JP2008263978A - 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】表面上での核酸の単離及び精製のための方法及び装置の提供。核酸を含む試料から、単純な方法で、核酸を固定化し、かつ同様に単純な工程によってリリースする。それにより単純な実施が完全に自動化された方法の実施を特に可能にする表面、例えば多孔性膜を使用する方法を提供する。更に、その後の反応段階において、複雑さなしにこの相から核酸を再度リリースでき、かつ、使用できるのであれば、更なる適用、例えば、制限分解、RT、PCT若しくはRT−PCRのために、又は他のいずれかの上述した分析的-若しくは酵素的反応において核酸を使用することができるような方法で、核酸を、固定相、特に膜と結合させうる。該方法を実施することができる特別な単離容器も提供する。
【選択図】なし
Description
- 少なくとも1つの核酸試料を膜に供給すること;
- 膜における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の膜からのリリース; 及び
-- ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、アクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド(polyvinylidendifluoride)、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩(polyethylentetrafluorethylene-copolymerisate)、ポリベンズイミダゾール(polybenzimidazole)、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩(polyethylenechlorotrifluorethylene-copolymerisate)、ポリイミド、ポリフェニレンスルフィド(polyphenylenesulfide)、セルロース、セルロース混合エステル(cellulose mixed esters)、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル(polyacrylnitriles)、ポリアクリロニトリル共重合体(polyacrylnitrile-copolymers)、ニトロセルロース、ポリプロピレン及び/又はポリエステルを含む膜を通した輸送(transfer)によるリリースされた核酸の除去。
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 溶出媒体(elution medium)による表面からの固定化された核酸のリリース。
- 表面において、少なくとも1つの核酸試料に含まれる核酸の固定化を可能にする結合形成条件への、少なくとも1つの核酸試料の標準化;
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給; 及び
- 表面における核酸の固定化、
を含み、結合条件の調整の前及び/又は後に、予備精製が行われることを特徴とする。
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- リリースされた核酸の表面からの除去
が続けて行われる。
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 核酸による増幅反応の実施。
- 適用可能であれば、 (これらが反応中になお結合する限り) 表面からの反応 生成物のリリース; 及び
- リリースされた反応生成物の表面からの除去。
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- 少なくとも1つの核酸における化学反応の実施; 及び
- 事前に固定化を行わない、表面からの核酸の除去。
- 内部に配置された膜を有する単離容器の設置;
- 核酸の少なくとも1つの試料を備えた単離容器への供給;
- 膜上での核酸の固定化;
- 膜を通した試料の液体成分の輸送; 及び
- 単離容器内に配置された膜上での少なくとも1つの核酸の性質の分析。
- 少なくとも1つの膜が配置された単離容器の設置;
- 1つの核酸試料の単離容器への供給;
- 核酸が少なくとも1つの膜と結合するような、試料に含まれる核酸のアルコ ールによる沈殿。この方法は、少なくとも1つの膜の孔径が、0.2μm以 上であることを特徴とする。
- 所定量の洗浄バッファーの表面上への適用; 及び
- 表面を通した洗浄バッファーの輸送。
- 固定化バッファーと核酸試料との混合;
- 固定化バッファー混合した核酸試料の表面上への供給; 及び
- 本質的に供給方向における表面を通した液体成分の輸送。
ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、硝酸セルロース(cellulose nitrate)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート及びアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩又はポリフェニレンスルフィド、セルロース及びセルロース混合エステル、酢酸セルロース又は窒素含有セルロース(nitric cellulose)及びポリベンズイミダゾール、ポリイミド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、疎水化ガラス繊維膜、それら中で疎水化ナイロン膜が特に好ましい。
生体試料由来である場合、それらは適当なバッファーでまず溶解されるべきである。ここで、追加の方法を、溶解、例えば均質化又は超音波のような機械的な影響、酵素の影響、温度の変化又は添加剤のために導入することができる。必要であるか所望される場合、溶菌からいかなる砕片(debris)をも取り除くために、溶解の後に予備精製段階を行うことができる。次いで、まだ実施されていないならば、表面における核酸の固定化が行われる条件が標準化される。結合条件の標準化の後であっても、累積的に(cumulative)又は代わりに予備精製段階を続けることができる。
図1は、本発明による方法の実施に適した自動装置の概略図を示す。
図2は、本発明の方法の実施のための単離容器及び回収管の第一の態様を示す。
図3は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第二の態様を示す。
図4は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第三の態様を示す。
図5は、本発明による上部を有する単離容器の態様を示す。
図6は、本発明の方法による様々な試料の、電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図7は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図8は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図9は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の更に別の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図10は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを再度示す。
図11は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを最後に示す。
図2では、漏斗型単離容器10には、溶解及び洗浄バッファーを吸収するために働くスポンジ様材料13を含有する回収管12上に配置される表面11、例えば膜が備えられる。吸引性能を改善するために、スポンジ様材料13の下に超吸収性層(superabsorbent layer)14を配置することもできる。代わりに、層14は、水を化学的に、例えばアクリレートに変化させることができる材料を含むこともできる。それにより、水も工程から除去される。核酸の溶菌液及び他の調製物を、漏斗に入れる。スポンジ様材料13は、膜11を通して適用された液体を取り出す。溶出バッファーの添加の前に、スポンジは、例えば、回収管12(図示せず)の内部の機構によって、膜から多少間隔を置いて配置される。これは、最後の段階において溶出液バッファーもが、膜11を通して吸い取られることを防止するであろう。このバッファーは、表面(図1b)で少し(rather)留まり、そして上方で核酸と共に除去することができる。このアセンブリーを使用する場合、自動装置において真空機構5は必要とされない。
図5Aは、円筒状上部20を有する単離容器を示す。この上部は、ねじ連結装置25によって下部22に接続される。液体の強固な結合(liquid-tight connection)を可能にし、かつ膜11を支持する限り、ねじ連結装置の代わりに、他の形の連結部を使用することもできる。この例の態様において、膜11が、上部20の底部開口部に直接配置される。しかし、それは、内側へ、又は上部の壁に対して90°ではない角度に配置されることもある。下部は、同様に円筒状の形を示すが、他の態様では、違うように開発されることもある。そのような長方形型として、基板上の上部20の安定性を改善するものが使用されてもよい。例えば、本発明による方法の所定のオプション(certain options)を用いて使用された溶液を吸収剤材料に完全に含有させるために、下部22においてより大きな空間が必要とされる場合、上部20に関連する下部22の拡大も可能である。
HeLa細胞からの全RNAの単離
化学的後処理によって疎水性にされた市販の疎水性ナイロン膜(例えばMSI製の材料:1.2μmの孔径を有するマグナSH(Magna SH)、又はパル社(Pall GmbH)製の材料:1.2μmの孔径を有するヒドロロン(Hydrolon))は、プラスチックカラム中に、単一層で配置される。これらの膜は、機械的支持体として役立つポリプロピレン・フリット上に配置される。これらの膜は、環を有するプラスチックカラム中に固定される。
2列目は、1.2μmの孔径を有するヒドロロンからの疎水性ナイロン膜によって単離された全RNAを表す。
3列目は、シリカ膜によって単離された全RNAのクロマトグラムを表す。
それぞれの場合において、50μlの全RNA単離物が分析された。
様々な塩/アルコール混合物によって疎水性膜とRNAを結合させるによる結合していないRNAの単離
この実施例において、溶菌液及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水性膜に通される。
疎水性ナイロン膜(例えばパル社(Pall company)製1.2μmヒドロロン)は、実施例1と同様の方法で、真空チャンバーに連結したプラスチックカラムへ導入される。
HeLa細胞からの全RNAの単離
実施例1に従って、様々な疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、遠心分離によって以下の単離段階を行う。
膜当り3−5つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、シリカ膜の使用によって、測定可能な容量の全RNAは全く単離することができない。
親水性膜上への結合によるHeLa細胞からの全RNAの単離
実施例1に従って、様々な親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、以下の単離段階を遠心分離によって行う。
異なる親水性ナイロン膜による単離の結果を、表3bに示す。膜当り2−5つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、測定可能な容量の全RNAを単離することはできない。
水溶液からの結合していないRNAの単離
実施例1に従って、異なる疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製RLTバッファー350μlと混合する。続いて、エタノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離(10000×g;1分)によって膜に通す。続いてバッファー、例えばキアゲン製RPEによって膜を2回洗浄する。
各バッファーを、遠心分離によって膜に通す。膜を乾燥させるために、最後の洗浄段階を、20000×gで行う。
この方法で得られた、単離された全RNAの容量を、260nmでの吸光度測定によって測定する。260及び280nmでの吸光度の値の比の測定により、RNAの品質を測定する。
膜当り3−5つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜を使用することによって、溶出液を膜の最上面から取り除くことにより回収する場合、測定可能な容量の全RNAを単離することはできない。
親水性膜に結合することによる水溶液からの結合していないRNAの単離
実施例1に従って、異なる親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製RLTバッファー350μlと混合する。続いて、エタノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って膜へ通し、洗浄及び乾燥させる。
続いて、実施例1に既に記載したようなRNAを、RNaseを含まない水によって溶出し、膜の最上面からピペットで取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全RNAの容量を、260nmでの吸光度測定によって測定する。260及び280nmでの吸光度の値の間の比の測定によって、RNAの品質を測定する。
膜当り2−5の並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が膜の最上面から除去されることにより回収される場合、測定可能な容量の全RNAを単離することはできない。
膜の孔径に依存するHeLa細胞からの全RNAの単離
実施例1に従って、異なる孔径を有する疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てた。
実施例3に従って、5×105個のHeLa細胞から細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーRW1及びRPEによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、20000×gで2分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例1に記載のように溶出を行う。
結果を下記表5に記載する。
膜当り3−5つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
HeLa細胞から単離された全RNAの安定性及び品質
実施例1に従って、親水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、孔径3μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
実施例3に従って、5×105個のHeLa細胞から、細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーRW1及びRPEによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、20000×gで2分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例1に記載のように溶出を行う。
単離された全RNAを、37℃で16時間インキュベートし、続いて非変性(non-denaturalizing)アガロースゲルに適用し、分析する。RNAが何ら変性されなかったことが明らかになる。上記の方法によって単離されたRNAは、核酸分解酵素による汚染を示さないので、高品質である。
96ウェルトレイ(96-well-tray)内の親水性膜における結合による水溶液からの結合していないRNAの単離
親水性ポリビニリデンジフルオライド膜を有する96ウェルプレート(ミリポア社(millipore)製デュラポア(Durapore)、0.65μm)を使用する。
全RNAを含む水溶液5.3mlを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば、キアゲン社製RLTバッファー18.4mlと混合する。続いて、エタノール13.1mlを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物350μlを、ウェル毎に添加し、真空を適用することによって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のRPEによって膜を2回洗浄する。バッファーは、それぞれの場合において、バッファーを、真空の適用によって膜を通して輸送する。最後の洗浄段階の後に、紙タオルによってトレイを拭き取り、次いで真空を適用することによって5分間乾燥させる。続いて、RNAを、実施例1に記載のようにRNaseを含まない水によって溶出し、膜からピペットで取り除く。
この方法で得られた、単離された全RNAの容量は、その後260nmでの吸光度測定によって測定され、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出した。平均値は8.4μgで、標準偏差は0.7μgである。
毛管力による全RNAの単離
親水性ポリビニリデン・ジフルオライド膜(ミリポア社製デュラポア、0.65μm)を有する96ウェルプレートを使用する。
全RNAを含有する水溶液33μlを、市販のイソシアン酸グアニジニウム(guanidinium-iso-cyanate)を含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製RLTバッファー110μlと混合する。続いて、エタノール78μlを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物45μlを、ウェル毎に添加する。 強い吸引性(suction properties)を有する家庭用スポンジを水に浸し、スポンジの表面上の膜の底面に96ウェルプレートを配置する。RNA混合物を、毛管力によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のRPEによって膜を2回洗浄する。トレイをスポンジの表面に置くことによって、バッファーも膜を通して輸送することができる。最後の洗浄段階の後、トレイを5分間空気にさらして乾燥させる。
続いて、実施例1に記載のように、RNaseを含まない水によってRNAを溶出し、ピペットによって膜から取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全RNAの容量を、260nm0の波長での吸光度測定によって測定し、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出する。平均値は5.9μgで、標準偏差は0.7μgである。
塩酸グアニジニウムを含有するバッファーによる水溶液からのゲノムDNAの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばMSI社製マグナSH、孔径5μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン社製バッファーを用いて精製を行う。
肝臓組織由来のゲノムDNAを含有する水溶液200μlを、PBSバッファー中で調製する。塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えば、キアゲン社製AL200μlを添加して混合する。続いて、エタノール210μlを添加し、ボルテックスミキサーによる攪拌によって混合する。実施例3に従って、混合物をカラムへ添加し、遠心分離によって膜を通して輸送する。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製AWによって膜を洗浄し、乾燥させる。実施例1に記載のように溶出を行う。3つの並行試験を行い、平均値を算出する。
イソチオシアン酸グアニジニウムを含有するバッファーによって疎水性膜に結合させることによる水溶液からのゲノムDNAの単離
実施例1に従って、様々な膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全DNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(4MのGITC、0.1MのMgSO4、25mMのクエン酸ナトリウム、pH4)350μlと混合する。続いて、エタノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物をカラムへ添加し、遠心分離(10000×g;1分)によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製RPEによって膜を2回洗浄する。それぞれの場合、遠心分離によって膜を通してバッファーを輸送する。膜を乾燥させるために、20000×gにおいて最後の洗浄段階を行う。実施例1に記載のように溶出を行う。膜当り3つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
結果を表6に記載する。
組織からのゲノムDNAの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばMSI製マグナ−SH、5μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲンのバッファーによって精製を行う。
ATLバッファー180μlを、腎臓組織(マウス)10mgへ添加し、機械的ホモジナイザー(homogenizer)においてすり潰す。続いて、プロテイナーゼ(proteinase)K(水20μlに約0.4mg溶出)を添加し、55℃で10分間インキュベートする。塩酸グアニジニウム含有バッファー、例えばキアゲン製AL200μlを添加した後、及び70℃で10分間インキュベートした後、この溶液へエタノール200μlを加えて混合する。この混合物をカラム内へ置き、遠心分離によって膜に通す。アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製AW1及びAW2によって膜を洗浄し、続いて遠心分離によって乾燥させる。実施例1に記載のように溶出を行う。3つの並行試験を行い、平均値を算出する。
血液からのゲノムDNAの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えば、MSI社製マグナ−SH、5μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン製バッファーによって精製を行う。
続いて、単離されたDNA量を、260nmの波長における吸光度の測定によって測定すると、1.03μgである。260nm及び280nmでの吸光度の比は、1.7である。
RNAとDNAとの混合物からの全RNAの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、1.2μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNA及びゲノムDNAを含有する水溶液275μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製RLTバッファー175μlと混合する。続いて、エタノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物をカラムに加え膜を通して輸送し、実施例4に従って洗浄及び乾燥する。最初の遠心分離段階からの浸透物(penetrant)は、市販のミニスピンカラム(Mini-Spin-Column)(例えば、キアゲン社製QIAampミニスピンカラム)へ輸送され、遠心分離によって膜を通して取り出される。実施例4に従い、更なる洗浄段階を行う。続いて、遠心分離(10000×g、1分)によって、RNaseを含まない水を用いて核酸を溶出し、非変性アガロースゲルにおいて分析する(図7)。ここで記載の方法は、全RNAとゲノムDNAの良好な分離を可能にする。
1列目:疎水性ナイロン膜による全RNAの単離;
2列目:キアゲン社製QIAampミニスピンカラムによる浸透物からのゲノムDNAの単離。
疎水性及び親水性膜との結合によるに水溶液からのプラスミドDNAの単離
実施例1に従って、様々な膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液(クロンテック社(Clontech company)製pCMV□)100μlを、塩酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(4MのGITC、0.1MのMgSO4、25mMの酢酸ナトリウム、pH4)350μlと混合する。続いて、イソプロパノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物を、実施例4に従ってカラムに加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。最後に、プラスミドDNAを、実施例1に既に記載したようなRNaseを含有しない水によって溶出し、ピペットで膜から取り除く。
その後、単離されたプラスミドDNAの容量を、260nmの波長での吸光度測定によって測定する。
様々な膜をによる単離の結果を、以下の表に記載する。
膜当り3つの並列試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
異なるカオトロピック剤の使用による水溶液からの全RNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液各100μlを、異なる濃度のイソチオシアン酸グアニジニウム(GITC)又は塩酸グアニジニウム(GuHCl)を含む異なる溶解バッファー350μlと混合する。続いて、エタノール250μlを加え、ピペッティングによって混合する。その後、混合物をカラムへ輸送し、遠心分離(10000×g;1分)によって膜に通す。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製RPEによって膜を2回洗浄する。遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、20000×gで最後の洗浄段階を行う。実施例1に記載のように溶出を行う。2つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表8に記載する。
異なるアルコールの使用による水溶液からの全RNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度4M)350μlと混合する。続いて、異なる量のエタノール又はイソプロパノールを加え、700μlまでのRNaseを含有しない水を入れて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って膜に通し、洗浄する。実施例1のように溶出を行った。
2つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表9に記載する。
様々なpH値を有する水溶液からの全RNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度4M)350μlと混合する。バッファーは、クエン酸ナトリウム25mMを含有し、HCl又はNaOHによって異なるpH値に調整される。続いて、エタノール250μlを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って膜に通して洗浄する。実施例1のように溶出も行った。2つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表10に記載する。
様々な塩類を含む水溶液からの全RNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNA含有水溶液100μlを、塩類(NaCl、KCL、MgSO4)を含有する溶解バッファー350μlと混合する。 続いて、H2O又はエタノール250μlを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って膜に通し、洗浄する。2つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表11に記載する。
様々なバッファー条件による水溶液からの全RNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度2.5M)350μlと混合する。溶解バッファーを、様々な濃度のpH7のクエン酸ナトリウム、又はpH7.2のシュウ酸ナトリウムと混合する。 続いて、エタノール250μlを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、そして、実施例1に従って、膜に通して洗浄し、溶出する。
結果を表12に記載する。2つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
様々なバッファー物質による水溶液からの全DNAの固定化
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン1.2μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全DNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(4MのGITC、0.1MのMgSO4)350μlと混合する。溶解バッファーを、様々なバッファー物質(濃度25mM)と混合し、様々なpH値に標準化する。続いて、エタノール250μlを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って、膜に通し、洗浄し、そして溶出する。
結果を表13に記載する。3つの試験を行い、それぞれの時点で平均値を決定する。
フェノールによる水溶液からの全RNAの固定化
実施例1のように、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、1.2μm)を有するプラスチックカラムを構成する。
RNA水溶液を、フェノール700μlと混合し、遠心分離によって膜を通して分配する。実施例4のように、膜を洗浄し、RNAを溶出させる。2つの測定を行った。それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離されたDNAの容量を、260nmの波長での吸光度測定によって測定すると、約10.95μgになる。260nmにおける吸光度と280nmにおけるものの比は、0.975になる
異なる塩濃度の下で固定化された全RNAの洗浄
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー350μl(濃度4M)と混合する。続いて、エタノール250μlを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例4に従って膜に通し、洗浄する。その後、様々な濃度のNaCl及び80%エタノールを含有するバッファーで、膜を2回洗浄する。各回ごとに、遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、20000×gで最後の洗浄段階を行う。実施例1に従って溶出も行われる。2つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表14に記載する。
異なる塩及びバッファー条件の下での固定化された全RNAの溶出
実施例1に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全RNAを含有する水溶液100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー350μl(濃度4M)と混合する。続いて、エタノール250μlを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例1に従って膜へ通し、洗浄する。
溶出のために、精製されたRNAを膜から溶出するために、70μlのNaCl含有溶液、トリス/HClバッファー(pH7)、又はシュウ酸ナトリウム水溶液(pH7.2)を、ピペットで膜上へ移す。1〜2分のインキュベーションの後、10−30℃の温度において、ピペットで溶出液を膜の表面から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を1回繰り返す。2つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表12に要約する。
様々な温度における固定化されたRNAの溶出
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、3μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
単離のために、5×105個のHeLa細胞を使用する。以後の単離段階は、実施例3に記載のように行われる。
溶出のために、様々な温度のRNaseを含まない水70μlを、膜からRNAを溶出するために、膜上へピペットで移す。適当な溶出温度における1−2分のインキュベーションの後、溶出液をピペットで膜の上方から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を1回繰り返す。
3つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表16に要約する。
遠心分離による固定化されたRNAの溶出
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン 1.2μm)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全DNAを含有する水溶液350μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば キアゲン製RLTバッファー350μlと混合する。続いて、エタノール250μlを加えてピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離(10000×g;1分)膜に通す。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製RPEによって膜を2回洗浄する。各回において、バッファーを、遠心分離によって膜を通して輸送する。膜を乾燥させるために、20000×gにおいて最後の洗浄段階を行う。
溶出のために、RNaseを含有しない水70μlを、RNAを膜からリリースするためにピペットで膜上へ移す。10−30℃の範囲内の温度で、1分間インキュベートした後、溶出液を、遠心分離(10000×g、1分)によって膜を通して輸送する。完全な溶出を確実なものにするために、溶出段階を再び繰り返し、それら溶出液を混合する。5つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離された全RNAの容量を、260nmの波長における吸光度測定によって測定すると、平均で6.4μgになる。260nmにおける吸光度と280nmにおけるものの比は、1.94になる。
β-アクチン(β-actin)mRNAの増幅及び検出のための5´−ヌクレアーゼPCR検定(5'-nuclease PCR-assays)の使用による“リアルタイム”定量RT−PCR(“Real Time”quantitative RT-PCR)における全RNAの使用
実施例3に従って、市販の膜(パル、3μmの孔径を有するヒドロロン)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
RNAを単離するために、1×105個のHeLa細胞を使用し、実施例1に記載のように全RNAの精製を行う。実施例1に記載のように、2×70μlのH2Oによって溶出を行う。残留する微量のDNAの完全な除去のために、分析前にDNaseによって試料を処理する。
37℃で1時間、cDNA合成を行い、その後直ちにPCRを40サイクル行う。パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ(Perkin Elmer Applied Biosystems)製ABI PRISMTM7700配列検出機(ABI PRISMTM Sequence Detector)において、反応及び分析を行う。PCRサイクル中に生成された全てのアンプリコン(amplicon)は、タクマン−プローブから分割することによって生成される発光分子(light-emitting molecule)を生じさせる。生成された全ての光信号は、生成されるアンプリコン量に正比例し、従って全RNA試料中の最初の転写可能容量に正比例する。発光を装置で測定し、コンピュータープログラムによって評価する。光信号を、バックグラウンド上で検出せざるを得ないPCRサイクルは、“しきい値サイクル(Threshold Cycle)”(ct.)と呼ばれるであろう。この値は、試料中で使用することができる特異的に増幅されたRNAの量に対する尺度(measure)である。
β−アクチンmRNAの増幅及び検出のためのRT−PCRにおける全RNAの使用
実施例1に従って、市販の膜(パル社、1.2又は3μmの孔径を有するヒドロロン;サルトリウス社(Sartorius company)、0.45μmの孔径を有するサルトロン(Sartolon))を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
RNAを単離するために、2つの異なる原料を使用する:
1)水溶液中の肝臓(マウス)からの全RNA;実施例4に記載のように、精製及び溶出を行う;及び
2)5×105個のHeLa細胞;実施例3に記載のように全RNAの生成及び溶出を行う。
それぞれの試験に対し、単離された全RNA20ngを使用する。対照として、RNeasy−キット(キアゲン)によって精製されたRNA及びRNAを含まない調製物を使用する。
A:1〜8列:150Bp−フラグメントのRT−PCR;
1、2列:ヒドロロン1.2μm膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのRNA;
3、4列:サルトロン膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
5、6列:ヒドロロン3μm膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
7列:RNeasy−ミニキット(RNeasy-Mini-Kit)によって精製したRNA;
8列:RNAを含まない対照。
B:1〜8列:1.7kBp−フラグメントのRT−PCR
1、2列:ヒドロロン1.2μm膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのRNA;
3、4列:サルトロン膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
5、6列:ヒドロロン3μm膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
7列;RNeasy−ミニキットによって精製したRNA;
8列:RNAを含まない対照。
β−アクチンmRNAの増幅及び検出のためのNASBA反応(核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence based amplification))における全RNAの使用
実施例1に従って、市販の膜(パル社、1.2又は3μmの孔径を有するヒドロロン;サルトリウス社、0.45μmの孔径を有するサルトロン)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
RNAを単離するために、2つの異なる原料を使用する:
1)水溶液中の肝臓(マウス)からの全RNA;実施例4に記載のように精製及び増幅を行う;及び
2)5×105個のHeLa細胞、実施例3に記載のように全RNAの精製及び溶出を行う。
上記の方法で単離した、使用される20ngの全RNAに対し、特異的転写を確認することができる(図9)。
1〜8列:NASBA反応物;
1、2列:ヒドロロン1.2μm膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのRNA;
3、4列:サルトロン膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
5、6列:ヒドロロン3μm膜によって精製したHeLa細胞からのRNA;
7列:RNeasyミニキットによって精製したRNA;
8列:RNAを含まないRNA
疎水性膜上のβ−アクチンmRNAの増幅及び検出のためのNASBA反応
実施例1に従って、市販の膜(パル社、3μmの孔径を有するヒドロロン;0.45μmの孔径を有するスポール(Supor)−450;ミリポア社(Millipore company)、3μmの孔径を有するフルオロポア(Fluoropore)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
反応容器を、まず最初に湯浴(waterbath)において41℃で5分間インキュベートする。この反応に続いて、RNaseH、T7ポリメラーゼ及びAMVV−RTからなる酵素混合物を加えて41℃で90分間インキュベートする。続いて、増幅された調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
A:1〜4列:HeLa細胞から、ヒドロロン3μm膜によって精製したRNA;
1列:2.5×105個の細胞;
2列:1.25×105個の細胞;
3列:6×104個の細胞;
4列:3×104個の細胞;
B:1〜3列:HeLa細胞から精製したRNA;
1列:2.5×105個のHeLa細胞からヒドロロン3μm膜によって精製したRNA;
2列:5×105個のHeLa細胞からスポール−450PRによって精製したRNA;
3列:5×105個のHeLa細胞からフルオロポア3μm膜によって精製したRNA。
酵素AvaIを有する疎水性膜上でのプラスミドDNAの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製スポール−200PR)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液(クロンテック社(Clontech company)製pCMV)100μlを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(4MのGITC、0.1MのMgSO4、25mMの酢酸ナトリウム、pH 4)350μlと混合する。続いて、イソプロパノール250μlを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物を、実施例4に従ってカラムへ加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。
制限酵素AvaI用バッファー100μlを膜へ適用し、そして
1)除去し、新しい反応容器へ移し、続いて制限酵素(例えば、プロメガ社(Promega company)製AvaI)を加え;
2)制限酵素(例えば、プロメガ社(Promega company)製AvaI)をカラム中の溶出液に加える。
1列:切断されていないプラスミド;
2、3列:AvaI用反応バッファーによる溶出、新しい容器内での制限;
4、5列:膜上でのAvaIによる制限。
イソプロパノールによる沈殿のための加圧濾過
標準のプロトコルに従って、アニオン交換クロマトグラフィーによって溶出段階に含まれるプラスミドDNAの単離を行う。高塩濃度バッファーにおいてカラムからDNAを溶出する。続いて、0.7容量のイソプロパノールをこのDNA溶液に加え、調製物を混合し、室温で1−5分間インキュベートする。使用する濾過装置は、濾過カートリッジ内に5cm2の表面を有する0.45μmの酢酸セルロースフィルターである(滅菌濾過用標準装置、例えば、サルトリウス社製ミニサート(Minisart))。このフィルターは、プランジャ(plunger)が取り除かれたシリンジ上に差し込まれる。
ここでシリンジをDNAとイソプロパノールとの混合物で充填し、混合物をプランジャによってフィルターを介して加圧する。この形の沈殿物中には、(細孔を通ることができない)DNAが高い割合でフィルター上に残留する
ここで、シリンジからプランジャを取り除き、再度取り替えて、そしてフィルターを介して空気を加圧する。この段階は、1−2回繰り返され、膜の乾燥に役立つ。
続いて、バッファーがシリンジの本体に充填され、プランジャによって膜を介して加圧されるように溶出するために低塩バッファーを使用する。収量を増加させるために、この最初の溶出液は、シリンジ本体にもう一度充填され、プランジャによって膜を介して加圧される。この試験装置によって得られた収量は、典型的には80%〜90%の範囲である(実施例34参照)。
イソプロパノールによるDNAの沈殿のための真空濾過
加圧濾過のように、プラスミドDNAをまず最初に単離し、0.7容量(vol)のイソプロパノールを加える。濾過装置は、5cm2の表面を有する0.45μmの酢酸セルロースが供えられた、真空濾過用に構成された装置である。0.45μmの硝酸セルロースフィルター又は0.65μmの酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースの多層フィルターを使用することもできる。
イソプロパノールとDNAとの混合物を1−5分間インキュベートし、次いで濾過装置上に移す。真空をつなぐことにより、フィルターを通して溶液を吸い取る。適量の70%エタノールをDNA沈殿を含むフィルターに加え、真空を再度つなぐことによって洗浄する。低塩バッファーを添加することにより、フィルターからのDNAの溶出を行い、短時間のインキュベーションを行い、そしてもう一度真空をつなぐ。2回目の容量の低塩バッファーを用いてフィルターから再度溶出することにより、又は1回目の溶出段階からの溶出液による再開された(renewed)溶出によって、生成物を得ることができる。
ここでも同様に、得られた収量は、典型的には、初めに使用されたDNAの80%〜90%の範囲である。
方法として、実施例32において示された真空濾過を使用する。真空濾過器サルトリウス(Sartorius)16315を、濾過容器として使用する。DH5αから単離されたpCMVβを、プラスミドDNAとして使用する。
実施例34に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用された濾過装置は、市販の0.45μm酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。プラスミドDNAとして、DH5αから単離されたpCMVβを使用する。
実施例32に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用した濾過装置は、濾過チャンバー(QIAvac)上に差し込まれた市販の0.45μmの酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。貯蔵部として、シリンジの本体を、フィルターの他方の端へ取り付ける。DH5αから単離したPCMVβを、プラスミドDNAとして使用する。15mlのQFバッファー(高塩濃度バッファー)を、500μgのプラスミドに加えて混合する。10.5mlのイソプロパノールを加えて再度混合する。これを、5分間インキュベートする。このように沈殿させたプラスミドDNAを、濾過装置に固定した膜へ移す。ここで、真空をつなぎ、濾過を開始する。フィルターは、70mlエタノール5mlで洗浄しない。むしろ、2mlのバッファーEB(キアゲン)によって直ちに溶出を行う。溶出液によって後溶出を1回行う。DNAの総量を測定する。以下の結果が得られる:
Claims (17)
- 以下の段階を含む単離容器内での核酸の分析方法;
- 膜を備えた単離容器の設置;
- 少なくとも1つの核酸試料の単離容器への供給;
- 該膜における核酸の固定化;
- 該膜を通した試料の液体部の輸送;及び
- 単離容器内に含まれる該膜上の核酸の少なくとも1つの性質の分析。 - 液体部の輸送後に、少なくとも1つの化学反応が核酸において行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 分析される性質が、核酸の放射性であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 分析される性質が、核酸の分子に対する結合力であることを特徴とする請求項1又は3に記載の方法。
- 前記分子が抗体であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記分子が核酸結合蛋白質であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記分子が染料分子であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 供給が上方で行われることを特徴とする請求項1〜7の1項に記載の方法。
- 以下の段階をさらに含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固定化された核酸の該膜からのリリース;
- 核酸における少なくとも1つの化学反応の実施;及び
- 更なる固定化を伴わない該膜からの核酸の除去。 - 化学反応が核酸増幅反応である請求項9に記載の方法。
- 増幅反応が等温ではないことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 増幅反応が等温であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 増幅反応が、SDA反応(“鎖置換増幅”)、PCR又はRT−PCRであることを特徴とする請求項10〜12の1項に記載の方法。
- 増幅反応の実施前に、核酸が適当な反応バッファーによって膜からリリースされ、かつ溶出液が膜上又は膜内に置かれることを特徴とする請求項10〜13の1項に記載の方法。
- リリースされた増幅反応生成物の膜からの除去を更に含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 膜からの核酸のリリースを引き起こさない反応バッファー中で増幅反応が行われることを特徴とする請求項10〜13の1項に記載の方法。
- 以下の段階を更に含むことを特徴とする請求項16に記載の方法;
- 膜からの増幅反応生成物のリリース;及び
- リリースされた増幅反応生成物の該膜からの除去。
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