JPWO2018061877A1 - 核酸を抽出する方法及びそれに用いるキット - Google Patents

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Abstract

生体試料から核酸を抽出する方法を開示する。かかる方法は（ｉ）生体試料と陰イオン性界面活性剤とカオトロピック化合物とを混合して、溶解液を得る工程と、（ｉｉ）溶解液と沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを混合し、核酸をシリカ粒子に吸着させる工程と、（ｉｉｉ）核酸を吸着したシリカ粒子を洗浄液により洗浄する工程と、（ｉｖ）シリカ粒子に吸着した核酸を溶出液により溶出する工程と、を備え、少なくとも工程（ｉ）及び（ｉｉ）を７５℃を超える温度で行う。

Description

本発明は、核酸を抽出する方法及びそれに用いるキットに関する。
生体試料から核酸を抽出する方法の一つとして、ＢＯＯＭ法がある（例えば、特許文献１を参照）。この方法では、核酸などの生体高分子から水和水を奪い当該生体分子の高次構造を不安定化させる物質であるカオトロピック化合物の存在下で、核酸をシリカ粒子に吸着させ、生体試料から核酸を単離する。
ＢＯＯＭ法を利用した方法として、例えば、生体試料を溶解する工程と、カオトロピック化合物及び／又はアルカノールの存在下で、シリカ等と核酸とを固定化する工程とを備える方法であって、当該核酸の固定化を３６〜７５℃の温度範囲で実施する方法が挙げられる（例えば、特許文献２を参照）。
特開平２−２８９５９６号公報 特表２００８−５２９５０９号公報
核酸を抽出するには、細胞の膜構造を破壊し、内容物を細胞外に放出させる溶解工程が必要である。溶解方法の一つとしてタンパク質分解酵素による酵素的溶解法が、市販の核酸抽出キットでは広く採用されている。また、微生物の中でもグラム陽性菌や真菌など特殊な細胞壁を有する細胞から核酸を抽出する場合には、リゾチームやザイモリアーゼなどの細胞壁分解酵素による前々処理が別途必要となる。このため生物材料の種類に応じて、一般的に、対応するキットあるいはプロトコールは異なる。
また酵素的溶解法を採用しているキットの多くは、核酸抽出の全工程時間に対して、溶解工程に大部分の時間を割いている。また、さらに遠心分離工程が必要な場合が多い。よって、迅速性が求められるようなアプリケーションには適していない。
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、したがって、本発明の目的は、生体試料から、核酸を抽出するために要する時間を短縮することができる、核酸を抽出する方法及びそれに用いるキットを提供することである。
本発明は、生体試料から核酸を抽出する方法であって、（ｉ）生体試料と陰イオン性界面活性剤とカオトロピック化合物とを混合して、溶解液を得る工程と、（ｉｉ）溶解液と沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを混合し、核酸をシリカ粒子に吸着させる工程と、（ｉｉｉ）核酸を吸着したシリカ粒子を洗浄液により洗浄する工程と、（ｉｖ）シリカ粒子に吸着した核酸を溶出液により溶出する工程と、を備え、少なくとも工程（ｉ）及び（ｉｉ）を７５℃を超える温度で行う方法を提供する。
上記方法では、好ましくは、工程（ｉｖ）を７５℃を超える温度で行う。
沸点が７５℃を超えるアルカノールは、１−プロパノールであってよい。
陰イオン性界面活性剤は、好ましくはドデシル硫酸リチウムである。
カオトロピック化合物は、グアニジニウム塩であってよい。
本発明はまた、陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液と、カオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液と、沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを含む吸着液と、を含む、核酸抽出キットを提供する。
キットにおいて、沸点が７５℃を超えるアルカノールは、１−プロパノールであってよい。
キットにおいて、陰イオン性界面活性剤は、好ましくはドデシル硫酸リチウムである。
キットにおいて、カオトロピック化合物は、グアニジニウム塩であってよい。
本発明によれば、生体試料から、核酸を抽出するために要する時間を短縮することができる、核酸を抽出する方法及びそれに用いるキットを提供することが可能となる。
図１（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ全自動核酸抽出機による核酸の抽出量を示す図である。（ａ）は肺炎球菌を含む試料を用いた場合、（ｂ）は百日咳菌を含む試料を用いた場合、（ｃ）は酵母菌を含む試料を用いた場合、（ｄ）はヒトアデノウイルス２型を含む試料を用いた場合、（ｅ）はＡ型インフルエンザウイルスを含む試料を用いた場合の結果を表す図である。 図２（ａ）,（ｂ）は、それぞれ全自動核酸抽出機による核酸の抽出量を示す図である。（ａ）は健常人由来検体に肺炎球菌を含む検体を添加した試料を用いた場合、（ｂ）は健常人由来検体にヒトアデノウイルス２型を含む検体を添加した試料を用いた場合の結果を表す図である。 図３（ａ）,（ｂ）は、それぞれ溶出温度と核酸の抽出量との関係を示す図である。（ａ）は肺炎球菌を含む試料を用いた場合、（ｂ）はＡ型インフルエンザウイルスを含む試料を用いた場合の結果を表す図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本実施形態に係る、生体試料から核酸を抽出する方法は、（ｉ）生体試料と陰イオン性界面活性剤とカオトロピック化合物とを混合して、溶解液を得る工程を備える。
溶解液は、例えば、ヒートブロック上に配置されたマイクロチューブに、生体試料、陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液、及びカオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液を入れて混合し、加熱することにより得られる。
生体試料と陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液とカオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液とを同時に混合してもよく、生体試料と陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液又はカオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液のいずれかの溶液とを混合して混合液を得た後、当該混合液及びもう一方の溶液を混合してもよい。
本明細書において「生体試料」とは、核酸の抽出に供される検体をいい、具体的には、ウイルス、ファージ、細菌、真菌、生物の細胞、組織及び器官の一部又は全部であり、生体から直接採取するものの他、水、土壌、空気等の環境から得られる検体も含む。生体試料としては、例えば、血液、咽喉スワブ、鼻咽喉スワブ、喀痰、髄液、尿、糞便、唾液等が挙げられる。
核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの天然に存在する核酸であってよい。
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＬＤＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤は、低温で析出しにくいことから、好ましくはドデシル硫酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＬＤＳ）である。
カオトロピック化合物としては、例えば、グアニジニウム塩等が挙げられる。グアニジニウム塩は、例えば、（イソ）チオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）及び塩酸グアニジニウムであってよい。
工程（ｉ）の後、（ｉｉ）溶解液と沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを混合し、核酸をシリカ粒子に吸着させる。
核酸をシリカ粒子に吸着させるには、例えば、ヒートブロック上に設置され、上記溶解液が入っているマイクロチューブに、沸点が７５℃を超えるアルカノール、カオトロピック化合物及びシリカ粒子を含む吸着液を加えて混合し、加熱する。
工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の実施温度は、溶解から吸着までに要する時間を短縮する観点から、７５℃を超える温度であり、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上である。工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の実施温度は、好ましく１００℃以下、より好ましくは９８℃以下、更に好ましくは９５℃以下である。工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の実施温度は、例えば、７５〜１００℃、７５〜９８℃、７５〜９５℃、８０〜１００℃、８０〜９８℃、８０〜９５℃、８５〜１００℃、８５〜９８℃、又は８５〜９５℃である。
工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の実施温度をともに７５℃を超える温度にすることによって、液温の温度変化に要する時間を短縮することができる。そのため、生体試料の溶解から核酸の吸着までに要する時間を短縮することができる。その結果、核酸の抽出に要する時間（生体試料の溶解から核酸の溶出までに要する時間）をも短縮できる。
工程（ｉｉ）に使用されるアルカノールの沸点は、７５℃を超える温度であり、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上である。工程（ｉｉ）に使用されるアルカノールの沸点は、好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１１０℃以下、更に好ましくは１００℃以下である。工程（ｉｉ）に使用されるアルカノールの沸点は、例えば、７５〜１２０℃、７５〜１１０℃、７５〜１００℃、８０〜１２０℃、８０〜１１０℃、８０〜１００℃、８５〜１２０℃、８５〜１１０℃、又は８５〜１００℃である。
沸点が７５℃を超えるアルカノールは、例えば、１−プロパノール、エタノール、イソプロパノール等である。
カオトロピック化合物の具体例は、工程（ｉ）におけるカオトロピック化合物の具体例と同様である。
シリカ粒子としては、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム（「ゼオライト」ともいう）、アミノ基を有するシリカ等から構成される粒子が挙げられる。シリカ粒子は、集積を容易にする観点から、好ましくは磁性シリカ粒子である。
工程（ｉｉ）の後、（ｉｉｉ）核酸を吸着したシリカ粒子を洗浄液により洗浄する。
工程（ｉｉｉ）は、例えば、核酸を吸着したシリカ粒子に、アルコール及び陰イオン性界面活性剤を含む第一の洗浄液を加えて攪拌した後、核酸を吸着したシリカ粒子及び第一の洗浄液を分離する工程、及び分離後のシリカ粒子に、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）を含む第二の洗浄液を加えて攪拌した後、核酸を吸着したシリカ粒子及び第二の洗浄液を分離する工程を備えてよい。
アルコールは、２−プロパノール、１−プロパノール又はエタノールであってよい。アルコールは、これらの混合物でもよい。
陰イオン性界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）であってもよく、ドデシル硫酸リチウムであってもよい。陰イオン性界面活性剤は、これらの混合物であってもよい。
ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）の平均分子量は、２００〜１００００であってよい。このようなポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）としては、例えば、ポリエチレングリコール ４０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ４０００、ＰＥＧ４０００）が挙げられる。本明細書において、ポリエチレングリコールの平均分子量とは、第十六改正日本薬局方に記載の各マクロゴール（ポリエチレングリコール）の平均分子量試験に従って測定された値を意味する。
工程（ｉｉｉ）の後、（ｉｖ）シリカ粒子に吸着した核酸を溶出液により溶出する。
核酸は、例えば、次の方法により溶出できる。すなわち、まず、核酸を吸着したシリカ粒子及び溶出液を混合して攪拌した後、加熱する。再度攪拌した後、シリカ粒子と溶液とを分離することにより、核酸を溶出できる。
工程（ｉｖ）の実施温度は、吸着した核酸を、短時間で、効率よく溶出する観点から、７５℃を超える温度であり、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上である。工程（ｉｖ）の実施温度は、好ましく１００℃以下、より好ましくは９８℃以下、更に好ましくは９５℃以下である。工程（ｉｖ）の実施温度は、例えば、７５〜１００℃、７５〜９８℃、７５〜９５℃、８０〜１００℃、８０〜９８℃、８０〜９５℃、８５〜１００℃、８５〜９８℃、又は８５〜９５℃である。
工程（ｉｖ）の実施温度を、工程（ｉｉ）の実施温度と同様に７５℃を超える温度に設定することによって、ヒートブロック等のヒーターの加熱条件を変えることなく、核酸の抽出（生体試料の溶解から核酸の溶出まで）を行うことができる。そのため、ヒーター内及び溶液の温度変化に要する時間を短縮し、核酸の抽出に要する時間（生体試料の溶解から核酸の溶出までに要する時間）を更に短縮することができる。
工程（ｉ）、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｖ）の実施温度をともに７５℃を超える温度にすることによって、高収量の核酸を、短時間で、生体試料から得ることが可能となる。また、工程（ｉ）、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｖ）の実施温度がともに７５℃を超える温度であれば、同程度の温度条件にて工程（ｉ）、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｖ）の実施が可能であることから、ヒーターは単一でよく、異なる温度設定の、複数のヒーターを必要としない。
溶出液は、例えば、滅菌水、低塩濃度の緩衝液等が挙げられる。低塩濃度の緩衝液は、例えば、１０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を含む緩衝液である。
上記工程（ｉ）から工程（ｉｖ）までを、手動で行ってよく、核酸抽出機を用いて全自動で行ってもよい。
本実施形態に係る方法に必要な各溶液は、予めパッケージングして、核酸抽出キットとして利用できる。すなわち、核酸抽出キットは、陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液を含む。陰イオン性界面活性剤の具体例は、生体試料から核酸を抽出する方法の工程（ｉ）における陰イオン性界面活性剤の具体例と同様である。
陰イオン性界面活性剤の濃度は、生体試料及び第一の溶解用溶液の混合液中の濃度として、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％、更に好ましくは０．５〜３質量％である。
第一の溶解用溶液は、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）及びエチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ）を更に含有してよい。
核酸抽出キットは、カオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液を更に含む。
カオトロピック化合物の具体例は、生体試料から核酸を抽出する方法の工程（ｉ）におけるカオトロピック化合物の具体例と同様である。
第二の溶解用溶液に含まれるカオトロピック化合物の濃度は、生体試料、第一の溶解用溶液及び第二の溶解用溶液の混合液中の濃度として、好ましくは０．０１〜５Ｍ、より好ましくは０．１〜４．５Ｍ、更に好ましくは１〜４Ｍである。
第二の溶解用溶液は、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を更に含有してよい。
核酸抽出キットは、沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを含む吸着液を更に含む。
沸点が７５℃を超えるアルカノール、カオトロピック化合物及びシリカ粒子の具体例及び好ましい態様は、生体試料から核酸を抽出する方法における、沸点が７５℃を超えるアルカノール、カオトロピック化合物及びシリカ粒子の具体例及び好ましい態様と同様である。
沸点が７５℃を超えるアルカノールの濃度は、上記溶解液及び吸着液の混合液中における濃度として、好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは１０〜９０質量％、更に好ましくは２０〜７０質量％である。
吸着液に含まれるカオトロピック化合物の濃度は、上記溶解液及び吸着液の混合液中における濃度として、好ましくは０．０１〜５Ｍ、より好ましくは０．１〜４Ｍ、更に好ましくは１〜４．５Ｍである。
核酸抽出キットは、生体試料から核酸を抽出する方法における、第一の洗浄液、第二の洗浄液及び溶出液を更に含んでよい。
本実施形態に係る核酸抽出キットは、広範囲なアプリケーションに適用可能である。本実施形態に係る核酸抽出キットによれば、血液、咽喉スワブ、鼻咽喉スワブ、喀痰、髄液、尿、糞便、唾液等の臨床試料中に含まれる、細菌、真菌、ウイルス等の広範囲の生物材料からの核酸の抽出が同一のキットで可能となる。さらに、一般的な方法に比べて、抽出に要する時間を短縮することができる、核酸を抽出する方法及びそれに用いるキットを提供することが可能となる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
以下の表１に示す菌及びウイルスを用いた。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、「Ｓ．Ｐ」ともいう）を、培養プレートから釣菌し、生理食塩水に懸濁し、濁度測定にてＭｃＦ＃１の菌液濃度に調整したものを検体（１）として用いた。百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、「Ｂ．Ｐ」ともいう）を、培養プレートから釣菌し、生理食塩水に懸濁し、濁度測定にてＭｃＦ＃１の菌液濃度に調整したものを検体（２）として用いた。酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、「Ｓ．Ｃ．」ともいう）を、培養プレートから釣菌し、生理食塩水に懸濁し、６００ｎｍ波長における濁度測定にてＯＤ＝６．０に相当する菌液濃度に調整したものを検体（３）として用いた。ヒトアデノウイルス２型（Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２、「ＡＤＶ」ともいう）を、Ａ５４９細胞に感染培養し、培養上清から回収したものを検体（４）として用いた。Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型、「ＦｌｕＡ」ともいう）を、ＭＤＣＫ細胞に感染培養し、その培養上清を検体（５）として用いた。
Figure 2018061877
核酸抽出試薬として、以下に示す組成の溶液を調製した。
第一の溶解用溶液：２３３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２３．３ｍＭ ＥＤＴＡ、４．６（ｗ／ｗ）％ ＬＤＳ
第二の溶解用溶液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４．２５Ｍ ＧｕＳＣＮ
吸着液：４７．３（ｗ／ｗ）％ １−プロパノール、２．５Ｍ ＧｕＳＣＮ、シリカ磁性粒子
第一の洗浄液：４１．０（ｗ／ｗ）％ ２−プロパノール、１Ｍ ＮａＣｌ、１．１（ｗ／ｗ）％ ＳＤＳ
第二の洗浄液：９．５（ｗ／ｗ）％ ＰＥＧ４０００、１Ｍ ＮａＣｌ
溶出液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
（実施例１：全自動核酸抽出機による、核酸の抽出）
以下の手順により、核酸抽出機を用い全自動で、Ｓ．Ｐ、Ｂ．Ｐ、Ｓ.Ｃ、ＡＤＶ、ＦｌｕＡから核酸を抽出した。すなわち、まず、生理食塩水２００μＬに、Ｓ．Ｐ検体（１）３μＬを加えて生体試料Ａを得た。同様にして生理食塩水２００μＬにＢ.Ｐ検体（２）を２μＬ、Ｓ.Ｃ検体（３）を３μＬ、ＡＤＶ検体（４）を３μＬ、ＦｌｕＡ検体（５）を１μＬ、それぞれ加えて生体試料Ｂ〜Ｅを得た。マイクロチューブに、生体試料Ａ〜Ｅと第一の溶解用溶液１５０μＬとを混合した後、７秒間攪拌した。その後、１１０℃のヒートブロック上で１分間加熱した。ヒートブロックで加熱したまま、さらに第二の溶解用溶液３５０μＬを加えて７秒間攪拌した後、１１０℃のヒートブロック上で１分間加熱した。ヒートブロックで加熱したまま、さらに吸着液８００μＬを加えた後、７秒間攪拌した。続いて、１１０℃のヒートブロック上で１分間加熱後、7秒間攪拌し、さらに１１０℃のヒートブロック上で1分間加熱した。核酸を吸着したシリカ磁性粒子と溶液とを分離した後、第一の洗浄液９００μＬを加えて７秒間撹拌した。再度、核酸を吸着したシリカ磁性粒子と溶液とを分離した後、第二の洗浄液９００μＬを加えて７秒間撹拌した。シリカ磁性粒子を集磁して上清を廃棄した後、溶出液２５０μＬを加えて７秒間撹拌した。１１０℃のヒートブロック上で２分間静置した後、７秒間撹拌し、核酸を吸着したシリカ磁性粒子と溶液とを分離して、核酸抽出液Ｉ〜Ｖを得た。なお、液温をモニターして溶解工程、吸着工程、ならびに溶出工程において、液温が７５℃を超えていることを確認した。
得られた核酸抽出液Ｉ〜Ｖにおける核酸をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行い核酸を定量した。すなわち、まず、以下の表２に示すプライマーセット及びプローブを用い、以下に示す試薬組成と反応条件でＰＣＲを実施した。実施例１について、同様の抽出及び定量を３回行った。平均値と標準誤差の結果を図１（ａ）〜（ｅ）に示す。
Figure 2018061877
ＰＣＲ反応液の組成とＰＣＲ反応の条件

核酸抽出液Ｉ又はＩＶ
２× Premix Ex TaqTM （Takara） １２．５μＬ
１０μＭ フォワードプライマー ０．５μＬ
１０μＭ リバースプライマー ０．５μＬ
１０μＭ プローブ ０．５μＬ
DNase,RNaseフリー水（Sigma） ６μＬ
鋳型 ５μＬ

熱変性 ９５℃ １０秒 １サイクル
増幅 ［９５℃ ５秒 ⇒ ６０℃ ２０秒］ ４０サイクル

核酸抽出液ＩＩ
２× Premix Ex TaqTM (Takara) １０μＬ
１０μＭ フォワードプライマー １．８μＬ
１０μＭ リバースプライマー １．８μＬ
１０μＭ プローブ １．０μＬ
DNase,RNaseフリー水（Sigma） ０．４μＬ
鋳型 ５μＬ

熱変性 ９５℃ １５秒 １サイクル
増幅 ［９５℃ ３秒 ⇒ ５７℃ ３０秒］ ４０サイクル

核酸抽出液ＩＩＩ
２× Premix Ex TaqTM （Takara） １２．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー ０．２５μＬ
５０μＭ リバースプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ プローブ ０．５μＬ
DNase,RNaseフリー水（Sigma） ６．５μＬ
鋳型 ５μＬ

熱変性 ９５℃ １０秒 １サイクル
増幅 ［９５℃ ５秒 ⇒ ６０℃ ２０秒］ ４０サイクル

核酸抽出液Ｖ
２× QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix （QIAGEN） １２．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー ０．３μＬ
５０μＭ リバースプライマー ０．３μＬ
５μＭ プローブ ０．５μＬ
QuantiTect RT Mix（QIAGEN） ０．２５μＬ
20IU/μL Rnase Inhibitor ０．１μＬ
DNase,RNaseフリー水（Sigma） ６．０５μＬ
鋳型 ５μＬ

逆転写 ５０℃ ３０分 １サイクル
熱変性 ９５℃ １５分 １サイクル
増幅 ［９４℃ １５秒 ⇒ ５６℃ ７５秒］ ４５サイクル
（実施例２：全自動核酸抽出機による、健常人由来試料中の肺炎球菌核酸の抽出）
健常人由来試料に検体（１）をスパイクして核酸を抽出した。まず、咽頭スワブ懸濁液２００μＬに、検体（１）３μＬを加えて生体試料Ｆを得た。同様にして、鼻咽頭スワブ懸濁液２００μＬに検体（１）３μＬを、血清２００μＬに検体（１）３μＬを、血液（ＥＤＴＡ−２Ｋ抗凝固剤含有）２００μＬに検体（１）３μＬを、血液（クエン酸ナトリウム抗凝固剤含有）２００μＬに検体（１）３μＬを、血液（ヘパリン抗凝固剤含有）２００μＬに検体（１）３μＬを、それぞれ加えて生体試料Ｇ〜Ｋを得た。実施例１と同様にして核酸抽出液ＶＩ〜Ｘを得た。
得られた核酸抽出液ＶＩ〜Ｘについて、実施例１と同様にして、ＰＣＲ反応を行い核酸を定量した。
なお生体試料Ｈの作製には、健常人由来粉末血清を精製水で復元したものを、健常人由来試料として用い、抽出及び定量を３回実施してＮ＝３の結果を得た。生体試料Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋの作製には、それぞれ３ドナーの健常人試料が用いられ、抽出及び定量は１回実施し、Ｎ＝３の結果とした。図２（ａ）にＮ＝３の結果を平均値と標準誤差で示す。また比較対照として実施例１における抽出液Ｉの結果（生理食塩水）も示す。
（実施例３：全自動核酸抽出機による、健常人由来試料中のアデノウイルス核酸の抽出）
検体（１）の代わりに、検体（４）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、核酸抽出液を得て、ＰＣＲ反応を行い定量した。結果を図２（ｂ）に示す。また比較対照として実施例１における抽出液ＩＶの結果（生理食塩水）も示す。
（実施例４：溶出温度と肺炎球菌ゲノムＤＮＡの回収効率との関係）
溶出温度を室温（２５℃）、５０℃、８０℃又は１１０℃の設定環境で実施したこと以外は、実施例１と同様にして、検体（１）の生体試料Ａから抽出液を得て、ＰＣＲ反応を行い、核酸を定量した。結果を図３（ａ）に示す。
（実施例５：溶出温度とインフルエンザウイルスＡゲノムＲＮＡの回収効率との関係）
溶出温度を室温（２５℃）、５０℃、８０℃又は１１０℃の設定環境で実施したこと以外は、実施例１と同様にして、検体（１）の生体試料Ａから抽出液を得て、ＰＣＲ反応を行い、核酸を定量した。結果を図３（ｂ）に示す。
（参考例１）
ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｓ．Ｐを含む生体試料から核酸を抽出した。すなわち、サンプルとして遠心沈渣物の代わりに検体（１）を用いたこと、及びＢｕｆｆｅｒ ＡＥあるいは精製水の代わりに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は、キットの推奨プロトコールに従って、核酸を抽出した。なお、キットの推奨プロトコールとは、QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook (第5版)に記載の、Appendix D : Protocol for Bacteria, Isolation of genomic DNA form Gram-positive bacteria及びProtocol: DNA purification from Tissuesである。ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した核酸について、実施例１と同様にして、ＰＣＲ反応を行い核酸を定量した。結果を図１（ａ）に示す。
（参考例２）
ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｂ．Ｐを含む生体試料から核酸を抽出した。すなわち、サンプルとして遠心沈渣物の代わりに検体（２）を用いたこと、プロテアーゼＫ処理を１０分間で実施したこと、及びＢｕｆｆｅｒ ＡＥあるいは精製水の代わりに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は、キットの推奨プロトコールに従って、核酸を抽出した。なお、キットの推奨プロトコールとは、QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook (第5版)に記載の、Appendix D : Protocol for Bacteria, Isolation of genomic DNA from bacterial plate cultures及びProtocol: DNA purification from Tissuesである。抽出した核酸について、参考例１と同様にして核酸を定量した。結果を図１（ｂ）に示す。
（参考例３）
ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｓ．Ｃを含む生体試料から核酸を抽出した。すなわち、サンプルとして遠心沈渣物の代わりに検体（３）をそれぞれ用いたこと、プロテアーゼＫ処理を１０分間で実施したこと、及びＢｕｆｆｅｒ ＡＥあるいは精製水の代わりに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は、キットの推奨プロトコールに従って、核酸を抽出した。なお、キットの推奨プロトコールとは、QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook (第5版)に記載の、Appendix E : Protocol for Yeast及びProtocol: DNA purification from Tissuesである。抽出した核酸について、参考例１と同様にして核酸を定量した。結果を図１（ｃ）に示す。
（参考例４）
ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＡＤＶを含む生体試料から核酸を抽出した。すなわち、キットの推奨プロトコールに記載の血漿あるいは血清の代わりに、生理食塩水２００μＬに検体（４）３μＬを加えたものを用いたこと以外は、キットの推奨プロトコールに従って、核酸を抽出した。なお、キットの推奨プロトコールとは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Handbook(2010年度版)に記載の、Protocol:Purification of Viral Nucleic Acids from Plasma or Serum である。
ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した核酸について、実施例１と同様にして、ＰＣＲ反応を行い定量した。結果を図１（ｄ）に示す。
実施例１〜３及び参考例１〜４について、抽出に要した時間を以下の表３に示す。
Figure 2018061877

Claims (9)

  1. 生体試料から核酸を抽出する方法であって、
    （ｉ）前記生体試料と陰イオン性界面活性剤とカオトロピック化合物とを混合して、溶解液を得る工程と、
    （ｉｉ）前記溶解液と沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを混合し、前記核酸を前記シリカ粒子に吸着させる工程と、
    （ｉｉｉ）前記核酸を吸着した前記シリカ粒子を洗浄液により洗浄する工程と、
    （ｉｖ）前記シリカ粒子に吸着した前記核酸を溶出液により溶出する工程と、
    を備え、
    少なくとも工程（ｉ）及び（ｉｉ）を７５℃を超える温度で行う方法。
  2. 前記工程（ｉｖ）を７５℃を超える温度で行う、請求項１に記載の方法。
  3. 前記沸点が７５℃を超えるアルカノールが１−プロパノールである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸リチウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記カオトロピック化合物がグアニジニウム塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 陰イオン性界面活性剤を含む第一の溶解用溶液と、
    カオトロピック化合物を含む第二の溶解用溶液と、
    沸点が７５℃を超えるアルカノールとカオトロピック化合物とシリカ粒子とを含む吸着液と、を含む、核酸抽出キット。
  7. 前記沸点が７５℃を超えるアルカノールが１−プロパノールである、請求項６に記載のキット。
  8. 前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸リチウムである、請求項６又は７に記載のキット。
  9. 前記カオトロピック化合物がグアニジニウム塩である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
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