JP6049639B2 - クロロフィルｃ含有脱顆粒抑制剤 - Google Patents

Description

本発明はクロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制剤に関する。

近年、食生活の変化や大気汚染、感染症の減少などに伴って、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、接触過敏症、に代表される様々なアレルギー疾患や、高齢化社会に伴う変形性関節症などの骨関節関連疾患の患者数は急速に増加している。

厚生労働省の「平成１５年 保険福祉動向調査」によると、国民全体の約１／３(３５．９%)、４，０００万人以上において、老若男女問わず、皮膚、呼吸器または目鼻の各症状のいずれかのアレルギー症状を有しているとの報告がなされている。

また、疾患別に見ると、厚生労働科学研究赤澤班２０１０報告書において、小児気管支喘息の有病率は２００５年〜２００８年の時点で、６〜７歳で１３．８％、１３〜１４歳で９．５％、１６〜１８歳で８．３％であり、成人（２０〜４４歳）における気管支喘息の有病率は５．４％であった。アレルギー性鼻炎・花粉症では、２００９年の鼻アレルギー診療ガイドラインによると、１９９８年から２００８年にかけて、アレルギー鼻炎全体で２９．８％から３９．４％に増加し、スギ花粉症においても１６．２％から２６．５％に増加していた。また、アトピー性皮膚炎においては、３歳で１３．２％、小学６年生で１０．６％、２０歳代で９．４％、３０歳代が８．３％、４０歳代が４．８％、５０〜６０歳代が２．５％であった（アトピー性皮膚炎治療ガイドライン２００８）。

日常生活においてアレルギー疾患は、国民の生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ：ＱＯＬ）の低下を招く大きな要因の一つになっている。上記の厚生労働省の調査では、呼吸器におけるアレルギー症状によって、「よく眠れなかった」と答える者がアレルギー症状を訴える者のおよそ半分を占め(５３．４%)、更には目鼻におけるアレルギー症状においては、「仕事・家事・学業に集中出来なかった」と答える者が約４割(３７．２%)であった。

従来、アレルギー疾患の治療においては、抗ヒスタミン剤やステロイド剤などの薬剤が対症療法的に処方されてきたが、これらの薬剤は長期連用による副作用が大きいという問題があった。そこで、アレルギー症状を軽減、抑制、あるいは予防でき、かつ日常の食生活に取り入れることの出来る、安全で容易に製造し得る素材の開発が望まれていた。

一方、高齢化社会に伴い、変形性関節症や骨粗鬆症など骨関節疾患も年々と増加の途を辿っている。２００７年の厚生労働省国民生活基礎調査では、介護が必要となった主な原因として、「関節疾患」が要支援者全体の２０．２％（１位）、「骨折・転倒」が１２．５％（４位）、要介護者においても「関節疾患」は９．４％（４位）、「骨折・転倒」が８．４％（５位）を占めており、骨関節疾患は国民の日常生活動作（Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｄａｉｌｙ Ｌｉｖｉｎｇ, ＡＤＬ）やＱＯＬを低下させる大きな要因の一つになっている。同年、日本整形外科学会によって、運動器の障害のため要介護の状態や要介護となる危険の高い状態を指すロコモティブシンドローム（Ｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と呼ばれる概念が提唱され、２００９年には東京大学医学部附属病院の吉村らによって、大規模住民コホート研究（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ / ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ, ＲＯＡＤ）を行った結果、ロコモティブシンドローム対象者数（４０歳以上）が４，７００万人にも上るとの推定が報告されている。アレルギー疾患や骨関節疾患はＡＤＬやＱＯＬ、健康寿命の低下を招く非常に重大な疾患であり、更には増え続ける医療費削減の観点からも、その対策が急務であることは明白である。

このような状況の下、これまでにアレルギー疾患や変形性関節症を軽減、抑制、あるいは予防する医薬品や食品素材の開発が盛んに行われている。例えば食品成分としては、乳酸菌（特許文献１）やローヤルゼリー（特許文献２）、海藻に含まれる水溶性成分である多糖類のフコイダン（特許文献３）（特許文献４）やアルギン酸（特許文献５）などにアレルギー抑制作用が報告されている。

花粉症やアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎やアレルギー性結膜炎などの様々なアレルギー疾患の発症において、肥満細胞や好塩基球の脱顆粒反応が重要であることが知られている。アレルゲンが生体内に侵入すると、アレルゲン特異的な抗体の産生が誘導され、産生されたアレルゲン特異的な抗体は、肥満細胞や好塩基球といった細胞の表面に結合し感作が成立する。再び生体内にアレルゲンが侵入すると、肥満細胞や好塩基球の細胞表面に結合したアレルゲン特異的な抗体とアレルゲンが結合することで、ケミカルメディエーターを含む顆粒を細胞外へ放出し、血管透過性の亢進や気管支平滑筋の収縮などのアレルギー反応を引き起こす。よって、花粉症やアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎やアレルギー性結膜炎などの様々なアレルギー疾患を抑制する一つの方法として、この脱顆粒反応を抑制することが有効である。

これまでに脱顆粒抑制作用を有する食品素材として、植物（ガラナ）抽出物（特許文献６）や紅藻類に含まれているフィコエリスリン（非特許文献１）などが報告されている。

更には、近年の研究より、変形性関節症抑制作用を有するグルコサミン塩酸塩に脱顆粒抑制作用が報告され、脱顆粒抑制作用を介した変形性関節症の抑制効果が報告されている（非特許文献２）。このことから脱顆粒反応抑制作用を調べることにより、アレルギー疾患だけではなく、変形性関節症を抑制する効果も確認することが可能である。

変形性関節症抑制作用を有する素材として、グルコサミン塩酸塩のほかにコンドロイチン硫酸塩（非特許文献３）（非特許文献４）（非特許文献５）（非特許文献６）（非特許文献７）（非特許文献８）やキク科植物（特許文献７）、香辛料（特許文献８）などの植物抽出物が報告されている。

ところで、植物などに含まれる光合成色素であるクロロフィルはＭｇやＺｎを配位した環状テトラピロールの金属錯体と定義され、色素として着色剤や食品添加物として利用される他、近年では光線力学療法として医療への応用も行われている（非特許文献９）。一方、高純度のクロロフィルは植物や藻類などから有機溶媒などを用いて抽出され、吸光光度計や高速液体クロマトグラフィーなどを用いて分離・精製されている（非特許文献１０）（非特許文献１１）（非特許文献１２）。また、クロロフィルの有する機能性としては、クロロフィル類縁体であるクロロフィリン銅錯体について抗酸化作用による抗菌、抗ガン、抗動脈硬化、乾癬抑制作用などの報告（非特許文献１３）がなされているものの、クロロフィルの脱顆粒抑制作用による血管透過性抑制作用などのアレルギー抑制効果、または変形性関節症抑制効果については未だ報告されていない。

特許第４２１２８３８号公報 ＷＯ２００４／０１９９７１ Ａ１ 特開平１１−２１２４７号公報 特開平１０−７２３６２号公報 特許第４０１２９７７号公報 特開平２０１０−７０５３１号公報 ＷＯ２００８／０１０３３５ 特開平２００６−２２００２号公報

Ｆｏｏｄ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ. Ｖｏｌ．１７, Ｎｏ．２, １７１−１７７ (２０１１) Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ. ８６(９−１０), ３３７−３４３ (２０１０) Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ.２７,２０５−２１１(２０００) Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ.２３,１３８５−１３９１(１９９６) Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ.２８,１７３−１８１(２００１) Ｔｈｅ ｎｅｗ ＥＮＧＬＡＮＤ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ. ３５４, Ｎｏ．８，７９５−８０８(２００６) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ. Ｖｏｌ．４６,Ｎｏ．１，１４−２４(２００６) Ｄｒｕｇ ａｇｉｎｇ．２４(７)，５７３−５８０(２００７) クロロフィル−構造・反応・機能− ｐ６９−７０（２０１１） Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２２，ｐ４３−５５（２００７） ＰＮＡＳ．Ｖｏｌ．１０２，ｐ８５０−８５５（２００５） Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１０，ｐ１９８９−２２２４（２００９） Ｎｅｗ ｊｅｒｓｅｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ. ８５(８), ６６９−６７３(１９８８)

本発明の課題は、近年患者数が急増しその対策が急務となっているアレルギー疾患及び骨関節疾患を抑制するために、脱顆粒抑制作用を示すクロロフィルcを活性成分として含有する脱顆粒抑制剤を提供することにある。

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、多くのクロロフィル類の中でもクロロフィルｃまたはクロロフィルｃを活性関与成分として含む藻類粉末、藻類抽出物が脱顆粒抑制作用を有することを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明はクロロフィルｃまたはクロロフィルｃを活性成分として含有することを特徴とする、肥満細胞や好塩基球などの脱顆粒反応を抑制することでアレルギー性症状または変形性関節症の軽減、治療又は予防するための組成物を提供することにある。

すなわち、本発明は、クロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制剤組成物である。当該脱顆粒抑制剤は、変形性関節症抑制剤として又はアレルギー抑制剤として使用することができる。また、クロロフィルｃを配合した食品としても使用できる。具体的には、クロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制用機能性食品として使用することができる。また、クロロフィルｃを配合した飼料またはペットフードとしても使用できる。具体的には、クロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制用飼料またはペットフードとして使用することが出来る。

本発明によれば、クロロフィルｃまたはクロロフィルｃを含有する特定の海藻類の抽出物を用いることにより経口摂取可能なクロロフィルｃを活性成分として含有する脱顆粒抑制剤を得ることが出来、医薬品、飲食物、飼料またはペットフードとして利用することが出来る。これらの医薬品、飲食物、飼料またはペットフードを経口摂取することによって、肥満細胞や好塩基球からの脱顆粒反応の抑制を通して、アレルギー性症状または変形性関節症の軽減、抑制、予防が可能となる。

図１は、クロロフィルａ〜ｄを用いた場合のラット好塩基球由来細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の脱顆粒抑制活性評価試験結果を脱顆粒率として表す図である。 図２は、クロロフィルｃ２を用いた場合のラット好塩基球由来細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の細胞毒性評価試験の結果を細胞生存率で表す図である。 図３は、水、２０％、４０％、６０％、８０％の含水エタノール、および１００％エタノールを用いて、あかもくからクロロフィルｃを抽出した抽出物を用いた場合のラット好塩基球由来細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の脱顆粒抑制活性評価結果を脱顆粒率として表す図である。 図４は、あかもくのエタノール水溶液の抽出分画物をＨＰＬＣによって分取した各フラクション脱顆粒率を示す図である。 図５は、薄層クロマトグラフィー分析による図４に示した活性フラクション（Ｆｒ．Ｊ）のスポットを示す写真である。 図６は、ＨＰＬＣによって分取した図４の活性フラクション（Ｆｒ．Ｊ）及びクロロフィルｃ２標品の吸収波長４５０ｎｍにおける吸光度を示す図表である。 図７は、ＨＰＬＣによって分取した図４の活性フラクション（Ｆｒ．Ｊ）及びクロロフィルｃ２標品の吸収スペクトルを示す図表である。 図８は、クロロフィルｃ１またはｃ３を用いた場合のラット好塩基球由来細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の脱顆粒抑制活性評価試験結果を脱顆粒率として表す図である。 図９は、クロロフィルｃ１またはｃ３を用いた場合のラット好塩基球由来細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の細胞毒性評価試験の結果を細胞生存率として表す図である。 図１０は、あかもく由来のクロロフィルｃ抽出物添加飼料によるＳＤラットの血管透過性抑制活性評価試験による各群の血管透過率を示す図である。 図１１は、あかもく由来のクロロフィルｃ抽出物添加飼料によるＣ５７ＢＬ／６マウスの花粉症抑制活性評価試験による各群の1時間辺りの鼻掻き回数を示す図である。 図１２は、あかもく由来のクロロフィルｃ抽出物添加飼料、グルコサミン添加飼料、ＳＣＰ（ＮＢ）添加飼料、クロロフィルｃ抽出物とグルコサミンとを添加した飼料およびクロロフィルｃ抽出物とＳＣＰ（ＮＢ）とを添加した飼料によるＤＡラットの変形性関節症抑制活性評価試験の結果であり、変形性関節症発症初日(０日)から発症１５日目までの関節症スコアを合算した値を示す図である。

本発明は、上述したように、クロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制剤組成物であり、本発明についてさらに詳細に説明する。

クロロフィルｃは、下記に示すような特定の藻類に含まれ、ポルフィリン系化合物であり、構造式：

を有し、クロロフィルｃ１、ｃ２およびｃ３からなる。クロロフィルｃ１、ｃ２及びｃ３の構造は、脱顆粒反応の抑制作用を有しないクロロフィルａやｂ、ｄなどのクロリンπ骨格を有する分子とは異なり、上記の構造式に示す通り炭素の１７位―１８位の間に２重結合を持つポルフィリンπ骨格を有することを特徴とする。また、分子量はｃ１（６１０）、ｃ２（６０８）、ｃ３（６５３）と近似し、ジエチルエーテル中の極大吸収スペクトルも、ｃ１（４４４．４ ｎｍ）、ｃ２（４４７．８ ｎｍ）、ｃ３（４５０．８ ｎｍ）と近似している。更には、いずれのクロロフィルｃも藻類内においてジビニルプロトクロロフィリドａより生合成が開始され、光合成作用や抗酸化作用を示す。

クロロフィルｃは肥満細胞や好塩基球からの脱顆粒反応の抑制を通して、アレルギー性症状または変形性関節症の軽減、抑制、予防が可能となる。

本発明の組成物に含有させるクロロフィルｃを得る原料は特に限定されない。クロロフィルｃは植物に含まれる光合成色素の中の1つで、酸素発生型光合成生物の中の渦鞭毛藻門、クリプト藻門、黄金色藻綱、ラフィド藻綱、褐藻綱、珪藻綱、真正眼点藻綱などの不等毛藻門、ハプト藻門などに含まれることが知られている。好ましくは、しおみどろ目しおみどろ科アキネトスポラ属のＥｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓｕｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｕｇｏｅｎｓｉｓ、アステロネマ属のたまがたしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｂｒｅｖｉａｒｔｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｆｅｌｄｍａｎｎｉａ ｂｒｅｖｉａｒｔｉｃｕｌａｔａ、Ｈｉｎｃｋｓｉａ ｂｒｅｖｉａｒｔｉｃｕｌａｔａ、しおみどろ属のけなししおみどろ、ｃｏｎｆｅｒｖｏｉｄｅｓ、つむがたしおみどろ、ちゃぼしおみどろ、しおみどろ、ひめみるしおみどろ、えぞしおみどろ、フェルドマニア属のなんかいしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ、みるしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｚｕｅｎｓｉｓ、ヒンクシア属のＥｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｇｉｆｆｏｒｄｉａ ｇｒａｎｕｌｏｓａ、ながみしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｆｅｌｄｍａｎｎｉａ ｉｎｄｉｃａ、Ｇｉｆｆｏｒｄｉａ ｉｎｄｉｃａ、たわらがたしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｍｉｔｃｈｅｌｌａｅ、Ｇｉｆｆｏｒｄｉａ ｍｉｔｃｈｅｌｌａｅ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｇｉｆｆｏｒｄｉａ ｏｖａｔａ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｓａｎｄｒｉａｎｕｓ、Ｇｉｆｆｏｒｄｉａ ｓａｎｄｒｉａｎａ、ラミナリオコラックス属のわかめやどりみどろ、Ｇｏｎｏｎｅｍａ ａｅｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｂｌｏｎｅｍａ ａｅｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、ラミナリオネマ属、かぎしおみどろ属のかぎしおみどろ、やどりみどろ属のこぶやどりみどろ、ぴらえら科みなみしおみどろ属のみなみしおみどろ、ぴらえら属のぴらえら、いそぶどう科いそぶどう属のいそぶどう、ｍｉｃｒｏｍｏｒａ、Ｓｏｒｏｃａｒｐｕｓ ｕｖａｅｆｏｒｍｉｓ、きたしおみどろ属のきたしおみどろ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｒｉｃａｔｕｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｗａｄａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｒｅｃｕｒｖａｔｕｓ、いそがわら目にせいしのかわ科にせいしのかわ属のにせいしのかわ、いそがわら科まつも属のいとまつも、ぐんじまつも、Ｃｈｏｒｄａｒｉａ ｇｕｎｊｉｉ、まつも、Ｈｅｔｅｒｏｃｈｏｒｄａｒｉａ ａｂｉｅｔｉｎａ、くろはんもん属のくろはんもん、きんいろはんもん属のきんいろはんもん、ハパロスポンギディオン属のＭｅｓｏｓｐｏｒａ ｓｃｈｍｉｄｔｉｉ、いしつきごびあ属のいしつきごびあ、Ｇｏｂｉａ ｓａｘｉｃｏｌａ、Ｓａｕｎｄｅｒｓｅｌｌａ ｓａｘｉｃｏｌａ、いそがわら属のいそがわら、いそいわたけ（いそはんもん，はんもんそう）、うすばおおぎ目うすばおおぎ科うすばおおぎ属のうすばおおぎ、くろがしら目くろがしら科くろがしら属のはねぐんせんくろがしら、ほそぐんせんくろがしら、よつでくろがしら、わいじがたくろがしら、ひじきのくろがしら、にっぽんまたざきくろがしら、こもんくろがしら、ｔｅｎｕｉｓ、ながぐんせんくろがしら、はねくろがしら、みつでくろがしら、ａｐｉｃａｌｉｓ、ｃａｅｓｐｉｔｏｓａ、じゅうたんくろがしら、ｆｕｒｃｉｇｅｒａ、ぎんあんくろがしら、えちごくろがしら、ｌｉｎｅａｒｉｓ、ｓｅｓｓｉｌｉｓ、みつまたくろがしら、またざきくろがしら、ほそえくろがしら、ｄｉｖａｒｉｃａｔａ、ｆ． ｊａｐｏｎｉｃａ、ｓｈｉｉｙａｅｎｓｉｓ、ｖｉｒｉｄｉｓ、ぐんせんくろがしら、つくばねくろがしら、なしのみくろがしら、くびれくろがしら、かしらざき科かしらざき属のかしらざき、えぞかしらざき属のえぞかしらざき、あみじぐさ目あみじぐさ科やはずぐさ属のえぞやはず、おおばやはず、やはずぐさ、りぼんやはず、すじやはず、うらぼしやはず、ｍｅｍｂｒａｎａｃｅａ、へらやはず、うすばやはず、ひめやはず、しわやはず、あみじぐさ属のおおまたあみじ、とげあみじ、あみじぐさ、さきびろあみじ、かずのあみじ、はいあみじぐさ、いとあみじ、おおばあみじぐさ、こもんあみじ、へらあみじぐさ、はりあみじぐさ、ふたえおおぎ属のふたえおおぎ、Ｃｈｌａｎｉｄｏｐｈｏｒａ ｒｅｐｅｎｓ、Ｃｈｌａｎｉｄｏｔｅ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ、やれおおぎ属のやれおおぎ、はいおおぎ属のはいおおぎ、Ｇｙｍｎｏｓｏｒｕｓ ｃｏｌｌａｒｉｓ、Ｐｏｃｏｃｋｉｅｌｌａ ｖａｒｉｅｇａｔａ、さなだぐさ属のさなだぐさ、うみうちわ属のうみうちわ、うすばうみうちわ、あかばうみうちわ、こなうみうちわ、しまめうみうちわ、おきなうちわ、こがねうみうちわ、うすゆきうちわ、もふぃっとうみうちわ、おきなわうみうちわ、りゅうきゅううみうちわ、えつきうみうちわ、つちいろうみうちわ、しわうみうちわ、にせあみじ属のふくりんあみじ、Ｄｉｌｏｐｈｕｓ ｏｋａｍｕｒａｅ、Ｄｉｌｏｐｈｕｓ ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、こもんぐさ属のあつばこもんぐさ、ｖａｒｉａｂｉｌｅ ｓｅｎｓｕ Ｙｅｎｄｏ、ひろはこもんぐさ、こもんぐさ、ほそばこもんぐさ、ｓｏｌｉｅｒｉ ｓｅｎｓｕ Ｙｅｎｄｏ、じがみぐさ属のじがみぐさ、ｌｏｂａｔｕｍ、しまおおぎ属のしまおおぎ、えつきしまおおぎ、ながまつも目にせもずく科にせもずく属のきたにせもずく、にせもずく、ながまつも科ながまつも属のひもながまつも、ながまつも、ほそまつも、おきなわもずく属のおきなわもずく、Ｅｕｄｅｓｍｅ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ｓｅｎｓｕ Ｏｋａｍｕｒａ、きしゅうもずく、にせふともずく属のにせふともずく、からふともずく属のからふともずく、ふさもずく属のふさもずく、くろも属のくろも、Ｍｙｒｉｏｃｌａｄｉａ ｋｕｒｏｍｏ、もつきちゃそうめん属のもつきちゃそうめん、Ｇｏｂｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ、くろもずく属のくろもずく、いしもずく属のいしもずく、ｊａｐｏｎｉｃａ、おけさもずく、Ｃａｓｔａｇｎｅａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ、くさもずく、Ｃｈｏｒｄａｒｉａ ｆｉｒｍａ、ふともずく属のふともずく、Ｅｕｄｅｓｍｅ ｃｒａｓｓａ、なみまくら科なみまくら属のすぎもくのなみまくら、まるがたごのけのり、Ｇｏｎｏｄｉａ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ、なみまくら、ｆｕｃｉｃｏｌａ ｓｅｎｓｕ Ｏｋａｍｕｒａ、ｇｌｏｂｏｓａ Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ひるなみまくら、ｃｒａｓｓａ、ｆｌａｃｃｉｄａ ａｕｃｔ． Ｊａｐｏｎ．、ｓａｄｏｅｎｓｉｓ、ほそなみまくら、そめわけぐさ属のそめわけぐさ、ひなのそめわけぐさ、ｔｏｒｔｕｏｓａ、なみまくらもどき属のなみまくらもどき、ねばりも科いそぐるみ属のいそぐるみ、ねばりも属のえだうちねばりも、ねばりも、なんきんねばりも、いとねばりも、ひなねばりも、おけさねばりも、いわねばりも、ｇｒａｎｕｌｏｓａ、ひめねばりも属のひなねばりも、ひめねばりも、こごめねばりも属のこごめねばりも、ミリアクチュラ属のごのけのり、もくのつゆ、しわのかわ科しわのかわ属のしわのかわ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｕｓ ｒｕｇｏｓｕｓ、ミリオネマ科コンプソネマ属のもくのはりも、ヘカトネマ属のそろいへかとねま、へかとねま、ミクロスポンギウム属のＭｙｒｉｏｎｅｍａ ｇｌｏｂｏｓｕｍ、ミリオネマ属のみりおねま、むかししおみどろ属のむかししおみどろ、てんいこんぷそねま、もずく科もずく属のもずく、ひもまくら属のひもまくら、ｒｈｉｚｏｄｅｓ、ういきょう目こもんぶくろ科こもんぶくろ属のこもんながぶくろ、ｔｕｒｎｅｒｉ、きたいわひげ属のきたいわひげ、Ｍｙｅｌｏｐｈｙｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、えぞぶくろ科えぞふくろ属のほそえぞぶくろ、えぞふくろ、ｃｙｓｔｏｓｅｉｒａｅ ｓｅｎｓｕ Ｙｅｎｄｏ、にせかやも科にせかやも属のにせかやも、シチャポビア属、ういきょうも科ういきょうも属のふとばういきょうも、ういきょうも、ｈｉｐｐｕｒｏｉｄｅｓ、はばもどき科こぶのひげ属のこぶのひげ、Ｌｉｔｏｓｉｐｈｏｎ ｙｅｓｏｅｎｓｅ、はばもどき属のちしまはばもどき、おおばはばもどき、うすばはばもどき、はばもどき、ごあんめ、がさがさはばもどき、ｃｈａｒｔａｃｅａ ｓｅｎｓｕ Ｕｍｅｚａｋｉ、ひだはばもどき、けぶかはばもどき、はばだまし、ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ ｓｅｎｓｕ Ｙｅｎｄｏ、ゆるじはばもどき、いそひげも属のいそひげも、よこじまのり科おしょろぐさ属のおしょろぐさ、さめずぐさ属のさめずぐさ、Ｋｊｅｌｌｍａｎｉａ ａｒａｓａｋｉｉ、よこじまのり属のよこじまのり、かやものり目むらちどり科むらちどり属のむらちどり、ぼうがたむらちどり、ｐａｃｉｆｉｃａ、かやものり科ふくろのり属のわたも、ｓｉｎｕｏｓａ ｆ． ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、うすかわふくろのり、ほそくびわたも、ふくろのり、かごめのり属のかごめのり、ほそかごめのり、いわひげ属 のうつろいわひげ、いわひげ、ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ、せいようはばのり属のはばのり、Ｅｎｄａｒａｃｈｎｅ ｂｉｎｇｈａｍｉａ、せいようはばのり、Ｉｌｅａ ｆａｓｃｉａ、ほそばのせいようはばのり、もさくだふくろ属のもさくだふくろ、かやものり属のかやもどき、うすかやも、かやものり、ひらかやも、むちも目むちも科むちも属のけべりぐさ、むちも、ひらむちも、けやりも目けやりも科いちめがさ属のいちめがさ、ｃａｂｒｅｒａｅ、うみぼっす属のうみぼっす、けやり属のけやり、ｓｃｏｐａｒｉｕｓ、うるしぐさ目うるしぐさ科うるしぐさ属のうるしぐさ、たばこぐさ、けうるしぐさ、こんぶ目こんぶもどき科こんぶもどき属のこんぶもどき、ちがいそ科あいぬわかめ属のほそばわかめ、ちがいそ、ふうちょうわかめ、Ｐｌｅｕｒｏｐｔｅｒｕｍ ｐａｒａｄｉｓｅｕｍ、あいぬわかめ、くしろわかめ、おにわかめ属のおにわかめ、わかめ属のあおわかめ、わかめ、ひろめ、つるも科つるも属のつるも、Ｃｈｏｒａ ｆｉｌｕｍ ａｕｃｔ． ｊａｐｏｎ．、あなめ属のあなめ、ｃｒｉｂｒｏｓｕｍ、おおのあなめ、すじめ属のすじめ、こんぶ科かじめ属のかじめ、くろめ、つるあらめ、あんとくめ属のあんとくめ、かじめ属のさがらめ、あらめ、ねこあしこんぶ属のねこあしこんぶ、みすじこんぶ属のあつばすじこんぶ、ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ ｓｅｎｓｕ Ｍｉｙａｂｅ ｅｔ Ｎａｇａｉ、ごへいこんぶ属のごへいこんぶ、こんぶ属のみついしこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ａｎｇｕｓｔａｔａ、ちぢみこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｃｉｃｈｏｒｉｏｉｄｅｓ、がっがらこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｃｏｒｉａｃｅａ、おにこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉａｂｏｌｉｃａ、とろろこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｇｙｒａｔａ、Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｇｙｒａｔａ、まこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、あつばすじこんぶ、Ｃｙｍａｔｈａｅｒｅ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍｉｙａｂｅ ｅｔ Ｎａｇａｉ、からふとこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、えながこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｐｅｄａｌｉｓ、ながこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ、りしりこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｏｃｈｏｔｅｎｓｉｓ、ほそめこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ、がごめこんぶ、Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ ｃｒａｓｓｉｆｏ
ｌｉａ、えんどうこんぶ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｙｅｎｄｏａｎａ、くろしおめ属のくろしおめ、Ｈｅｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｋｕｒｏｓｈｉｏｅｎｓｅ、にせつるも科にせつるも属のほそつるも、にせつるも、Ｃｈｏｒｄａｒｉａ ｎａｇａｉｉ、いしげ目いしげ科いしげ属のいしげ、いろろ、ｆｏｌｉａｃｅａ、ひばまた目ひばまた科ひばまた属のひばまた、ｅｖａｎｅｓｃｅｎｓ、えぞいしげ属のえぞいしげ、Ｐｅｌｖｅｔｉａ ｂａｂｉｎｇｔｏｎｉｉ、Ｐｅｌｖｅｔｉａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ、ほんだわら科すぎもく属のすぎもく、うがのもく属のねぶともく、Ｃｙｓｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ、えぞもく、Ｃｙｓｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｇｅｍｉｎａｔｕｍ、うがのもく、Ｃｙｓｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｈａｋｏｄａｔｅｎｓｅ、やばねもく属のやばねもく、ｔｒｉｑｕｅｔｒａ、Ｃｙｓｔｏｓｅｉｒａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ、じょろもく属のじょろもく、ｙｅｎｄｏｉ、かいふもく、Ｃｙｓｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｉｓｙｍｂｒｉｏｉｄｅｓ、ひえもく、ほんだわら属のきればもく、かたわもく、すなびきもく、えちごねじもく、つくしもく、あきよれもく、ほっかいもく、たまえだもく、まじりもく、ほそばもく、ｖｕｌｇａｒｅ ｖａｒ． ｌｉｎｅａｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｅｎｓｕ Ｙｅｎｄｏ、ふしすじもく、あつばもく、べりべりもく、こぶくろもく、とさかもく、とげみもく、ふたえもく、ひめこもく、なんかいもく、しだもく、ほんだわら、ｅｎｅｒｖｅ、ひじき、Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、おおばのこぎりもく、こなふきもく、いそもく、あかもく、ふたえひいらぎもく、しまうらもく、とさもく、しろこもく、ながみもく、のこぎりもく、ｓｅｒｒａｔｉｆｏｌｉｕｍ ａｕｃｔ． ｊａｐｏｎ.、とげもく、ふしいともく、みやべもく、ｋｊｅｌｌｍａｎｉａｎｕｍ、たまははきもく、ｋｊｅｌｌｍａｎｉａｎｕｍ ｆ． ｍｕｔｉｃｕｍ、ひめはもく、ｏｐａｃｕｍ、ならさも、たまなしもく、ひらねじもく、うすいろもく、やつまたもく、まめたわら、からくさもく、こばもく、たまきればもく、おおばもく、やなぎもく、ちゅらしまもく、ねじもく、ふくれみもく、ひゅうがもく、ながしまもく、ｒａｃｅｍｏｓｕｍ Ｙａｍａｄａ ｅｔ Ｓｅｇｉ、まるばのがらも、うすばのこぎりもく、よれもく、ｔｏｒｔｉｌｅ、きしゅうもく、へらならさも、うすばもく、うみとらのお、たつくり、いとよれもく、なんきもく、あずまねじもく、よれもくもどき、えんどうもく、えながもく、えぞのねじもく、ｓａｇａｍｉａｎｕｍ ｖａｒ． ｙｅｚｏｅｎｓｅ、らっぱもく属のかさもく、らっぱもく、たかつきもく、ｔｒｉａｌａｔａ、などの褐藻類が挙げられる。クロロフィルｃの原料として褐藻類のあかもく、かじめ、くろめ及びこんぶが特に好ましい。

本発明で使用するクロロフィルｃを得るための抽出方法は、クロロフィルｃが分解あるいは変性されなければ特に限定されない。例えば、抽出に用いる原料はそのまま用いてもよいし脱塩処理、水洗処理、乾燥処理してからでもよく、抽出効率を向上させるために粉末化してからでもよい。更には、細胞の中に含まれているクロロフィルｃをより抽出しやすくするために、細胞膜を形成するタンパク質やクロロフィルｃと結合しているタンパク質などを分解するプロテアーゼや細胞壁などに存在するセルロースを分解するセルラーゼ等の酵素処理による分解工程を行ってもよい。そして、真空濃縮や、凍結濃縮、膜濃縮などの手法を用いて抽出物を濃縮してもよい。

本発明で使用するクロロフィルｃを得るための抽出に用いる抽出溶媒は、クロロフィルｃが分解あるいは変性しなければ特に限定されない。例えば、水や塩類を含む水溶液や、メタノール、エタノール、ブタノールなどのアルコール類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、ヘキサンなどのアルカン類など有機系溶媒などが挙げられ、好ましくは、エタノールやメタノール、アセトン、ジエチルエーテルなどが挙げられる。

一例としてクロロフィルｃの製造法を具体的に述べれば、クロロフィルｃの含まれる藻類を、塩分や、多糖類などのクロロフィルｃ以外の水溶性成分及び不溶性成分などの不純物を除去することで簡便で安価にクロロフィルｃを濃縮する目的で、１倍から１００倍量の水を用いて撹拌しながら洗浄を行い、同様の洗浄操作を数回繰り返した後、適切な条件下で乾燥させ、粉砕機を用いて粉砕し、クロロフィルｃを濃縮した藻類の乾燥粉末を製造することが出来る。

また、更にクロロフィルｃを濃縮する目的で、上記のように製造したクロロフィルｃを濃縮した藻類の乾燥粉末を、６０％〜１００％、好ましくは８０％の含水エタノールを用いて撹拌しながら、常温条件下で一晩抽出する。抽出後、吸引濾過して不溶物を除去して得られた抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて乾固させることで、クロロフィルｃを濃縮した藻類の含水エタノール抽出物を製造することが出来る。

また、更にクロロフィルｃを濃縮することを目的として、上記のように製造したクロロフィルｃを濃縮した藻類の含水エタノール抽出物を、ｎ−ブタノールと水を用いて分液操作を行い、得られたｎ−ブタノール分画物を、更にヘキサンと含水メタノールを用いて分配操作を行う。得られた含水メタノール分画物を、シリカゲルカラムとＯＤＳカラムを用いて分画操作を行い、アセトニトリル水溶液と純のアセトニトリルを用いてグラジエント溶出を行い、波長２５４ｎｍにおける吸光度を用いてピークを確認しながらＨＰＬＣ分取を行う。得られたフラクションとクロロフィルｃ標品について、ＨＰＬＣを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定しクロロフィルｃ標品と同一の保持時間にピークが見られることを確認することによって、クロロフィルｃを濃縮した藻類の含水エタノール抽出物から更に高度に精製したクロロフィルｃを製造することが出来る。

本発明において、分解工程に使用出来るプロテアーゼは特に限定されない。例えば、ニューラーゼＦ３Ｇ、ニューラーゼＡ、モルシンＦ、スミチームＡＰ、デナプシン２Ｐ、オリエンターゼ２０Ａ、テトラーゼＳ、ブリューワーズクラレックス、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、パパインＷ−４０、ブロメラインＦ、プロモッド２２３ＬＰ、スミチームＬＰ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰＬ、プロチンＳＤ−ＮＹ−１０、プロチンＳＤ−ＰＣ−１０Ｆ、ブリューワーズプロテアーゼ、アクセラザイムＮＰ５０．０００、精製パパイン、食品用精製パパイン、デナチームＡＰ、ＰＴＮ、ニュートラーゼ、ヌクレイシン、オリエンターゼ１０ＮＬ、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼＯＮＳ、Ｐａｐａｉｎ Ｆ、ｔｒｙｐｓｉｎ ４．０Ｔ、ＣＯＲＯＬＡＳＥ Ｎ、ＶＥＲＯＮ Ｌ１０、ＣＯＲＯＬＡＳＥ Ｌ１０、ＣＯＲＯＬＡＳＥ ７０８９、パンチダーゼＮＰ−２、パンチダーゼＰ、アロアーゼＡＰ−１０、アロアーゼＮＰ−１０、アロアーゼＮＳ、エンチロンＮＢＳ、パパイン、プロテックス７Ｌ、プロテックス１４Ｌ、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＳＤ−ＡＣ−１０Ｆ、プロチンＳＤ−ＡＹ−１０、プロレザーＦＧ−Ｆ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、アルカリプロテアーゼＧＬ、プロテックス６Ｌ、プロテックス８９Ｌ、ピュラフェクト、ピュラフェクトＯＸ、プロペラーゼ、プロテックスＯＸＧ、プロテックス４０Ｌ、スミチームＭＰ、デルボラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、アルカラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、カンナーゼ、ノボザイムＦＭ、ビオプラーゼＯＰ、ビオプラーゼＡＬ−１５ＦＧ、ビオプラーゼ３０Ｇ、ビオプラーゼＡＰＬ−３０、ビオプラーゼＸＬ−４１６Ｆ、ビオプラーゼＳＰ−２０ＦＧ、ビオプラーゼＳＰ−４ＦＧ、プロテアーゼＣＬ−１５、オリエンターゼ２２ＢＦ、アロアーゼＸＡ−１０、エンチロンＳＡ、ベイクザイムＰＰＵ９５．０００、ベイクザイムＢ５００、ポーラザイム、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、コクラーゼ・Ｐ、アクチナーゼＡＳ、グリンドアミルＰＲ５９、グリンドアミルＰＲ４３、フレーバーザイム、プロメタックス、ノボラン、ＶＥＲＯＮ Ｗ、プロテアーゼＡＬ、マグナックスＭＴ、ソフターゲンＭ２、コルプリン、フロマーゼ、名糖レンネット、名糖レンネットスーパー、マキシレンなどが挙げられる。

本発明において、分解工程に使用出来るセルラーゼは特に限定されない。例えば、セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４、β―グルカナーゼ、スペザイム ＣＰ、マルチフェクト、マルチフェクトＧＣ エクストラ、オプチフローＲＣ、プリマファースト、インディエイジニュートラフレックス、アクセルレース、オプチマッシュ、オプチマーゼＣＸ、ピュラダックスＨＡ、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ、ＧＯＤＯ−ＴＣＬ、ＧＯＤＯ−ＴＣＤ−Ｈ３、ベッセレックス、ソフターゲン・Ｃ−１、超耐熱性セルラーゼ、セルライザーＣＬ、セルライザーＡＣＥ、セルレースナガセ、セルチームＣ、セルラーゼＳＳ、セルラーゼＸＬ−５３１、ベイクザイムｃｏｎｃｒｅａｔｅ、シトラーゼ ＣＬ、ベイクザイム Ｘ−ＣＥＬＬ、バリターゼ ＴＲＬ、バリターゼ ＡＮＣ４０、セルソフト、ケアザイム、セルザイム、セルクラスト、Ｃｅｌｌｉｃ ＣＴeｃ、セルロシンＡＣ４０、セルロシン ＡＬ、セルロシン ＴＦ、セルラーゼ“オノズカ”３Ｓ、セルラーゼ Ｙ−ＮＣ、パンセラーゼ ｂｒ、ＣｅｌｌＳＥＢ Ｔｓ、スミチームＡＣ、スミチームＣ、スクラーゼＣ、エンチロンＭＣ、エンチロンＭＣＨ、バイオヒット、バイオスター、セルラーゼ ＥＳ、フィニザイム、ウルトラフロ、ビスコザイム、グルカネックス、フィルトラーゼＬ、フィルトラーゼＮＬＣＬ、フィルトラーゼＰｕｒｅｍｉｕｍ Ｌ、スミチーム ＢＧＡ、ナリンギナーゼなどが挙げられる。

本発明の組成物の形態は特に限定されない。例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤などが挙げられる。本発明の組成物は、経口で投与してもよく、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。該組成物は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等の添加剤を含んでいても良い。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などがそれぞれ挙げられる。

本発明の組成物は、その剤型に応じて異なるが、通常全組成物中にクロロフィルｃが乾燥重量として０．１〜１００ｍｇ程度含まれている。また、クロロフィルｃを活性成分として含む藻類粉末又は藻類抽出物は、通常全組成物中に０．１〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％程度含まれている。

投与量は患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定され、1日1回又は数回に分けて投与すればよい。例えば、一日当たり、クロロフィルｃが乾燥重量として０．１〜１００ｍｇ、クロロフィルｃを活性成分として含む藻類粉末または藻類抽出物は０．１ｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｇ〜３ｇ程度摂取すればよい。

本発明の組成物をそのまま、または当該組成物を加工食品に添加することによって、当該食品を脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性、変形性関節症抑制活性の有する機能性飲食品にすることができるが、対象となる飲食品の種類は、活性成分であるクロロフィルｃの脱顆粒抑制作用、アレルギー抑制作用、変形性関節症抑制作用が阻害されないものであれば特に限定されない。

加工食品の例として、例えば、菓子・パン類；穀粉・麺類；水産加工品；農産・林産加工食品；畜産加工品；乳・乳製品；油脂・油脂加工品；酒類；飲料；調味料；調理冷凍食品；レトルト食品；インスタント食品；魚介せんべいなどの調味乾燥品；魚卵塩蔵品などの塩蔵品；甘露煮、しぐれ煮、角煮などの佃煮；焼き加工品；茹で加工品；魚介味噌などの調味加工品；蒸しかまぼこ、焼きかまぼこ、揚げかまぼこ、茹でかまぼこ、風味かまぼこ、包装かまぼこ、細工かまぼこ、燻製かまぼこなどのかまぼこ；醤油漬、味噌漬、粕漬、酢漬、麹漬などの漬け物；かつお塩辛、うに塩辛、いか塩辛などの塩辛；缶詰；瓶詰；魚醤油；エキス製品などが挙げられる。

本発明の飲食品は、健康飲食品、健康補助飲食品、特定保健用食品、栄養機能食品、等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする飲食品をいう。これらの飲食品には、例えば、アレルギーの症状を緩和する、花粉症の症状を緩和する、アトピー性皮膚炎の症状を緩和する、変形性関節症の症状を緩和する、アレルギーが気になる方の食品、変形性関節症が気になる方の食品などの表示が付されていてもよい。

本発明の組成物をそのまま、または当該組成物を飼料またはペットフードに添加することによって、当該飼料またはペットフードを脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性、変形性関節症抑制活性を有する飼料またはペットフードにすることができるが、対象となる飼料またはペットフードの種類は、活性成分であるクロロフィルｃの脱顆粒抑制作用、アレルギー抑制作用、変形性関節症抑制作用が阻害されないものであれば特に限定されない。

本発明の飼料またはペットフードは、牛、豚、鶏等の家畜・家禽用飼料、甲殻類や魚介類等の養殖用飼料であってもよいし、犬、猫、ハムスター、リス等の愛玩動物用ペットフードであってもよく、特に限定されない。本発明の飼料またはペットフードの形態は特に限定されることはなく、例えばペレットタイプ、クランブルタイプ、フレークタイプ、バルキータイプ、ドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末タイプ、顆粒タイプ、カプセルタイプなどが挙げられる。

以下に実施例を記載して本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されることはない。

（実施例１）クロロフィルｃによる脱顆粒抑制活性評価試験
これまでに脱顆粒抑制作用が知られていなかったクロロフィル類について、以下に記載するＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来細胞株を用いた脱顆粒抑制活性評価試験を行った。

まず、ＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来細胞株を細胞数が２．５×１０^５細胞/ｍｌとなるよう、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；以降ＦＢＳと記載)を含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて希釈し、２４ウェル培養プレートに１ｍｌ/ウェルずつ分注して３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で一晩培養した。培養上清を除去した後、１ｍｌ/ウェルのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと称する）で細胞表面を洗浄し、５０ｎｇ/ｍｌとなるようＭｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）をＤＭＥＭ培地で希釈したＡｎｔｉ ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を５００μｌ/ウェルずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で２時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、Ａｎｔｉ ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を除去した後、１３７ｍＭのＮａＣｌ(ナカライ社製)、２．７ｍＭのＫＣｌ（純正化学社製）、１．８ｍＭのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ(純正化学社製)、１ｍＭのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（純正化学社製）、５．６ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ(和光純薬社製)、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ(和光純薬社製)、０．１％のＢＳＡを含む緩衝液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｙｒｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒ：以下「ＭＴ ｂｕｆｆｅｒ」と称する）を１．５ｍｌ/ウェルずつ用いて洗浄し、これを２回繰り返した。次にクロロフィル類であるクロロフィルａ標品(ＤＨＩ社製)、クロロフィルｂ標品(ＤＨＩ社製)、クロロフィルｃ２標品(ＤＨＩ社製)、クロロフィルｄ標品(非特許文献１０や１１などを参考に紅藻類表面に付着するシアノバクテリアより精製)を０．５％含むＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを４９０μｌ/ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で１０分間インキュベーションした。また、脱顆粒反応の抑制を受けないコントロール群には０．５％のエタノールを含むＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。１０分間のインキュベーション後、２００ｎｇ/ｍｌとなるようＡｌｂｕｍｉｎ, ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｙｌ(ＳＩＧＭＡ社製)を添加して均一になるようよく撹拌した後、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、１０分間氷冷して反応を止め、５００μｌの上清を回収した。培養上清を回収した細胞に５００μｌ/ウェルずつＣｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した後、超音波細胞破砕機を用いて細胞を破砕して均一にした細胞破砕液を５００μｌ回収した。９６ウェルプレートに培養上清及び細胞破砕液を５０μｌ/ウェルずつ分注し、３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、培養上清及び細胞破砕液に、１００ｍＭのクエン酸とｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔｏａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ(和光純薬社製)を３．３ｍＭ含有した水溶液（以下「基質溶液」と称する）を１００μｌ/ウェルずつ加えてよく混合した後、３７℃で２５分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、２Ｍのグリシンを含む水溶液（以下「反応停止液」と称する）を１００μｌ/ウェルずつ添加してよく混合させ反応を停止させた後、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。このような一連の反応により脱顆粒反応によって放出された顆粒中に含まれているβ−ヘキソサミニダーゼの活性を測定することで、細胞から培養上清へ放出された顆粒の割合を算出した。評価に際しては、脱顆粒の抑制反応を受けない、試験サンプルの代わりに１００％のエタノールを０．５％添加したコントロール群の細胞から培養上清へ放出された顆粒の割合を１００％として、試験サンプル添加群における細胞から培養上清へ放出された顆粒の割合を脱顆粒率として評価した。

また、効果の評価に際して、分散分析を行い群間において統計学的に有意な差が認められた群について、Ｄｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較の検定を行った。統計学的に有意な差がある群については、５％の有意水準において有意な差が認められた場合は図表中に記号「＊」を、１％の有意水準において有意な差が認められた場合は図表中に記号「＊＊」を付した。以降全ての実施例において同様の検定を行った。

その結果、図１に示す通り、クロロフィルａ標品、クロロフィルｂ標品、クロロフィルｄ標品においては、まったく脱顆粒抑制活性は認められなかったが、一方で、クロロフィルｃ２標品を添加した群においては、添加したクロロフィルｃ２の乾燥重量濃度が０．０５μｇ/ｍｌ程度の非常に低濃度から濃度依存的な脱顆粒抑制活性を示すことが明らかとなった。よって、これまでクロロフィル類において全く知られていなかった脱顆粒抑制活性について、クロロフィルｃ２に非常に強力な活性を有することが明らかとなり、クロロフィルｃ２を用いることで、脱顆粒反応が関与している花粉症などのアレルギー症状や変形性関節症の予防や治療に有効であることが確認された。

（実施例２）ＲＢＬ−２Ｈ３好塩基球由来細胞株を用いた細胞生存率評価試験
実施例1と同様の濃度に希釈したＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来細胞株を９６ウェル培養プレートに０．１ｍｌ/ウェルずつ分注して３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で一晩培養した。培養上清を除去した後、１ｍｌ/ウェルのＰＢＳで細胞表面を洗浄したのち、実施例1と同様の乾燥重量濃度のクロロフィルｃ２標品を含むＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ/ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で４０分間インキュベーションした。また、脱顆粒反応の抑制を受けないコントロール群には０．５％のエタノールを含むＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。４０分のインキュベーション後、ＷＳＴ−１試薬（(株)同仁化学研究所製）を１０μｌ/ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度条件下で３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、室温にて１０分間静置したのち４５０ｎｍの吸光度を測定することで細胞生存率を評価した。

その結果、図２に示す通り、クロロフィルｃ２標品を添加したいずれの細胞群においても細胞生存率の低下は認められず、実施例1において明らかとなったクロロフィルｃ２による脱顆粒抑制活性は細胞毒性によるものではないことが確認された。

（実施例３）クロロフィルｃの製造例
クロロフィルｃは、上述したように渦鞭毛藻門、クリプト藻門、黄金色藻綱、ラフィド藻綱、褐藻綱、珪藻綱、真正眼点藻綱を含む不等毛藻門、ハプト藻門などの藻類に多く含まれていることが知られているため、クロロフィルｃの含まれる藻類の中から入手が容易で、かつ食経験を有するあかもくを、塩分や多糖類などのクロロフィルｃ以外の水溶性画分や水不溶性の不純物を除去することで簡便で安価にクロロフィルｃを濃縮する目的で、１５倍量の水を用いて３分間撹拌しながら洗浄を行い、同様の洗浄操作を３回繰り返した後、２５℃の条件下で一晩乾燥させたのち、粉砕機を用いて粉砕しクロロフィルｃ以外の不要物除去してクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末を製造した。

また、クロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末から、更にクロロフィルｃを濃縮することを目的として、褐藻類あかもくの乾燥粉末の乾燥重量の１５倍量の水または２０％または４０％または６０％または８０％の含水エタノールまたは１００％エタノールを用いて撹拌しながら、２５℃の条件下で一晩抽出した。抽出した後、吸引濾過して不溶物を除去して得られた抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて乾固させた。

この各乾固抽出物について、実施例１と同様にしてＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来細胞株を用いた脱顆粒抑制活性評価を行ったところ、図３に示す通り、水抽出物には脱顆粒抑制活性はまったく認められず、６０％〜１００％の含水エタノールないしエタノール抽出物にのみ脱顆粒抑制活性が認められた。更には、８０％の含水エタノールを用いて抽出した抽出物に最も強い脱顆粒抑制活性が認められた。よって、クロロフィルｃを効率的に抽出する抽出方法として、６０％〜１００％の含水エタノールないしエタノールを用いることが有効であり、更には８０％の含水エタノールを用いて抽出する場合が最も効率的にクロロフィルｃを抽出出来ることが確認され、クロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末から、クロロフィルｃを濃縮した含水エタノール抽出物を製造した。

また、クロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末から最も効率的にクロロフィルｃを抽出した８０％の含水エタノール抽出物を用いて、更にクロロフィルｃを高度に精製することを目的として、ｎ−ブタノールと水を用いて分液操作を行い、得られたｎ−ブタノール分画物を、更にヘキサンと９０％の含水メタノールを用いて分配操作を行った。得られた９０％の含水メタノール画分を、シリカゲルカラム（ＹＡＭＡＺＥＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社製）を用いて分画操作を行い、同様の分画操作を３回繰り返した。得られたクロロフィルｃの濃縮画分をＯＤＳカラム(Ｗａｔｅｒｓ社製)に供して、４５％のアセトニトリル水溶液と１００％のアセトニトリルを用いてグラジエント溶出を行い、波長２５４ｎｍにおける吸光度を用いてピークを確認しながらＨＰＬＣ分取を行い、Ａ〜Ｋの１１つのフラクションを得た。得られた分画物について、実施例１と同様にしてＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来細胞株を用いた脱顆粒抑制活性評価試験を行ったところ、図４に示す通り、Ｆｒ．Jにのみ脱顆粒抑制活性が認められた。脱顆粒抑制活性が認められたＦｒ．Ｊは、図５に示す通り単一のバンドまで精製されていることが確認され、Ｆｒ．Ｊ及びクロロフィルｃ２標品（ＤＨＩ社製）について、ＨＰＬＣを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定したところ、図６に示す通り、Ｆｒ．J及びクロロフィルｃ２標品共に保持時間が４．６分付近に同一のピークが見られた。更に、図７に示す通り、アセトニトリル水溶液に溶解したＦｒ．Ｊ及びクロロフィルｃ２標品の吸収スペクトルが一致、これら一連の結果よりＦｒ．Jはクロロフィルｃ２であることが特定され、これら一連の操作によってクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末より８０％の含水エタノールを用いて抽出した抽出物から、更に高度に精製したクロロフィルｃ２を製造した。

（実施例４）クロロフィルｃ１またはｃ３による脱顆粒抑制活性評価試験
これまでに脱顆粒抑制作用が知られていなかったクロロフィルｃ１またはｃ３について、実施例１と同様にして脱顆粒抑制活性評価を行った。その結果、図８に示す通り、クロロフィルｃ１標品（非特許文献１２などを参考に褐藻類より精製）またはｃ３標品（ＤＨＩ 社製）を添加した群において、実施例１で確認されたクロロフィルｃ２と同様に脱顆粒抑制活性を示すことが明らかとなった。よって、これまでクロロフィル類において全く知られていなかった脱顆粒抑制活性について、実施例１で確認されたクロロフィルｃ２だけではなく、クロロフィルｃ１またはｃ３にも活性を有することが明らかとなり、いずれかのクロロフィルｃを用いることによって、脱顆粒反応が関与している花粉症などのアレルギー症状や変形性関節症の予防や治療に有効であることが確認された。

（実施例５）クロロフィルｃ１またはｃ３による細胞生存率評価試験
クロロフィルｃ１またはｃ３について実施例２と同様にしてＲＢＬ−２Ｈ３好塩基球由来細胞株を用いた細胞生存率評価試験を行った。その結果、図９に示す通り、クロロフィルｃ１標品、ｃ３標品を添加したいずれの細胞群においても細胞生存率の低下は認められず、実施例４で明らかとなったクロロフィルｃ１またはｃ３による脱顆粒抑制活性は細胞毒性によるものではないことが確認された。

（実施例６）ＳＤラットを用いた血管透過性抑制活性評価試験
1週間の馴化を行った5週齢のＳＤ系雄性ラットに、実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末を、ＡＩＮ−７６文献配合飼料（オリエンタル酵母工業（株）社製）に３重量％または１重量％混合した飼料を２８日間自由摂取させた。あるいは実施例３で製造した褐藻類あかもくの８０％含水エタノール抽出物をＡＩＮ−７６文献配合飼料に１．１重量％混合した飼料を２８日間自由摂取させた。あるいはＡＩＮ−７６文献配合飼料のみを２８日間自由摂取させた（コントロール群）。これらの各飼料を２８日間自由摂取させたＳＤ系雄性ラットの尾静脈に、エバンスブルー色素を投与した。次に、エバンスブルー色素を投与したＳＤ系雄性ラットの背部皮内へ脱顆粒反応を介して血管透過性を惹起する薬剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０を注射した。麻酔下で頚椎脱臼した後、背部皮膚を剥離し、剥離した皮膚組織に浸透しているエバンスブルー色素の量を、プレートリーダーを用いて６２０ｎｍの吸光度を測定することで皮膚組織に透過しているエバンスブルー色素の量を定量した。定量したエバンスブルー色素の量より、コントロール群の皮下組織に透過しているエバンスブルー色素の量を１００％とした時の、各試験食を与えた際のＳＤ系雄性ラットの皮下組織に透過しているエバンスブルー色素の割合を血管透過率として算出した。その結果、図１０に示す通り、１％または３重量%のクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末を含む飼料、または１．１重量％の褐藻類あかもく抽出物を含む飼料を２８日間自由摂取させた群において、コントロール群に比べて血管透過率が抑制された。このことから、生体を用いた試験においても、実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末または褐藻類あかもくの８０％含水エタノール抽出物を経口摂取することによって、脱顆粒反応に起因する血管透過性を抑制し、血管透過性が関与する花粉症などのアレルギー疾患の予防や治療に効果を示すことが明らかとなった。

（実施例７）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた花粉症抑制活性評価試験
１週間の馴化を行った４週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（日本チャールズ・リバー(株)社製）に、０．５％のＣＭＣ溶液に懸濁した実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末を２ｇ/ｋｇ、または０．５％のＣＭＣ溶液に懸濁した実施例３で製造した褐藻類あかもく乾燥粉末から更にクロロフィルｃを濃縮した８０％含水エタノール抽出物を０．２ｇ/ｋｇまたは１ｇ/ｋｇを４週間反復強制経口投与した。あるいは０．５％のＣＭＣ溶液のみ（コントロール群）、または０．５％のＣＭＣ溶液に懸濁した脱顆粒抑制作用により花粉症抑制効果を示す医薬品であるオロパタジン（ＳＩＭＧＡ社製）（医薬品投与群）を４週間反復強制経口投与した。４週間の反復強制経口投与後、生理食塩水にて５０μｇ/ｍｌに溶解したＡｎｔｉＤＮＰ-ＩｇＥ溶液をマウス尻静脈内に投与して受動感作した。感作５日後、生理食塩水にて５０ｍｇ/ｍｌに溶解したＤＮＰ−ＯＶＡ抗原をマウスの両鼻に点鼻投与して鼻炎症状を惹起させ、１時間辺りの鼻掻き回数を数えることによって発症した花粉症症状を評価した。その結果、図１１に示す通り、実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末２ｇ/ｋｇ、または褐藻類あかもくの乾燥粉末から更にクロロフィルｃを濃縮した８０％含水エタノール抽出物１ｇ/ｋｇもしくは０．２ｇ/ｋｇを摂取した群において、コントロール群に比べて花粉症症状による鼻掻き回数を抑制することが明らかとなり、またその効果は、医薬品であるオロパタジンと同程度の強力な効果であることが示された。このことから、実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末または褐藻類あかもくの８０％含水エタノール抽出物を経口摂取することによって、脱顆粒反応を起因として実施例６で確認された血管透過性を抑制することによって花粉症症状を抑制し、花粉症などのアレルギー性鼻炎の予防や治療に効果を示すことが明確となった。

（実施例８）ＤＡラットを用いたＩＩ型コラーゲン感作変形性関節症抑制活性評価試験
１週間の馴化を行った８週齢のＤＡ/Ｓｌｃ雌性ラット（三協ラボサービス（株）社製）に、実施例３で製造したクロロフィルｃを濃縮した褐藻類あかもくの乾燥粉末をＣＲＦ−１配合飼料（オリエンタル酵母工業（株）社製）に３重量％配合した飼料、またはグルコサミン（焼津水産化学工業（株）社製）を２重量％ＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料、または食品用コンドロイチン硫酸（ＳＣＰ(ＮＢ)と表記、(株)マルハニチロ食品社製）を５重量％ＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料、または実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末３重量％に加えてグルコサミンを２重量％ＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料、または実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末３重量％に加えてＳＣＰ(ＮＢ)を５重量％ＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料、またはＣＲＦ−１配合飼料のみ（コントロール群）、を４週間自由摂取させた。４週間自由摂取させた後、腰背部の４箇所に関節症惹起物質であるウシＩＩ型コラーゲン溶液(コラーゲン技術研修会製)を０．１５ｍｇずつ皮内注射することで変形性関節症を惹起した。惹起後、目視により左右の後肢足蹠の状態を観察し、表1に示す後肢足蹠の状態と照らし合わせて発症した関節症を点数付けして評価した。その結果、図１２に示す通り、実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末をＣＲＦ−１配合飼料に３重量％配合した飼料を自由摂取した群において、コントロール群に比べて関節炎スコアが抑制されることが明らかとなり、また、その効果は変形性関節症の予防や治療に用いられているグルコサミンやＳＣＰ（ＮＢ）をＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料を自由摂取した群と同程度以上の、非常に強力な効果であることが示された。更に、実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末を、変形性関節症の予防や治療に用いられているグルコサミンまたはＳＣＰ（ＮＢ）と併用して摂取させることにより、グルコサミンやＳＣＰ（ＮＢ）のみをＣＲＦ−１配合飼料に配合した飼料を自由摂取させるよりも、強く変形性関節症を抑制することが確認された。これらの結果から、実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末を摂取することにより変形性関節症を抑制することが明らかとなった。更に、同じ変形性関節症抑制剤であるグルコサミンやＳＣＰ（ＮＢ）と、実施例３で製造したクロロフィルｃ濃縮褐藻類あかもくの乾燥粉末を併用することによって、より強力な変形性関節症抑制作用を示すことが明らかとなった。

Claims (10)

1. 有効成分としてクロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制剤組成物。
2. 変形性関節症抑制剤又はアレルギー抑制剤として使用する、請求項１に記載の組成物。
3. クロロフィルｃが褐藻類から抽出されてなる、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 褐藻類が、あかもく、かじめ、くろめ及びこんぶからなる群から選択される請求項３に記載の組成物。
5. グルコサミン及び／又はコンドロイチン硫酸を更に含有する請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
6. 有効成分としてクロロフィルｃを含有する脱顆粒抑制用食品組成物。
7. 変形性関節症抑制用又はアレルギー抑制用として使用する、請求項６に記載の食品組成物。
8. クロロフィルｃが褐藻類から抽出されてなる、請求項６又は７に記載の食品組成物。
9. 褐藻類が、あかもく、かじめ、くろめ及びこんぶからなる群から選択される請求項８に記載の食品組成物。
10. グルコサミン及び／又はコンドロイチン硫酸を更に含有する請求項６〜９のいずれかに記載の食品組成物。