JPH05155778A - Growth promoter and animal growth promoter containing lps - Google Patents
Growth promoter and animal growth promoter containing lpsInfo
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- JPH05155778A JPH05155778A JP3357351A JP35735191A JPH05155778A JP H05155778 A JPH05155778 A JP H05155778A JP 3357351 A JP3357351 A JP 3357351A JP 35735191 A JP35735191 A JP 35735191A JP H05155778 A JPH05155778 A JP H05155778A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、発育促進剤及び動物用
発育促進剤に関する。より詳細には、本発明は、ＬＰＳ
を含む発育促進剤及び動物用発育促進剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a growth promoter and a growth promoter for animals. More specifically, the present invention relates to LPS
And a growth promoter for animals.
【０００２】[0002]
【従来の技術】人間の場合、出生時の体重が２，５００
ｇ未満のものを未熟児と呼び、体重が２，５００ｇ以上
になるまでは特別の看護体制下で保育されるのが通例で
ある。これは、出生時体重が小さいほど、新生児期にお
ける死亡率が高く、或いは、様々な病気をおこしやす
く、又、その後の発育にも問題があることが多いからで
ある。（平山宗宏等編「育児全書」、１２６〜１２８
頁、昭和５２年社会保険出版社発行） 又、痩身者につ
いては、２０代では標準者及び肥満者よりも有意に死亡
指数が高い、年齢層に関係なく、入院率は痩身者が最も
多い、痩身者の方が肥満者より骨折しやすい等の報告が
ある。（森川憲導等著「肥満児とやせ児」、２４〜３０
頁、昭和５８年２月２８日株式会社ぎょうせい発行）上
記事情は、程度の差こそあれ、本質的に人間以外の動物
であっても同様であると推定される。加えて、人間の食
に供される牛、豚、魚等の場合には、その発育状況によ
り商品価値は決まり、又、育成期間が短い程経営効率は
よくなる。このように、出生時及びその後においても、
人間及びその他の動物において発育促進の必要が生じる
ことがある。現在、この発育は主として栄養摂取量の増
加により達成を意図されているが、食欲のない者に摂取
を強制するとかえって食欲を害し、好ましい結果は得ら
れない。又、摂取効率には個体差がある。そのため、人
間以外の動物、例えば肥育牛においてはホルモン剤、非
ホルモン剤が発育促進剤として与えられており、この場
合、飼料を節減するという効果の達成も意図されてい
る。しかし、ホルモン剤は副作用、体内残留性の点から
使用が差し控えられており、又、非ホルモン剤は、一部
が商品化されているにすぎない。（土屋平四郎等著「改
訂・肉牛飼養全科第２版」、１７９〜１８１頁、昭和６
３年社団法人農山漁村文化協会発行）従って、人間及び
その他の動物の健康体を回復、維持する手段、及び、よ
り経済的に食肉を提供する手段としての発育促進剤開発
の要請が存在しており、副作用や体内残留性の問題がな
く、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発が強く待たれて
いる。2. Description of the Related Art In humans, the birth weight is 2,500.
Those less than g are called premature babies, and they are usually kept under a special nursing system until they weigh 2,500 g or more. This is because the smaller the birth weight is, the higher the mortality rate in the neonatal period is, the more easily various diseases are caused, and the more the subsequent growth is often problematic. (Munehiro Hirayama et al., "Complete Parenting", 126-128
Page, published by Social Insurance Publishing Co., Ltd. in 1975) In addition, for those who are slim, their mortality index is significantly higher in their twenties than in the standard and obese people. There are reports that lean people are more likely to suffer bone fractures than obese people. ("Morikawa Kensuke et al.," Obese and thin children ", 24-30)
(Published by Gyosei Co., Ltd. on February 28, 1983) It is presumed that the above-mentioned circumstances are the same even if they are animals other than human beings to some extent. In addition, in the case of cattle, pigs, fish, etc., which are used for human food, the product value is determined by the growth status, and the shorter the growing period, the better the management efficiency. Thus, at birth and afterwards,
Developmental needs may arise in humans and other animals. At present, this development is mainly intended to be achieved by increasing the nutritional intake, but forcing the intake of a person who does not have an appetite will adversely affect the appetite, and the desired result cannot be obtained. Also, there are individual differences in intake efficiency. Therefore, in animals other than humans, such as fattening cattle, hormonal agents and non-hormonal agents are given as growth promoters, and in this case, it is also intended to achieve the effect of saving feed. However, hormonal agents have been withheld from the viewpoint of side effects and persistence in the body, and non-hormonal agents are only partially commercialized. ("Heisei Tsuchiya et al.," Revised Beef Cattle Breeding, Second Edition ", pp. 179-181, Showa 6)
Therefore, there is a demand for the development of growth promoters as a means to restore and maintain the health of humans and other animals and to provide meat more economically. Therefore, there is a strong need for the development of an inexpensive drug that is easy to administer and has no side effects or persistence problems in the body.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な発育
促進剤、動物用発育促進剤を提供することを技術的課題
とするものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has as its technical subject the provision of a novel growth promoting agent and animal growth promoting agent.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、優れ
た発育促進効果を有し、未熟児の誕生を予防し、副作用
や体内残留性の問題がなく、長期使用が可能であり、生
産コストが安く、しかも、経口、経皮、薬浴、注射いず
れの経路でも投与が可能な、大量に供給可能なＬＰＳを
含む発育促進剤、動物用発育促進剤を提供することによ
り達成される。この発育促進剤、動物用発育促進剤に
は、インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産
生能を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロ
ファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化
能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大かつ一
定の値（本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」
と称す）にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を
１００％とするマクロファージ活性化能（％）を表し、
横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファ
ージ活性化能のＥＤ５０を与えるリムラステスト陽性Ｌ
ＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるＬ
ＰＳの少なくとも１種が含まれる。ここで「少なくとも
１種を含む」とは、本発明のＬＰＳは各別に使用できる
ことはもちろん、その意図される用途が阻害されない限
り、それらの２種以上を任意に組み合わせて、又、更に
は他のいずれの物質とも組み合わせて使用できることを
意味する。例えば、他の発育促進剤、ビタミン剤等のい
わゆる栄養剤その他と配合することもできる。[Means for Solving the Problems] The above technical problems have an excellent growth-promoting effect, prevent the birth of premature infants, have no side effects or persistence in the body, and can be used for a long period of time. This can be achieved by providing a growth promoter containing a large amount of LPS and a growth promoter for animals which can be administered by any of oral, transdermal, medicinal bath and injection routes at low cost. The growth promoting agent and the animal growth promoting agent use the macrophage activating ability of LPS that activates the TNF producing ability of macrophages cultured in vitro as an index, and the ordinate indicates the macrophage of the macrophage when the LPS is not added. The macrophage activating ability that gives TNF production is 0%, and the TNF production of macrophages is a maximum and constant value (in other parts of this specification, "maximum constant amount").
The macrophage activating ability (%) of LPS is 100%.
When a sigmoid curve representing the limulus test-positive LPS content of the LPS on a horizontal axis is drawn on a logarithmic scale, a limus test-positive L giving an ED 50 of macrophage activating capacity is obtained.
L with a PS content of 0.4 to 100 ng / ml of culture solution
At least one of PS is included. The term "comprising at least one kind" as used herein means that the LPS of the present invention can be used separately, and as long as the intended use thereof is not impaired, two or more kinds thereof are arbitrarily combined, and further It means that it can be used in combination with any of the above substances. For example, it can be mixed with other growth promoters, so-called nutrients such as vitamins, and the like.
【０００５】「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一
種であり、動物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒
子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食して消化する大
型のアメーバ状細胞の総称である。「ＴＮＦ」は、マク
ロファージにより産生される腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）の総称であり［１
９８５年に発行された ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２
６０、２３４５〜２３５４頁］、マクロファージの活性
が高まるにつれてその産生量は増していく。「リムラス
テスト」は、１９６８年にレヴィン（Ｌｅｖｉｎ）が創
案した、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いた
エンドトキシン定量法である。本発明の発育促進剤、動
物用発育促進剤の活性成分として使用できるＬＰＳは、
特にその採取源、生産方法、精製方法を限定されること
はない。例えば、細菌や植物から採取されるＬＰＳであ
っても、或は合成リピドＡのような合成品であってもよ
い。なお、本明細書、特にその特許請求の範囲におい
て、採取源は特に名称で特定されたそのものに限定され
ることなく、その採取源の成長、保存、流通の過程で付
着、共存する細菌その他の全てのものが含まれる。例え
ば、「小麦ＬＰＳ」と特定された場合には、小麦そのも
のから採取されたＬＰＳのみならず、小麦の成長、保
存、流通の過程で付着、共存する細菌その他の全てのも
のが含まれるものと理解されたい。なぜならば、特に寄
生、共生植物、寄生、共生動物という関係が解明されて
いるもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生物、地衣
界生物に、それらにより付着、共存を許されたものが棲
息している例が多く存在し得ることは当業界で良く知ら
れていることであるからである。[0005] "Macrophage" is a type of immunocompetent cell, and is a generic term for large amoebic cells that are distributed in almost all tissues in the animal body and prey on and digest particulate foreign substances and waste cells in the body. Is. "TNF" is a tumor-damaging factor (Tumor) produced by macrophages.
Necrosis Factor) [1
The Journal of Biological Chemistry, published in 985 (The Journal o
f Biological Chemistry. , 2
60 , 2345-2354], the production amount increases as the activity of macrophages increases. The "limulus test" is an endotoxin quantification method, which was invented by Levin in 1968, using a horseshoe crab blood cell extract and a chromogenic synthetic substrate. The LPS that can be used as the active ingredient of the growth promoting agent and animal growth promoting agent of the present invention is
In particular, the collection source, production method, and purification method are not limited. For example, it may be LPS collected from bacteria or plants, or a synthetic product such as synthetic lipid A. Incidentally, in the present specification, particularly in the claims thereof, the collection source is not particularly limited to the one specified by the name, but the growth source of the collection source, storage, attachment of bacteria in the process of distribution, other coexisting bacteria, etc. Everything is included. For example, when "wheat LPS" is specified, not only LPS collected from wheat itself but also all bacteria and other substances that adhere and coexist during the growth, storage, and distribution processes of wheat are included. I want you to understand. This is because, in particular, other than those for which the relationship of parasitism, symbiotic plants, parasitism, and symbiotic animals has been elucidated, those that are allowed to adhere to or coexist with specific plants, animals, fungal organisms, lichen organisms. This is because it is well known in the art that there can be many examples in which
【０００６】これらＬＰＳのうちから、本発明の発育促
進剤、動物用発育促進剤の活性成分として使用できるＬ
ＰＳを選択するには、インビトロで培養されるマクロフ
ァージのＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロファ
ージ活性化能を指標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加し
ないときのマクロファージのＴＮＦ産生量を与えるマク
ロファージ活性化能を０％、マクロファージのＴＮＦ産
生量を最大恒量にする時のＬＰＳのマクロファージ活性
化能を１００％とするマクロファージ活性化能（％）を
表し、横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ
含有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マク
ロファージ活性化能のＥＤ５０を与えるリムラステスト
陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌで
あるものを選択すればよい。Of these LPS, L which can be used as an active ingredient of the growth promoter and animal growth promoter of the present invention.
In order to select PS, the macrophage activation ability of LPS that activates TNF production ability of macrophages cultured in vitro is used as an index, and the vertical axis indicates the amount of TNF production of macrophages when the LPS is not added. The activation capacity (0%) and the macrophage activation capacity (%) when the macrophage activation capacity of the LPS when the TNF production amount of the macrophage is maximally constant are taken as 100% are shown.
When drawing a sigmoid curve showing the content on a logarithmic scale, a limus test-positive LPS content giving an ED 50 of macrophage activating capacity of 0.4 to 100 ng / ml of culture medium may be selected.
【０００７】リムラステスト陽性植物源ＬＰＳ 原料植物として使用できるものを下記に例示する。な
お、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、
次の文献の記載を照合して決定された。 裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類：昭
和５７年（正編）、昭和５８年（続編）に北隆館から発
行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。但し、「燕麦」は、昭和４５年に女子栄養
大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和５
８年に至文堂から発行された「新日本植物誌顕花篇」の
記載を照合し、「裸麦」は、昭和４６年に東京同文書院
から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、「鳩
麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウコ
ン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダ
ミ」、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウイキョ
ウ」、「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾ
ウ」、「オタネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツヅ
ラフジ」、「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和６３年に
北隆館から発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記
載を照合し、「アボガド」は、昭和５３年に財団法人農
林統計協会から発行された熱帯農業技術叢書第１５号
「ブラジルの果実」の記載を照合し、「カイワレダイコ
ン」は、昭和５９年に北隆館から発行された「原色園芸
植物大図鑑」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和４
４年に廣川書店から発行された「図説熱帯植物集成」の
記載を照合し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品
協会が昭和６１年に公示した、「クロレラ規格基準」の
記載を照合して所属を決定した。 菌類：昭和６２年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和３７年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。 本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。裸子植物
としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマツを使用
できる。単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属
植物であるイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ
科オオムギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属
植物である鳥麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクマ
笹、イネ科ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤ
メ属植物であるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニ
ク、ユリ科キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ
科ジャノヒゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショ
ウガ属植物であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物で
あるウコン、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシ
ャクを使用できる。双子葉類植物としては、マメ科ダイ
ズ属植物である大豆、マメ科インゲンマメ属植物である
小豆、マメ科ソラマメ属植物であるそら豆、マメ科クズ
属植物であるクズ、マメ科カンゾウ属植物であるナンキ
ンカンゾウ、ナス科ナス属植物であるジャカイモ、トウ
ガラシ、ナス科トマト属植物であるトマト、ナス科トウ
ガラシ属植物であるトウガラシ、バラ科ビワ属植物であ
るビワ、バラ科サクラ属植物であるモモ、クスノキ科ア
ボガド属植物であるアボガド、クルミ科クルミ属植物で
あるクルミ、ウリ科トウナス属植物であるカボチャ、ウ
リ科アマチャヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ
科ダイコン属植物であるカイワレダイコン、マタタビ科
マタタビ属植物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属
植物であるドクダミ、コショウ科コショウ属植物である
胡椒、シキミ科シキミ属植物であるダイウイキョウ、ニ
クズク科ニクズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカ
ン属植物であるダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植
物であるオタネニンジン、セリ科サボシュニコビア属植
物であるボウフウ、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物
であるオオツヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であ
るウンカリア・ヒルスタを使用できる。シダ植物として
は、例えば、トクサ科トクサ属植物であるスギナ、ゼン
マイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを使用できる。ソ
ウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ類
植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。カ
ッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植物
であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、ホ
ンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。紅
ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ属
植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物と
しては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物であ
るクロレラを使用できる。菌類植物としては、例えば、
担子菌類植物、子ノウ菌類植物を使用できる。担子菌類
植物としては、例えば、ヒラタケ科マツオウジ属植物で
ある椎茸、キシメジ科エノキタケ属植物であるエノキ
茸、キシメジ科シメジ属植物であるシメジ、タコウキン
科マイタケ属植物であるマイ茸、サルノコシカケ科ポリ
ポラス属植物であるアワビ茸、ハラタケ科ハラタケ属植
物であるマッシュルーム、キクラゲ科キクラゲ属植物で
あるキクラゲ、モエギタケ科スギタケ属植物であるナメ
コを使用できる。子ノウ菌類植物としては、例えば、エ
ンドミセタセア科サッカロミセス属植物であるパン酵
母、醸造用酵母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵
母、清酒酵母、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の
他、サッカロミセス セレヴイシドに属する多くの酵母
（例えば、ウイスキーや老酒の製造に使用される酵母）
が含まれる。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物であ
る冬虫夏草も使用できる。植物源ＬＰＳは、以下に述べ
る方法で分離、精製できる。 １）原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した
後に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。例えば、原
料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつけたまま、
或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は、食用に供
せられている程度の粉末になるまで粉砕し、得られた粉
末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈降物を静置
又は遠心分離により除去するか、粉末に水を加えて練っ
て得られるドウをミキサー中でゆるやかに水洗し、沈降
物を除去すればよい。原料植物がクロレラである場合に
は、まず細胞膜を破砕し、エタノール洗浄により脂溶性
物質を除去した後に水抽出するとよい。この水抽出の際
の原料植物の粒度、水の温度、液性、添加量、攪拌の速
度、時間、遠心分離の際の条件等は特に制限する必要は
なく、原料植物の種類に応じて適宜調整すればよい。
又、抽出水の温度は高い方がＬＰＳの採取量、純度とも
に高い傾向があるが、操作の便宜上、原料植物に含まれ
る澱粉の糊化を招来しない５０℃以下とすることが好ま
しい。又、水の添加量は、原料植物の種類、粒度により
異なるが、穀類種子の場合にはその割合が７０ｗ／ｖ％
以下、望ましくは２０〜５０ｗ／ｖ％程度とすると操作
上便利である。更に、攪拌の速度は、起泡を引き起こさ
ない程度のものとすることが好ましい。なお、この段階
の操作迄で、本発明のリムラステスト陽性植物ＬＰＳの
純度は、リムラステスト活性データから判断して、例え
ば小麦種子の場合には約３０倍に上昇する。以下、穀類
種子を原料として使用する場合を例にとり説明するが、
いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考にして、他
植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリムラステスト
陽性ＬＰＳを高純度で回収する方法を実施することは極
めて容易である。 ２）純度を更に上げるためには、上記１で得られた上清
を常法に従って限外雄過に付して分子量５０００以下の
画分を除去すればよい。 ３）得られた乾燥品を、５０ｍｇ／ｍｌになるように蒸
留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を回収する。 ４）この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にする
と沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである
必要はなく、例えば、トリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡと
称す）、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロ
酢酸が使用できる。 ５）次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留
水で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収す
る。 ６）沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカ
リを加える。この際使用するアルカリも特定のものであ
る必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムが使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がｐＨ１１より大きく
なると目的のＬＰＳが失活するので注意が必要である。 ７）次いで酸を加えてｐＨ８としてから３７℃に加温
し、更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、３
７℃に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付
す。なお、この際使用する酸も特定のものである必要は
ない。 ８）上清を回収して氷冷し、４℃で再び遠心分離操作に
付す。 ９）上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に
従って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも
特定のものである必要はない。 １０）次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾過用の担体と
しては、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−７５、Ｇ−１００、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）Ｓ−２００、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
６Ｂ［以上は米国ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｉｎｃ．）製］、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ−１
００［米国バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．）社
製］、トーヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹
達工業社製）を使用できる。緩衝液はｐＨ３〜１０のも
のならいずれでもよい。例えば、トリス−ＨＣｌ又はリ
ン酸緩衝液が使用できる。 １１）次いでこの画分に蛋白分解酵素を加え、３７℃で
２時間以上インキュベージョンして残存蛋白質を分解
し、得られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により
濃縮する。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定
なものである必要はなく、例えば、Ｖ８プロテアーゼ、
キモトリプシン、トリプシン、サーモライシンが単独
で、或は任意に組み合わせて使用できる。市販品として
は、例えば、プロナーゼＥ（科研化学社）、プロティネ
ースＫ（メルク社）を使用できる。 １２）次いでこの画分を常法に従って、例えば、米国フ
ァルマシア社製のＦＰＬＣシステムでファルマシア社製
のモノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用して陰イオ
ン交換クロマトグラフィーに付してリムラステスト陽性
画分を得る。 １３）次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付
してリムラステスト陽性画分を回収する。 以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約２０％が回収され、純度約９５％の精製標品
が得られる。又、段階１）終了時の純度に比べ約１００
０倍の純度（小麦種子の場合）になる。以上の方法によ
って得られたリムラステスト陽性植物ＬＰＳはそのま
ま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供できる。又、
保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの任意
の手段により乾燥粉末として提供することもできる。こ
れらはいずれも常法で生産できる。 Examples of limulus test-positive plant-source LPS raw material plants that can be used are shown below. The family name and genus to which the plants described in this specification belong are:
It was decided by collating the descriptions in the following documents. Gymnosperms, monocotyledons, dicotyledons, ferns, and sows: Matched to "Primary color Makino Botanical Encyclopedia" issued by Kitatakakan in 1982 (original edition) and 1983 (sequel) And decided the affiliation. However, "oat" is the same as the "edible botanical illustration" published by the Women's Nutrition University Press in 1945.
Matched the description of "New Japan Botanical Magazine Aika Hen" published by Sobundou in 8 years, and "Naked Barley" matched the description of "Comprehensive Food Encyclopedia" issued by Tokyo Doshoin in 1946. "Hatomugi", "Karabisubikaku", "Janahige", "Turmeric", "Matatabi", "Amatachuru", "Dokudami", "Pepper", "Pepper", "Daiwaki", "Daidai", "Kudzu" , "Nankinkanzo", "Panthus ginseng", "Bowfu", "Otsudurafuji", "Uncaria hilster" collate with the description of "Primary color Makino Wakan herb encyclopedia" issued by Kitatakakan in 1988. , "Avocado" is the same as the tropical agricultural technology series No. 15 "Brazil's Fruit" published by the Japan Agricultural and Forestry Statistics Association in 1978, and "Kaiware Radish" is from Hokuryukan in 1984. Departure It has been against the description of the "primary color garden plants Encyclopedia", "nutmeg" is, in 1929
In comparison with the description of "Illustrated tropical plant collection" published by Hirokawa Shoten in 4 years, "Chlorella" is compared with the description of "Chlorella standard" published by the Japan Health Food Association in 1986. Decided to belong. Fungus: The affiliation was determined by collating the description in "Primary color new Japanese fungus pictorial book" issued by a nursery company in 1987. However, yeast was checked by referring to the "Microbiology Handbook" published by Gihodo in 1937, and "Futonatsu Natsuso" was checked by checking the above-mentioned "Primary color Makino Wakana herbal medicine encyclopedia" and the affiliation was determined. .. The raw material plants that can be used in the present invention are, for example, gymnosperms, monocotyledons, dicotyledons, ferns, sows, and fungi, which can be used individually or as a mixture. As the gymnosperm, for example, pine which is a pine plant of the pine family can be used. The monocotyledonous plants include, for example, rice, which is a plant of the genus Poaceae, wheat, which is a plant of the family Gramineae, barley, which is a plant of the family Barley of the family Gramineae, and barley, which is a plant of the family Oataceae, oats. , Bear grass which is a plant of the genus Gramineae, pigeon barley which is a plant of the genus Juzudama, iris which is a plant of the family Iridaceae, garlic which is a plant of the family Liliaceae, asparagus which is a plant of the family Liliaceae, family Liliaceae. It is possible to use Janohige which is a genus of the genus Jardinaceae, ginger which is a genus of the ginger genus Ginger, turmeric which is a genus of the genus Turmeric of the ginger family, and crow bishaku which is a plant of the genus Turmeric family Hangea. Examples of dicotyledonous plants include soybeans which are legumes of the genus Soybean, azuki beans which are legumes of the kidney bean, broad beans which are legumes of the leguminous plant, kudzu which are legumes of the leguminous plant, and legumes of the legume family. Peanut liquorice, potatoes which are solanaceous plants of the family Solanaceae, capsicum, tomato which is a plant of the genus Tomato of the Solanaceae family, capsicum which is a plant of the family Solanaceae plants, loquat which is a plant of the genus Rosaceae, peach which is a plant of the genus Rosaceae, Lauraceae avocado plant Avocado, walnut family walnut plant walnut, Cucurbitaceae Touna plant pumpkin, cucurbitaceae plant genus Amachatsuru, Brassicaceae plant radish plant Kabatarei genus Matatabi plant Matatabi, which is the plant of the genus Lentilaceae Pepper, which is a genus of genus, Daikikyo, which is a plant of the genus Shikimi, squid, which is a plant of the genus Narcissus, daisies, which is a plant of the citrus family Rutaceae, which is a plant of the genus Panax ginseng, which is a plant of the genus Panax ginseng, which belongs to the genus Savoschnicobia. It is possible to use a certain bowfish, Otsutsuruji, which is a plant of the genus Otsutsuruji, which belongs to the family Tsutsuruji, and Uncaria hilsta, which is a plant of the genus Kagizura, belonging to the family Rubiaceae. As the fern plant, for example, horsetail, which is a plant belonging to the genus Astragalus, belonging to the family Equisetum, and mainspring, which is a plant belonging to the genus Spiral sp. Examples of the plants belonging to the genus Sophorae include plants belonging to the genus Cassius, plants belonging to the family Redaceae, plants belonging to the genus Green, and plants belonging to the genus Ranso. Examples of the Kasso plants include wakame, which is a plant belonging to the kelp family Wakame, kelp which is a plant belonging to the kelp family kelp, and Hijiki which is a plant belonging to the genus Hondokiaceae. As the red sour plant, for example, Asakusanori, which is a plant belonging to the genus Amanori of the family Ushikenori can be used. As the green grass plant, for example, chlorella which is a plant of the genus Chlorella of the family Oocystis can be used. As a fungal plant, for example,
Basidiomycetes and ascomycetes can be used. Examples of basidiomycete plants include shiitake mushrooms that are genus Pleurotus genus plants, enoki mushrooms that are enokitake plants of the family Kishimeji family, shimeji mushrooms that are genus plants of the genus Chidaceae, maitake mushrooms that belong to the genus Physcomitaceae of the family Oleaceae, genus Polyporus Abalone mushrooms, which are plants, mushrooms, which belong to the genus Agaricaceae, mushrooms, which belong to the genus Asteraceae, and nameko, which belongs to the genus Asteraceae, can be used. As an ascomycete plant, for example, baker's yeast, which is a plant of the genus Saccharomyces of the family Endomyceteaceae, or yeast for brewing can be used. Brewing yeasts include brewer's yeast, sake yeast, wine yeast, soy sauce yeast, miso yeast, and many yeasts belonging to Saccharomyces cerevisiae (for example, yeasts used in the production of whiskey and old sake).
Is included. In addition, Cordyceps sinensis, which is a plant of the genus Nostoc, belonging to the family Baccinaceae can also be used. The plant-source LPS can be separated and purified by the method described below. 1) If necessary, the raw material plant is appropriately shredded, dried, pulverized, and then well suspended in distilled water, and the supernatant is recovered. For example, if the source plant is cereal seed, leave the seed coat attached,
Alternatively, after removing the seed coat, it is easily crushed, or crushed until it becomes a powder that is about to be used for food, water is added to the obtained powder to make a dispersion liquid, and the precipitate is stirred and then precipitated. It may be removed by standing or centrifugation, or the dough obtained by adding water to the powder and kneading may be gently washed with water in a mixer to remove the precipitate. When the starting plant is Chlorella, it is advisable to first crush the cell membrane, remove the fat-soluble substance by washing with ethanol, and then extract with water. The particle size of the raw material plant at the time of this water extraction, the temperature of water, the liquidity, the addition amount, the stirring speed, the time, the conditions at the time of centrifugation, etc. need not be particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of the raw material plant. Adjust it.
Further, the higher the temperature of the extracted water, the higher the amount of LPS collected and the higher the purity tend to be. However, for convenience of operation, it is preferably 50 ° C. or lower, which does not cause gelatinization of the starch contained in the raw material plant. The amount of water added varies depending on the type of raw material plant and particle size, but in the case of cereal seeds, the ratio is 70 w / v%.
Hereafter, it is desirable for the operation to be about 20 to 50 w / v%, which is convenient for operation. Furthermore, it is preferable that the stirring speed be such that foaming does not occur. By the operation up to this stage, the purity of the limulus test positive plant LPS of the present invention is judged to be about 30 times higher in the case of wheat seeds, as judged from the limulus test activity data. Hereinafter, the case where grain seeds are used as a raw material will be described as an example,
It is extremely easy for a person skilled in the art to carry out a method for removing high-purity limulus test-positive LPS by removing contaminating sugars, proteins and the like from other plants by referring to the following description. 2) In order to further increase the purity, the supernatant obtained in 1 above may be subjected to ultrafiltration according to a conventional method to remove a fraction having a molecular weight of 5000 or less. 3) The dried product thus obtained is suspended in distilled water so as to have a concentration of 50 mg / ml, and subjected to a centrifugation operation to collect a supernatant. 4) The supernatant is cooled with ice water, and acid is added to make the solution acidic to cause precipitation. The acid used at this time does not have to be a specific one, and for example, trichloroacetic acid (hereinafter referred to as TCA), perchloric acid, trifluoroacetic acid, acetic acid, dichloroacetic acid can be used. 5) Next, it is subjected to a centrifugation operation to collect the precipitate, washed with distilled water, and again subjected to a centrifugation operation to recover the precipitate. 6) Suspend the precipitate in distilled water and add alkali until the precipitate dissolves. The alkali used at this time does not have to be a specific one, and for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, sodium carbonate, sodium acetate can be used. It should be noted that the target LPS will be inactivated if the basicity becomes higher than pH 11 when the precipitate is dissolved. 7) Next, add an acid to adjust the pH to 8 and then heat to 37 ° C, and add an acid to acidify the product.
Centrifuge using a centrifuge kept at 7 ° C. The acid used at this time does not have to be a specific one. 8) Collect the supernatant, cool with ice, and centrifuge again at 4 ° C. 9) The supernatant is collected, neutralized by adding an alkali, and concentrated by ultrafiltration according to a conventional method. The alkali used at this time does not have to be a specific one. 10) Next, gel filtration is performed according to a conventional method to collect and combine the rimus test positive fractions. As a carrier for gel filtration, for example, Sephadex G
-75, G-100, Sephacryl
l) S-200, Sepharose
6B [The above is Pharmacia, USA (Pharmacia
Inc. )], Biogel (Biogel) P-1
00 [manufactured by US Biorad Inc.], Toyo Pearl HW-50, HW-55 (manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.) can be used. Any buffer may be used as long as it has a pH of 3 to 10. For example, Tris-HCl or phosphate buffer can be used. 11) Next, a proteolytic enzyme is added to this fraction and the remaining protein is decomposed by incubating at 37 ° C. for 2 hours or more, and the obtained enzyme-treated solution is concentrated by ultrafiltration according to a conventional method. The proteolytic enzyme used at this time does not have to be a specific one. For example, V8 protease,
Chymotrypsin, trypsin, thermolysin can be used alone or in any combination. As commercially available products, for example, Pronase E (Kaken Kagaku) and Proteinase K (Merck) can be used. 12) Then, this fraction was subjected to a conventional method, for example, using a FPLC system manufactured by Pharmacia, USA, mono-Q-Sepharose, Q-, manufactured by Pharmacia.
Anion exchange chromatography is performed using Sepharose to obtain a limulus test positive fraction. 13) Next, gel filtration is carried out for desalting according to a conventional method to collect a limulus test positive fraction. By the above operation, in the case of wheat seeds, about 20% of the initial limulus activity is recovered, and a purified sample with a purity of about 95% is obtained. Also, the purity is about 100 compared to the purity at the end of step 1).
It is 0 times more pure (for wheat seeds). The limulus test-positive plant LPS obtained by the above method can be provided as it is or in a concentrated form to an arbitrary degree. or,
In order to improve storage stability, it can be provided as a dry powder by any means such as freeze-drying or spray-drying. Any of these can be produced by a conventional method.
【０００８】リムラステスト陽性細菌源ＬＰＳ 従来より知られている大腸菌ＬＰＳ、アルカリゲネス
ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）から
得られるＬＰＳ［ピー．エイチ．グラハム（Ｐ．Ｈ．Ｇ
ｒａｈａｍ）、エム，エイ．オーブリエン（Ｍ．Ａ．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）共著、”アントニック ファン リー
ウヴェンホック（Ａｎｔｏｎｉｃｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅ
ｎｈｏｃｋ）、ｖｏｌ．３４、３２６〜３３０頁（１９
６８年）：本明細書の他の箇所では、Ａ．ラディオバク
ターＬＰＳと称す］、百日咳菌ＬＰＳ、リピドＡ等の
他、本明細書で追って詳述する細菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ
２、ＬＰＳ３及びそれらの合成ＬＰＳが該当する。大腸
菌ＬＰＳは、例えば、米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社か
ら市販されている。百日咳菌ＬＰＳは、例えば、フナコ
シ薬品（日本）から市販されている。又、公知の百日咳
菌、例えば、東浜株１相菌の死菌体から、例えば、下記
文献記載の公知方法により調製することもできる。ウエ
ブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）等著の「ジャーナル オブ
イミュノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ）、７４４、５５（１９５５）；ウェストフ
ァル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等著の「ツェト．ナツールフ
ォルシュ（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）」、７６、１
４８（１９５２）。リピドＡは、例えば、第一化学薬品
から市販されている。上記菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、Ｌ
ＰＳ３をそれぞれ産生する３種の菌は、本発明者等が検
討した小麦からはその産地、種類を問わず分離されてい
る。従って、いずれの産地、種類の小麦及びその加工品
からも分離されると推定される。本発明者等がそれら３
種の細菌を分離できることを確認した小麦粉の産地、種
類は次の通りである。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノーザン・スプリングス 米国 １・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本 上記細菌からＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を分離する
には、ウェストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等が「メソ
ッズ イン カーボハイドレート ケミストリ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）のｖｏｌ．Ｖ［米国ニューヨークのアカ
デミック プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）社が
１９６５年に発行］の８３頁に記載した熱フェノール法
を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即
ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フ
ェノールと共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を
回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し、
限外濾過により濃縮して粗ＬＰＳ画分を得、この画分を
常法に従い、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣシス
テムでファルマシア社製のモノＱ−セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付
して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上
の操作により、純度９６％以上の精製標品が得られる。
原料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの検出、含量測定
は、後記実験例１に詳述する通り、例えば、生化学工業
株式会社からトキシカラ−システムという名称で市販さ
れている試薬セットを使用して実施できる。即ち、原料
植物を同システムのＬＳ−１セットと合わせて発色さ
せ、その発色の強さを、同じく同セットのＥｔ−２セッ
トを使用して作成した検量線と対比させればよい。糖は
フェノール−硫酸法［エム．デユボイス（Ｍ．Ｄｕｂｏ
ｉｓ）等著、アナリテイカル ケミストリ（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２８、３
５０頁、１９５６年］で、蛋白はローリー法［オー．エ
イチ．ローリー（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ）等著、ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）］、ｖｏｌ．１９３、６５頁、１９５１年］で測定
した。 Limulus Test Positive Bacterial Source LPS E. coli LPS, Alcaligenes, which has been conventionally known
LPS obtained from A. radiobacter [P. H. Graham (PHG
raham), M, A .. O'Brien (MA
O'Brien, co-authored, "Antonic van Leeuwenhock
nhock), vol. 34, 326-330 (19
68): elsewhere in this specification, A. Radiation Bacterial LPS], B. pertussis LPS, Lipid A, etc., as well as bacterial sources LPS1, LPS described in detail later in this specification.
2, LPS3 and their synthetic LPS are relevant. E. coli LPS is commercially available from, for example, Difco, USA. B. pertussis LPS is commercially available from, for example, Funakoshi Yakuhin (Japan). In addition, it can also be prepared from known pertussis bacteria, for example, dead cells of Tohama strain 1-phase bacterium, for example, by a known method described in the following literature. "Journal of Immunity" by Webster and others.
, 744, 55 (1955); Westphal et al., "Z. Naturforsch," 76, 1.
48 (1952). Lipid A is commercially available, for example, from Daiichi Pure Chemicals. The above-mentioned bacterial sources LPS1, LPS2, L
The three types of bacteria that produce PS3, respectively, have been isolated from wheat examined by the present inventors, regardless of their origin and type. Therefore, it is presumed that it is separated from wheat and wheat products of all production areas and types. The present inventors
The flour production areas and types confirmed to be able to separate the bacteria of the species are as follows. The name of dark wheat, the origin of wheat flour Dark Northern Springs USA 1. Canadian Wheat Canada Hard Red Winter Semi-Hard USA Australian Standard Wheat Australia Horosiri Japan To isolate LPS1, LPS2 and LPS3 , Westphal, et al. “Methods in Carbohydrate Chemistry (Me
ways in Carbohydrate Che
(mistry) vol. V [published by Academic Press, Inc., New York, USA, 1965], page 83, using the hot phenol method and further purification with an anion exchange resin. That is, after suspending the bacterial cells in distilled water, stirring with distilled water and an equal volume of hot phenol, then collecting the aqueous layer by centrifugation, the aqueous layer is dialyzed to remove the phenol,
A crude LPS fraction was obtained by concentration by ultrafiltration, and this fraction was subjected to a conventional method, for example, using a Pharmacia FPLC system to produce Pharmacia Mono Q-Sepharose (Se).
pharose), Q-sepharose (Sepharo)
Se) may be used for purification by anion exchange chromatography, and desalting may be performed according to a conventional method. By the above operation, a purified sample with a purity of 96% or more can be obtained.
The limulus test positive LPS in the raw material can be detected and the content thereof can be measured, for example, by using a reagent set commercially available from Seikagaku Kogyo Co., Ltd. under the name Toxicolor System, as described in detail in Experimental Example 1 below. That is, the raw material plants may be colored together with the LS-1 set of the same system, and the intensity of the color development may be compared with the calibration curve prepared using the Et-2 set of the same set. The sugar is a phenol-sulfuric acid method [M. Deuboisu (M. Dubo
is) et al., Analytical Chemistry (Analy)
(Chemical Chemistry), vol. 28, 3
50, 1956], the protein is the Lowry method [Oh. H. OH Lowry et al., Journal of Biological Chemistry (Journa)
l of Biological Chemistr
y)], vol. 193, 65, 1951].
【０００９】ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮ
Ｆ産生能を活性化する能力の測定方法 動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（プ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）
らにより、プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブ ユーエスエー［Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇ ｏｆ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ＵＳＡ．、７２、３６６６〜３
６７０頁（１９７５年）］に報告されている。プライミ
ング段階開始のために投与される薬剤が「プライマー」
（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリング段階
開始のために投与される薬剤が「トリガー」（内因性Ｔ
ＮＦ産生剤）である。ＬＰＳがマクロファージのインビ
トロＴＮＦ産生能を活性化する能力を測定するには、マ
ウスのマクロファージ腹腔常在細胞を採取し、これにプ
ライマーとしての組み換えマウスＩＦＮ−γを添加し、
次いで、トリガーとしてのＬＰＳを添加し、そのＴＮＦ
活性を測定すればよい。ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞
［プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー ７２、 ３６６６〜
３６７０頁］に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。Ｌ９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥ
Ｍ培地と表す）で育成し、８×１０４個の細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２
であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その
後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ／ｍｌ
となるように加え、培養液の液量を１５０μｌとする。
即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０
μｌ加える（この際稀釈率を適宜調製し、ＥＤ５０を求
められる）。更に、最終液量２００μｌとなったＬ９２
９細胞を上記条件で１８時間培養する。細胞障害活性を
測定するには、まず全培地を除去し、ついで、０．１％
クリスタルバイオレットを含む１％メチルアルコール溶
液を加えて固定染色する。クリスタルバイオレットは全
有核細胞を染色するが、死細胞は染色後にプレート底面
より水洗で除去されるので、生存細胞の結果から細胞障
害活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ（５９０ｎ
ｍ）での吸光度を指標として測定し、対照群に対する染
色度と比較することで細胞障害活性を測定する。活性の
定義は次の様に行う。Ｌ９２９細胞が５０％生存できる
検体の稀釈率（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳ
［腫瘍障害血清（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｓｅ
ｒｕｍ）］を使用し、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位
／ｍｌ）を２．４×１０６単位／ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−
α（旭化成株式会社から入手した組換えヒト型ＴＮＦ）
を用いて決定する。このウサギＴＮＳのＥＤ５０を与え
る稀釈率（Ｃ）を求める。検体活性（単位／ｍｌ）はＮ
／Ｃ × ｎで計算する。In vitro TN of LPS in macrophages
Method for measuring the ability to activate F-producing ability It is necessary to have a production precursor (priming) step and a production initiation (triggering) step in order to produce TNF in the animal body.
The Proceeding of National Academy Science of USA [Proce
eding of NationalAcademy
Science of USA. , 72, 3666-3
670 (1975)]. The drug administered to initiate the priming phase is the "primer"
(Endogenous TNF production promoter), the drug administered to initiate the triggering phase is the "trigger" (endogenous TNF).
NF producer). To measure the ability of LPS to activate the in vitro TNF-producing ability of macrophages, mouse macrophage peritoneal resident cells were collected, and recombinant mouse IFN-γ as a primer was added thereto,
Then, LPS was added as a trigger, and the TNF was added.
The activity may be measured. TNF activity was measured in L-929 cells [Proceeding of National Academy].
Science of USA 72 , 3666-
Based on the cytotoxicity to [3670 page], it is measured as follows. L929 cells were supplemented with 5% fetal calf serum in Eagle Minimum Essential Medium (hereinafter, ME).
M medium), and 8 × 10 4 cells are 100
It is made to be contained in μl of the same medium and bred in a 96-well flat bottom plate. Breeding conditions are 37 ° C., 2 hours, 5% CO 2.
The method used in ordinary cell culture may be used. After that, actinomycin D was added to the medium at a final concentration of 1 μg / ml.
And the volume of the culture solution is 150 μl.
Immediately, dilute the sample appropriately with MEM medium to 50
Add μl (at this time, adjust the dilution ratio appropriately to obtain the ED 50 ). Furthermore, the final volume of L92 was 200 μl.
Nine cells are cultured under the above conditions for 18 hours. To measure the cytotoxic activity, first remove all medium, then 0.1%
Fix and stain by adding 1% methyl alcohol solution containing crystal violet. Although crystal violet stains all nucleated cells, dead cells are removed by washing with water from the bottom of the plate after staining, and therefore cytotoxic activity can be directly measured from the results of viable cells. This dyeing degree is OD (590n
The cytotoxic activity is measured by measuring the absorbance in m) as an index and comparing it with the staining degree for the control group. The definition of activity is as follows. The dilution ratio (N) of the sample in which L929 cells can survive 50% is determined. Rabbit TNS as a control
[Tumor Necrosis Se
Rum)], the activity n (unit / ml) of this rabbit TNS is 2.4 × 10 6 units / mg / ml of TNF-.
α (recombinant human TNF obtained from Asahi Kasei Corporation)
To determine. The dilution ratio (C) giving the ED 50 of this rabbit TNS is determined. Sample activity (unit / ml) is N
Calculate by / C × n.
【００１０】提供できる剤の製造方法 本発明の発育促進剤は、常法の製剤技術により、散剤、
顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、
貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、坐剤、
注射剤、薬浴剤等の形態で提供できる。又、動物用とし
ては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加
剤として調製することもできる。飼料添加剤とする場合
には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミ
ックス製剤とは、飼料との混合を容易にするために澱粉
などの飼料成分で希釈されたものを指す。本発明の発育
促進剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加でき
る飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。又、ミ
ネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料
であってもよい。これら製剤には、所望ならば、保存
性、均質性を保持するために、常法により賦形剤、保存
剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。更に、矯
味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。賦形剤と
しては、例えば、乳糖、デンプンが使用できる。保存剤
としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオ
キシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の
パラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸ナトリウ
ム、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プ
ロピルパラベン等が使用できる。緩衝剤としては、例え
ば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用できる。 Method for Producing Agent that can be Provided The growth promoting agent according to the present invention is
Granules, pills, tablets, troches, capsules, liquids,
Patches, ointments, liniments, lotions, suppositories,
It can be provided in the form of injections, medicated baths and the like. Further, for animals, it can be further prepared as a feed additive, a premix preparation, and a drinking water additive. When used as a feed additive, it is preferably a powder or granules. Further, the premix formulation refers to a formulation diluted with a feed ingredient such as starch in order to facilitate mixing with a feed. The feed to which the growth promoting agent of the present invention can be added as a feed additive or a premix preparation may be any commercially available feed. It may also be a feed containing feed additives such as minerals, vitamins and amino acids. If desired, additives such as an excipient, a preservative and a buffer may be added to these preparations by a conventional method in order to maintain the storability and homogeneity. Further, a corrigent, a flavoring agent, and a coloring agent can be included. As the excipient, for example, lactose or starch can be used. Examples of preservatives that can be used include paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate and propyl paraoxybenzoate, sodium dehydroacetate, phenol, methylparaben, ethylparaben, propylparaben and the like. As the buffer, for example, citrate, acetate, phosphate and the like can be used.
【００１１】発育促進効果の確認 本発明の発育促進効果は、マウスに投与し、増体効果を
調べることにより確認した。以下、実施例、製造例、実
験例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、それ
らで使用された「大腸菌ＬＰＳ］は、米国ディフコ（Ｄ
ｉｆｃｏ）社製０１２８：Ｂ８である。 Confirmation of Growth-Promoting Effect The growth-promoting effect of the present invention was confirmed by administering to mice and examining the weight gain effect. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Production Examples, and Experimental Examples. The "E. coli LPS" used in them is US Difco (D
0128: B8 manufactured by ifco).
【００１２】製造例１（小麦ＬＰＳの製造） １）小型ニーダに、１．０９％の灰分を含む硬質小麦粉
（アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング）
（３，１２０ｇ）を入れ、２．０３リットルの蒸留水を
加えて１０分間練ってドウとした。１５分間の静置後に
１０リットルの水を加えてゆるやかに攪拌してデンプン
乳液を洗い出し、同時に可溶性成分を溶出させた。この
溶出液を５℃の冷蔵庫中で１２時間静置した後、デンプ
ン等の沈降部を除去した。上清を凍結乾燥して２０１．
１ｇの粉末を得た（粉末Ａ）。更に、残留ドウに５リッ
トルの蒸留水を加えてゆるやかに攪拌し、以下、上記と
同様に処理して４０．１ｇの粉末を得た（粉末Ｂ）。 ２）これら粉末Ａ、Ｂを米国アミコン社製限外濾過機Ｈ
Ｆ−Ｌａｂ１に供し、分子量画分５，０００については
中空系カートリッジＨＦ−Ｌａｂ１ＰＭ５を、分子量画
分１０，０００については中空系カートリッジＨＦ−Ｌ
ａｂ１ＰＭ１０を取り付けて限外濾過を行った［温度５
〜１０℃。入圧２５ｐｓｉ（１．７６ｋｇ／ｃｍ２）、
出圧１５ｐｓｉ（１．０６ｋｇ／ｃｍ２）］。その結果
に基づき各部分を次のように命名した。 粉末Ａ：分子量５，０００以下の部分をａ１ 分子量５，０００以上の部分をａ２ 粉末Ｂ：分子量５，０００以下の部分をｂ１ 分子量５，０００以上の部分をｂ２ 粉末Ａ：分子量１０，０００以下の部分をａ３ 分子量１０，０００以上の部分をａ４ 粉末Ｂ：分子量１０，０００以下の部分をｂ３ 分子量１０，０００以上の部分をｂ４ これら各画分を後記実験例１に詳述する方法に準拠し
てリムラステストに付したら、分子量５，０００以上の
画分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、
分子量５，０００以下の画分にはほとんど存在しないこ
とが確認された。 ３）上記粉末ａ２の３０ｇを１リットル三角フラスコに
入れ、６００ｍｌの蒸留水を注いで、６０分間スターラ
ーで攪拌した後、日立冷却高速遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ
（ローターＲＰＲ１６を事前に４℃に冷却しておいた）
で４℃で遠心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付
して上清を回収した。 ４）この上清を１リットル三角フラスコに入れ、氷冷下
（液温約２℃）、スターラーで攪拌しながら、事前に２
℃に冷却してあった１００％ＴＣＡ水溶液２０．５ｍｌ
を滴下し、滴下終了後氷水中に１０分間放置した。 ５）次いで前記と同様にして４℃で遠心分離操作（１
０，０００Ｇ×１０分）に付して沈殿を回収し、氷水中
で冷却下、３００ｍｌの蒸留水と共に５００ｍｌのビー
カーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にし
て４℃で遠心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付
して沈殿を回収した。 ６）この沈殿を１リットルビーカーに入れ、蒸留水５０
０ｍｌで懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約３．５ｍ
ｌを使用して中和（ｐＨ７）し、ついで、氷水中で冷却
しながら、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約２ｍｌを添加し
て０．０２Ｎ水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈
殿を溶解した。 ７）１Ｎ塩酸約１．５ｍｌを加えてｐＨ８とし、次いで
１００ｍｌの蒸留水を加えた後に１リットル三角フラス
コに移して３７℃のインキュベーター内で３０分間ゆっ
くり振とうした。 ８）１００％ＴＣＡ水溶液３０ｍｌを加えて混合した
後、３７℃のインキュベーター内で１０分間ゆっくり振
とうしてから、約３７℃に保温した遠心分離器トミーＣ
Ｄ１００Ｒ（トミー精器社製）を使用して遠心分離操作
（３，０００Ｇ×１０分）に付した。 ９）上清を回収して氷冷し、４℃で遠心分離操作（１
０，０００Ｇ×１０分）に付した。 １０）上清を回収して１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液約
３．６ｍｌで中和してｐＨ７とし、限外濾過器（東洋濾
紙ＵＨＰ−１５０、フィルター：ＵＫ−１０、Ｎ２圧：
４．０ｋｇ／ｃｍ２）で濃縮した。 １１）得られた濃縮液６０ｍｌを、セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム［米国ファルマシア社（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）製、カラムサイズ：５ｃ
ｍ（内径）×１００ｃｍ（２リットル）］を使い、ゲル
濾過［緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／１０ｍＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、流速：６０ｍｌ／時］に付して、
各２０ｍｌの画分を得た。 １２）初めから４３番目から５６番自迄の画分２８０ｍ
ｌを併せ、プロナーゼＥ（科研化学社）４５０μｇを加
え、振とう下、３７℃に２時間保温した後に、限外濾過
器（東洋濾紙ＵＨＰ−６２、フィルター：ＵＫ−１０、
Ｎ２圧：４．０ｋｇ／ｃｍ２）で濃縮した。次いで、フ
ァルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラム：モノＱＨＲ
１０／１０）を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料をカラム
に付した後、上記緩衝液でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増
加された組成を持つ緩衝液（２００ｍｌ）でカラムを洗
った。次いで、ＮａＣｌ濃度を、１６５ｍＭから１Ｍの
ＮａＣｌ濃度勾配になるように増加させながら全量４０
０ｍｌで目的ＬＰＳを溶出させ、各２ｍｌの画分を回収
した。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をか
けてから５〜８番目の画分を併せて、ＬＰＳ純度約９２
％の８ｍｌ［ＬＰＳ：３．０３ｍｇ（後記実験例１記載
の方法で測定したリムラステスト陽性ＬＰＳ換算値であ
る。以下のＬＰＳ量も全てこの換算値である）、糖：
０．２３ｍｇ、蛋白：０．０４ｍｇ］を回収した。 １３）次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×２
０．２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液：
水）に付して各３ｍｌの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併せて、Ｌ
ＰＳ純度約９５％の１２ｍｌ（ＬＰＳ：２．７ｍｇ、
糖：０．１８ｍｇ、蛋白：０．０３ｍｇ）を回収した。
なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーに
より酸性であることを確認した。 １４）上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで凍
結乾燥し、重量を測定したら０．７５ｍｇあった。（以
下、この凍結乾燥標品を小麦ＬＰＳと称す）この小麦Ｌ
ＰＳのリムラス活性を後記実験例１記載の方法で測定し
たら２．７ｍｇに相当するので、その比活性は ２．７
÷０．７５＝３．６になる。また、夾雑物として存在し
得る単独の糖は、以上の精製により実質上全て除去され
たと考えられるので、検出された糖は全て、小麦ＬＰＳ
を構成している糖と考えられる。従って、この段階での
小麦ＬＰＳの純度を重量に基づいて計算すると 蛋白＝０．０３ｍｇ ＬＰＳ＝０．７５−０．０３＝０．７２ｍｇ だから、 ０．７２÷０．７５×１００＝９６（％） である。[0012]Production example 1(Production of wheat LPS) 1) Hard wheat flour containing 1.09% ash in a small kneader
(American or Canadian hardlet spring)
(3,120g) and put 2.03L of distilled water
In addition, it was kneaded for 10 minutes to give a dough. After standing for 15 minutes
Add 10 liters of water and gently stir to add starch
The emulsion was washed out and the soluble components were eluted at the same time. this
Allow the eluate to stand in a refrigerator at 5 ° C for 12 hours, then
The sedimentation part such as ash was removed. Lyophilize the supernatant to 201.
1 g of powder was obtained (powder A). Furthermore, 5 liters for the residual dough
Add distilled water of torr and stir gently.
By the same treatment, 40.1 g of powder was obtained (powder B). 2) These powders A and B are ultrafilter H made by Amicon Inc.
It was subjected to F-Lab1 and the molecular weight fraction of 5,000 was
Hollow cartridge HF-Lab1PM5 is
For 10,000 minutes hollow cartridge HF-L
ab1PM10 was attached and ultrafiltration was performed [temperature 5
-10 ° C. Input pressure 25 psi (1.76 kg / cmTwo),
Output pressure 15 psi (1.06 kg / cmTwo)]. as a result
Each part was named as follows. Powder A: a part with a molecular weight of 5,000 or less is a1 A for molecular weight of 5,000 or moreTwo Powder B: b having a molecular weight of 5,000 or less1 B for molecular weight of 5,000 or moreTwo Powder A: a part with a molecular weight of 10,000 or less is aThree A with a molecular weight of 10,000 or moreFour Powder B: b having a molecular weight of 10,000 or lessThree B for molecular weight of 10,000 or moreFour Each of these fractions was prepared according to the method detailed in Experimental Example 1 below.
If you put it on the limulus test,
A large amount of limulus test positive components are present in the fraction,
It is rarely found in the fractions with a molecular weight of 5,000 or less.
Was confirmed. 3) Powder aTwo30 g of the
Put it in, pour 600 ml of distilled water, and stir for 60 minutes.
Agitator, then Hitachi Cooling High Speed Centrifuge SCR-20B
(Rotor RPR16 was previously cooled to 4 ° C)
Centrifuge operation (10,000G × 10 minutes) at 4 ℃
Then, the supernatant was recovered. 4) Put this supernatant in a 1 liter Erlenmeyer flask and under ice cooling.
(Liquid temperature approx. 2 ° C), while stirring with a stirrer, 2 in advance
20.5 ml of 100% TCA aqueous solution cooled to ℃
Was added dropwise, and after completion of the addition, the mixture was left in ice water for 10 minutes. 5) Then, in the same manner as above, the centrifugation operation (1
50,000 G × 10 minutes) and collect the precipitate,
While cooling in 500 ml beer with 300 ml distilled water.
Place in a car, suspend, cool in ice water, and repeat as above.
At 4 ° C for centrifugation (10,000G x 10 minutes)
The precipitate was collected. 6) Place the precipitate in a 1 liter beaker and add 50 parts of distilled water.
Suspended with 0 ml, 1N sodium hydroxide solution about 3.5 m
Neutralize (pH 7) using 1 and then cool in ice water
While adding about 2 ml of 1N sodium hydroxide solution
To a 0.02N sodium hydroxide solution
Melted the lord. 7) Add about 1.5 ml of 1N hydrochloric acid to adjust the pH to 8 and then
1 liter triangular frass after adding 100 ml distilled water
Move it to a 30 minute incubator at 37 ℃.
I was shaken. 8) 30 ml of 100% TCA aqueous solution was added and mixed
Then, shake gently in an incubator at 37 ° C for 10 minutes.
After that, the centrifugal separator Tommy C kept at about 37 ° C
Centrifuge operation using D100R (Tomy Seiki)
(3,000 G × 10 minutes). 9) Collect the supernatant, cool with ice, and centrifuge at 4 ℃ (1.
10,000 G × 10 minutes). 10) Collect the supernatant and remove the 10N sodium hydroxide solution.
Neutralize to pH 7 with 3.6 ml and filter with an ultrafilter (Toyo Roshi).
Paper UHP-150, filter: UK-10, NTwoPressure:
4.0 kg / cmTwo) Was concentrated. 11) 60 ml of the obtained concentrate was added to Sepharose (Se).
pharose) 6B column [US Pharmacia (P
farmia Inc. ), Column size: 5c
m (inner diameter) × 100 cm (2 liters)]
Filtration [buffer: 10 mM Tris-HCl / 10 mM Na
Cl (pH 7.5), flow rate: 60 ml / hour],
Fractions of 20 ml each were obtained. 12) Fraction 280m from the 43rd to 56th from the beginning
and combined with 450 μg of Pronase E (Kaken Kagaku).
After shaking and shaking, keep the temperature at 37 ℃ for 2 hours, and then perform ultrafiltration.
Container (Toyo Roshi UHP-62, Filter: UK-10,
NTwoPressure: 4.0 kg / cmTwo) Was concentrated. Then,
Armacia FPLC system (column: Mono QHR
10/10) using anion exchange chromatography
Attached to. That is, 10 mM Tris-HCl (pH 7.
5) and column with a buffer containing 10 mM NaCl
Then, increase the NaCl amount to 165 mM with the above buffer solution.
Wash the column with buffer (200 ml) having the added composition.
It was. The NaCl concentration is then changed from 165 mM to 1M.
The total amount is 40 while increasing the NaCl concentration gradient.
Elute target LPS with 0 ml and collect fractions of 2 ml each
did. If the limulus test was confirmed to be positive,
LPS purity of about 92
% 8 ml [LPS: 3.03 mg (Experimental Example 1 described below
It is the limulus test positive LPS conversion value measured by the method
It The following LPS amounts are all in this converted value), sugar:
0.23 mg, protein: 0.04 mg] was recovered. 13) Next, 8 ml of the same is separated into Sephadex (Seph
adex) G-25 [column: 2.0 cm (inner diameter) x 2
0.2 cm (66 ml)] using gel filtration (buffer:
Water) to collect fractions of 3 ml each. Limulus
The 9th to 12th fractions confirmed to be positive
12 ml of PS purity about 95% (LPS: 2.7 mg,
Sugar: 0.18 mg, protein: 0.03 mg) was recovered.
This fraction was subjected to anion exchange chromatography.
It was confirmed to be more acidic. 14) Freeze the above fractions at -80 ℃ until freezing until a constant weight is reached.
After binding and drying, the weight was measured and found to be 0.75 mg. (Below
Below, this freeze-dried preparation is called wheat LPS) This wheat L
The limulus activity of PS was measured by the method described in Experimental Example 1 below.
Since it corresponds to 2.7 mg of cod, its specific activity is 2.7.
÷ 0.75 = 3.6. It also exists as a contaminant.
The single sugar obtained is virtually all removed by the above purification.
Therefore, all the sugars detected were wheat LPS.
It is considered to be the sugar that constitutes the. Therefore, at this stage
When the purity of wheat LPS is calculated based on weight, protein = 0.03 mg LPS = 0.75-0.03 = 0.72 mg, so 0.72 ÷ 0.75 × 100 = 96 (%).
【００１３】小麦ＬＰＳの物性 １５）分子量 小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製
し、その４μｌを１．５ｍｌのトレフチューブに入れ
た。これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤ
Ｓ、５％メルカプトエタノール、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）を加えて調製したＳＤＳ処理液１μｌを
加え、この混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマシア
社製のファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）
を使用し、電極との間にＳＤＳ−バッファー ストリッ
プ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｔｒｉｐ）（ファルマシア社製）
が介在せられた１μｌの上記混液をゲル［ファルマシア
社製のファスト ゲル グラディエント（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ８−２５）］に塗付し、最
大電圧２５０ｖ、最大電流１０ｍＡにセットして泳動を
開始させた（本明細書でこの泳動法をＳＤＳ−１法と称
する）。泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙
動を観察した。クマシー染色では、染色液としてファル
マシア製の０．１％ファスト ゲルブルー（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）Ｒを、脱色液として、メタノー
ル：酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使い、次
の順序で染色・脱色した。 １：５０℃で８分間染色 ２：５０℃で５分間脱色 ３：５０℃で８分間染色 ４：５０℃で１０分間脱色 ５：５０℃で５分間保護（グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比５：１０：８５混液） ６：乾燥 銀染色は、次の順序で行った。 １：５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理 ２：５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ３：５０℃で４分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ４：５０℃で６分間、増感液（８．３％グルタルジアル
デヒド）で処理 ５：５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ６：５０℃で５分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ７：５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ８：５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ９：４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理 １０：３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １１：３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２：３０℃で３０秒間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄
液）で処理 １３：３０℃で４分間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液）
で処理 １４：５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ／ｖ％酢
酸）で処理 １５：５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 １６：乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量８，００
０±１，０００の位置に小麦ＬＰＳの主要染色帯が検出
された。別途、小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して２ｍｇ／
ｍｌ溶液を調製し、その１０μｌを１．５ｍｌ容プラス
チックチューブに入れた。これに、別途、１８０μｌの
１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メルカプ
トエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１２．５
μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）及び２２．５
μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０μｌを
加えてよく混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、こ
の加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。１０ｍｌの１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシン及び３．
０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解して調製し
た泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気泳動槽に
入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定
し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０ｖに１時間、
次いで、１５０ｖに固定して、色素がゲルより溶出する
まで泳動を続けた（本明細書においてこの泳動法をＳＤ
Ｓ−２法と称する）。泳動終了後に、バイオラッド社の
銀染色キット１６１−０４４３を使い銀染色を室温で行
って、挙動を確認した。結果、分子量８，０００±１，
０００、５，０００±２，０００の位置に小麦ＬＰＳの
主要染色帯が検出された。なお、ＳＤＳ−１法、ＳＤＳ
−２法で、小麦ＬＰＳと同時に泳動させた蛋白分子量マ
ーカーは、ファルマシア社製のＬＭＷキットＥ［ホスホ
リラーゼｂ（９４ｋ）、アルブミン（６７ｋ）、オブア
ルブミン（４３ｋ）、カーボニックアンヒトラーゼ（３
０ｋ）、トリプシンインヒビター（２０ｋ）、α−ラク
トアルブミン（１４ｋ）］、ペプチド分子量マーカー
は、ファルマシア社製の１８６０−１０１分子量マーカ
ー［ミオグロビン（１６．９ｋ）、ミオグロビンＩ＆Ｉ
Ｉ（１４．４ｋ）、ミオグロビンＩ（８．２ｋ）、ミオ
グロビンＩＩ（６．０ｋ）、ミオグロビンＩＶ（２．５
ｋ）］であった。 １６）リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して、２５
μｇの小麦ＬＰＳを含む２０μｌの溶液を調製し、小試
験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％硫酸を添加し、
１６０℃で２時間加熱した。次いで、２０μｌの１０ｖ
／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分間加
熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌの蒸留水、次い
で０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ硫酸、２ｍｌの
蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブデン酸アンモニ
ウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコルビン酸を混合
して調製し、その０．５ｍｌを使用）を添加して室温で
３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの吸光度（ＯＤ
８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作製用の試料と
しては、リン酸二水素カリウム（和光純薬社製）を蒸留
水で希釈し、リン重量としてそれぞれ２．５μｇ、１μ
ｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．５ｍｌの溶液を調
製して使用した。なお、リン１ｇはリン酸二水素カリウ
ム４．３９ｇに相当する。得られた結果を表１に示す。 Physical Properties of Wheat LPS 15) Molecular Weight Wheat LPS was dissolved in distilled water to prepare a 1 mg / ml solution, and 4 μl of the solution was placed in a 1.5 ml tref tube. Separately, add 2.5 mM SD to 1 mM EDTA.
1 μl of an SDS-treated solution prepared by adding S, 5% mercaptoethanol, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) was added, and this mixed solution was immersed in boiling water for 3 minutes. Pharmacia Fast System (Phast System)
And SDS-buffer strip (Buffer Strip) (manufactured by Pharmacia) between the electrodes.
1 μl of the above mixed solution in which a gel was interposed was used as a gel [Pharmacia Fast Gel Gradient (Phast
Gel Gradient 8-25)], the maximum voltage was set to 250 v and the maximum current was set to 10 mA to start the migration (this migration method is referred to as SDS-1 method in the present specification). After the electrophoresis, the behaviors in Coomassie staining and silver staining were observed. For Coomassie staining, 0.1% Fast Gel Blue (Phast) made by Pharmacia
Gel Blue) R was dyed and decolorized in the following order using a mixed solution of methanol: acetic acid: distilled water (volume ratio 3: 1: 6) as a decolorizing solution. 1: Staining at 50 ° C. for 8 minutes 2: Decoloring at 50 ° C. for 5 minutes 3: Staining at 50 ° C. for 8 minutes 4: Decoloring at 50 ° C. for 10 minutes 5: Protection at 5 ° C. for 5 minutes (volume ratio of glycerol, acetic acid, and distilled water) 5:10:85 mixed solution) 6: Drying Silver dyeing was performed in the following order. Treatment with washing liquid (ethanol, acetic acid, distilled water volume ratio 5: 1: 4 mixture) at 1: 50 ° C. for 2 minutes, 2: 50 ° C. for 2 minutes washing liquid (ethanol, acetic acid, distilled water volume ratio 10: 5 : 85 mixed solution) 3: 50 ° C. for 4 minutes, washed solution (ethanol, acetic acid, distilled water volume ratio 10: 5: 85 mixed solution) treated at 4: 50 ° C. for 6 minutes, sensitizing solution (8.3%) Treatment with glutardialdehyde) 5: 50 ° C. for 3 minutes, cleaning solution (mixture of ethanol, acetic acid and distilled water at a volume ratio of 10: 5: 85) Treatment with 6: 50 ° C. for 5 minutes, cleaning solution (ethanol, acetic acid, distilled water) Volume ratio of 10: 5: 85) 7: 50 ° C for 2 minutes, cleaning solution (deionized water) 8: 50 ° C for 2 minutes, cleaning solution (deionized water) 9: 40 ° C 13 Treatment with 0.25 w / v% silver nitrate for 10 minutes, washing at 10: 30 ° C. for 30 seconds Treatment with (deionized water) 11: 30 ° C. for 30 seconds, treatment with cleaning solution (deionized water) 12: 30 ° C. for 30 seconds, developing solution (0.04 v / v% formaldehyde + 2.5 w / v% sodium carbonate washing solution) ) 13:30 for 4 minutes, developer (0.04 v / v% formaldehyde + 2.5 w / v% sodium carbonate wash)
Treatment with 14: 50 ° C. for 2 minutes, reaction stop solution (5% v / v% acetic acid) 15: 50 ° C. for 3 minutes, protection solution (acetic acid, glycerol,
Treatment with distilled water volume ratio of 10: 8: 85) 16: Dry LPS dyes silver, but not Coomassie dye.
A major stained band of wheat LPS was detected at a position of 0 ± 1,000. Separately, dissolve wheat LPS in distilled water to 2 mg /
A ml solution was prepared and 10 μl thereof was placed in a 1.5 ml plastic tube. Separately, 180 μl of 10% (w / v) SDS, 45 μl of 5% β-mercaptoethanol, 90 μl of CBB dye solution, 112.5
μl 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) and 22.5
10 μl of an SDS-treated solution prepared by adding μl of distilled water was added and mixed well, then immersed in a boiling water bath for 5 minutes, immediately after this heating, immediately immersed in ice water and rapidly cooled. 10 ml 1
2. 0% (w / v) SDS, 17.9 g tricine and 3.
The migration buffer prepared by dissolving 03 g of Tris in 1 liter of distilled water was placed in a slab gel electrophoresis tank manufactured by Marisol. A 20% polyacrylamide gel was fixed in the electrophoresis tank, the sample was put in the sample groove, and the voltage was set to 50 V for 1 hour.
Then, the sample was fixed at 150 v, and electrophoresis was continued until the dye was eluted from the gel (this electrophoresis method was referred to as SD herein).
S-2 method). After completion of the electrophoresis, silver staining was performed at room temperature using Silver Staining Kit 161-0443 manufactured by Bio-Rad to confirm the behavior. As a result, the molecular weight is 8,000 ± 1,
A major staining band of wheat LPS was detected at the positions of 000, 5,000 ± 2,000. The SDS-1 method and SDS
-2 method, protein molecular weight markers electrophoresed with wheat LPS were LMW kit E [Phosphorylase b (94k), albumin (67k), ovalbumin (43k), carbonic ampitase (3
0k), trypsin inhibitor (20k), α-lactalbumin (14k)], and peptide molecular weight markers are 1860-101 molecular weight markers [myoglobin (16.9k), myoglobin I & I manufactured by Pharmacia.
I (14.4k), myoglobin I (8.2k), myoglobin II (6.0k), myoglobin IV (2.5
k)]. 16) Phosphorus content Chen-Toribara method [Chen et al., "Analytical Chemistry (Ana
(Lytical Chemistry), vol. Two
8, 1756-1758 (1956), the procedure was as follows. Dissolve wheat LPS in distilled water and add 25
A 20 μl solution containing μg wheat LPS was prepared and placed in a small test tube. Add 20 μl of 50 v / v% sulfuric acid,
Heated at 160 ° C. for 2 hours. Then 20 μl of 10v
After adding / v% perchloric acid, it was incinerated by heating with a gas burner for 1 minute. Then 0.5 ml distilled water, then 0.5 ml reaction reagent (1 ml 6N sulfuric acid, 2 ml distilled water, 2 ml 2.5 v / w% ammonium molybdate and 1 ml 10 v / w% ascorbic acid were mixed. Prepared, and 0.5 ml thereof was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 820 nm (OD
820 nm ) was measured. As a sample for preparing a calibration curve, potassium dihydrogen phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with distilled water to give phosphorus weights of 2.5 μg and 1 μm, respectively.
A 0.5 ml solution containing g, 0.25 μg, 0 μg was prepared and used. In addition, 1 g of phosphorus corresponds to 4.39 g of potassium dihydrogen phosphate. The results obtained are shown in Table 1.
【００１４】[0014]
【表１】 [Table 1]
【００１５】表１において、小麦ＬＰＳのデータは、無
機リンの混入（例えば、リン酸緩衝液に由来する）によ
る誤差を避けるために、加熱処理をしていない対照のデ
ータを減じた値である。小麦ＬＰＳの分子量を８，００
０と仮定し、上表の結果に基づいてその１分子当たりの
リン数を次式により計算すると１〜４になる。In Table 1, the data of wheat LPS are the values obtained by subtracting the data of the control which has not been heat-treated in order to avoid an error due to the incorporation of inorganic phosphorus (for example, derived from a phosphate buffer solution). . The molecular weight of wheat LPS is 8,000
Assuming 0, the number of phosphorus per molecule is calculated by the following formula based on the results in the above table, and becomes 1 to 4.
【００１６】[0016]
【数１】 [Equation 1]
【００１７】上記実験でリン数が１〜４と変動している
原因の１つとしては、精製段階でのモノフォスフォエス
テラーゼ混入で、リン酸が脱離したことも考えられる。 １７）ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。小麦ＬＰ
Ｓを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そ
の１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イワ
キガラス社製）に入れ、これに１００μｌの８ＮＨＣｌ
を添加して１１０℃で１６時間加熱した。４ＮＮａＯＨ
を約２００μｌ添加してｐＨ７とした。その１００μｌ
を分取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入
れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた後に、１０５℃で
１．５時間加熱し、次いで流水で冷却した。次いで、１
００μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加えた後に室温で１
時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測定した。検量線作
製用試料としては０．２０〜２００μｇ／ｍｌのＮ−ア
セチル グルコサミン（和光純薬社製）を使用した。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製。 結果、小麦ＬＰＳのヘキソサミン数は６±２／分子（仮
定分子量８，０００）だった。 １８）脂肪酸含有量 ９０μｌの小麦ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に１
０μｌの内部標準（０．５５ｍＭのマルガリン酸）を加
えた。１．０ｍｌの０．５Ｍナトリウムメチラートを加
えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った。
室温で１時間放置後に９６０μｌの０．５ＮＨＣｌを加
えて中和した。これに２ｍｌのヘキサンを加えて１５分
間激しく攪拌した。次いで、１，０００ｇで５分間遠心
分離を行いヘキサン層を分取した。窒素ガスでヘキサン
を蒸発させて、約２０μｌになるまで濃縮した。このサ
ンプルをガスクロマトグラフィー［本体：島津社製のＧ
Ｃ８ＡＰＦ、キャピラリーカラム：カナダのスペルコ
（Ｓｐｅｌｃｏ）社製ＦＳＣＡＰ Ｓｐ２３３０、キャ
リヤーガス：窒素］に付して脂肪酸量を測定した。脂肪
酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合成リピ
ドＡである大腸菌型ＬＡ−１５−ＰＰ（分子量２，００
０で、１分子中の脂肪酸数は６であることが知られてい
る）を用いた。結果、小麦ＬＰＳの脂肪酸数は６±２／
分子（仮定分子量８，０００）であると推定された。上
記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添付
の図１〜図３に示す。図１は小麦ＬＰＳの、図２は大腸
菌ＬＰＳの、図３は百日咳菌ＬＰＳのチャートである。
図１〜図３において、図示されている主要ピーク番号に
対応する保持時間（分）は次の通りであった。 図１〜図３の比較により、小麦ＬＰＳのチャートは大腸
菌ＬＰＳのチャートに似ているが、百日咳菌ＬＰＳのも
のとは大きく異なることは明白である。 １９）ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、１．０５ｍｇ／ｍｌの小麦ＬＰＳを含む蒸
留水２５０μｌを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３０
分間加熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却し、つい
で日立分光光度計３２０を使って４２０、４７０、６３
０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値をそ
れぞれＡ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、１２７μｇ／ｍｌのＫＤＯア
ンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含む
蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料それ
ぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値 （ＳＴ）は０．３７９、標準試料の値
（Ｓｓ）は０．２９４であった。この値の比較により、
小麦ＬＰＳには５±１モル／分子量８千のＫＤＯが含ま
れると推定された。It is considered that one of the causes that the number of phosphorus fluctuates from 1 to 4 in the above experiment is that phosphate is eliminated due to contamination with monophosphoesterase in the purification step. 17) Hexosamine content Elson-Morgan method (Tokyo Kagaku Dojin Shuppan "Biochemistry Experiment Course" No. 37)
7 to 379) and performed as follows. Wheat LP
S was dissolved in distilled water to prepare a 1 mg / ml solution, 100 μl of which was placed in a Spitz with screw cap (Iwaki Glass Co., Ltd.), and 100 μl of 8N HCl was added thereto.
And heated at 110 ° C. for 16 hours. 4N NaOH
Was added to adjust the pH to 7. 100 μl
Was collected, placed in another Spitz with a screw cap, added with 200 μl of the following reagent A, heated at 105 ° C. for 1.5 hours, and then cooled with running water. Then 1
Aliquot 00 μl, add 670 μl of 96% ethanol, and further add 67 μl of the following reagent B.
After standing for a time, the absorbance was measured at 535 nm. As a sample for preparing a calibration curve, 0.20 to 200 μg / ml N-acetylglucosamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. (Reagent A) Prepared by mixing 75 μl of acetylacetone and 2.5 ml of 1.25N sodium carbonate. (Reagent B) Prepared by mixing 1.6 g of p-dimethylbenzaldehyde, 30 ml of concentrated hydrochloric acid and 30 ml of 96% ethanol. As a result, the hexosamine number of wheat LPS was 6 ± 2 / molecule (the assumed molecular weight was 8,000). 18) 1 part in a distilled water solution of wheat LPS (1 mg / ml) having a fatty acid content of 90 μl
0 μl of internal standard (0.55 mM margaric acid) was added. The fatty acid ester was hydrolyzed and esterified by adding 1.0 ml of 0.5 M sodium methylate.
After standing at room temperature for 1 hour, 960 μl of 0.5N HCl was added to neutralize. To this, 2 ml of hexane was added and stirred vigorously for 15 minutes. Then, centrifugation was performed at 1,000 g for 5 minutes to separate the hexane layer. Hexane was evaporated with nitrogen gas and concentrated to about 20 μl. This sample was analyzed by gas chromatography [Main unit: Shimadzu G
C8APF, capillary column: FSCAP Sp2330 manufactured by Spelco of Canada, carrier gas: nitrogen], and the amount of fatty acid was measured. As a standard for measuring the amount of fatty acid, Escherichia coli type LA-15-PP (molecular weight of 2,000) which is a synthetic lipid A manufactured by Daiichi Pure Chemicals, Ltd.
0, the number of fatty acids in one molecule is known to be 6). As a result, the number of fatty acids in wheat LPS is 6 ± 2 /
It was estimated to be a molecule (assumed molecular weight 8,000). The charts observed by the above gas chromatography are shown in the attached FIGS. 1 to 3. FIG. 1 is a chart of wheat LPS, FIG. 2 is a chart of E. coli LPS, and FIG. 3 is a chart of B. pertussis LPS.
The retention times (minutes) corresponding to the major peak numbers shown in FIGS. 1 to 3 were as follows. By comparison of Figures 1-3, it is clear that the wheat LPS chart is similar to the E. coli LPS chart, but is significantly different from that of B. pertussis LPS. 19) KDO content The KDO (2-keto-3-deoxyoctonate) content was determined by the diphenylamine method [Shaby (Shaby
R. ) Et al., Analytical Biochem (Analy
mechanical Biochem. ), 58 (1), 123
~ 129 (1974)]. A KDO detection reagent was prepared by combining 500 mg of diphenylamine, 5 ml of ethanol, 45 ml of glacial acetic acid, and 50 ml of concentrated hydrochloric acid (all manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Part 5
250 μl of distilled water containing 1.05 mg / ml of wheat LPS was combined with 00 μl, and the mixture was heated in a boiling water bath at 100 ° C. for 30 times.
After heating for 1 minute, cool in cold water (23 ° C) for 30 minutes, then use Hitachi spectrophotometer 320 to 420, 470, 63
The ultraviolet absorption at 0 and 650 nm was measured (measured values are A420, A470, A630, and A650, respectively). As a standard sample, 250 μl of distilled water containing 127 μg / ml of KDO ammonium salt [manufactured by Sigma, USA] was used. The value of the following equation was determined for each of the specimen sample and the standard sample. S = A420-A470 + A630-A650 The value (S T ) of the specimen sample was 0.379 and the value (S s ) of the standard sample was 0.294. By comparing this value,
It was estimated that wheat LPS contained 5 ± 1 mol / 8,000 KDO of KDO.
【００１８】製造例２（クロレラＬＰＳの製造） １）細胞膜破砕クロレラ（株式会社マンナンフーズ製）
３０ｇを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノー
ルで洗浄した。 ２）この洗浄残渣２６ｇを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸
留水に溶かし、４５℃で２時間振とう後に遠心分離操作
（４℃、１０，０００Ｇ×３０分）に付した。 ３）上清を回収し、東洋濾紙Ｎｏ．２で濾過し、次いで
蒸留水で抽出した。 ４）抽出液２９０ｍｌを下記条件で陰イオン交換クロマ
トグラフィーに付した。 カラム：Ｑ−セファロース（φ３ｃｍ×２３ｃｍ、容量
約１８０ｍｌ） 緩衝剤：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、Ｎａ
Ｃｌ濃度勾配：１０ｍＭ、４００ｍＭ、１Ｍ 流速：１００〜２００ｍｌ／時 温度：室温 ５）素通りした画分３１０ｍｌをグルコアミラーゼで処
理して澱粉を分解した（ｐＨ５．０、４０℃、約２時
間）。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生じない
ことにより確認した。 ６）遠心分離（１０，０００Ｇ×１０分）に付して上清
を回収し、１０ＮＮａＯＨ溶液で中和してｐＨ７とし、
分子量２０万カットのポアサイズを有するウルトラフィ
ルターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を
行った。 ７）得られた濃縮液３０ｍｌをファルマシア社製ＦＰＬ
Ｃシステム（カラム：モノＱＨＲ１０／１０）を使って
陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌと１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液
（ｐＨ７．５）で試料をカラムに付した後、上記緩衝液
でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増加された組成をした液
（２００ｍｌ）でカラムを洗った。次いで、目的ＬＰＳ
を溶出するため、１６５ｍＭから１ＭのＮａＣｌ濃度勾
配になるようにＮａＣｌ濃度を増加させながら全量４０
０ｍｌでカラムを洗い、各２ｍｌの画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
５〜８番目の画分を併せた。 ８）次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×２
０．２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液：
水）に付して各３ｍｌの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併せて１２
ｍｌを回収した（ＬＰＳ：１４．３ｍｇ、糖：２．０ｍ
ｇ、蛋白：０．５３ｍｇ）。ＬＰＳは後記実験例１記載
の方法で測定した。 ９）上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで凍結
乾燥し、重量を測定したら５．８ｍｇあった。（以下、
この凍結乾燥標品をクロレラＬＰＳと称す）このクロレ
ラＬＰＳのリムラス活性は１４．３ｍｇに相当するの
で、その比活性は １４．３÷５．８＝２．５ になる。また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る
単独の糖は実質上全て除去されたと考えられるので、検
出された糖は全て、クロレラＬＰＳを構成している糖と
考えられる。従って、この段階でのクロレラＬＰＳの純
度を重量に基づいて計算すると、 蛋白＝０．５３ｍｇ ＬＰＳ＝５．８−０．５３＝５．２７ｍｇ なので、 ５．２７÷５．８×１００＝９１（％）である。クロレラＬＰＳの物性 製造例１に記載の方法と同様にして、次の値が得られ
た。分子量は、ＳＤＳ−２法により測定した。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００ リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万 Production Example 2 ( Production of Chlorella LPS) 1) Cell membrane disruption Chlorella (mannan foods Co., Ltd.)
30 g was washed with ethanol until the washings did not turn green. 2) 26 g of this washing residue was dissolved in distilled water at a concentration of 100 mg / ml, shaken at 45 ° C. for 2 hours, and then subjected to centrifugation (4 ° C., 10,000 G × 30 minutes). 3) The supernatant was collected, and Toyo Filter Paper No. It was filtered through 2 and then extracted with distilled water. 4) 290 ml of the extract was subjected to anion exchange chromatography under the following conditions. Column: Q-Sepharose (φ3 cm × 23 cm, capacity about 180 ml) Buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), Na
Cl concentration gradient: 10 mM, 400 mM, 1 M Flow rate: 100 to 200 ml / hour Temperature: room temperature 5) 310 ml of the passed-through fraction was treated with glucoamylase to decompose starch (pH 5.0, 40 ° C., about 2 hours). Decomposition of starch was confirmed by the fact that no coloration occurred in the iodine starch reaction. 6) Centrifuge (10,000 G × 10 minutes) to collect the supernatant, neutralize with 10N NaOH solution to pH 7,
Ultrafiltration was carried out using an ultrafilter having a pore size of 200,000 molecular weight cut to remove and concentrate decomposed products. 7) Add 30 ml of the obtained concentrated liquid to FPL manufactured by Pharmacia.
Anion exchange chromatography was carried out using the C system (column: Mono QHR 10/10). That is, 10
After the sample was applied to the column with a buffer solution (pH 7.5) containing mM Tris-HCl and 10 mM NaCl, the column was washed with a solution (200 ml) having a composition in which the NaCl amount was increased to 165 mM with the above buffer solution. . Then the target LPS
To elute the total amount of 40% while increasing the NaCl concentration to obtain a 165 mM to 1 M NaCl concentration gradient.
The column was washed with 0 ml and each 2 ml fraction was collected. The 5th to 8th fractions after the concentration gradient was applied, where the positive limulus test was confirmed, were combined. 8) Next, 8 ml of the same is separated into Sephadex (Sephadex).
dex) G-25 [column: 2.0 cm (inner diameter) x 2
0.2 cm (66 ml)] using gel filtration (buffer:
Water) to collect 3 ml fractions. Combined with the 9th to 12th fractions with positive limulus test
ml was collected (LPS: 14.3 mg, sugar: 2.0 m)
g, protein: 0.53 mg). LPS was measured by the method described in Experimental Example 1 below. 9) The above fraction was freeze-dried at −80 ° C. and then freeze-dried to a constant weight, and the weight was measured and found to be 5.8 mg. (Less than,
This freeze-dried preparation is referred to as Chlorella LPS). Since the limulus activity of this Chlorella LPS corresponds to 14.3 mg, its specific activity is 14.3 ÷ 5.8 = 2.5. In addition, it is considered that the above-described purification removed substantially all the single sugars that could be present as contaminants, and therefore all the detected sugars are considered to be sugars that make up Chlorella LPS. Therefore, when the purity of Chlorella LPS at this stage was calculated based on the weight, since protein = 0.53 mg LPS = 5.8-0.53 = 5.27 mg, 5.27 ÷ 5.8 × 100 = 91 ( %). Physical Properties of Chlorella LPS The following values were obtained by the same method as in Production Example 1. The molecular weight was measured by the SDS-2 method. Main molecular weight = 40,000 to 90,000 Phosphorus number = 4 ± 1 / molecular weight 10,000 Hexosamine number = 7 ± 1 / molecular weight 10,000 Fatty acid number = 6 ± 1 / molecular weight 10,000 KDO number = 2 ± 1 / molecular weight 10,000
【００１９】製造例３（百日咳菌ＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液（２．
０×１０１０ 細胞／ｍｌ）を死菌体として用いた。上
記死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液
（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しなが
ら抽出した。８，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで１／１０に濃縮した。これを８，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを
６倍量加えて−２０℃で一晩放置した。４，０００Ｇ、
４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、２０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）
社製のソニファイア１８５型で超音波処理（出力コント
ロール５、１５分、室温）に付した。次いで２，５００
Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核酸分
解酵素ＤＮａｓｅｌ、ＲＮａｓｅ Ａで１５〜１６時間
処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ
と、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを使用した）。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃で２時間加温
した。次いで２，５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌ
ｍａｎ）社のアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使
い、孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ
［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、
流速＝約３ｍｌ／ｃｍ２／時）］、生化学工業社製のＬ
Ｓ−１キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合
わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径
０．２μｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装
置：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＦＰ
ＬＣ、樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ ＨＲ１０／
１０、緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭの
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で１５分洗浄し、次いで、Ｎａ
Ｃｌ量を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いで、
２０分かけて、ＮａＣｌ量が１６５ｍＭから１Ｍの濃度
勾配になるようにＮａＣｌ量を増加させながら洗浄し、
次いで、１ＭのＮａＣｌで３０分洗浄する、流速＝２ｍ
ｌ／分］、生化学工業社製のＬＳ−１キットを用いてリ
ムラス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分を
カラムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）社製セファデックスＧ−２５ファイン（ｆｉ
ｎｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍ×長さ２５ｃｍ、溶
出液＝蒸留水］、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標
品（４．５０ｍｇ）に混入している可能性の最も高い物
質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線（２００〜４０
０ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度を求めた。吸光
度１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｌであることを用
いて上記吸光度から核酸濃度を算出したら１％以下であ
った。又、ＳＤＳ−１法、ＳＤＳ−２法のいずれによっ
ても蛋白質は明確には検出されなかった。従って、検出
感度を考慮すると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋
白質は高々０〜３％と推定される。従って、上記凍結乾
燥標品の純度は９６％以上と推定された。製造例１に記
載の方法と同様にして測定されたこの百日咳菌ＬＰＳの
物性は次の通りであった。分子量はＳＤＳ−２法によっ
て測定した。百日咳菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝６，０００±１，０００ リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千 Production Example 3 ( Production of Bordetella pertussis LPS) A pertussis solution for test (2.
0 × 10 10 cells / ml) were used as dead cells. The dead cells were suspended in sterile water to a concentration of 25 mg (dry weight) / ml. To this, an equal amount of 90% hot phenol solution (68 to 70 ° C) was added, and extraction was performed while shaking at 68 ° C for 1 hour. The aqueous layer was separated by centrifugation at 8,000 G and 4 ° C. for 20 minutes. To the remaining phenol layer, the same amount of sterilized water as the above aqueous layer was added, and the same extraction was performed. The obtained aqueous layer was combined with the previous aqueous layer, dialyzed in running water overnight, and then concentrated to 1/10 with a rotary evaporator. This is 8,0
Centrifuge at 00G, 4 ° C. for 20 minutes. Collect the supernatant,
A small amount of sodium acetate was added, 6 volumes of cold ethanol at 0 to 4 ° C was added, and the mixture was left at -20 ° C overnight. 4,000G,
The precipitate collected by centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes was washed twice with ethanol, then once with acetone, and dried with an aspirator. The residue was suspended in distilled water so as to have a concentration of 20 mg / ml, and the suspension was transferred to Branson, USA.
It was subjected to ultrasonic treatment (power control 5, 15 minutes, room temperature) with a Sonifier 185 manufactured by the same company. Then 2,500
G, centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. This supernatant was treated at 4 ° C. for 15 to 16 hours with the nucleases RNase A and nucleases manufactured by Sigma, USA (finally 10 μg / ml DNase I).
And 20 μg / ml RNase A was used). Further, the same concentration of nucleolytic enzyme was added and the mixture was heated at 37 ° C. for 2 hours. Then, the mixture was centrifuged at 2,500 G and 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. This supernatant is
(manufactured by the company Acrodisc) and filtered with a pore size of 0.2 μm. The filtrate was subjected to molecular sieve [Resin: Sepharose 6B manufactured by Pharmacia, USA, column size = internal diameter 5 cm × length 100 cm, buffer = 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl (pH 7.5),
Flow rate = about 3 ml / cm 2 / hour)], L manufactured by Seikagaku Corporation
Fractions positive for limulus activity were examined using the S-1 kit and combined, and filtered using the above-mentioned Acrodisc of Gelman with a pore size of 0.2 μm. The filtrate is subjected to ion exchange [apparatus: FP manufactured by Pharmacia, USA]
LC, Resin: Mono Q HR10 / manufactured by Pharmacia, USA
10. Wash with buffer = 10 mM Tris-HCl + 10 mM NaCl, pH 7.5 for 15 minutes, then Na
Cl amount was increased to 165 mM and washed for 30 minutes, then
Washing is carried out for 20 minutes while increasing the NaCl amount so that the NaCl amount becomes a concentration gradient from 165 mM to 1 M,
Then wash with 1 M NaCl for 30 minutes, flow rate = 2 m
1 / min], limus activity positive fractions were examined and combined using the LS-1 kit manufactured by Seikagaku Corporation. The combined fractions were desalted on a column [resin: Pharmacia, USA (Pharm
Acea Sephadex G-25 Fine (fi
ne), column size = inner diameter 2 cm × length 25 cm, eluent = distilled water], and then freeze-dried. The substance most likely contaminated with this freeze-dried preparation (4.50 mg) is nucleic acid. Therefore, the ultraviolet absorption curve (200-40
0 nm) was taken and the absorbance at 260 nm was determined. Using the fact that the nucleic acid concentration at the absorbance of 1 was 50 μg / ml, the nucleic acid concentration was calculated from the above absorbance to be 1% or less. Moreover, the protein was not clearly detected by either the SDS-1 method or the SDS-2 method. Therefore, considering the detection sensitivity, it is estimated that the protein mixed in the freeze-dried preparation is at most 0 to 3%. Therefore, the purity of the freeze-dried preparation was estimated to be 96% or higher. The physical properties of this B. pertussis LPS measured in the same manner as in Production Example 1 were as follows. The molecular weight was measured by the SDS-2 method. Physical properties of B. pertussis LPS Main molecular weight = 6,000 ± 1,000 Phosphorus number = 4 / molecular weight 6,000 Hexosamine number = 12 / molecular weight 6,000 Fatty acid number = 4 / molecular weight 6,000 KDO number = 2 ± 1 / molecular weight 6,000
【００２０】なお、製造例１に記載の方法と同様にして
測定された大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
社製Ｏ１２８：Ｂ８］の物性は次の通りであった。分子
量はＳＤＳ−２法によって測定した。大腸菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８，０００± ４，０００ リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万Escherichia coli LPS measured in the same manner as in Production Example 1 [Difco, USA]
The physical properties of O128: B8] manufactured by the company were as follows. The molecular weight was measured by the SDS-2 method. Physical properties of Escherichia coli LPS Main molecular weight = 40,000 ± 10,000 8,000 ± 4,000 Phosphorus number = 12 / molecular weight 30,000 Hexosamine number = 45 ± 6 / molecular weight 30,000 Fatty acid number = 18 / molecular weight 30,000 KDO number = 5 ± 1 / molecular weight 30,000
【００２１】製造例４（ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３
の製造） １）５０ｍｌ容コーニングチューブに、１．０９％の灰
分を含む硬質小麦粉（カナダ産の１・カナディアン・ホ
イート）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｌの蒸留水
を加えて５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。 ２）この液を３７℃の水浴中で振とう培養し、培養開始
後０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、
８時間、１０時間、１２時間、２０時間、２４時間、４
５時間目に各０．５ｍｌを採取し、１０゜〜１０５倍希
釈して標準寒天培地（下記組成を持つ日水製薬社製の培
地）に１００μｌ宛をまき込み、生菌数の測定、コロニ
ーの観察を行った。標準寒天培地（日水製薬社コード番号：０５６１８） １リットル中 酵母エキス ２．５ｇ ペプトン ５．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ ７．１±０．１ ３）種類が異なると考えられた、培養経過時間８時間
目、１０時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロ
ニー（コロニー１）、クリーム色不透明コロニー（コロ
ニー２）、黄色半透明コロニー（コロニー３）、乳白色
不透明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコ
ロニー（コロニー５）を上記と同種の別の標準寒天培地
にまき、植え継ぎ、一方で、コロニー１〜５の細菌のグ
ラム染色性、リムラス活性を調べた。上記コロニーのう
ち、コロニー４及びコロニー５（共にグラム染色性＋）
のリムラス活性はコロニー１〜３（共にグラム染色性
−）に比べて極めて低かったので、以後の検討から除
き、日水製薬社製の培地及びＩＤテスト・ＥＢ−２０を
使用し、コロニー１〜３の形態、生化学的性状を観察し
た。次の結果が得られた。 Production Example 4 (LPS1, LPS2, LPS3
Production of) 1) 1.04 g of hard wheat flour (Canadian Wheat from Canada) containing 1.09% ash content is weighed and put into a 50 ml Corning tube, and 20 ml of distilled water is added to 50 mg / ml. Was prepared. 2) This solution was subjected to shaking culture in a water bath at 37 ° C., and 0 hours, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 6 hours after the start of the culture.
8 hours, 10 hours, 12 hours, 20 hours, 24 hours, 4
At the 5th hour, 0.5 ml of each was collected, diluted 10 ° to 10 5 times, and 100 μl was spread on a standard agar medium (medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. having the following composition) to measure the viable cell count. The colonies were observed. Standard agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. code number: 05618) In 1 liter Yeast extract 2.5 g Peptone 5.0 g Glucose 1.0 g Agar 15.0 g pH 7.1 ± 0.1 3) Different types were considered. , Yellow to cream opaque colonies (colony 1), cream opaque colonies (colony 2), yellow translucent colonies (colony 3), milky white opaque colonies (colony 4) observed at the 8th and 10th hours of elapsed culture time. ), Small white opaque colonies (colony 5) were seeded on another standard agar medium of the same species as above and subcultured, while the colony 1 to 5 bacteria were examined for Gram stainability and limulus activity. Of the above colonies, colony 4 and colony 5 (both Gram stain +)
Limulus activity was significantly lower than that of colonies 1 to 3 (both Gram stainability −), and therefore was excluded from the subsequent examination, using Nissui Pharmaceutical's medium and ID test EB-20, The morphology and biochemical properties of 3 were observed. The following results were obtained.
【００２２】コロニー１を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−１） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６４号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５０
９号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ） 生育状態 １）標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明コロ
ニーを形成する。 ２）ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成す
る。 ［ＳＳ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５０３１］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ 胆汁酸塩 ９．０ｇ ペプトン ７．５ｇ ラクトース １０．０ｇ クエン酸ナトリウム ８．５ｇ チオ硫酸ナトリウム ５．５ｇ クエン酸第二鉄 １．０ｇ ニュートラルレッド ０．０２５ｇ プリリアントグリン ０．０３３ｇ カンテン １３．５ｇ ｐＨ：７．１±０．１ ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 ［ＴＳＩ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５１０
３］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ ペプトン １５．０ｇ ラクトース １０．０ｇ シュクロース １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ クエン酸第二鉄 ０．２ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ フェノールレッド ０．０２ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ：７．６±０．１ （ｃ）生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：＋ ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：＋ １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：− ３）アルギニンの分解：− ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：− Bacteria forming colony 1 (identification number: 9
(0081-1) (Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science and Technology, Institute of Microbial Technology)
Deposited in Japan as Microbiology Research Institute Contribution No. 11664 from August 17, 1950
It was presumed that the bacterium belongs to the genus Serratia of the family Enterobacteriaceae based on the morphology and biochemical properties described below (which was transferred to the international deposit under the Budapest Treaty as No. 9). (A) Morphology 1) Short rods 2) No motility 3) Gram stainability :-( b) Growth state 1) Standard agar medium: Yellow to cream colored, round opaque colonies are formed. 2) SS agar medium: white and translucent colonies are formed. [SS agar medium: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. code number: 05031] In one liter composition, meat extract 5.0 g bile salt 9.0 g peptone 7.5 g lactose 10.0 g sodium citrate 8.5 g sodium thiosulfate 5.5 g citric acid Ferric acid 1.0 g Neutral red 0.025 g Priliantogulin 0.033 g Agar 13.5 g pH: 7.1 ± 0.1 3) TSI agar medium: No change on the slope, but yellow on the upper part Change. Produces gas. [TSI agar medium: Nissui Pharmaceutical Co. code number: 0510
3] In a composition of 1 liter Meat extract 5.0 g NaCl 5.0 g Peptone 15.0 g Lactose 10.0 g Sucrose 10.0 g Glucose 1.0 g Ferric citrate 0.2 g Sodium thiosulfate 0.2 g Phenol red 02g agar 15.0g pH: 7.6 ± 0.1 (c) Physiological properties 1) Forges-Proscher's reaction: + 2) Indole formation: − 3) Hydrogen sulfide formation: − 4) Use of citric acid : + 5) Urease: -6) Oxidase: -7) OF test: + (d) Availability of carbon source 1) Lactose: + 2) Adonite: -3) Rhamnose: + 4) Mannitol: +5 ) Esculin: + 6) Inosit: -7) Sorbit: + 8) Arabinose: + 9) Raffinose: + 10) Sucrose: + (e) 1) Decarboxylation of lysine: - 2) Use of malonic acid: - 3) decomposition of arginine: - 4) deamination of phenylalanine: - 5) Decarboxylation of ornithine: -
【００２３】コロニー２を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−２） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６５号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
０号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定さ
れる。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ）生育状態 １）標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形
成する。 ２）ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成す
る。 ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：＋ ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：＋ １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：＋ ３）アルギニンの分解：＋ ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：＋ Bacteria forming colony 2 (identification number: 9
(Headed to the Institute of Microbial Technology, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Technology, Heisei 2)
Deposited in Japan as Microbiology Research Institute No. 11665 from August 17, 1996, and Microbiology Research Article No. 351 from August 12, 1991.
Based on the morphology and biochemical properties described below, the bacterium was presumed to belong to the genus Enterobacter of the family Enterobacteriaceae. (A) Morphology 1) Short rods 2) No motility 3) Gram stainability :-( b) Growth state 1) Standard agar medium: A cream-colored and opaque colony is formed. 2) SS agar medium: Red and opaque colonies are formed. 3) TSI agar medium: There is no change on the slope, but the upper part turns yellow. Produces gas. (C) Physiological properties 1) Forges-Proschauer reaction: +2) Production of indole: -3) Production of hydrogen sulfide: -4) Utilization of citric acid: +5) Urease: -6) Oxidase: -7) OF test: + (d) Availability of carbon source 1) Lactose: + 2) Adnite: -3) Rhamnose: + 4) Mannitol: + 5) Esculin: + 6) Inosit: -7) Sorbit: + 8) Arabinose: + 9) Raffinose: + 10) Sucrose: + (e) Others 1) Decarboxylation of lysine: -2) Utilization of malonic acid: + 3) Decomposition of arginine: + 4) Deamination of phenylalanine Reaction: -5) Decarboxylation of ornithine: +
【００２４】コロニー３を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−３） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６６号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
１号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ） 成育状態 １）標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形
成する。 ２）ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ） 生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：− ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：− １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：＋ ３）アルギニンの分解：− ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：− Bacteria forming colony 3 (identification number: 9
(Heisei 2 in the Institute of Microbial Technology, Ministry of International Trade and Industry
Deposited in Japan as Microbiology Research Institute No. 11666 from August 17, 1996, and Microbiology Research Article No. 351 from August 12, 1991.
Based on the morphology and biochemical properties described below, the bacterium was presumed to belong to the genus Pantoea of the family Enterobacteriaceae. (A) Morphology 1) Short rods 2) No motility 3) Gram stainability :-( b) Growth state 1) Standard agar medium: Yellow, round, translucent colonies are formed. 2) SS agar: does not form colonies. 3) TSI agar medium: There is no change on the slope, but the upper part turns yellow. Does not generate gas. (C) Physiological properties 1) Forges-Proscher's reaction: +2) Indole production: -3) Hydrogen sulfide production: -4) Citric acid utilization: +5) Urease: -6) Oxidase: -7) OF test: + (d) Availability of carbon source 1) Lactose: + 2) Adnite: − 3) Rhamnose: + 4) Mannitol: + 5) Esculin: + 6) Inosit: − 7) Sorbit: − 8) Arabinose: + 9) Raffinose: -10) Sucrose: + (e) Others 1) Decarboxylation of lysine: -2) Utilization of malonic acid: + 3) Decomposition of arginine: -4) Deamination of phenylalanine Reaction: -5) Decarboxylation of ornithine:-
【００２５】４）コロニー１、２、３をそれぞれ１リッ
トルのＬ−肉汁培地に移し、３７℃で一夜振とうし、
５，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理して集菌した。
なお、このＬ−肉汁培地は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社
のポリペプトン１０ｇ、同社の酵母エキス５ｇ、和光純
薬社の特級ＮａＣｌ（５ｇ）を蒸留水に入れ、ＮａＯＨ
でｐＨ７．５に合わせ、オートクレーブし、別途、予め
調製済みの和光純薬社の特級グルコースの４０％溶液を
４００倍に希釈して加えて調製したものである。 ５）各菌体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これ
に５０ｍｌの９０％熱フェノールを加えて６５〜７０℃
で２０分間攪拌し、冷却後に、１０，０００Ｇ、４℃で
２０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹ
Ｏ）社のＵＫ−２００を使用して限外濾過に付して分子
量２０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ２圧：２気
圧）。 ６）この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セフ
ァロース ファストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料を
カラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出さ
せた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して
脱塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。な
お、核酸は１ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）で溶出した。4) Each of the colonies 1, 2 and 3 was transferred to 1 liter of L-broth medium and shaken at 37 ° C. overnight,
The cells were collected by centrifugation at 5,000 G for 20 minutes at 4 ° C.
The L-broth medium was prepared by adding 10 g of polypeptone manufactured by Difco, 5 g of yeast extract manufactured by Difco, and special grade NaCl (5 g) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Was adjusted to pH 7.5, autoclaved, and separately prepared by adding a 40% solution of a special grade glucose of Wako Pure Chemical Industries, which had been prepared in advance, diluted 400 times. 5) Each cell was suspended in 50 ml of distilled water, and 50 ml of 90% hot phenol was added to the suspension to add 65-70 ° C.
The mixture was stirred for 20 minutes at 20 ° C., cooled, and then centrifuged at 10,000 G, 4 ° C. for 20 minutes to collect an aqueous layer. The phenol layer was subjected to the same operation as above twice more. The three aqueous layers were combined and dialyzed overnight to remove phenol, and the internal solution was advantech toyo (ADVANTEC TOY
O-) of UK-200 was used for ultrafiltration and concentrated by a molecular weight cut-off of 200,000 (N 2 pressure: 2 atm). 6) The concentrated sample was used as Q-Sepharose Fast Flow (Q-Sepharose) manufactured by Pharmacia.
Fast Flow) and subjected to anion exchange chromatography. That is, 10 mM Tris-HCl (p
After the sample was applied to the column with a buffer solution containing H7.5) and 10 mM NaCl, the limulus active fraction was eluted with 400 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). This eluate was subjected to ultrafiltration under the same conditions as described above, desalted and concentrated to obtain LPS having a purity of 96% or more. The nucleic acid was 1M NaCl / 10 mM Tris-HCl (p
It was eluted with H7.5).
【００２６】各菌体の結果は次の表２〜表４の通りであ
った。核酸量はＯＤ（２６０ｎｍ）での測定値に基づき
（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度（％）は次式に基づき計算
した。The results of each bacterial cell are shown in Tables 2 to 4 below. The amount of nucleic acid was calculated based on the measured value at OD (260 nm) (10D = 50 μg), and the purity (%) was calculated based on the following formula.
【００２７】[0027]
【数２】 [Equation 2]
【００２８】[0028]
【表２】 [Table 2]
【００２９】[0029]
【表３】 [Table 3]
【００３０】[0030]
【表４】 [Table 4]
【００３１】７）分子量 各菌体ＬＰＳの分子量を、製造例１と同様にしてＳＤＳ
−２法により測定したら、５，０００±１，０００（菌
体９００８１４−１に由来するＬＰＳ１）、６，５００
±２，５００（同−２に由来するＬＰＳ２及び同−３に
由来するＬＰＳ３）であった。銀染色におけるそれらの
染色帯を図４に示す。図４で、番号１〜３がそれぞれＬ
ＰＳ１〜ＬＰＳ３に対応する。図４に示されるように、
ＬＰＳ１は分子量３万付近にもややまとまった染色帯を
示した。ＬＰＳ２は３０，０００から４３，０００の間
にも染色帯が認められるが、１４，０００以下の染色帯
の染色度と比較すると、高分子のものは極めて少ないと
推定される。後述する糖量、ヘキソサミン量から判断し
ても、ＬＰＳ２は最も糖含有率が低く、ついでＬＰＳ
３、ＬＰＳ１の順で高くなり、電気泳動で観察されたパ
ターンと一致すると考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥
収量の比もＬＰＳ２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に低くな
っている。以上の観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分
子のＬＰＳが多く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に
その割合は少なくなると推定される。7) Molecular weight The molecular weight of each bacterial cell LPS was changed to SDS in the same manner as in Production Example 1.
-5,000 as measured by the -2 method (LPS1 derived from bacterial cell 900814-1), 6,500
± 2,500 (LPS2 derived from the same-2 and LPS3 derived from the same-3). Those dyed bands in silver staining are shown in FIG. In FIG. 4, numbers 1 to 3 are L, respectively.
Corresponds to PS1 to LPS3. As shown in FIG.
LPS1 showed a slightly aggregated staining band even at a molecular weight of around 30,000. Staining bands of LPS2 are also observed between 30,000 and 43,000, but it is presumed that the number of polymer is extremely small compared with the staining degree of the staining band of 14,000 or less. Judging from the amount of sugar and the amount of hexosamine described later, LPS2 has the lowest sugar content.
3 and LPS1 increase in this order, which is considered to be consistent with the pattern observed by electrophoresis. Further, the ratio of the amount of LPS / the total dry yield also decreases in the order of LPS2, LPS3, and LPS1. From the above observation results, it is estimated that LPS2 has a relatively large amount of low-molecular-weight LPS, and then the ratio of LPS3 and LPS1 decreases in that order.
【００３２】８）リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．
６μｇ、１０３．６μｇのＬＰＳを含む２０μｌの溶液
を調製し、小試験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％
硫酸を添加し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２
０μｌの１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで１分間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌ
の蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ
硫酸、２ｍｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度ＯＤ（８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬
社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．
５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、リン１ｇはリ
ン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。結果を表５
に示す。なお、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量（μｇ）は吸光量から計算された値で
ある。リン量（重量％）は、次式により計算した。な
お、式中の「０．６７」は、標準のリン１μｇのＯＤ値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各ＬＰＳの
濃度（ｍｇ／ｍｌ）を指す。8) Phosphorus content Chen-Toribara method [Chen et al., "Analytical Chemistry (Ana
(Lytical Chemistry), vol. Two
8, 1756-1758 (1956), the procedure was as follows. LPS1, LPS2 and LPS3 were separately dissolved in distilled water to give 31.6 μg and 57.
A 20 μl solution containing 6 μg, 103.6 μg LPS was prepared and placed in a small test tube. 20 μl of 50 v / v%
Sulfuric acid was added and heated at 160 ° C. for 2 hours. Then 2
After adding 0 μl of 10 v / v% perchloric acid, the mixture was heated with a gas burner for 1 minute to incinerate. Then 0.5 ml
Distilled water, then 0.5 ml of reaction reagent (1 ml of 6N
Sulfuric acid, 2 ml of distilled water, 2 ml of 2.5 v / w% ammonium molybdate and 1 ml of 10 v / w% ascorbic acid were mixed and prepared, 0.5 ml of which was used) and added for 30 minutes at room temperature. After standing, the absorbance OD at 820 nm (820 nm) was measured. In addition, as a sample for preparing a calibration curve, potassium dihydrogen phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with distilled water, and phosphoric acid weights of 2.5 μg, 1 μg, 0.25 μg, and 0 μg were included, respectively.
A 5 ml solution was prepared and used. In addition, 1 g of phosphorus corresponds to 4.39 g of potassium dihydrogen phosphate. The results are shown in Table 5.
Shown in. The numerical value indicating the absorbance is a value obtained by subtracting the data of the control which has not been heat-treated in order to avoid an error due to the mixing of inorganic phosphorus (for example, derived from a phosphate buffer solution). The phosphorus amount (μg) is a value calculated from the light absorption amount. The phosphorus amount (% by weight) was calculated by the following formula. In the formula, “0.67” indicates the OD value of 1 μg of standard phosphorus, and the sample concentration indicates the concentration (mg / ml) of each LPS dissolved in distilled water.
【００３３】[0033]
【数３】 [Equation 3]
【００３４】リン数は、次式により計算した、分子量
５，０００当たりの換算数である。The phosphorus number is a conversion number per 5,000 molecular weight calculated by the following formula.
【００３５】[0035]
【数４】 [Equation 4]
【００３６】[0036]
【表５】 [Table 5]
【００３７】９）ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ（ＬＰＳ１）、２．８８
ｍｇ（ＬＰＳ２）、５．１８ｍｇ（ＬＰＳ３）／ｍｌの
溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨ７とし
た。その１００μｌを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、１００μｌを分取し、６７０μｌの９６
％エタノールを加え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加
えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μ
ｇ／ｍｌのＮ−アセチル グルコサミン（和光純薬社
製）を使った。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製した。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製した。 結果、ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のヘキソサミン数
は各々９±１／分子量５，０００、７±１／分子量５，
０００、５±１／分子量５，０００だった。9) Hexosamine content Elson-Morgan method (Tokyo Kagaku Dojin Shuppan "Biochemistry Experiment Course" No. 37)
7 to 379) and performed as follows. Dissolve LPS in distilled water to give 1.58 mg (LPS1), 2.88
A solution of mg (LPS2), 5.18 mg (LPS3) / ml was prepared, and 100 μl thereof was put into a Spitz (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) equipped with a screw cap.
μl 8N HCl was added and heated at 110 ° C. for 16 hours. About 200 μl of 4N NaOH was added to adjust the pH to 7. A 100 μl portion thereof was taken, placed in another Spitz equipped with a screw cap, and after adding 200 μl of the following reagent A, the mixture was heated at 105 ° C. for 1.5 hours and then cooled with running water. Then 100 μl was taken and 670 μl of 96
% Ethanol was added, and 67 μl of the following reagent B was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the absorbance was measured at 535 nm. 0.20 to 200μ as a sample for preparing a calibration curve
G / ml N-acetyl glucosamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. (Reagent A) It was prepared by mixing 75 μl of acetylacetone and 2.5 ml of 1.25N sodium carbonate. (Reagent B) It was prepared by mixing 1.6 g of p-dimethylbenzaldehyde, 30 ml of concentrated hydrochloric acid and 30 ml of 96% ethanol. As a result, the number of hexosamines in LPS1, LPS2, and LPS3 was 9 ± 1 / molecular weight 5,000 and 7 ± 1 / molecular weight 5, respectively.
It was 5,000, 5 ± 1 / molecular weight 5,000.
【００３８】１０）ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ１を
含む２５０μｌ蒸留水溶液；（２）０．５７６ｍｇ／ｍ
ｌのＬＰＳ２を含む２５０μｌ蒸留水溶液；（３）０．
５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ３を含む２５０μｌ蒸留水溶
液；のいずれかを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３３
分間加熱後に冷水（２４．５℃）中で３０分間冷却し、
ついで日立分光光度計３２０を使い４２０、４７０、６
３０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値を
各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、０．５μモル／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含
む蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（ＳＴ）はＬＰＳ１で０．１０９、ＬＰＳ
２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった。標準
試料の値（ＳＳ）は０．２４６であり、蒸留水のみの値
は０．００５であった。この値の比較により、分子量
５，０００当たり、ＬＰＳ１には２±１の、ＬＰＳ２に
は１〜２個の、ＬＰＳ３には２±１個のＫＤＯが含まれ
ると推定された。なお、これらの値は、ＬＰＳ１を例に
とると、次のように計算される。溶液に含まれるＫＤＤ
の濃度をχ（μモル／ｍｌ）とすると、10) KDO content The KDO (2-keto-3-deoxyoctonate) content was measured by the diphenylamine method [Shabyal.
R. ) Et al., Analytical Biochem (Analy
mechanical Biochem. ), 58 (1), 123
~ 129 (1974)]. A KDO detection reagent was prepared by combining 500 mg of diphenylamine, 5 ml of ethanol, 45 ml of glacial acetic acid, and 50 ml of concentrated hydrochloric acid (all manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Part 5
(1) 0.505 mg / ml LPS1 in 250 μl distilled aqueous solution in 00 μl; (2) 0.576 mg / m
250 μl distilled aqueous solution containing 1 l of LPS2; (3) 0.
250 μl distilled aqueous solution containing 518 mg / ml LPS3; and 33 in a boiling water bath at 100 ° C.
After heating for 1 minute, cool in cold water (24.5 ° C) for 30 minutes,
Then, using Hitachi spectrophotometer 320, 420, 470, 6
Ultraviolet absorption was measured at 30 and 650 nm (measured values are A420, A470, A630, and A650, respectively). As a standard sample, 0.5 μmol / ml KDO
250 μl of distilled water containing ammonium salt [manufactured by Sigma, USA] was used. The value of the following equation was determined for each of the specimen sample and the standard sample. S = A420-A470 + A630-A650 The sample value (S T ) is 0.109 for LPS1, LPS
2 was 0.078 and LPS3 was 0.099. The value of the standard sample (S S) is 0.246, the value of the distilled water alone was 0.005. By comparison of these values, it was estimated that LPS1 contained 2 ± 1, LPS2 contained 1-2, and LPS3 contained 2 ± 1 KDO per 5,000 molecular weight. Note that these values are calculated as follows, taking LPS1 as an example. KDD contained in solution
Let χ (μmol / ml) be the concentration of
【００３９】[0039]
【数５】 [Equation 5]
【００４０】上記式から、χ＝０．２２１となる。従っ
て、ＬＰＳ１の１モル（５，０００と仮定）に含まれる
ＫＤＤのモル数をｙとすると、次式により、ｙ＝２．１
９となる。From the above equation, χ = 0.221. Therefore, letting y be the number of moles of KDD contained in 1 mole of LPS1 (assuming 5,000), y = 2.1
It becomes 9.
【００４１】[0041]
【数６】 [Equation 6]
【００４２】以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方
例である。なお、実施例１〜４におけるＬＰＳ量は、リ
ムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算量である。実施例１ （錠剤） 小麦ＬＰＳ ０．０４ｇ ６％ＨＰＣ乳糖 １７８ｇ ステアリン酸タルク ８ｇ バレイショデンプン １４ｇ 以上を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含
む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。実施例２ （内用液剤） クロレラＬＰＳ １ｍｇ 精製水 １００ｍｌ The following is a formulation example of a preparation containing the LPS of the present invention. The LPS amounts in Examples 1 to 4 are E. coli LPS-equivalent amounts by the limulus test. Example 1 (Tablet) Wheat LPS 0.04 g 6% HPC Lactose 178 g Talc stearate 8 g Potato starch 14 g The above ingredients were mixed and tableted to prepare 400 0.5 g tablets containing 0.1 mg wheat LPS. did. Example 2 (internal solution) Chlorella LPS 1 mg Purified water 100 ml
【００４３】実験例１（リムラステスト陽性植物ＬＰＳ
の定量） 各種植物に含まれるリムラステスト陽性ＬＰＳの定量
を、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムを使っ
て行った。 ９６穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を１
穴当たり１８０μｌ入れた。試料２０μｌ（試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した）をプレー
トの穴の１つに加えた。プレートミキサーで攪拌しなが
らピペッティングを行って１０倍希釈液を調製した。
（以後、順次希釈試料を２０μｌずつとり、同様に処理
することで１００倍、１０００倍、…と１０倍希釈系列
液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比を変
えることにより希釈率は任意に設定できる。） 内部標準として１．５μｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ溶液
の１００，０００倍希釈液を調製し、希釈やリムラステ
スト発色が正常であることを確認した。 上記の１０倍希釈液３５μｌを別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムのＬ
Ｓ−１セット３５μｌを添加し、３７℃で３０分間放置
した。ついで１０５μｌの１Ｍ酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。この試料液の波長４１５ｎｍでの吸
光度を、９６穴用吸光度計プレートリーダーＭＴＰ−１
００（コロナ電気株式会社製）で測定した。バックグラ
ンドとしては蒸留水を、検量線作成用としては４２ｐｇ
／ｍｌの生化学工業株式会社のトキシカラージステムの
ＥＴ−１セットを使用して検量線を作成し、この検量線
を基準にして各試料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの定
量を行った。（試料が蒸留水である場合の吸光度を０と
した。）なお、この方法で前記ＬＳ−１セットを使用し
た場合には１０〜４５ｐｇ／ｍｌの範囲内で発色に定量
性があることが確認されたので、この範囲に入らないと
きは、希釈率を変えて再実験した。希釈試料の定量値
は、 （検量線から読み取った値）×（希釈率） で計算した。得られた結果を、固体試料の場合にはｎｇ
／ｇ単位で、液体試料の場合にはｎｇ／ｍｌ単位で次の
表６〜表１１に示す。なお、表中の試料の欄の会社名、
地名等は、当該試料の入手先、産地をさす。かかる記載
がない品はスーパーストアー忠実屋の神奈川県津久井郡
中野町店で購入した品で、製造者が不明なものを指す。
なお、「ホクレン」は、北海道農業協同組合連合会の略
称である。 Experimental Example 1 (limus test positive plant LPS
Quantification) The limulus test positive LPS contained in various plants was quantified using a Toxigara system manufactured by Seikagaku Corporation. 1 well of 96-well flat bottom or round bottom plate with distilled water for injection
180 μl was added per hole. 20 μl of sample (prepared by dissolving in distilled water for injection if the sample was a solid) was added to one of the holes in the plate. A 10-fold diluted solution was prepared by pipetting while stirring with a plate mixer.
(Hereafter, by taking 20 μl of each diluted sample and treating in the same manner, a 10-fold, 1000-fold, ..., 10-fold diluted series solution can be prepared. Dilution is performed by changing the ratio of distilled water for injection and sample. The rate can be set arbitrarily.) As an internal standard, a 100,000-fold diluted solution of 1.5 μg / ml E. coli LPS solution was prepared, and it was confirmed that the dilution and the color development of the limulus test were normal. 35 μl of the 10-fold diluted solution described above was placed in a hole of another plate, and was added to L of Toxicolor System of Seikagaku Corporation.
35 μl of S-1 set was added and left at 37 ° C. for 30 minutes. Then, 105 μl of 1 M acetic acid water was added and stirred to stop the reaction. The absorbance of this sample solution at a wavelength of 415 nm was measured using a 96-well absorbance meter plate reader MTP-1.
00 (manufactured by Corona Electric Co., Ltd.). Distilled water as background, 42 pg for making calibration curve
/ Ml Seikagaku Kogyo Co., Ltd. Toxicolor system ET-1 set was used to prepare a calibration curve, and the limulus test positive LPS in each sample was quantified based on this calibration curve. (When the sample was distilled water, the absorbance was set to 0.) When the LS-1 set was used by this method, it was confirmed that the color development was quantitative within the range of 10 to 45 pg / ml. Therefore, if it did not fall within this range, the experiment was repeated by changing the dilution rate. The quantitative value of the diluted sample was calculated by (value read from calibration curve) x (dilution rate). The result obtained is ng in the case of a solid sample.
/ G unit, and in the case of a liquid sample, ng / ml unit is shown in the following Tables 6 to 11. The company name in the sample column in the table,
The place name, etc. refer to the place where the sample is obtained and the place of origin. Items without such a description are those purchased at the Superstore Faithful store in Nakano-cho, Tsukui-gun, Kanagawa prefecture, and the manufacturer is unknown.
“Hokuren” is an abbreviation for the Hokkaido Federation of Agricultural Cooperatives.
【００４４】[0044]
【表６】 [Table 6]
【表７】 [Table 7]
【表８】 [Table 8]
【表９】 [Table 9]
【表１０】 [Table 10]
【表１１】 [Table 11]
【００４５】実験例２（マクロファージのインビトロＴ
ＮＦ産生能を活性化する際のＥＤ５０を与えるリムラス
テスト陽性ＬＰＳの含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
液ｍｌであるＬＰＳの選択方法） ９週齢の、平均体重２９ｇの各群３匹のオスのＣ３Ｈ／
Ｈｅマウスのマクロファージ腹腔常在細胞２００μｌ
（２×１０５個）／穴を９６穴の平底プレートに入れ、
プライマーとしての組換えマウス１ＦＮ−γ（１００単
位／ｍｌ）を各穴に１０μｌ宛加えた。別途、各種ＬＰ
Ｓ源を６５℃の熱水（ｇ／ｍｌ）で５時間抽出して調製
した抽出液を各種希釈し、その１０μｌ／穴をプライマ
ー投与の３時間後にトリガーとして加えた。２時間培養
後に遠心分離操作に付した（３０００Ｇ、２０分）。各
穴から得られた１３０μｌの、ＴＮＦ活性はＬ９２９細
胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リムラステスト
陽性ＬＰＳ含有量は生化学工業株式会社のトキシカラー
ジステムを使用して測定した。測定値を、縦軸にＴＮＦ
産生量（単位／培養液ｍｌ）を、横軸（対数尺）に対応
リムラステスト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）
を表す座標にプロットし、プロットされた各点から推定
されるシグモイド曲線を描いた。トリガーを投与しなか
った場合のＴＮＦ産生量を与える各トリガーのマクロフ
ァージ活性化能を０％とし、トリガー投与の効果として
増大するＴＮＦ産生量が最大恒量に達したときの各トリ
ガーのマクロファージ活性化能を１００％とし、その５
０％に相当するマクロファージ活性化能を与えるリムラ
ステスト陽性ＬＰＳ含有量を曲線から読み取った。マク
ロファージ活性化能とリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
との相関関係が上記条件を満たしたＬＰＳ採取源の結果
を表１２〜表１４に示す。表中で、「ＴＮＦ」はＴＮＦ
産生量（単位／培養液ｍｌ）を、「活性化能」はマクロ
ファージ活性化能（％）を、「ＬＰＳ」はリムラステス
ト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）を表す。な
お、トリガー無添加時のＴＮＦ産生量は０．７５単位／
ｍｌであったので、ＴＮＦ産生量が０．７５単位／ｍｌ
以下である場合をマクロファージ活性化能０％とし、マ
クロファージ活性化能（％）は次式により計算した。 Experimental Example 2 (In vitro T of macrophages
Selection method of LPS in which the content of limulus test-positive LPS that gives an ED 50 for activating NF production is 0.4 to 100 ng / ml of culture solution) 9 weeks old, average weight 29 g Male C3H /
200 mu l of macrophage peritoneal cells of He mouse
(2 × 10 5 pieces) / Put holes in a 96-well flat bottom plate,
Recombinant mouse 1FN-γ (100 units / ml) as a primer was added to each well in an amount of 10 μl. Separately, various LP
Extraction solutions prepared by extracting the S source with hot water (g / ml) at 65 ° C. for 5 hours were diluted variously, and 10 μl / well thereof was added as a trigger 3 hours after the primer administration. After culturing for 2 hours, centrifugation was performed (3000 G, 20 minutes). The TNF activity of 130 μl obtained from each well was measured based on the toxicity to L929 cells, and the limulus test positive LPS content was measured using a Toxicolor Distem of Seikagaku Corporation. The measured value is plotted on the vertical axis as TNF
Amount of production (unit / ml of culture solution) corresponds to the horizontal axis (logarithmic scale) Limuras test positive LPS content (ng / ml of culture solution)
Was plotted on the coordinates representing the sigmoid curve estimated from each plotted point. The macrophage activating ability of each trigger that gives the TNF production amount when the trigger is not administered is 0%, and the macrophage activating ability of each trigger when the TNF production amount that increases as the effect of the trigger administration reaches the maximum constant amount To 100%, 5
The limulus test positive LPS content giving a macrophage activating capacity corresponding to 0% was read from the curve. Tables 12 to 14 show the results of LPS collection sources in which the correlation between the macrophage activating ability and the limulus test positive LPS content satisfied the above conditions. In the table, "TNF" is TNF
The production amount (unit / ml of culture solution), the "activation ability" represents the macrophage activation ability (%), and the "LPS" represents the limulus test positive LPS content (ng / culture medium ml). The amount of TNF produced without addition of trigger was 0.75 units /
Since it was ml, the TNF production amount was 0.75 unit / ml
The following cases were defined as 0% macrophage activating ability, and the macrophage activating ability (%) was calculated by the following formula.
【００４６】[0046]
【数７】 [Equation 7]
【００４７】[0047]
【表１２】 [Table 12]
【表１３】 [Table 13]
【表１４】 [Table 14]
【００４８】実験例３（実験動物での発育促進効果−そ
の１） Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスに、出生後、蒸留水（６匹）、Ｌ
ＰＳ換算でそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ（６匹）、５０ｎｇ／
ｍｌ（５匹）の粉末Ａ−ａ２（製造例１）を含むように
調製した蒸留水を自由摂取させた。（以下、それぞれ、
蒸留水摂取群、５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群と称
す。） 他の給餌条件は全く同様であり、株式会社日本
クレア市販のラット、マウス用の飼料ＣＥ−２を自由摂
取させた。出生後に体重を測定し、各群の平均値（／
匹）として、次の表１５に示す結果が得られた。表中、
５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群の欄中の増加率は、それ
ぞれそれらの平均値の、蒸留水投与群の平均値に対する
増加率（％）を表している。 Experimental Example 3 (Growth-promoting effect in experimental animals-Part 1) Male C3H / He mice were postnatally distilled water (6), L
PS conversion: 5 ng / ml (6 animals), 50 ng / ml
Distilled water prepared so as to contain ml (5 animals) of powder Aa 2 (Production Example 1) was freely taken. (Hereinafter,
It is called a distilled water intake group, a 5 ng intake group, or a 50 ng intake group. The other feeding conditions were exactly the same, and the feed CE-2 for rats and mice commercially available from CLEA Japan, Inc. was freely taken. Body weight was measured after birth and the average value (/
The results shown in Table 15 below were obtained. In the table,
The increase rates in the columns of the 5 ng intake group and the 50 ng intake group represent the increase rate (%) of the average value thereof with respect to the average value of the distilled water administration group.
【００４９】[0049]
【表１５】 [Table 15]
【００５０】図５は、表１５に示した結果をグラフ化し
たものである。表１５及び図５より、本発明のＬＰＳが
有意な発育促進効果を示すことが明らかである。FIG. 5 is a graph of the results shown in Table 15. From Table 15 and FIG. 5, it is clear that the LPS of the present invention shows a significant growth promoting effect.
【００５１】実験例４（実験動物での発育促進効果−そ
の２） 懐妊しているＣ３Ｈ／Ｈｅ雌マウスに蒸留水、ＬＰＳ換
算でそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌの粉末Ａ−
ａ２（製造例１）を含むように調製した蒸留水を自由摂
取させた。（以下、それぞれ、蒸留水摂取群、５ｎｇ摂
取群、５０ｎｇ摂取群と称す。） 摂取開始後６日目に
蒸留水摂取群マウスから誕生した雌マウスを５匹、５ｎ
ｇ摂取群から誕生した雌マウスを７匹、５０ｎｇ摂取群
から誕生した雌マウスを４匹選び、誕生後２０日目から
それぞれ親マウスと同じ物を摂取させた。他の給餌条件
は誕生前から全く同様であり、株式会社日本クレア市販
のラット、マウス用の飼料ＣＥ−２を自由摂取させた。
誕生後２０日目から各マウスの体重を測定し、各群の平
均値（／匹）として、次の表１６に示す結果が得られ
た。表中、５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群の欄中の増加
率は、それぞれ、それらの平均値の、蒸留水投与群の平
均値に対する増加率（％）を表している。 Experimental Example 4 (Growth-promoting effect in experimental animals-2) Pregnant female C3H / He mice were distilled water, and 5 ng / ml and 50 ng / ml of powder A in terms of LPS were added to powder A-.
Distilled water prepared so as to contain a 2 (Production Example 1) was freely ingested. (Hereinafter, referred to as a distilled water intake group, a 5 ng intake group, and a 50 ng intake group, respectively.) Five female mice born from the distilled water intake group on the 6th day after the start of intake, 5n
Seven female mice born from the g-administered group and four female mice born from the 50-ng ingested group were selected and ingested the same thing as the parent mice from the 20th day after birth. The other feeding conditions were exactly the same before birth, and the feed CE-2 for rats and mice commercially available from CLEA Japan, Inc. was freely taken.
The body weight of each mouse was measured from the 20th day after birth, and the results shown in the following Table 16 were obtained as the average value (/ animal) of each group. In the table, the increase rates in the columns of the 5 ng intake group and the 50 ng intake group represent the increase rates (%) of their average values with respect to the average value of the distilled water administration group.
【００５２】[0052]
【表１６】 [Table 16]
【００５３】図６は、表１６に示した結果をグラフ化し
たものである。表１６及び図６より、本発明のＬＰＳが
有意な発育促進効果を示すこと、又、表１５及び図５に
示した結果との比較により、誕生後に本発明のＬＰＳを
初めて摂取させるよりも、懐妊中の親にも摂取させるこ
とによりその発育促進効果は約２倍になることを示して
いる。FIG. 6 is a graph of the results shown in Table 16. From Table 16 and FIG. 6, it can be seen that LPS of the present invention shows a significant growth-promoting effect, and comparison with the results shown in Table 15 and FIG. It has been shown that the growth-promoting effect is approximately doubled when it is taken by the parent during pregnancy.
【００５４】投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを発育促進剤、動物用発育促進剤として
投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは
獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、
投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人
（６０ｋｇ）で、経口投与で１μｇ〜１００ｍｇ、静脈
投与で１０ｎｇ〜１０ｍｇ、経皮投与で１００ｎｇ〜１
ｍｇが１日１回の投与量の一応の目安となる。なお、動
物では、牛、馬等の大型動物は上記の量の６０分の１を
体重１ｋｇ当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中
型、小型の動物ではその２倍量を体重１ｋｇ当たりの量
の目安とし、鶏等の鳥類では更にその２倍量を体重１ｋ
ｇ当たりの量の目安とし投与できる。なお、ベーレンス
ケルバー（Ｂｅｈｒｅｎｓ Ｋ Dosage, Administration Interval, Toxicity Value When the LPS of the present invention is administered as a growth promoter or animal growth promoter, the amount and interval of administration are, of course, strictly controlled by the attending physician or veterinarian. Subject's age, symptoms, weight,
It is individually determined in consideration of the effect of administration, but it is 1 μg to 100 mg by oral administration, 10 ng-10 mg by intravenous administration, 100 ng-1 by transdermal administration in human adult (60 kg).
mg is a tentative guideline for once-daily dose. For large animals such as cows and horses, use 1/60 of the above amount as a guideline for the amount per kg of body weight, and for medium-sized and small animals such as pigs, dogs and cats, double the amount. As a guideline for the amount per kg, for birds such as chickens, double the amount more than 1k
It can be administered as an indication of the amount per g. Behrens Kerber
【外１】 ｒｂｅｒ）法により計算した、７週齢の平均体重２２ｇ
のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスにおけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３のＬＤ５０はそれぞれ１５０、１８０、１８０
μｇ／匹であり、大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ）社製０１２８：Ｂ８］の値３００μｇ／匹の６０
％以下であった。又、小麦ＬＰＳ（製造例１）、大腸菌
ＬＰＳ（同上）、百日咳菌ＬＰＳ（製造例３）の毒性値
ＬＤ５０（１群２匹の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウス、平均体重
４５ｇ、における平均値）は静脈内投与でそれぞれ３．
２、３．４、１１ｍｇ／ｋｇであり、皮内投与でそれぞ
れ１６、１６、３２ｍｇ／ｋｇだった。[Outer 1] rber) method, 7-week-old average body weight 22 g
, LPS1, LPS2 in C3H / He male mice,
LD 50 of LPS3 is 150, 180, 180 respectively
μg / animal, E. coli LPS [US Difco (Difco
Co) 0128: B8] value 300 μg / animal 60
% Or less. Further, the toxicity value LD 50 (average value in two male BALB / C mice per group, average weight 45 g) of wheat LPS (Production Example 1), E. coli LPS (same as above), and B. pertussis LPS (Production Example 3) was Each by intravenous administration 3.
The doses were 2, 3.4, and 11 mg / kg, and the intradermal administration was 16, 16, and 32 mg / kg, respectively.
【００５５】[0055]
【発明の効果】本発明により、優れた発育促進効果を有
し、未熟児の誕生を予防し、副作用や体内残留性の問題
がなく、長期使用が可能であり、生産コストが低く、し
かも、経口、経皮、薬浴、注射のいずれの経路でもで投
与可能な、大量に供給可能な発育促進剤、動物用発育促
進剤が提供される。According to the present invention, it has an excellent growth promoting effect, prevents the birth of premature babies, has no side effects or persistence in the body, can be used for a long period of time, and has a low production cost. Provided are a growth promoter and an animal growth promoter that can be administered in a large amount and can be administered by any of oral, transdermal, drug bath and injection routes.
【図１】小麦ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけて
得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピークを
図示したチャートである。FIG. 1 is a chart showing peaks showing the presence of fatty acids in a molecule, obtained by subjecting wheat LPS to gas chromatography.
【図２】大腸菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。FIG. 2 is a chart showing peaks showing the presence of fatty acids in the molecule obtained by subjecting Escherichia coli LPS to gas chromatography.
【図３】百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。FIG. 3 is a chart showing peaks showing the presence of fatty acids in the molecule obtained by subjecting B. pertussis LPS to gas chromatography.
【図４】ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３の、ＳＤＳ−２
法におけるパターンを示す図である。FIG. 4 shows SDS-2 of LPS1, LPS2, and LPS3.
It is a figure which shows the pattern in a method.
【図５】本発明のＬＰＳの発育促進効果を示すグラフで
ある。FIG. 5 is a graph showing the growth promoting effect of LPS of the present invention.
【図６】本発明のＬＰＳの発育促進効果を示すグラフで
ある。FIG. 6 is a graph showing the growth promoting effect of LPS of the present invention.
【符号の説明】 図４において、１はＬＰＳ１の、２はＬＰＳ２の、３は
ＬＰＳ３のパターンを示す。 図５、図６において、は蒸留水投与群の、△は本発明の
ＬＰＳの５ｎｇ投与群の、▲は本発明のＬＰＳの５０ｎ
ｇ投与群のデータを示す。[Description of Reference Signs] In FIG. 4, 1 indicates a pattern of LPS1, 2 indicates a pattern of LPS2, and 3 indicates a pattern of LPS3. In FIG. 5 and FIG. 6, is for the distilled water administration group, Δ is for the LPS 5 ng administration group of the present invention, and ▲ is the LPS of the present invention 50 n.
The data of the g administration group are shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 月岡 大輔 千葉県千葉市春日１−21−17 (72)発明者 水野 伝一 神奈川県鎌倉市岡本18 (72)発明者 大島 治之 東京都八王子市館町1097館ケ丘団地２−１ −513 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (72) Inventor Daisuke Tsukioka 1-21-17 Kasuga, Chiba City, Chiba Prefecture (72) Inventor Denichi Mizuno 18 Okamoto, Kamakura City, Kanagawa Prefecture (72) Inventor Haruyuki Oshima Hachioji City Hall, Tokyo Town 1097 Kangaoka housing complex 2-1 −513
Claims (11)
を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０
％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時
のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマ
クロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰ
Ｓのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシ
グモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ５０を与えるリムラステ
スト陽性ＬＰＳ含有量か０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍ
ｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む発育促進剤。1. A growth promoter containing LPS, wherein the macrophage activating ability of LPS that activates the TNF-producing ability of macrophages cultured in vitro is used as an index, and the vertical axis indicates the macrophage when the LPS is not added. Of macrophage activation that gives TNF production
%, The macrophage activating ability (%) is defined as 100% of the macrophage activating ability of LPS when the TNF production amount of the macrophage is maximally constant, and the horizontal axis shows the LP.
When a sigmoid curve representing the limulus test positive LPS content of S on a logarithmic scale is drawn, the limus test positive LPS content giving an ED 50 of macrophage activating capacity is 0.4 to 100 ng / medium
A growth promoter comprising at least one LPS which is 1.
菌から得られるＬＰＳ、リピドＡ、それらの台成ＬＰＳ
及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項
１記載の発育促進剤。2. LPS obtained from a plant, LPS obtained from a bacterium, lipid A, and their underlying LPS.
The growth promoting agent according to claim 1, which is selected from the group consisting of: and a mixture thereof.
られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載の
発育促進剤。 主要分子量：８，０００±１，０００（ＳＤＳ−１法に
よる） ８，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法による） ５，０００±２，０００（ＳＤＳ−２法による） リン数：１〜４／分子量８千 ヘキソサミン数：６±２／分子量８千 脂肪酸数：６±２／分子量８千 ＫＤＯ数＝５±１／分子量８千3. The growth promoter according to claim 2, wherein the LPS obtained from a plant is an LPS obtained from wheat and having the following physical properties. Main molecular weight: 8,000 ± 1,000 (by SDS-1 method) 8,000 ± 1,000 (by SDS-2 method) 5,000 ± 2,000 (by SDS-2 method) Phosphorus number: 1 to 1 4 / Molecular weight 8,000 Hexosamine number: 6 ± 2 / Molecular weight 8,000 Fatty acid number: 6 ± 2 / Molecular weight 8,000 KDO number = 5 ± 1 / Molecular weight 8,000
ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
載の発育促進剤。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００（ＳＤＳ−２
法による） リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万4. The growth promoting agent according to claim 2, wherein the LPS obtained from a plant is an LPS obtained from Chlorella and having the following physical properties. Main molecular weight = 40,000 to 90,000 (SDS-2
Phosphorus number = 4 ± 1 / molecular weight 10,000 Hexosamine number = 7 ± 1 / molecular weight 10,000 Fatty acid number = 6 ± 1 / molecular weight 10,000 KDO number = 2 ± 1 / molecular weight 10,000
得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載
の発育促進剤。 主要分子量＝４０，０００±１０，０００（ＳＤＳ−２
法による） ８，０００± ４，０００（ＳＤＳ−２法による） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万5. The growth promoting agent according to claim 2, wherein the LPS obtained from bacteria is an LPS obtained from Escherichia coli and having the following physical properties. Main molecular weight = 40,000 ± 10,000 (SDS-2
8,000 ± 4,000 (by SDS-2 method) Phosphorus number = 12 / molecular weight 30,000 Hexosamine number = 45 ± 6 / molecular weight 30,000 Fatty acid number = 18 / molecular weight 30,000 KDO number = 5 ± 1 / Molecular weight 30,000
有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：５，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法に
よる） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００6. The growth promoter according to claim 2, wherein the LPS obtained from bacteria is an LPS having the following physical properties. Main molecular weight: 5,000 ± 1,000 (by SDS-2 method) Phosphorus number: 2 ± 1 / molecular weight 5,000 Hexosamine number: 9 ± 1 / molecular weight 5,000 KDO number: 2 ± 1 / molecular weight 5,000
有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−２法に
よる） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００7. The growth promoter according to claim 2, wherein the LPS obtained from bacteria is an LPS having the following physical properties. Main molecular weight: 6,500 ± 2,500 (by SDS-2 method) Phosphorus number: 1-2 / molecular weight 5,000 Hexosamine number: 7 ± 1 / molecular weight 5,000 KDO number: 1-2 / molecular weight 5,000
有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−２法に
よる） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００8. The growth promoting agent according to claim 2, wherein the LPS obtained from bacteria is an LPS having the following physical properties. Main molecular weight: 6,500 ± 2,500 (by SDS-2 method) Phosphorus number: 2 ± 1 / molecular weight 5,000 Hexosamine number: 5 ± 1 / molecular weight 5,000 KDO number: 2 ± 1 / molecular weight 5,000
ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
載の発育促進剤。 主要分子量＝６，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法に
よる） リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千9. The growth promoter according to claim 2, wherein the LPS obtained from bacteria is an LPS obtained from B. pertussis and having the following physical properties. Main molecular weight = 6,000 ± 1,000 (by SDS-2 method) Phosphorus number = 4 / molecular weight 6,000 Hexosamine number = 12 / molecular weight 6,000 Fatty acid number = 4 / molecular weight 6,000 KDO number = 2 ± 1 / molecular weight 6 thousand
ィオバクターＬＰＳである、請求項２記載の発育促進
剤。10. The LPS obtained from bacteria is A. The growth promoting agent according to claim 2, which is Radiobacter LPS.
り、インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産
生能を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロ
ファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化
能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量に
する時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％と
するマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そ
のＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で
表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファージ活性化
能のＥＤ５０を与えるリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるＬＰＳの少な
くとも１種を含む動物用発育促進剤。11. An animal growth promoter containing LPS, wherein the macrophage activating ability of LPS, which activates the TNF producing ability of macrophages cultured in vitro, is used as an index, and the LPS is not added to the vertical axis. The macrophage activating ability that gives TNF production of macrophages is 0%, and the macrophage activating ability (%) is 100% that is the macrophage activating ability of LPS when the TNF production of macrophages is maximally constant. When a sigmoid curve representing the limulus test positive LPS content of the LPS on a logarithmic scale is drawn on the axis, a limus test positive LPS content of 0.4 to 100 ng / ml of culture solution giving an ED 50 of macrophage activating capacity is obtained. An animal growth promoter containing at least one kind.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3357351A JPH05155778A (en) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Growth promoter and animal growth promoter containing lps |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3357351A JPH05155778A (en) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Growth promoter and animal growth promoter containing lps |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05155778A true JPH05155778A (en) | 1993-06-22 |
Family
ID=18453687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3357351A Pending JPH05155778A (en) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Growth promoter and animal growth promoter containing lps |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05155778A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996023002A1 (en) * | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Low-molecular-weight lipopolysaccharide |
| US8075928B2 (en) | 2003-09-26 | 2011-12-13 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
-
1991
- 1991-12-02 JP JP3357351A patent/JPH05155778A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996023002A1 (en) * | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Low-molecular-weight lipopolysaccharide |
| US8075928B2 (en) | 2003-09-26 | 2011-12-13 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
| EP2444480A1 (en) | 2003-09-26 | 2012-04-25 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
| US9394513B2 (en) | 2003-09-26 | 2016-07-19 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
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