JPH0449241A - 抗リュウマチ剤、動物用抗リュウマチ剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗リュウマチ剤、動物用抗リュウマチ剤に関
する。

［従来の技術］ 慢性関節リュウマチは、病理学的には膠原病の範−に入
る人畜共通の代表的炎症性疾患である。

動物では、牛特に舎飼牛に比較的多発し、次いて犬、山
羊で多く発症し、馬、豚での発症は稀である。小動物で
は適当な処置を続けると生存させることができるが、大
動物では栄養障害に陥りやすく、又、二次感染を受けて
死亡する（昭和６３年に養賢堂から発行された、中村良
−等著「新編獣医ハンドブック」の２１３〜２１４頁）
。

慢性関節リュウマチは頑固で難治性の全身性疾患なので
、日常生活、社会生活を維持させるような適切な治療を
長期にわたって行う必要がある。

これら慢性関節リュウマチの基礎療法の一つとして薬物
療法はかなり大きな範囲を占めており、アスピリン、非
ステロイド抗炎症剤、副腎皮質ステロイド剤等が使用さ
れている。中でも非ステロイド抗炎症剤の使用が最も多
い。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、従来の薬剤は全て副作用が問題であり、投与に
細心の注意が必要とされている。（■金属出版発行、伊
丹康人等編、整形外科ＭＯＯＫ１１Ｊｏ、３７　ｒ慢性
関節リュウマテの治療」、５〜１９頁、１９８４年）。

かかる現状に鑑み、本発明は、抗リュウマチ効果が高く
て副作用が少なく、従って化学療法係数が高く、かつ、
生産コストが低く、しかも、経口、経皮、注射での投与
が可能な、大量に供給可能な新規な抗リュウマチ剤、動
物用抗リュウマチ剤を提供するために完成されたもので
ある。

［課題を解決するための手段］ 本発明により、ＬＰＳを含む抗リュウマチ剤、動物用抗
リュウマチ剤が提供される。この抗リュウマチ剤、動物
用抗リュウマチ剤には、インビトロで培養されるマクロ
ファージのＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロフ
ァージ活性化能を指標とし、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％
、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大かつ一定のｆｌ
ｌ（本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」と称
す）にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１０
０％とするマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸
に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対
数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ５ｓを与えるリムラステ
スト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜ｂ含まれる。

ここて「少なくとも１種を含む」とは、本発明のＬＰＳ
は各別に使用できることはもちろん、その意図される用
途が阻害されない限り、それらの２種以上を任意に朝み
合わせて、又、更には他のいずれの物質とも朝み合わせ
て使用できることを意味する。

「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一種であり、動
物体内のほとんと全ての組織に分布し、粒子状の異物や
体内の老廃細胞などを捕食して消化する大型のアメーバ
状細胞の総称である。「ＴＮＦＪは、マクロファージに
より産生される腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ）の総称であり［１９８５年に発
行された　ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミ
ストリー（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　、２６０．２３４５〜２３５４頁コ、マ
クロファージの活性が高まるにつれてその産生量は増し
ていく。

「リムラステスト」は、１９６８年にレヴイン（Ｌｅｖ
ｊｎ）により創案された、カブトガニ血球抽出液と発色
合成基質を用いたエンドトキシン定量法である。

本発明の抗リュウマチ剤、動物用抗リュウマチ剤の活性
成分として使用できるＬＰＳは、特にその採取源、生産
方法、精製方法を限定されることはない０例えば、細菌
や植物から採取されるＬＰＳであっても、或は合成リピ
ドＡのような合成品であってもよい。なお、本明細書、
特にその特許請求の範囲において、採取源は特に名称で
特定されたそのものに限定されることなく、その採取源
の成長、保存、流通の過程で付着、共存する細菌その他
の全てのものが含まれる９例えば、「小麦ＬＰＳＪと特
定された場合には、小麦そのものから採取されたＬＰＳ
のみならず、小麦の成長、保存、流通の過程で付着、共
存する細菌その他の全てのものが含まれるものと理解さ
れたい。なぜならば、特に寄生植物、寄生動物という関
係が解明されているもの以外にも、特定の植物、動物、
菌界生物、地衣界生物に、それらにより付着、共存を許
されたものが棲息している例が多く存在し得ることは当
業界で良く知られていることであるからである。

これらＬＰＳのうちから、本発明の抗リュウマチ剤、動
物用抗リュウマチ剤の活性成分として使用できるＬＰＳ
を選択するには、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％
、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時の
ＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマク
ロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰＳ
のリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシグ
モイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤｓｓを与えるリムラステ
スト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍ
ｌであるものを選択すればよい。

リムラステスト陽性細菌源ＬＰＳ 従来より知られている大腸菌ＬＰＳ、百日咳菌ＬＰＳ、
リピドへ等が該当する。

大１１１１ｉＬＰＳは、例えば、米国デイフコ（Ｄ−ｉ
ｆｃｏ）社から市販されている。

百日咳１ｉＬＰＳは、例えば、フナコシ薬品から市販さ
れている。又、公知の百日咳菌、例えば、東浜株■相菌
の死菌体から、例えば、下記文献記載の公知方法により
調製することもてきる。

ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）等著の「ジエイ、イミ
ュノル（Ｊ、ｆｍｍｕｎｏ　１．）　、７４４．５５　
（１９５５）： ウエストファル（Ｗｅ−ｓｔｐｈａｌ）等著の「ツエト
、ナツールフォルシュ（Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）
」、７６．１４Ｂ　（１９５２）。

リピドＡは、例えば、第一化学薬品から市販されている
。

リムラステスト陽性植物ｔＴｊＬＰｓ 原料植物として使用できるものを下記に例示する。なお
、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、次
の文献の記載を照合して決定された。

裸子捕物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類：昭
和５７年（正＆Ｉ）、昭和５８年（続誓）に北隆館から
発行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所
属を決定した。但し、「燕麦」は、昭和４５年に女子栄
養大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和
５８年に至文京から発行された「新日本植物誌顕花篇」
の記載を照合し、「７ｘ麦」は、昭和４６年に東京同文
書院から発行されたｒ総合食品事典Ｊの記載を照合し、
「鳩麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウ
コン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダミ
」、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウィキョウ」、
「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾウ」、「オ
タネニンジン」、「ボウフウＪ、「オオッヅラフジＪ、
「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和６３年に北隆館から
発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合し
、「アボガド」は、昭和５３年に財団法人農林統計協会
から発行された熱帯農業技術叢書第１５号「ブラジルの
果実」の記載を照合し、「カイワレダイコン」は、昭和
５９年に北隆館から発行された「原色園芸植物大図鑑」
の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和４４年に履用書
店から発行された「図説熱帯植物集成」の記載を照合し
、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品協会が昭和６
１年に公示した、「クロレラ規格基準」の記載を照合し
て所属を決定した。

ｉＩＩ類：昭和６２年に保育社から発行された「原色日
本新菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し
、酵母は、昭和３７年に技報堂から発行された「微生物
学ハンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前
掲の「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。

本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。

裸子植物としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマ
ツを使用できる。

単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属植物であ
るイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ科オオム
ギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属植物であ
る１麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクサ笹、イネ科
ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤメ属植物で
あるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニク、ユリ科
キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ科ジャノヒ
ゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショウガ属植物
であるミョウガ、ショウガ科つコン属植物であるウコン
、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシャクを使用
できる。

双子葉類植物としては、マメ科ダイズ属植物である大豆
、マメ科インゲンマメ属植物である小豆、マメ科ソラマ
メ属植物であるそら豆、マメ科クズ属植物であるクズ、
マメ科カンゾウ属植物であるナンキンカンゾウ、ナス科
ナス属植物であるジャガイモ、トウガラシ、ナス科トマ
ト属植物であるトマト、ナス科トウガラシ属植物である
トウガラシ、バラ科ビワ属植物であるビワ、バラ科サク
ラ属植物であるモモ、クスノキ科アボガドｌｌｌ１Ｍ物
であるアボカド、クルミ科りルミ属植物であるクルミ、
ウリ科トウナス属植物であるカポチャ、ウリ科アマチャ
ヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ科ダイコン属
植物であるカイワレダイコン、マタタビ科マタタビ属植
物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属植物であるド
クダミ、コシヨウ科コシヨウ属植物である胡櫂、シキミ
科シキミ属植物であるダイウィキョウ、ニクズク科ニク
ズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカン属植物であ
るダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植物であるオタ
ネニンジン、セリ科サポシュニコビア属植物であるボウ
フウ、ツヅラフジ科オオッヅラフジ属植物であるオオツ
ヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であるウンカリア
・ヒルスタを使用できる。

シダ植物としては、例えば、トクサ科トクサ属植物であ
るスギナ、ゼンマイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを
使用できる。

ソウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ
ＢＭ物、緑ソウ類槌物、ランソウ類植物を使用できる。

カンゾウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植
物であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、
ホンダワラ科ヒジキ属植物であるヒシキを使用できる。

紅ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ
属植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物
としては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物で
あるクロレラを使用できる。

菌類植物としては、例えば、担子菌類植物、子ノウ菌類
植物を使用できる。担子菌類植物としては、例えば、ヒ
ラタケ科マツオウジ属植物である椎茸、キシメジ科エノ
キタケ属植物であるＬツキ茸、キシメジ科シメジ属植物
であるシメン、タコウキン科マイタケ属植物であるマイ
茸、サルノコシカケ科ポリポラス属植物であるアワビ茸
、ハラタケ科ハラタケ属植物であるマツシュルーム、キ
クラゲ科キクラゲ属植物であるキクラゲ、モエギタケ科
スギタケ属植物であるナメコを使用できる。

子ノウ菌類植物としては、例えば、エンドミセタセア科
サッカロミセス属植物属植物であるパン酵母、醸造用酵
母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵母、清ｎ酵母
、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の他、サッカロミ
セス属植物　セレヴイシトに属する多くの酵母（例えば
、ウィスキーや老酒の製造に使用される酵母）が含まれ
る。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物である冬虫夏
草も使用できる。

以上に述べた原料植物中のリムラステスト陽性ＬＰＳの
検出、含量測定は、例えば、生化学工業株式会社からト
キシカラーシステムという名称で市販されているに薬セ
ットを使用して実施できる。

即ち、原料植物を同システムのＬＳ−１セツトと合わせ
て発色させ、その発色の強さを、同じく同セットのＥ　
ｔ−２セツトを使用して作成した検量線と対比させれば
よい。

植物ｆｆＬＰｓは、以下に述べる方法で分離、精製でき
る。

■原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した後
に蒸留水によく懸濁し、上溝を回収する。

例えば、原料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつ
けたまま、或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は
、食用に供せられている程度の粉末になるまで粉砕し、
得られた粉末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈
降物を静置又は遠心分離により除去するか、粉末に水を
加えて練って得られるトウをミキサー中でゆるやかに水
洗し、沈降物を除去すればよい。

原料植物がクロレラである場合には、まず細胞膜を破砕
し、エタノール洗浄により脂溶性物質を除去した後に水
抽出するとよい。

この水抽出の際の原料植物の粒度、水の温度、液性、添
加量、攪拌の速度、時間、遠心分離の際の条件等は特に
制限する必要はなく、原料植物の種類に応じて適宜調整
すればよい。又、抽出水の温度は高い方がＬＰＳの採取
量、純度ともに高い傾向があるが、操作の便宜上、原料
植物に含まれる澱粉の糊化を招来しない５０℃以下とす
ることが好ましい。又、水の添加量は、原料Ｍγグの種
類、粒度により異なるが、穀類種子の場合にはその割合
が７０　ｗ　／　ｖ％以下、望ましくは２０−・５０ｗ
／Ｖ％程度とすると操作上１宜である。更に、攪拌の速
度は、起泡を引き起こさない程度のものとすることが好
ましい、なお、この段階の操作迄で、本発明のリムラス
テスト陽性Ｍ物ＬＰＳの純度は、リムラステスト活性デ
ータから判断して、例えば小麦種子の場合には約３０倍
に上昇する。

以下、穀類種子を原料として使用する場合を例にとり説
明するが、いわゆる当業者であれば、以下の記載を舎考
にして、他植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリム
ラステスト陽性ＬＰＳを高純度で回収する方法を実施す
ることは極めて容易である。

■純度を更に上げるためには、上記■で得られた上溝を
常法に従って限外濾過に付して分子量５０００以下の両
分を除去すればよい。

■得られた乾燥品を、５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ＳＬにな
るように蒸留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を
回収する。

■この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にすると
沈殿が生しる。この際使用する酸は特定のものである詑
・要はなく、例えば、トリクロロ酢＃１（以下、ＴＣＡ
と称す）、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、ＦＩＲ、ジク
ロロ酢酸を使用できる。

■次いて、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留水
で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収する。

■沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカリ
を加える。この際使用するアルカリも特定のものである
必要はなく、例えば水酸イヒナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムを使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がｐＨ１１より大きく
なると目的のＬＰＳが失活するので注意が必要である。

■次いで酸を加えてｐＨ８とじてから３７℃に加温し、
更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、３７℃
に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付す。

なお、この際使用する酸も特定のものである必要はない
。

■上清を回収して水冷し、４℃て再び遠心分離操作に付
す゛ ■上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に従
って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも特
定のものである必要はない。

［相］次いて常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾適用の担体と
しては、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−７５、Ｇ−１００゜セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）Ｓ−２００、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
６Ｂ　［以上は米国ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａＩｎｃ、）製］、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ−１
００［米国バイオラッド（ＢｉｏｒａｄＩｎｃ、）社製
］、トーヨーパールＨＷ　−５０、ＨＷ−５５（東洋曹
達工業社製）を使用できる。

緩衝液はｐＨ３〜１０のものならいずれでもよい。

例えば、トリス−ＨＣｔ又はリン酸緩衝液を使用できる
。

０次いてこの両分に蛋白分解酵素を加え、３７℃で２時
間以上インキユヘーションして残存蛋白質を分解し、得
られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により濃縮す
る。なお、この際ζこ使用する蛋白分解酵素も特定なも
のである必要はなく、例えば、ｖ８プロテアーゼ、キモ
トリプシン、トリプシン、サーモライシンを単独で、或
は任意に組み合わせて使用できる。市販品としては、例
えば、プロナーゼＥ（科研化学社）、プロティネースＫ
（メルク社）を使用できる。

＠次いてこの画分を常法に従って、例えば、米国ファル
マシア社製のＦＰＬＣシステムでファルマシア社製のモ
ノＱ−セファ０−ス（Ｓｅｐｈ−ａｒｏｓｅ）、Ｑ−セ
ファロース（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ−ｒｏｓｅ）を使用し
て陰イオン交換クロマトグラフィーに付してリムラステ
スト陽性画分を得る。

＠次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付して
リムラステスト陽性画分を回収する。

以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約２０％が回収され、純度約９５％の精製標品
が得られる。又、段階■終了時の純度に比へ約１０００
倍の純度（小麦種子の場合）になる。

以上の方法によって得られたリムラステスト陽性植物Ｌ
ＰＳはそのまま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供
できる。又、保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾
燥なとの任意の手段により乾燥粉末として提供すること
もできる。これらはいずれも常法で生産できる。

動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（ブ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）
らにより、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカ
デミ−サイエンスオブ　ニーニスニー［Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　］、ＵＳＡ、、７２．３６６６〜３６
７０頁（１９７５年）］に報告されている。

ブライミング段階開始のために投与される薬剤が「ブラ
イマー」　（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガ
リング段階開始のために投与される薬剤が「トリカー」
　（内因性ＴＮＦ産生剤）である。

ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮＦ産生能を活
性化する能力を測定するには、マウスのマクロファージ
腹腔常在細胞を採取し、これにブライマーとしての朝み
換えマウスＩ　Ｆ　Ｎ　−ｒを添加し、次いて、トリガ
ーとしてのＬＰＳｆｅ添加し、そのＴＮＦ活性を測定す
ればよい。

ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞［プロシーディング　オ
ブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニ
スニー　７２、３６６６〜３６７０頁コに対する細胞毒
性を基にして、次のようにして測定する。

Ｌ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清を加えたイーグルミ
ニマムエツセンシャル培地（以下、ＭＥＭ培地と表す）
で育成し、８ＸＩＯＪ個の細胞が１００μ交の同上培地
に含まれる様にし、９６大の平底プレートで育種する。

育種条件は３７℃、２時閏、５％ＣＯ２，１００％Ｈ２
０であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。そ
の後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ／ｍ
λとなるように加え、培’ｌ液の液量を１５０μ９とす
る。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを
５０μ免加える（この際稀釈率を適宜調製し、ＥＤ５ａ
を求める事ができる）、更ζこ、最終液量２００μ免と
なったし９２９細胞を上記条件で１８時間培養する。

細胞障害活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いで０．１％クリススタバイオレ・ントを含む１％メチ
ルアルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバ
イオレットは全有核細胞を染色するが、死細胞は染色後
にプレート底面より水洗で除去されるので、生存細胞の
結果から細胞障害活性を直接測定できる。この染色度を
ＯＤ　５９１１１１１１での吸光度を指標として測定し
、対照群に対する染色度と比較する事で細胞障害活性を
測定する。活性の定義は次の様に行う。

Ｌ９２９細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を
求める。対照としてウサギＴＮＳ　［腫瘍障害血清（Ｔ
ｕｍｏｒ　　ＮｅｃｒｏｓｉｓＳｅｒｕｍ）］を使用し
、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍ９）を２ ４Ｘ１０６単位／　ｍ　ｇ　／ ｍ　ＬｃＤ　Ｔ　Ｎ　Ｆ−αを用いて決定する。このウ
サギＴＮＳのＥＤｓ＠を与える稀釈率（Ｃ）を求める。

検体活性（単位／　ｍ　ｌ）は　−×　ｎ　て計算する
。

提供できる剤の製造方法 本発明の抗リュウマチ剤は、常法の製剤技術により、散
剤、顆粒剤、火剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液
剤、貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、串
刺、注射剤等の形態て提供てきる。又、動物用としては
、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加剤と
して調製することもてきる。飼料添加剤とする場合には
、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミック
ス製剤とは、飼料との混合を容易にするために澱粉なと
の飼料成分で希釈されたものを指す。本発明の抗リュウ
マチ剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加でき
る飼料は市販されている飼料のいずれでもよい、又、ミ
ネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料
であってもよい。

これら製剤には、所望ならば、保存性、均質性を保持す
るために、常法により、賦形剤、保存剤、緩衝剤等の添
加剤を加えることもてきる。更に、矯味剤、矯臭剤、着
色剤を含めることもてきる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンを使用できる
。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル
、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロ
ピル等のパラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸
ナトリウム、フェノール、メチルパラヘン、エチルパラ
ベン、プロピルパラベン等を使用できる。緩衝剤として
は、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用で
きる。

以下、製造例、実施例、実験例により本発明を例示する
。

製造例１（小麦ＬＰＳの製造） ■小型ニーダに、１．０９％の灰分を含む硬質小麦粉（
アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング）（３
，１２０ｇ）を入れ、２．０３２の蒸留水を加えて１０
分間練ってトウとした。１５分間の静置後に１０１の水
を加えてゆるやかに攪拌してデンプン乳液を洗い出し、
同時に可溶性成分を溶出させた。この溶出液を５℃の冷
蔵庫中で１２時間静置した後、デンプン等の沈降部を除
去した。上澄み液を凍結乾燥して２０１．１ｇの粉末を
得た（粉末Ａ）。

更に、残留トウに５２の蒸留水を加えてゆるやかに攪拌
し、以下、上記と同様に処理して４０゜１ｇの粉末を得
た（粉末日）。

■これら粉末Ａ、Ｂを米国アミコン社製限外濾過機ＨＦ
−Ｌａｂｌに供し、分子量画分５，０００については中
空系カートリッジＨＦ−ＬａｂｌＰＭ５を、分子量画分
１０，０００については中空系カートリッジＨＦ−Ｌａ
ｂｌＰＭｌｏを取り付けて限外濾過を行った［温度５〜
１０℃。入圧２５ｐｓ　ｉ　　（１，７６ｋｇ／ｃｍ２
）、比圧１５ｐｓ’ｉ　（１，０６ｋｇ／ｃｍ２）］　
、その結果に基づき、各部分を次のように命名した。

粉末Ａ２分子量５，０００以下の部分をａ分子量５．ｏ
ｏｏ以上の部分をａ２ 粉末Ｂ：分子量５，０００以下の部分をｂ＋分子量５，
０００以上の部分をｂ２ 粉末Ａ：分子量１０，０００以下の部分をａ３分子量１
０，０００以上の部分をａ１ 粉末Ｂ：分子量１０，０００以下の部分をｂ３分子量１
０，０００以上の部分をす。

これら各画分を後記実験例１に詳述する方法に準拠して
リムラステストに付したら、分子量５゜０００以上の画
分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、分
子量５，０００以下の画分にはほとんど存在しないこと
が確認された。

■上記粉末ａ２の３０ｇをＩＱ、三角フラスコに入れ、
６００ｍλの蒸留水を注いで、６０分間スターラーで攪
拌した後、日立冷却高速遠心機５ＣＲ−２０Ｂ　（ロー
ターＲＰＲ１６を事前に４℃に冷却しておいた）で４℃
で遠心分離操作（１０，０００ｇＸ１０分）に付して上
清を回収した。

■この上清を１９三角フラスコに入れ、水冷下（液温約
２℃）、スターターで攪拌しながら、事前に２℃に冷却
してあった１００％ＴＣＡ水溶液２０．５ｍ＋１を滴下
し、滴下終了後氷水中に１０分閉放置した。

■次いて前記と同様にして４℃で遠心分離操作（１０，
０００ｇＸ１０分）に付して沈殿を回収し、氷水中で冷
却下、１００　ｍ　ｌの蒸留水と共に５００ｍλのビー
カーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にし
て４℃で遠心分離操作（１０，０００ｇＸ１０分）に付
して沈殿を回収した。

■この沈殿をｉｔヒビ−−に入れ、蒸留水５００　ｍ　
ｌで懸濁し、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液約３゜５ｍλを
使用して中和（ｐＨ７）Ｌ／、ついて、氷水中で冷却し
ながら、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液約２ｍ１Ｌを添加し
て０．０２Ｎ水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈
殿を溶解した。

■ＩＮ塩酸約１．５ｍ１Ｌを加えてｐＨ８とし、次いて
１００ｍ１の蒸留水を加えた後に１２三角フラスコに移
して３７℃のインキュヘーター内て３０分間ゆっくり振
盪した。

■１００％ＴＣＡ水ｉＭ３０ｍａを加えて混合した後、
３７℃のインキュヘーター内で１０分間ゆっくり振盪し
てから、約３７℃に保温した遠心分離器トミーＣＤ１０
０Ｒ（）ミー精器社製）を使用して遠心分離操作（３，
０００ｇＸ１０分）に付した。

■上清を回収して水冷し、４℃で遠心分離操作（１０，
０００ｇＸＩＯ分）に付した。

［相］上清を回収してＩＯＮ水酸化ナトリウム溶液約３
．６ｍ１Ｌで中和してｐＨ７とし、限外濾過器（東洋濾
紙ＵＨＰ−１５０、フィルター：　ＵＫ−１０、Ｎ２圧
：４．０ｋｇ／ｃｍ２）で濃縮し・た。

■得られた濃縮ｆ１６０ｍｌ＋Ｅ、セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム［米国ファルマシア社（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　　Ｉｎｃ、）製・カラムサイズ：５
ｃｍ（内径）Ｘ１００ｃｍ（２１Ｌ）］を使い、ゲル濾
過［緩衝液：　１０ｍＭトリス−ＨＣ１Ｌ／　１０　ｍ
　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＩＬ　（ｐＨ７、５）、流速：６０ｍ
１／時コに付して、各２０　ｍ　Ｑの両分を得た。

■初めから４３番目から５６番目迄の両分２８０ｍλを
併せ、ブロナーセＥ（科研化学社）４５０μｇを加え、
振盪下、３７℃に２時間保温した後に、限外濾過器（東
洋濾紙ＵＨＰ−６２、フィルター：　Ｕ　Ｋ　−１０、
Ｎ２圧：４．０ｋｇ／ｃｍ２）で濃縮した。次いて、フ
ァルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラム：モノＱＨＲ
ＩＯ／１０）を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、１０ｍＭ）リス−ＨＣＱ［ｐＨ７゜５
）と１０ｍＭのＮａＣａを含む緩衝液で試料をカラムに
付した後、上記緩衝液でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増加
された組成を持つ緩衝液（２００ｍｆＬ）てカラムを洗
った。次いて、Ｎ　ａ　ＣＬｍ１度を、１６５ｍＭから
ＩＭのＮ　ａ　Ｃ１ｍ度勾配になるように増加させなが
ら全量４００ｍ１で目的ＬＰＳを溶出させ、各２ｍλの
両分を回収した。リムラステスト陽性が確認された、濃
度勾配をかけてから５〜８番目の画分を併せて“、ＬＰ
Ｓ純度約９２％の８ｍｌ［ＬＰＳ　：　３．０３ｍｇ　
（リムラステストによる大＠＠Ｌ　Ｐ　Ｓ換算値である
。以下のＬＰＳ量も全てこの換算値である）、糖：０．
２３　ｍ　ｇ、蛋白：０．０４ｍｇ）を回収した。

■次いでその８ｒｎｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．Ｏｃｍ（内径）Ｘ２０
．２ｃｍ　（６６ｍｌＬ）］を使ってゲル縮退（緩衝液
：水）に付して各３ｍλの両分を回収した。リムラステ
スト陽性の確認された第９〜１２番目の両分を併せて、
ＬＰＳ純度約９５％の１２ｍ１Ｌ（ＬＰＳ　：　２．７
ｍｇ、糖：０゜１８ｍｇ、蛋白：０．０３ｍｇ）を回収
した。糖はフェノール−硫酸法で、蛋白はローリ−法で
測定した。なお、この両分は、陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより酸性であることを確認した。

又、ＳＤＳゲル電気泳動法による分子量は６，０００〜
１０，０００だ）た。

［株］上記画分を一８０℃で凍結後に恒量になるまで凍
結乾燥し、重量を測定したら０．７５ｍｇあった。（以
下、この凍結乾燥標品を小麦ＬＰＳと称す） この小麦ＬＰＳのリムラス活性を後記実験例１記載の方
法で測定したら２．７ｍｇに相当するので、その比活性
は ２．７÷０．７５＝３．６ になる。

また、夾雑物として存在し得る単独の糖は、以上の精製
により実質下金て除去されたと考えられるので、検出さ
れた糖は全て、小麦ＬＰＳを構成している糖と考えられ
る。従って、この段階での小麦ＬＰＳの純度を重量に基
づいて計算すると、蛋白＝０．０３ｍｇ ＬＰＳ量０．　７５−０．　０３＝０．　７２ｍｇだか
ら、 ０．７２÷０．７５Ｘ１００＝９６　（％）である。

小麦ＬＰＳの物性 ■分子量 小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍ５１溶液を調
製し、そのト１を１．５ｍλのトレフチューブに入れた
。これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤＳ、
５％メルカプトエタノール、１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ
８，０）を加えて調製したＳＯ５処理液１μ（を加え、
この混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマシア社製の
ファストシステム（Ｐｈａｓｔ　　Ｓｙｓｔｅｍ）を使
用し、電極との間に５ＤＳ−バッファー　ストリップ（
Ｂｕｆｆｅｒ　　５ｔｒｉｐ）（ファルマシア社製ンが
介在せられた］μλの上記混液をゲル［ファルマシア社
製のファスト　ゲル　グラデイエン）（Ｐｂａｓｔ　　
　　Ｇｅｌ　　　　　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　　　　８−２
５）に塗付し、最大電圧２５０ｖ、最大電流１０ｍＡＥ
Ｚセットして泳動を開始させた。泳動終了後、クマシー
染色と銀染色における挙動を社察した。

クマシー染色では、染色液としてファルマシア製の０．
１％ファスト　ゲル　ブルー　（Ｐｈ−ａｓｔ　　Ｇｅ
ｌ　　Ｂｌｕｅ）　　Ｒを、脱色液として、メタノール
：酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使用し、次
の順序で染色・脱色を行った。

１）５０℃で日分間染色 ２）５０℃で５分間脱色 ３）５０℃で８分間染色 ４）５０℃でｌＯ分閉放色 ５）５０℃で５分間保護（グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比５：１０：８５混液） ６）乾燥 銀染色は、次の順序で行った。

１）５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：Ｉ：４混液）で処理２）５０℃で２分間
、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理３）５０℃で４分間、洗浄液（エタ
ノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５：８５混液）で処
理４〕５０℃で６分間、増感液（８，３％グルタルジア
ルデヒド）で処理 ５）５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水
の容量比１０：５：８５混液）て処理６）５０℃で５分
間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理７）５０℃で２分間、洗浄液（脱イ
オン水）で処理 ８〕５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ９）４０℃で１３３分間０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理 １０１３０℃で３０秒間、洗浄？＆（脱イオン水）で処
理 １１１３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２１３０℃で３０秒間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液
）で処理 １３１３０℃で４分間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５　ｗ　／　ｖ％炭酸ナトリウム洗
浄液）で処理 １４１５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ／ｖ％酢酸
）で処理 ＋５１５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 １６）乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量８，００
０±１，０００の位置に小麦ＬＰＳの主要染色帯が検出
された。

［相］リン含有量 チェンートリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｊｂａ　−ｒａ）
法［チェン等著、「アナリティ力ル　ケミストリ（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ−ｔ　ｒｙ）　、ｖｏ　
１．２Ｂ、１７５６〜１７５Ｂ頁（１９５６年）に準拠
して次の通りに行った。

小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して、２５μｇの小麦ＬＰＳ
を含む２０ｔｔｆＬの溶液を調製し、小試験管に入れた
。２０μ艷の５０　ｖ　／　ｖ％硫酸を添加し、１６０
℃で２時間加熱した。次いて、２０μ気の１０　ｖ　／
　ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分前加
熱して灰化させた。その後に０゜５　ｍ　ｌの蒸留水、
次いで０．５ｍｆＬの反応試薬（１ｍａの６Ｎ硫酸、２
ｍ−蒸留水、２ｍ１Ｌの２，５Ｖ／Ｗ％モリブデン酸ア
ンモニウム及び１ｍ１ｌｋの１０ｖ／ｗ％のアスコルビ
ン酸を混合して調製し、その０．５ｍλを使用）を添加
して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの吸光
度り０Ｄ８２１Ｉｎ、）を測定した。なお、検量線作製
用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬社
＆りを蒸留水で希釈し、リン重量としてそれぞれ２．６
μｇ、１μｇ、ｏ、　２ｓｕ−ｇ、０μｇを含む０．５
ｍ１Ｌの溶液をｗＲ製して使用した。なお、リンＩｇは
リン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。得られた
結果を次表１に示す。

表　　１ 注：小麦ＬＰＳのデータは、憲機リンの混入（例えば、
リンｖｉ緩衝液に由来する）による誤差を避けるために
、加熱処理をしていない対照のデータを減した値である
。

小麦ＬＰＳの分子量を８，０００と仮定し、上表の結果
に基づいてその１分子当たりのリン数を次式により計算
すると１〜４になる。

２５ＸｌＯ−３２ 上記実験で１ルン数が１〜４と変動している原因の１つ
としては、精製段階でのモノフォスフオニステラーゼの
混入により、リン酸が脱離したことも考えられる。

０ヘキソサミン含有量 エルソンーモルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍａｒ　−ｇａｎ）
法（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ、４の３
７７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。

小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１　ｍ　ｇ　／　ｍ艷の
溶液を調製し、その１００μ交をスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μ艷の８ＮＨＣａを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｉ添加してｐＨ７とした
。その１００μλを分取し、別のスクリューキャップ付
きスピッツに入れ、２００μ化の下記試１ｉＡを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いて流水で冷却
した。次いて、１００μλを分取し、６７０μ鼠の９６
％エタノールを加え、更二こ、６７μ地の下記試薬Ｂを
加えた後に室温で１時間放置し、５３５μｍて吸光度を
測定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００
μｇ／ｍｌＬのＮ−アセチル　グルコサミン（和光純薬
社Ｉりを使用した。

（試薬Ａ）７５μｔのアセチルアセトンと２．５ｍλの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混 合して調製。

（試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルヘンズアルデヒトと
３０　ｍ　ｆＬの濃塩酸と３０ｍＡの９６％エタノール
を混合してＦＡＩ！。

結果、小麦ＬＰＳのへキソサミン数は６±２７分子（仮
定分子量８，０００）だった。

０脂肪酸含有量 ９０μ見の小麦ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍｇ／ｍ１Ｌ）に
１０μ化の内部標準（０，５５ｍＭのマルガリン酸）を
加えた。１．０ｍｌの０．５Ｍナトリウムメチラートを
加えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った
。室温で１時間放置後に９６０μ（の０．５ＮＨＣ＋Ｌ
を加えて中和した。

これに２　ｍ　ｌのヘキサンを加えて１５分間激しく攪
拌した。次いて、１，０００ｇで５分間遠心分離を行い
ヘキサン層を分取した。窒素ガスてヘキサンを蒸発させ
て、約２０μ鱈こなるまで濃縮した。

このサンプルをガスクロマトグラフィー［本体：島津社
製のＧＣ８ＡＰＦ、キャピラリーカラム：カナダのスペ
ルコ（Ｓｐｅｌｃｏ）社製ＦＳＣＡＰ　　５ｐ２３３０
、キャリヤーガス：Ｕ素］に付して脂肪酸量を測定した
。脂肪酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合
成リピドＡである大腸菌型ＬＡ−１５−ＰＰ　（分子量
２，０００で、１分子中の脂肪酸数は６であることが知
られている）を用いた。

結果、小麦ＬＰＳの脂肪酸数は６±２７分子（仮定分子
量８，０００）であると推定された。

上記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添
付図面第１〜３図に示す。第１図は小麦ＬＰＳの、第２
図は大腸菌ＬＰＳの、第３図は百日咳菌ＬＰＳのチャー
トである。

第１〜３図において、図示されている主要ビク番号に対
応する保持時間（分）は次の通りであった。

第１図：　ビーク番号　　保持時間（分）１　　　　　
　　２．４５０ ２　　　　　　２．７５８ 第２図：　ビーク番号　　　保持時間（分）１　　　　
　　　　　　　　　　２．４１７２　　　　　　　　　
　　　　　２、　７４２第３図：　ビーク番号　　保持
時間（分〕１　　　　　　　　　　　　　　２、　４３
３２　　　　　　　　　　　　　　３、　０２８第１〜
３図の比較により、小麦ＬＰＳのチャートは大腸菌ＬＰ
Ｓのチャートに似ているが、百日咳菌ＬＰＳのものとは
大きく異なることは明白である。

＠ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ　アール（Ｓｈａｂｙ　
　Ｒ，）等著、アナリティ力ルバイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ　−ｃｈｅｍ、）、５Ｂ（１）、
１２３〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通り
に行った。

５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍ鼠のエタノール、
４５℃艷の氷酢酸、５０ｍ１の濃塩酸（全て和光純薬社
１１）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５０
０　ＩＪＥＬｔこ、１．０５ｍｇ／ｍｔの小麦ＬＰＳを
含む蒸留水２５０μ（を合わせ、１００℃の沸騰水浴中
で３０分閉放熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却し
、ついて日立分光光度計３２０を使って４２０．４７０
．６３０．６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（それ
ぞれＡＪ２１１、Ａ　４？１１％　Ａ　６３９ｓ　Ａ　
８５９とする）。標準試料としては、１２７μｇ　／　
ｍ　ｆＬのＫＤＯアンモニウム塩［米国シグマ（Ｓ　ｉ
　ｇｍａ）社製］を含む蒸留水２５０μλを使用した。

検体試料、標４試料それぞれについて、次式の値を求め
た。

５＝ＡＪ２１１−Ａａ７１１＋Ａｅ３ｅ−Ａ６５０検体
試料のＩＩＮ（ＳＴ）は０．３７９、標４試料の１Ｉｉ
（Ｓｓ）は０．２９４であった。こノ値ノ比較により、
小麦ＬＰＳには５±１モル／分子量８千のＫＤＯが含ま
れると推定された。

製造例２（クロレラＬＰＳの製造） ■細胞膜破砕クロレラ（■マンナンツーズ社８１）３０
ｇを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノールで
洗浄した。

■この洗浄残渣２６ｇを１００ｍｇ／ｍｆＬの濃度で蒸
留水に溶かし、４５℃で２時間振盪後に遠心分離操作（
４℃、１０．００θｇＸ３０分）に付した。

■上溝を回収し、東洋濾紙Ｎ０８２で濾過し、次いて蒸
留水で抽出した。

■抽出液２９０ｍｍを下記条件で陰イオン交換クロマト
グラフィーに付した。

カラム：Ｑ−セファロース（φ３　ｃ　ｍ　Ｘ　２３ｃ
ｍ、容量的１８０ｍ１） 緩衝剤：１０ｍＭ）リス−ＩＣＩＬ（ｐ）（７，５）、
Ｎ　ａ　ＣＩＬｓ度勾配：１０ｍＭ、４００ｍＭ、１Ｍ 流速：１００〜２００ｍｎ１時 温度：室温 ■素通りした画分３１０ｍλをグルコアミラーゼで処理
して澱粉を分解した（ｐＨ５，０，４０℃、約２時間）
。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生しないこと
により確認した。

■遠心分離（１０，０００ｇＸ１０分）に付して上溝を
回収し、１０ＮＮａＯＨ溶液で中和してｐＨ７とし、分
子量２０万カツトのポアサイズを有するウルトラフィル
ターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を行
った。

■得られた濃縮液３０ｍ１をファルマシア社製ＦＰＬＣ
システム（カラム：モノＱＨＲＩＯ／１０）を使って陰
イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、ＩＯｍ
Ｍ）リスーＨＣ丈と１０ｍＭのＮａＣ化を含む緩衝液（
ｐＨ７，５）で試料をカラムに付した後、上記緩衝液で
ＮａＣ１量が１６５ｍＭに増加された組成をしたＭ（２
００℃免）てカラムを洗った。次いて、目的ＬＰＳを溶
出するため、１６５ｍＭからＩＭのＮ　ａ　Ｃ１１１度
勾配になるようにＮａＣλ濃度を増加させながら全量４
００ｍｔでカラムを洗い、各２ｍ−画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
５〜８番目の両分を併せた。

０次いてその８ｍ１Ｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）Ｘ２０
．２　ｃｍ　（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液
：水ンに１すしで各３　ｍ　ｌの両分を回収した。リム
ラステスト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併
せて１２ｍ１Ｌを回収した（ＬＰＳ　：　１４．３ｍｇ
、糖：２．０ｍｇ、蛋白：０．５３ｍｇ）、ＬＰＳは後
記実験例１記載の方法で、糖はフェノール−ＲＷＩＩ法
で、蛋白はローリ−法で測定した。

■上記画分を一８０℃で凍結後に恒量にな名まで凍結乾
燥し、重量を測定したら５．８ｍｇあった。（以下、こ
の凍結乾燥標品をクロレラＬＰＳと称す） このクロレラＬＰＳのリムラス活性は１４．３ｍｇに相
当するので、その比活性は ｌ　４　、３　÷　５．　８＝２．　５になる。

また、以上のＷ製で、夾雑物として存在し得る単独の糖
は実質下金て除去されたと考えられるので、検出された
糖は全て、クロレラ・ＬＰＳを構成している糖と考えら
れる。従って、この段階でのクロレラＬＰＳの純度を重
量に基づいて計算すると、 蛋白＝０．５３ｍｇ ＬＰＳ＝５．８−０．５３＝５．２７ｍｇだから、 ５．２７÷５．８Ｘ１００＝９１　（％）である。

クロレラＬＰＳの物性 製造例１に記載の方法と同様にして、次の値が得られた
。

分子量＝４０，０００〜９０，０００ リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±ｌ／分刊１万 脂肪酸数＝６±ｌ／分千量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万 製造例３（百日咳菌ＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から人手した試験用百日咳菌液（２，
ＯＸ　１０１”　！Ｉ胞／　ｍ　ＩＬ）を死菌体として
用いた。

上記死菌体を２５ｍｇ　（乾燥重量）　／ｍｆＬとなる
ように滅菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノ
ール液（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪
しながら抽出した。８，０００ｇ、４℃で２０分間遠心
分離して水層を分安し・た。残りのフェノール層に、上
記水層と等量のＷ＆菌水を加えて同様の抽出を行フた。

得られた水層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後
に、ロータリーエバポレータで１／１０に濃縮した。こ
れを８゜０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清
を分取し、酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エ
タノールを６倍量加えて一２０℃で一晩放置した。４．
００−０ｇ、４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿
物をエタノールで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄
し、アスピレータで乾燥させた。

残さを、２０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌとなるように蒸留水
に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）社製のソ
ニファイア１８５型で超音波処理（出力コントロール５
．１５分、室温）に付した。次いて２゜５００ｇ、４℃
で１０分間遠心分離し、上清を分取した。

この上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核
酸分解酵素ＤＮａｓｅ　　ｌ５ＲｎａｓｅＡて１５〜１
６時間処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓ
ｅ　　　＋　と、２０ｕｇ／ｍｇ、のＲｎａｓｅＡを使
用した）。更に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃
で２時間加温した。次いて２．５００ｇ、４℃で１０分
間遠心分野し、上清を分取した。

この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）社のアクロデ
ィスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使い、孔径０．２μｍで
濾過した。濾液を分子篩にかけ［樹脂：米国ファルマシ
ア（Ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｍ　ｒ・、　ｃ　ｉ　ａ　）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５ｃｍＸ長さ１００ｃｍ、緩衝液＝ＩＯｍＭの
トリス−ＨＣｆＬ、ｌ０ｍＭのＮａｃｌ（ｐＨ７，５）
　、流速＝約３ｍａ／ｃｍ２／時）、生化学工業社製の
ＬＳ−１キツトを用いてリムラス活性陽性画分を調べて
合わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径
０．２１ｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装置
：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）社製Ｆ
ＰＬＣ１樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ　　ＨＲ１
０／１０、緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｕ＋１０ｍ
ＭのＮａＣＱ、（ｐＨ７，５）で１５分洗浄し、次いて
、ＮａＣｌ量を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次
いで、２０分かけて、ＮａＣ１量が１６５ｍＭからＩＭ
の濃度勾配になるようにＮａＣｌ量を増加させながら洗
浄し、次いて、ＩＭのＮａＣｌ量で３０洗浄する、流速
＝　２　ｍ　Ｌ１分フコ生化学工業社製のＬＳ−１キツ
トを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合わせた。

合わせた画分をカラムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製セファデックスＧ−２５
フアイン（ｆｉｎｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍＸ長
ざ２５ｃｍ、溶出液＝蒸留水コ、次いで凍結乾燥した。

この凍結乾燥標品（４，５０ｍｇ）に混入している可能
性の最も高い物質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線
（２００〜４００ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度
を求めた。吸光度１のときの核酸濃度が５０ｕｇ／ｍλ
であることを用いて上記吸光度から核酸濃度を算出した
ら１％以下であった。又、ＳＤＳ電気泳動ては蛋白質は
明確には検出されなかった。従って、検出感度を考慮す
ると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋白質は高々０
〜３％と推定される。従って、上記凍結乾燥標品の純度
は９６％以上と推定された。

Ｉ！造例１に記載の方法と同様にして測定されたこの百
日咳１ｆＬＰｓの物性は次の通りであった。

百日咳菌ＬＰＳの物性 分子ｔ＝６．ｏｏｏ±１．０００． ９．０００±１，０００ （複数観察されたクマシー染色帯のうち、染色強度が最
高の２つの染色帯の値である。） リン数＝５７分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２７分子量８千脂肪酸数＝５７
分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１７分子量８千 なお、製造例１に記載の方法と同様にして測定された大
腸菌ＬＰＳ　［米国デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製０１２
８：Ｂ８：ｌの物性は次の通りであった。

大Ｉｌｌ薗ＬＰＳの物性 分子量＝３０，０００±５，０００ （ＰＪ段状に連続したクマシー染色帯のうち、染色強度
が最高のものの値である。）リン数＝１２７分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万脂肪酸数＝１８
／分子量３万 ＫＤＯ数＝５＋１／分子量３万 以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方例である。な
お、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換
算量である。

実施例２（内用液剤） クロレラＬＰＳ １ｍｇ 精製水 １００ｍ　免 １３例３（軟膏剤） 小麦ＬＰＳ　　　　　　　　　Ｏ，１ｇ精製ラノリン ０ｇ ０００ｇ 実施例４（注射剤） 小麦ＬＰＳ ０．５ｍｇ 実施例１　（錠剤） 小麦ＬＰ５　　　　　　　　０．０４ｇ６％ＲＰＣ乳糖
　　　　　　　１７８ｇステアリン酸タルク　　　　　
　　　８ｇバレイショデンブン　　　　　　１４ｇ以上
を混和し、打錠して、Ｏ，１ｍｇの小麦ＬＰＳを含む０
．５ｇの錠剤４００個を調製した。

合計 １０００ｍ　党 実験例１（リムラステスト陽性植物ＬＰＳの定量）各種
植物に含まれるリムラステスト陽性ＬＰＳの定量を、生
化学工業株式会社のトキシカラーシステムを使って行っ
た。

■９６穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を１
穴当たり１８０μ免入れた。試料２０μ２（試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解してｒ１４Ｉ！シた）を
プレートの穴の１つに加えた。プレートミキサーで攪拌
しながらピペッティングを行って１０倍希釈液を調製し
た。（以後、順次希釈試料を２０μ免ずつとり、同様に
処理することで１００倍、１０００倍、・・・と１０倍
希釈系列液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の
量比を変えることにより希釈率は任意に設定できる。）
■内部標準として１．５μｇ　／　ｍ　Ｑ、の大腸菌Ｌ
ＰＳ溶液のｉｏｏ、ｏｏｏ倍希釈液を調製し、希釈やリ
ムラステスト発色が正常であることを確認した。

■上記■の１０倍希釈液３５μ化を別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラーシステムのＬ
Ｓ−１セツト３５μ良を添加し、３７℃で３０分間放置
した。ついで１０５μｔの１Ｍ酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。

この試料液の波長４１５ｎｍでの吸光度を、９６穴用吸
光度計プレートリーダーＭＴＰ−１００（コロナ！気株
式会社！りで測定した。バックグランドとしては蒸留水
を、検量線作成用としては４２ｐｇ／ｍλの生化学工業
株式会社のトキシカラーシステムのＥＴ−１セツトを使
用して検量線を作成し、この検量線を基準にして各試料
中のリムラステスト陽性ＬＰＳの定量を行った。（試料
が蒸留水である場合の吸光度をＯとした。）なお、この
方法で前記ＬＳ−１セツトを使用した場合にはｌＯ〜４
５　ｐ　ｇ／ｍｌＬの範囲内で発色に定量性があること
が確認されたので、この範囲に入らないときは、希釈率
を変えて再実験した。

希釈試料の定量値は、 （検量線から読み取った値）Ｘ（希釈！＄）で計算した
。

得られた結果を、固体試料の場合にはｎｇ／ｇ単位で、
液体試料の場合にはｎ　ｇ／ｍλ単位で次表１に示す。

なお、表中の試料の欄の会社名、地名等は、当該試料の
入手先、産地をさす。かかる記載がない品はスーパース
トアー忠実屋の神奈川県津久井郡中野町店で購入した品
で、製造者が不明なものを指す。

表　　１ リムラステスト陽性 試Ｎ（固体）　　　　　　ＬＰＳＩ　　（ｎｇ）裸子植
物 松の実（輿南貿易）　　　　　　　　　　１２５単子葉
類 硬質系小麦種子（千葉製粉）　　　　　２，２５０硬質
系小麦種子（千葉製粉） （分子量５０００以上）　　　１，０００．０００硬質
系小麦粉（千葉製粉）　　　　　’　７，５００小麦ふ
すま（千葉製粉ン （分子＠５０００以上ン　　　　　　　　１００小麦胚
芽（千１＃製粉）　　　　　　　　　１，６００小麦胚
芽く千Ｍ製粉） （分子量５０００以上）　　　　　＜１０，０００玄米
　　　　　　　　　　　　　　　　１，１００米粉く日
の本穀粉） （分子量５０００以上）　３ 米ぬか 米ぬか（分子量５０００以上） コーンフラワー（大洋飼料） （分子量５０００以上） コーングリッツ（大洋飼料） （分子ｊ１５０００以上） コーン（和光食糧） クマ笹（開本物産） アヤメ（種子） ニンニク（鱗茎） アスパラガス（芽） ミョウガ（花房） ヨクイニン（ウチダ和漢薬） （原Ｍ物は鳩麦） ハンゲ（松浦薬業） （原植物はカラスビシャク） バクモントウ（栃木犬？ｌＩ室） （原植物はシャツとゲ） １、　０００．　０００ ２９、　０００ ５００、　０００ ＜０．３ １５．０００ ３、　１００ ４、　１００ ４１、　０００ ２、　１００ ５、　５００ ４、　０００ ターメリック（エスピー食品）　　１９５，０００（原
植物はウコン） 双子葉類 大豆（王女食品）　　　　　　　　　　　　１５０大豆
（はぐれん）（分子量５０００以上）４００丹波黒大豆
（和光食糧）８５ 小豆（和光量［）　　　　　　　　　　　　４５０小豆
（和光量＄り （分子量５０００以上）　　３６，０００，０００ひた
し豆（和光食糧）　　　　　　　　　８００大正金時（
和光食糧）　　　　　　　　　　５５０大福豆（和光量
ｆＭ）　　　　　　　　　　３５０そら豆（生）　　　
　　　　　　　　　　７５０ジヤガイモ（はくれん） （分子量５０００以上）　　　　　　　　＜０．３ビワ
（種子）　　　　　　　　　　　　　　８００アボガド
（種子）　　　　　　　　　　　９５０モモ（種子）　
　　　　　　　　　　　　４，５００１．９００ クルミ（種子） ソラ豆（種子） カポチャ（ｆｉ子） トマト（生の実） カイワレダイコン（根を除く） マタタビ（丸久物産） アマチャズル（Ｋ、に、桜井） ドクダミ（ン易潤ｉｉｔ当たり） （帝京大学薬用植物園） 胡櫂（白）（エスピー食品） トウガラシ（興南貿易） 六角（興南貿易） ナツメグ（ライオン） （原植物はニクズク） トウヒ（ウチダ和漢薬） （原植物はダイダイ） カッコン（栃木天海堂） （原植物はクズ） ナンキンカンゾウ（ウチダ和漢薬） オタネニンジン（ウチダ和漢薬） ボウフウ（栃木天海堂） １０、　０００ １０、　５００ ５０、　０００ ４０．０００ ７３、　０００ １．２００ ２、　１００ ２、　１００ ５、　５００ ２、　０００ ８、　０００ ３、　０００ １Ｂ、　　ＣＯＯ ５０、０００ カンボウイ（栃木天満堂）　　　　６００，０００（原
植物はオオツヅラフジ） チョウトウコラ（ウチダ和漢薬）　　　７，０００（原
植物はウンカリア・ヒルスタ） 八味地黄丸（カネボウ薬品）　　　　１７，０００小柴
胡！（ツムラ）　　　　　　　　　１３，０００五苓！
（ツムラ）　　　　　　　　　　１２，０００猪苓湯（
ツムラ’Ｉ　　　　　　　　　　１４，０００十全大補
１１！（ツムラ）　　　　　　　　８，０００八味地黄
丸（ツムラ）　　　　　　　　８，０００ローヤルゼリ
ー　　　　　　　　　　１，０００［ペキン　ローヤル
　ゼリー （Ｐｅｋｉｎ　　Ｒｏｙａｌ　　Ｊｅｌｌｙ）ハチミツ
（加藤美峰園本舗）　　　　　　８００シダ植物 スギナ（湿潤重量当たり）　　　　　　　７００（帝京
大学薬用植物園） ゼンマイ（開本物産）　　　　　　　１０，０００ソウ
類 わかめ（三陸天然品）　　　　　　１１，０００わかめ
芽株く４谷健康食品） ひじき（生） 芽ひしき（小善本店） コブ（ヤマトタカハシ） アサクサノリ（乾燥生ノリ） クロレラ （■ヘルスタージャパンＹＳ） クロレラ （■マンナンフーズＹ５） ■ 椎茸（下仁田産） えのき茸（長野県中懸重） しめしく勢多郡宮城町） まいたけ（大利根） あわび茸（羽生） マツシュルーム きくらげ ナメコ エビオス（アサヒビール社製 ビール酵母） ２００、　０００ Ｂ５．１）００ １０５、　０００ ２　３　　ＦＪ　　、　　０　０　０ １３０、（１００ １、９００，０００ １、０００，０００ １６、０００ ２０、０００ ４０、０００ ２０５、０００ ｓ、　　ｏｏ。

２０、　０００ ７５、　０００ ２１．０００ ２５０、　０００ 冬虫夏草 ２４０．　０００ その他 雪印ナチュレヨーグルト（■１印）　　５，０００グリ
コビフイズスヨーグルト（■グリコ）５０リムラステス
ト陽性 試料（液体） ＬＰＳ量　（ｎｇ） ビール キリン アサヒ ファインビルスナー ラガービール ハートランド ファインドラフト スーパーイースト ワイン １、　１５０ １．２５０ １．５５０ １．４００ サントリー サントネージュ （白） （赤） ジードル（アップル） 日本酒 大間−級 黄桜二級 （大間酒造） （黄桜酒造） ２　、４ １．７ 大寒吟醸二級（玉泉堂酒造） 玄米酒 日々−献〈大間酒造） 薬味酒 陶陶酒デルカップ（陶陶酒本舗） 宝焼耐（宝酒造） その他 キョーレオピン（湧水製薬） ニンニク抽出液（湧水製薬） グロスキュー（クロレラ工業） 大麦健康メツコール（韓国・−和） サクロンハーブ液（エーザイ） ヘチマ水（自家！り パイオアルゲン（クロレラ工業） パンシロン内服液（ロート製薬） ユンケルファンティー（佐ＭＨ薬） コリホグス（小林製薬） ツディ（三共） ミオＤコーワ１００（コーツ） ２、　１ 】　２ １．２ 〈　２　、０ ｓ、　　ｏｏ。

２、　０．）０ １、　０００ ノゲイン（三共）　　　　　　　　　　　　　　９０ブ
レン５０（第−ＩＩＭン　　　　　　　　　７ソルマツ
ク（大ｍｕ薬）　　　　　　　　　　６０−ゼリーゴ〜
ルト（中外製薬）　　　　　　５バスビタン３０（Ｔ、
盤製薬）　　　　　　　　５チオビタ（大ＩＩ！！薬）
　　　　　　　　　　５未満リボビタン（大正製薬）　
　　　　　　　５未満アスパラゴールド（田辺製薬）　
　　　　５未満実験例２（マクロファージのインビトロ
ＴＮＦ産生能を活性化する際のＥＤｓｓを与えるリムラ
ステスト陽性ＬＰＳの含有量が０゜４〜１１００ｎ／培
養液ｍｔであるＬＰＳの選択方法） ９週齢の、平均体重２９ｇの各群３匹のオスのＣ３Ｈ／
Ｈｅマウスのマクロファージ腹腔常在細胞２００μλ（
２Ｘ１０５個）／穴を９６穴の平底プレートに入れ、ブ
ライマーとしての絹換えマウスＩＦＮ−ｒ　（１００単
位／　ｍ　ａ）を甚大に１０μ気宛加えた。別途、各種
ＬＰＳｉｌ！を６５℃の熱水（ｇ／ｍｌ）で５時間抽出
して調製した抽出液を各種希釈し、その１０μ免／穴を
ブライマー投与の３時間後にトリガーとして加えた。２
時間培養後に遠心分１ｗ操作に付した（１０００ｇ、２
０分）。甚大から得られた１３０μ艷の、ＴＮＦ活性は
Ｌ９２９″ｍ胞に対する毒性に基ついて測定し、又、リ
ムラステスト陽性ＬＰＳ含有量は生化学工業株式会社の
トキシカラーシステムを使用して測定した。

測定値を、縦軸にＴＮＦ産生量（単位／培養液ｍ１Ｌ）
を、横軸（対数尺）に対応リムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）を表す座標にプロットし、プ
ロットされた各点から推定されるシグモイド曲線を描い
た。トリガーを投与しなかった場合のＴＮＦ産生量を与
える各トリガーのマクロファージ活性化能を０％とし、
トリガー投与の効果として増大するＴＮＦ産生量が最大
恒量に達したときの各トリガーのマクロファージ活性化
能を１００％とし、その５０％に相当するマクロファー
ジ活性化能を与えるリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を
曲線から読み取った。

マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量との相間間係が上記条件を満たしたＬＰＳ採取源の
結果を次の表２に示す。表中で、「ＴＮＦ」はＴＮＦ産
生量（単位／培養液ｍ１Ｌ）を、「活性化能」はマクロ
ファージ活性化能（％）を、ｒＬＰｓＪはリムラステス
ト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍ１Ｌ）を表す。な
お、トリガー漸添加時のＴＮＦ産生量は０．７５単位／
ｍｌであったので、ＴＮＦ産生量が０．７５単位／ｍｌ
以下である場合をマクロファージ活性化能Ｏ％とし、マ
クロファージ活性化能（％）は次式により計算した。

表　　２ 表２に示された結果を第４〜７図に示す。

第４〜７図において、縦軸はマクロファージ活性化能（
％）を表し、横軸（対数尺）はリムラステスト陽性ＬＰ
Ｓｆ有Ｍ（ｎｇ／すｇａｍｍａ）を表している。

第４図乙こおいて、○はターメリックの、・は力ンボー
イの、口はコンブの、■はアサクサノリのデータを示す
。

第５図において、○はワカメ芽株エキスの、口は芽ヒジ
キの、■はエビオスのデータを示す。

第６図において、○は冬虫夏革の、・はワカメ芽株の、
口はクロレラのデータを示す。

第７図において、Ｏは大ｍ菌ＬＰＳの、・は小麦ＬＰＳ
の、口は百日咳菌ＬＰＳの、■はリピドＡのデータを示
す。

実験例３（抗リュウマチ効果の測定） 各群４匹のＷ　ｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒラット（１０週齢の
雄、平均体重４００ｇ）の足隨皮内に００１ｍ１／匹の
完全フロインドアジュバント［米国デイフコ社（Ｄｊｆ
ｃｍ）製コを投与し、この足蹴の腫れを防止する度合い
を指標として、製造例１て製造された小麦ＬＰＳの抗リ
ュウマチ効果を測定した。

なお、ポジティブコントロールとして、その抗炎症性が
高く評価されている非ステロイド抗炎症剤を代表するフ
ェニルブタシンを投与した。小麦ＬＰＳの投与量は１回
ｌμｇ／匹（リムラステスト陽性ＬＰＳ量）とし、フェ
ニルブタシンは１回１ｍｇ／匹を投与した。

実験は２通りの方法で行った。一方の方法Ａではアジュ
バント投与の４日前から１日おきに検体を投与し、他の
方法Ｂてはアジュバント投与後１日おきに検体を投与し
た（いずれの方法でも、検体はアジュバント投与後６ロ
目まで静脈内に投与した）。　結果は、アジュバント投
与前の足継の厚さを０％とする相対評価により、各群４
匹の平均として第８．９図に示す。第８図は方法Ａの結
果を、第９図は方法Ｂの結果を示している。

両図において、○は生理的食塩水の、△はフェニルブタ
シンの、・は小麦ＬＰＳのデータを示す。

第８．９図に示された結果から、本発明のＬＰＳはフェ
ニルブタシンと同等ないしそれ以上の抗炎症効果を示す
こと、又、アジュバント投与前から検体を投与する方法
Ａの方が、アジュバント投与復に検体投与を開始する方
法Ｂよりも抑制効果が持続し、従って、本発明のＬＰＳ
には、リュウマチ治療効果も予防効果もあることが明ら
かである。

投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを抗リュウマチ剤、動物用抗リュウマチ
剤として投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医
師或いは獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状
、体［投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の
成人＜６０ｋｇ）で、経口投与で１μｇ　−１００ｍ　
ｇ、静脈投与で１０ｎｇ〜１ｍｇ、経皮投与で１００　
ｎ　ｇ　−１ｍ　ｇが１日１回の投与量の一応の目安と
なる。なお、動物では、牛、馬等の大型動物は上記の量
の６０分の１を体重１ｋｇ当゛たりの量の目安とし、豚
、犬、猫等の中型、小型の動物ではその２倍量を体重１
ｋｇ当たりの量の目安とし、鶏等の鳥類では更にその２
倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし投与できる。

又、小麦ＬＰＳ　（％１造例１）、クロレラＬＰＳ（製
造例２）、大ｌ細菌ＬＰＳ　［米国デイフコ（Ｄ　ｉ　
ｆ　ｃ　ｏ）社１１０１２８：Ｂ８）、百日咳菌ＬＰＳ
　（製造例３）の毒性１１ｉＬＤ５ｓ（１群２匹の雄Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウス、平均体重４５ｇ、における平均値）
は次の通りであった。

［発明の効果コ 本発明により、抗リュウマチ効果が高くて副作用が少な
く、従って化学療法係数が高く、生産コストが低く、し
かも、経口、経皮、注射ての投与が可能な、大量に供給
可能な新規な抗リュウマチ剤、動物用抗リュウマチ剤が
提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、小麦ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。 第２図は、大腸菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。 第３図は、百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーに
かけて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピ
ークを図示したチャートである。 第４〜７図は、マクロファージ活性化能とリムラステス
ト陽性ＬＰＳ含有量との相間間係が本発明の条件を満た
している各種ＬＰＳの当該相ｒＩ１１関係を示すグラフ
である。 第８図は、アジュバント投与前から小麦ＬＰＳを与え続
けた場合の小麦ＬＰＳの抗リュウマチ効果を表す。 第９図は、アジュバント投与後から小麦ＬＰＳを与え続
けた場合の小麦ＬＰＳの抗リュウマチ効果を表す。 第４〜７図において、縦軸はマクロファージ活性化能（
％）を表し、横軸（対数尺）はリムラステスト陽性ＬＰ
Ｓ含有！（ｎｇ／培！Ｉ液ｍｉ）を表している。 第４図において、○はターメリックの、・は力ンボーイ
の、口はコンブの、■はアサクサノリのデータを示す。 第５図において、○はワカメ芽株エキスの、・は芽ヒジ
キの、口はエビオスのデータを示す。 第６図において、○は冬虫夏草の、・はワカメ芽株の、
口はクロレラのデータを示す。 第７図において、Ｏは大腸菌ＬＰＳの、・は小麦ＬＰＳ
の、口は百日咳ＭＬＰＳの、腸はリピドＡのデータを示
す。 第８．９図において、○は生理的食塩水の、△は既知非
ステロイド抗炎症剤であるフェニルブタシンの、・は小
麦ＬＰＳのデータを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＬＰＳを含む抗リュウマチ剤であり、インビトロ
   で培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能を活性化す
   るＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標とし、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
   のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％
   、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時の
   ＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマク
   ロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰＳ
   のリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシグ
   モイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ＿５＿０を与えるリムラ
   ステスト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
   液ｍｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む抗リュウマ
   チ剤。 （２）ＬＰＳが、植物から得られるＬＰＳ、細菌から得
   られるＬＰＳ及びリピドＡからなる群から選択される、
   請求項１記載の抗リュウマチ剤。 （３）植物が裸子植物、単子葉類植物、双子葉類植物、
   シダ植物、ソウ類植物、菌類植物及びそれらの混合物か
   らなる群から選択されるものである、請求項２記載の抗
   リュウマチ剤。 （４）裸子植物がマツ科マツ属植物である、請求項３記
   載の抗リュウマチ剤。 （５）マツ科マツ属植物がマツである、請求項４記載の
   抗リュウマチ剤。 （６）単子葉類植物がイネ科のイネ属植物、コムギ属植
   物、オオムギ属植物、カラス麦属植物、ササ属植物、ジ
   ュズダマ属植物、アヤメ科のアヤメ属植物、ユリ科のネ
   ギ属植物、キジカクシ属植物、ジャノヒゲ属植物、ショ
   ウガ科のショウガ属植物、ウコン属植物、サトイモ科ハ
   ンゲ属植物及びそれらの混合物からなる群から選択され
   るものである、請求項３記載の抗リュウマチ剤。 （７）イネ科イネ属植物がイネである、請求項６記載の
   抗リュウマチ剤。 （８）イネ科コムギ属植物が小麦である、請求項６記載
   の抗リュウマチ剤。 （９）イネ科オオムギ属植物が大麦、裸麦及びそれらの
   混合物からなる群から選択されるものである、請求項６
   記載の抗リュウマチ剤。 （１０）イネ科カラス麦属植物が烏麦、燕麦及びそれら
   の混合物からなる群から選択される、請求項６記載の抗
   リュウマチ剤。 （１１）イネ科ササ属植物がクサ笹である、請求項６記
   載の抗リュウマチ剤。 （１２）イネ科ジュズダマ属植物が鳩麦である、請求項
   ６記載の抗リュウマチ剤。 （１３）アヤメ科アヤメ属植物がアヤメである、請求項
   ６記載の抗リュウマチ剤。 （１４）ユリ科ネギ属植物がニンニクである、請求項６
   記載の抗リュウマチ剤。 （１５）ユリ科キジカクシ属植物がアスパラガスである
   、請求項６記載の抗リュウマチ剤。 （１６）ユリ科ジャノヒゲ属植物がジャノヒゲである、
   請求項６記載の抗リュウマチ剤。（１７）ショウガ科シ
   ョウガ属植物がミョウガである、請求項６記載の抗リュ
   ウマチ剤。（１８）ショウガ科ウコン属植物がウコンで
   ある、請求項６記載の抗リュウマチ剤。 （１９）サトイモ科ハンゲ属植物がカラスビシャクであ
   る、請求項６記載の抗リュウマチ剤。 （２０）小麦から得られるＬＰＳが次の物性を有するも
   のである、請求項８記載の抗リュウマチ剤。 分子量：８，０００±１，０００（ＳＤＳ電気泳動法） リン数：１以上／分子量８千 ヘキソサミン数：６±２／分子量８千 脂肪酸数：６±２／分子量８千 ＫＤＯ数：５±１／分子量８千 （２１）双子葉類植物がマメ科のダイズ属植物、インゲ
   ンマメ属植物、ソラマメ属植物、クズ属植物、カンゾウ
   属植物、ナス科のナス属植物、トマト属植物、トウガラ
   シ属植物、バラ科のビワ属植物、サクラ属植物、クスノ
   キ科アボガド属植物、クルミ科クルミ属植物、ウリ科の
   トウナス属植物、アマチャヅル属植物、アブラナ科ダイ
   コン属植物、マタタビ科マタタビ属植物、ドクダミ科ド
   クダミ属植物、コショウ科コショウ属植物、シキミ科シ
   キミ属植物、ニクズク科ニクズク属植物、ミカン科ミカ
   ン属植物、ウコギ科オタネニンジン属植物、セリ科サポ
   シュニコビア属植物、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植
   物、アカネ科カギカズラ属植物及びそれらの混合物から
   なる群から選択されるものである、請求項３記載の抗リ
   ュウマチ剤。 （２２）マメ科ダイズ属植物が大豆である、請求項２１
   記載の抗リュウマチ剤。 （２３）マメ科インゲンマメ属植物が小豆である、請求
   項２１記載の抗リュウマチ剤。 （２４）マメ科ソラマメ属植物がそら豆である、請求項
   ２１記載の抗リュウマチ剤。 （２５）マメ科クズ属植物がクズである、請求項２１記
   載の抗リュウマチ剤。 （２６）マメ科カンゾウ属植物がナンキンカンゾウであ
   る、請求項２１記載の抗リュウマチ（２７）ナス科ナス
   属植物がジャガイモ、トウガラシ及びそれらの混合物か
   らなる群から選択されるものである、請求項２１記載の
   抗リュウマチ剤。 （２８）ナス科トマト属植物がトマトである、請求項２
   １記載の抗リュウマチ剤。 （２９）ナス科トウガラシ属植物がトウガラシである、
   請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３０）バラ科ビワ属植物がビワである、請求項２１記
   載の抗リュウマチ剤。 （３１）バラ科サクラ属植物がモモである、請求項２１
   記載の抗リュウマチ剤。 （３２）クスノキ科アボガド属植物がアボガドである、
   請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３３）クルミ科クルミ属植物がクルミである、請求項
   ２１記載の抗リュウマチ剤。 （３４）ウリ科トウナス属植物がカボチャである、請求
   項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３５）ウリ科アマチャヅル属植物がアマチャヅルであ
   る、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３６）アブラナ科ダイコン属植物がカイワレダイコン
   である、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３７）マタタビ科マタタビ属植物がマタタビである、
   請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３８）ドクダミ科ドクダミ属植物がドクダミである、
   請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （３９）コショウ科コショウ属植物が胡椒である、請求
   項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４０）シキミ科シキミ属植物がダイウイキョウである
   、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４１）ニクズク科ニクズク属植物がニクズクである、
   請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４２）ミカン科ミカン属植物がダイダイである、請求
   項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４３）ウコギ科オタネニンジン属植物がオタネニンジ
   ンである、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４４）セリ科サポシュニコビア属植物がボウフウであ
   る、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４５）ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物がオオツヅ
   ラフジである、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４６）アカネ科カギカズラ属植物がウンカリア・ヒル
   スタである、請求項２１記載の抗リュウマチ剤。 （４７）シダ植物がトクサ科トクサ属植物、ゼンマイ科
   ゼンマイ属植物及びそれらの混合物からなる群から選択
   されるものである、請求項３記載の抗リュウマチ剤。 （４８）トクサ科トクサ属植物がスギナである、請求項
   ４７記載の抗リュウマチ剤。 （４９）ゼンマイ科ゼンマイ属植物がゼンマイである、
   請求項４７記載の抗リュウマチ剤。 （５０）ソウ類植物がカッソウ類植物、紅ソウ類植物、
   緑ソウ類植物、ランソウ類植物及びそれらの混合物から
   なる群から選択されるものである、請求項３記載の抗リ
   ュウマチ剤。 （５１）カッソウ類植物がコンブ科のワカメ属植物、コ
   ンブ属植物、ホンダワラ科ヒジキ属植物及びそれらの混
   合物からなる群から選択されるものである、請求項５０
   記載の抗リュウマチ剤。 （５２）コンブ科ワカメ属植物がワカメである、請求項
   ５１記載の抗リュウマチ剤。 （５３）コンブ科コンブ属植物がコンブである、請求項
   ５１記載の抗リュウマチ剤。 （５４）ホンダワラ科ヒジキ属植物がヒジキである、請
   求項５１記載の抗リュウマチ剤。（５５）紅ソウ類植物
   がウシケノリ科アマノリ属植物である、請求項５０記載
   の抗リュウマチ剤。 （５６）ウシケノリ科アマノリ属植物がアサクサノリで
   ある、請求項５５記載の抗リュウマチ剤。 （５７）緑ソウ類植物がオオシスティス科クロレラ属植
   物である、請求項５０記載の抗リュウマチ剤。 （５８）オオシスティス科クロレラ属植物がクロレラで
   ある、請求項５７記載の抗リュウマチ剤。 （５９）クロレラから得られるＬＰＳが次の物性を有す
   るものである、請求項５８記載の抗リュウマチ剤。 分子量＝４０，０００〜９０，０００（ＳＤＳ電気泳動
   法） リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万 （６０）菌類植物が担子菌類植物、子ノウ菌類植物及び
   それらの混合物からなる群から選択されるものである、
   請求項３記載の抗リュウマチ剤。 （６１）担子菌類植物がヒラタケ科マツオウジ属植物、
   キシメジ科のエノキタケ属植物、シメジ属植物、タコウ
   キン科マイタケ属植物、サルノコシカケ科ポリポラス属
   植物、ハラタケ科ハラタケ属植物、キクラゲ科キクラゲ
   属植物、モエギタケ科スギタケ属植物及びそれらの混合
   物である、請求項６０記載の抗リュウマチ剤。 （６２）ヒラタケ科マツオウジ属植物が椎茸である、請
   求項６１記載の抗リュウマチ剤。（６３）キシメジ科エ
   ノキタケ属植物がエノキ茸である、請求項６１記載の抗
   リュウマチ剤。 （６４）キシメジ科シメジ属植物がシメジである、請求
   項６２記載の抗リュウマチ剤。 （６５）タコウキン科マイタケ属植物がマイ茸である、
   請求項６１記載の抗リュウマチ剤。 （６６）サルノコシカケ科ポリポラス属植物がアワビ茸
   である、請求項６１記載の抗リュウマチ剤。 （６７）ハラタケ科ハラタケ属植物がマッシュルームで
   ある、請求項６１記載の抗リュウマチ剤。 （６８）キクラゲ科キクラゲ属植物がキクラゲである、
   請求項６１記載の抗リュウマチ剤。 （６９）モエギタケ科スギタケ属植物がナメコである、
   請求項６１記載の抗リュウマチ剤。 （７０）子ノウ菌類植物がエンドミセタセア科サッカロ
   ミセス属植物、バッカクキン科ノムシタケ属植物及びそ
   れらの混合物である、請求項６０記載の抗リュウマチ剤
   。 （７１）エンドミセタセア科サッカロミセス属植物が、
   パン酵母、醸造用酵母及びそれらの混合物である、請求
   項７０記載の抗リュウマチ剤。 （７２）バッカクキン科ノムシタケ属植物が冬虫夏草で
   ある、請求項７０記載の抗リュウマチ剤。 （７３）細菌が大腸菌、百日咳菌及びそれらの混合物か
   らなる群から選択されるものである、請求項３記載の抗
   リュウマチ剤。 （７４）大腸菌から得られるＬＰＳが次の物性を有する
   ものである、請求項７３記載の抗リュウマチ剤。 分子量＝３０，０００±５，０００（ＳＤ Ｓ電気泳動法） リン数＝１２／分子量３方 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３方 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万 （７５）百日咳菌から得られるＬＰＳが次の物性を有す
   るものである、請求項７３記載の抗リュウマチ剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千 （７６）ＬＰＳを含む動物用抗リュウマチ剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
   を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
   し、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファ
   ージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を
   ０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする
   時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とする
   マクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬ
   ＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表す
   シグモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ＿５＿０を与えるリムラ
   ステスト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
   液ｍｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む動物用抗リ
   ュウマチ剤。