またはセリンからなるアミノ酸のサブセットから選択される)は、アナログの等電点、安定性、セグメントヘリカルの安定性、および薬力学的特性を調整するための調整可能なノブとなる。本発明の短縮されたCドメインは、n=0、1、2、3、4、5、6または7残基を含むポリ-アラニンサブセグメント(An)を選択的に含む。そのため、Cドメインの全長は4~11残基の範囲となる。最も短いCドメインは中央にジ-アラニンサブセグメント([Asp/Glu]-Ala-Ala)を含み、最も長いCドメインは中央に7つのアラニンを含むポリ-アラニンサブセグメントを含み、合計9つのアラニン残基を持つ。
このアナログの薬力学的特徴は、Menting,J.G.,et al.(2014,"Protective hinge in insulin opens to enable its receptor engagement.")で提供されているように、糖尿病のラットモデルで皮下注射後にテストされた。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(33):E3395-404)に記載される。図6に示すように、SCI-4の生物学的活性、作用の開始、および作用の持続時間は、インスリンリスプロと、当技術分野で従来知られているより複雑なCドメインを含む2つの単鎖類似体(Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg;EEGPRR)とを相対的に定義した。SCI-2は、SCI-4と同じ4つの置換をA-およびB-ドメインに含み、作用の開始は早いが(インスリンリスプロと同様)、インスリン作用の延長された尾部を示す。SCI-3は、SCI-2のAドメインに野生型の残基(すなわちThrA8とTyrA14)が復元された変異体で、この変異体は作用発現が遅いが、そのオフセットはインスリンリスプロと同様であった。驚くべきことに、SCI-4の薬力学的プロファイルは、作用の開始、作用のオフセット、および統合された効力(曲線上の面積)に関して、インスリン・リスプロと本質的に同じである。HisA8とGluA14が存在するにもかかわらず、長く続く尾部がないことから、Cドメインの配列とインスリン部分の改変が相互に影響し合っていることがわかる。
糖尿病の患者を治療する方法は、本明細書に記載の単鎖のインスリンアナログを投与する工程を含む。本発明のインスリンアナログは、医薬品として、または疾患の治療のために使用することができる。いくつかの例では、本発明のインスリンアナログは、糖尿病の治療のための医薬品の製造に使用されても良い。
本発明の別の側面として、単鎖インスリン類似体は、酵母(Pichia pastoris)を用いて調製するか、ネイティブフラグメントライゲーションによる全化学合成を行うことができる。合成法による調製は、D-アミノ酸置換、PheやTyrの芳香環内のハロゲン置換、炭水化物によるセリンやスレオニンのO-結合型修飾などの非標準的な修飾の場合に好ましいが、非標準的な修飾を含む単鎖類縁体のサブセットを、拡張遺伝暗号技術や4塩基コドン技術によって製造することも可能であると考えられる。非標準的なアミノ酸置換の使用が、化学的分解または物理的分解に対する単鎖インスリンアナログの耐性を増強することができるというのが、本発明のさらに別の側面である。さらに、本発明の類似体が、糖尿病またはメタボリックシンドロームの治療方法を提供することを想定する。インスリンアナログの送達経路は、典型的には、シリンジまたはペンデバイスの使用による皮下注射である。インスリンポンプも同様に、外部インスリンポンプや移植可能な腹腔内ポンプなどを使用することができる。
本発明の単鎖インスリンアナログは、米国特許第8,921,313号に詳細に記載されているように、B24、B25、またはB26の位置にハロゲン原子などの他の修飾を含んでいても良い(その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる)。本発明のインスリンアナログはまた、残基B1-B3の欠失による前短縮されたB鎖を含んでいても良い。
医薬組成物は、このようなインスリンアナログ、およびその生理学的に許容される塩を含んでいても良く、選択的に亜鉛を含んでいても良い。亜鉛イオンは、インスリンアナログ6量体あたり2.2個の亜鉛原子から10個の亜鉛原子まで、さまざまな亜鉛イオン:タンパク質の比率で含まれていても良い。製剤のpHは、pH3.0~4.5(pIシフトした単鎖インスリンアナログの基礎製剤として)、またはpH6.5~8.0(pIが野生型インスリンと同様の単鎖インスリンアナログのプランディアルインスリン製剤として)の範囲であっても良い。このようないずれの製剤においても、インスリンアナログの濃度は、典型的には約0.6~5.0mMとなるだろう。5mMまでの濃度は、バイアルまたはペンで使用することができる。より濃縮された製剤(U-200以上、範囲U-500~U-1000を含む)は、顕著なインスリン抵抗性を有する患者において特に有益であると考えられる。賦形剤としては、グリセロール、グリシン、アルギニン、トリスなどの緩衝剤や塩類、フェノールやメタクレゾールなどの抗菌防腐剤などが挙げられ、後者の防腐剤はインスリン六量体の安定性を高めることが知られている。このような医薬組成物は、生理学的に有効な量の組成物を患者に投与することにより、糖尿病または他の病状を有する患者を治療するために使用することができる。
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列は、比較のために、配列ID番号:1として提供される。
配列ID番号:1(ヒトプロインスリン)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
ヒトインスリンのA鎖のアミノ酸配列は、配列ID番号:2として提供される。
配列ID番号:2(ヒトA鎖)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
ヒトインスリンのB鎖のアミノ酸配列は、配列ID番号:3として提供される。
配列ID番号:3(ヒトB鎖)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
SCI-4のアミノ酸配列は、配列ID番号:4として提供される。
配列ID番号:4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SCI-2のアミノ酸配列は、配列ID番号:5として提供される。
配列ID番号::5
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SCI-3のアミノ酸配列は、配列ID番号:6として提供される。
配列ID番号::6
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
前述の開示に基づき、ポリ-アラニンサブセグメントを含む短縮された単純化されたCドメインを共同で設計することにより、超安定な単鎖インスリンアナログがインスリンシグナルの持続時間を妨げずに適合するようになることが明らかになるはずである。結果として提供される単鎖インスリンアナログは、本明細書に記載された目的を遂行する。すなわち、これらの修飾されたタンパク質は、望ましい薬物動態学的特徴(治療上必要な皮下デポからの迅速または長時間の吸収率を付与する)を保持し、野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しながら、フィブリル化に対する強化された耐性を示す。したがって、明らかな変形は本発明の範囲内であり、したがって、特定の構成要素の選択は、本明細書に開示され記載された本発明の精神から逸脱することなく決定することができることを理解されたい。
配列ID番号:1(ヒトプロインスリン)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
ヒトインスリンのA鎖のアミノ酸配列は、配列ID番号:2として提供される。
配列ID番号:2(ヒトA鎖)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
ヒトインスリンのB鎖のアミノ酸配列は、配列ID番号:3として提供される。
配列ID番号:3(ヒトB鎖)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
SCI-4のアミノ酸配列は、配列ID番号:4として提供される。
配列ID番号:4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SCI-2のアミノ酸配列は、配列ID番号:5として提供される。
配列ID番号::5
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SCI-3のアミノ酸配列は、配列ID番号:6として提供される。
配列ID番号::6
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
前述の開示に基づき、ポリ-アラニンサブセグメントを含む短縮された単純化されたCドメインを共同で設計することにより、超安定な単鎖インスリンアナログがインスリンシグナルの持続時間を妨げずに適合するようになることが明らかになるはずである。結果として提供される単鎖インスリンアナログは、本明細書に記載された目的を遂行する。すなわち、これらの修飾されたタンパク質は、望ましい薬物動態学的特徴(治療上必要な皮下デポからの迅速または長時間の吸収率を付与する)を保持し、野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しながら、フィブリル化に対する強化された耐性を示す。したがって、明らかな変形は本発明の範囲内であり、したがって、特定の構成要素の選択は、本明細書に開示され記載された本発明の精神から逸脱することなく決定することができることを理解されたい。
Claims (16)
- インスリンA鎖ポリペプチド配列と、インスリンB鎖ポリペプチド配列と、およびインスリンA鎖ポリペプチド配列をB鎖ポリペプチド配列と連結する連結ペプチドとを含む単鎖インスリンアナログであって、前記連結ペプチドが
[Asp/Glu]-Ala-An-Ala-Xaa
の配列を有し、
前記Anは、長さが0~7個のアラニンの選択的なポリ-アラニンサブセグメントであり、Xaaはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジンおよびセリンからなるアミノ酸の群から選択される、単鎖インスリンアナログ。 - 請求項1記載の単鎖インスリンアナログにおいて、前記連結ペプチドのN末端アミノ酸がGluである、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項2記載の単鎖インスリンアナログにおいて、XaaがAlaである、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項3記載の単鎖インスリンアナログにおいて、AnがAla-Alaを含む、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項4記載の単鎖インスリンアナログにおいて、AnがAla-Alaからなる、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項1記載の単鎖インスリンアナログにおいて、XaaがAlaである、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項6記載の単鎖インスリンアナログにおいて、AnがAla-Alaを含む、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項7記載の単鎖インスリンアナログにおいて、AnがAla-Alaからなる、単鎖インスリンアナログ。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載のインスリンアナログであって、さらに、ヒトインスリンのA8位に相当する位置にHis置換、ヒトインスリンのA14位に相当する位置にTyr置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
- 請求項9記載のインスリンアナログにおいて、さらに、ヒトインスリンのB28位に相当する位置にAsp置換、ヒトインスリンのB29位に相当する位置にPro置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載のインスリンアナログであって、さらに、ヒトインスリンのB28位に相当する位置にAsp置換、ヒトインスリンのB29位に相当する位置にPro置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
- それを必要とする患者の血糖値のを低下させる方法であって、請求項1~8のいずれか1項に記載の単鎖インスリンアナログまたはその生理学的に許容される塩を前記患者に投与する工程を含む、方法。
- 請求項12記載の方法において、単鎖インスリンアナログが、インスリンペン、外部インスリンポンプまたは移植可能な腹腔内ポンプを使用して投与される、方法。
- 疾患の治療のための薬剤の製造のための請求項1~8のいずれか1項に記載の単鎖インスリンアナログの使用。
- 疾患の治療のための、請求項1~8のいずれか1項に記載の単鎖インスリンアナログ、またはその生理学的に許容される塩。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の単鎖インスリンアナログをコード化する核酸。
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