CN114480370A

CN114480370A - 核酸提取或纯化试剂和方法

Info

Publication number: CN114480370A
Application number: CN202111663589.XA
Authority: CN
Inventors: 邹永龙; 张佳斌; 田付友; 曲峰; 何宗顺
Original assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114480370B

Abstract

本发明涉及核酸提取或纯化试剂和方法。具体地说，本发明涉及一种裂解结合液，所述裂解结合液包含Tris‑HCl、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、EDTA‑Na₂、Brij 30、聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和水。本发明还涉及包括用于配制所述裂解结合液的试剂的试剂盒以及采用所述试剂盒提取或纯化核酸的方法。本发明具有操作简单、快捷的优点，特别是可以提取多种类型的生物样本的总核酸。

Description

核酸提取或纯化试剂和方法

技术领域

本发明涉核酸提取试剂领域，尤其涉及多生物样本类型的总核酸提取试剂。

背景技术

核酸是各类生命的最基本物质之一，不仅起着储存和传递遗传信息的作用，在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中也起着决定性的作用。自1869年瑞士物理学家Friedrich Miescher首次从白细胞中分离出核酸以来，全球各国的研究者们在核酸提取和纯化方法上进行了不懈的研究探索。核酸提取的传统方法包括酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、煮沸法等。自1979年Vogelstein和Gillespie首次将玻璃纤维用于回收琼脂糖凝胶中的DNA片段以来，以固相载体为基础的新型核酸提取方法便被发展起来，包括吸附膜离心柱提取法、玻璃珠吸附法及磁珠提取法。

磁珠提取法依据与吸附膜离心柱提取法相似的原理，在磁珠表面修饰可以吸附核酸的特定官能团，通过不同的溶液环境，达到裂解、结合、洗涤和洗脱的目的。同时利用磁珠自身的磁学性质，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。该技术能够从动植物组织、体液、培养细胞、环境等样本中分离获得高纯度的核酸，磁珠提取法在临床分子诊断方面有很多优势：容易实现自动化、高通量操作；操作简单、用时短，无需反复离心等操作；不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，安全无毒；磁珠与核酸的特异性结合使得其有非常高的核酸提取效率，更能满足临床分子诊断对于某些检测灵敏度要求非常高的项目需求。

随着磁珠提取法的不断发展，基于磁珠法技术的核酸提取也变得多种多样，但是不同的磁珠修饰方式、不同的核酸吸附环境等，对于磁珠法提取核酸的效率和稳定性有较大的影响，这也是造成市面上的磁珠法核酸提取产品虽然数量非常多，但其质量却良莠不齐的原因之一。现在市场上缺乏一款对于多种生物样本类型的总核酸提取(基因组DNA、病毒DNA、病毒RNA共提取)比较好的磁珠法核酸提取或纯化试剂，此外，现有市场上的核酸提取或纯化试剂绝大部分依旧采用裂解-结合-清洗-洗脱四个步骤，裂解完成后需要额外加入结合液才能进行磁珠与核酸的结合，不易实现自动化高通量。

中国专利CN112226432公开了一种磁珠法快速核酸提取试剂盒，，操作快速简便，手动操作仅需要5分钟即可完成一次提取过程，且样本裂解之后无需加入结合液，只需要转移磁珠，实现了仪器自动化高通量的需求，但其试剂盒只能应用于鼻咽拭子样本中的病毒核酸，限制了进一步应用。

中国专利CN106244583公开了一种磁珠法核酸提取方法，可以用于全血、细胞培养物、细菌培养物，拭子、组织、唾液等生物样本的核酸，但从发明内容发现只适合上述多种样本类型的基因组DNA提取，不能应用于病毒核酸的提取，且样本裂解完后后需要额外加入结合液进行核酸和磁珠的绑定，不易于自动化高通量的操作。

综上所述，虽然现有技术中不能提供一种能处理多生物样本类型的总核酸提取磁珠法核酸提取试剂，样本裂解完成后无需再添加结合液进行核酸和磁珠的结合，适用于自动化高通量仪器。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸提取或纯化试剂，本发明所提供磁珠法核酸提取试剂操作简单、快捷，可以提取多种类型的生物样本的总核酸(基因组DNA、病毒DNA、病毒RNA共提取)。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种裂解结合液，所述裂解结合液包含：Tris-HCl、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、EDTA-Na₂、Brij 30、聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和水。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：20-600mM Tris-HCl、1-5M盐酸胍、1-10M高氯酸钠、100-500mM氯化铵、1-50mM EDTA-Na₂、0.1-20％Brij 30、0.1-20％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为5.0-8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：50-500mM Tris-HCl、2-4M盐酸胍、1-5M高氯酸钠、100-300mM氯化铵、5-50mM EDTA-Na₂、0.5-10％Brij 30，0.1-10％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为6.0-8.0。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：100-200mM Tris-HCl、2-3M盐酸胍、2-5M高氯酸钠、100-200mM氯化铵、10-40mM EDTA-Na₂、1-5％Brij 30，0.2-2％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为6.5；

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含100mM Tris-HCl、3M盐酸胍、3M高氯酸钠、100mM氯化铵、10mM EDTA-Na₂、2％Brij 30，0.25％的分子量为4400的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，所述裂解结合液的pH为6.5。

本发明的裂解结合液中，Tris-HCl可以提供pH稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团的电荷状态，对DNA碱基起保护作用。

盐酸胍是破坏蛋白质三维结构的离液剂，能够快速破坏细胞膜或病毒，释放核酸，使蛋白质变性，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，可以使核酸酶活性减缩，抑制核酸酶活性。

高氯酸钠与盐酸胍类似，也是一种蛋白变性剂，同时提供了大量的一价阳离子(钠离子)建立了核酸的磷酸根与磁珠硅羟基表面的盐桥。

EDTA-Na₂是一种二价离子螯合剂，能够螯合Mg²⁺或Ca²⁺等二价阳离子，抑制金属依赖性的酶如DNase和RNase的活性，能够抑制核酸酶对裂解后游离暴露出来核酸的降解，从而减少核酸的降解。

本发明的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物作为一种核酸保护剂存在，防止其被核酸酶降解，同时所述的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物在低于pH7.0以下(如6.5)时能够与痕量的核酸结合，而在pH7.5以上(如8.0)时能够与核酸进行分离，不影响下游核酸检测。令人意外的，低浓度(0.1-1％)的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物的加入大大提高了低拷贝核酸的富集作用。于是，在一些优选的实施方式中，所述聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物分子量为2000-20000。优选的是，所述聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物分子量为4000-10000。

Brij 30(CAS：9002-92-0)是一种比较温和的非离子型表面活性剂(或称去污剂)，它能溶解脂质，同时具有促进氢键和阳离子桥形成的作用，常作为添加剂使蛋白保持稳定，特别是使膜蛋白保持其天然构象。本发明在实施例中尝试用其他常规的非离子表面活性剂如曲拉通X-100或吐温20进行替代，令人印象深刻的是在血液样本中Brij 30相比上述两种表面活性剂具有更好的裂解细胞的效果和核酸质量和回收率，得到洗脱液是澄清的。

本发明在第二方面提供了一种核酸提取或纯化试剂盒，所述试剂盒包括用于配制本发明第一方面所述的裂解结合液的试剂。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括用于配制磁珠悬浮液的试剂、用于配制清洗液的试剂和用于配制洗脱液的试剂。

在另一些优选的实施方式中，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为5-20％的、粒径为0.1-10μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为4.0-8.0，所述分散液包含10-50体积％的PEG300和余量的水；优选的是，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为10-15％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0-6.0，所述分散液包含20体积％的PEG300和余量的水；更优选的是，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为15％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0，所述分散液包含20体积％的PEG300和余量的水。所述水优选为无核酸酶水。超顺磁性硅颗粒在磁珠悬浮液中的量以质量体积百分数计，即超顺磁性硅颗粒的质量占磁珠悬浮液的体积的百分比。

在另一些优选的实施方式中，所述第一通用清洗液包含10-100mM Tris-HCl，10-200mM氯化锂，1-20mM EDTA-Na₂，1-5M盐酸胍和50-80％无水乙醇；优选的是，所述第一通用清洗液10-50mM Tris-HCl，50-100mM氯化锂，2-10mM EDTA-Na₂，2-4M盐酸胍和50％无水乙醇；更优选的是，所述第一通用清洗液包含50mM Tris-HCl，100mM氯化锂，2mM EDTA-Na₂，3M盐酸胍和50％无水乙醇。

在另一些优选的实施方式中，所述第二通用清洗液包含：5-100mM Tris-HCl，5-100mM氯化钠和40-60％PEG300；优选的是，所述第二通用清洗液包含10-20mM Tris-HCl，10-25mM氯化钠好50％PEG300；更优选的是，所述第二通用清洗液包含10mM Tris-HCl，20mM氯化钠和50％PEG300。

在另一些优选的实施方式中，所述洗脱液包含10mM Tris-HCl，并且pH为8.5。

本发明在第四方面提供了一种从生物样本中提取或纯化核酸的方法，所述方法采用本发明第一方面所述的裂解结合液进行提取或纯化。

优选的是，本发明在第四方面所提供的一种从生物样本中提取或纯化核酸的方法采用本发明第二方面所述的试剂盒进行提取或纯化。

在一些优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：将生物样本加入到离心管中；

(2)样本裂解：向步骤(1)的生物样本中加入所述裂解结合液，在50-80℃的温度加热3-20min，得到样品裂解液；

(3)核酸吸附：向步骤(2)所述的样品裂解液中加入所述磁珠悬浮液，混匀静置，待磁珠完全吸附后弃去液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得的吸附后磁珠中加入所述第一通用清洗液，混匀后静置至磁珠完全吸附，弃去液体，得到第一清洗磁珠；

(5)第二清洗：向步骤(4)所得的第一清洗磁珠中加入所述第二通用清洗液，混匀后静置至磁珠完全吸附，弃去液体，得到第二清洗磁珠；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得的第二清洗磁珠中加入所述洗脱液，混匀后在50-80℃孵育洗脱5-10min，收集洗脱后所得的核酸溶液。

在另一些优选的实施方式中，在所述生物样本选自由血液、血浆、血清和唾液组成的组的液体生物样本的情况下，所述生物样本的体积用量为200μL，在所述生物样本为各种拭子洗脱物的情况下，所述生物样本的体积用量为200--400μL；在步骤(2)中，加入以所述生物样本的体积用量计为1-2倍的所述裂解结合液；在步骤(3)中，加入5-30μL的所述磁珠悬浮液；在步骤(4)中，加入200-1000μL的所述第一通用清洗液；在步骤(5)中，加入200-1000μL的所述第二通用清洗液；在步骤(6)中，加入40-100μL的所述洗脱液。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，在所述生物样本选自由血液、血浆、血清和唾液组成的组的液体生物样本的情况下，所述生物样本的体积用量为200μL；在所述生物样本为各种拭子洗脱物的情况下，所述生物样本的体积用量为300μL；在步骤(2)中，加入2倍体积的所述裂解结合液，并且50-80℃加热5-10min；在步骤(3)中，加入10-20μL的所述磁珠悬浮液；在步骤(4)中，加入500-600μL的所述第一通用清洗液；在步骤(5)中，加入500-600μL的所述第二通用清洗液；在步骤(6)中，在60℃孵育洗脱5min。

在一些更具体的实施方式中，所述方法利用本发明第二方面所述的试剂盒从血液、血浆、血清、唾液和拭子洗脱物样本中提取或纯化总核酸(可以实现基因组DNA、RNA、病毒DNA、病毒RNA的共提取或纯化)，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：混匀样本，取200μL各种体液(血液、血浆、血清、唾液)或200-400μL各种拭子洗脱物样于离心管中，用于检测。

(2)样本裂解：向步骤(1)检测样本中加入1-2倍体积的本申请的裂解结合液，50-80℃加热3-20min，得样品裂解液；

(3)核酸吸附：向步骤(2)所述样品裂解液中加入5-30μL磁珠悬浮液，混匀1min后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得磁珠中加入200-1000μL第一通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体；

(5)第二清洗：向步骤(4)所得磁珠中加入200-1000μL第二通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得清洗后磁珠中加入40-100μL洗脱液，震荡混匀50-80℃加热5-10min后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

相对于现有技术，本发明具有如下有益的技术效果：

(1)提供一种多类型样本的总核酸提取或纯化试剂，无需再对不同的样本类型选用不同的核酸提取或纯化试剂盒。

(2)可以配套自己化核酸提取仪实现快速高通量的核酸提取或纯化。

(3)可以同时对一份样本中的基因组DNA、病毒DNA和病毒RNA进行分析检测。

(4)本发明提供的方案中第二清洗液是不含有易挥发的乙醇或者异丙醇，无需进行醇的挥发控干，节约流程的时间，减少了气溶胶的污染。

(5)本发明提取或纯化的方案不含蛋白酶K，操作更为方便，成本更低。

附图说明

图1是本发明实施例4中20个重复拭子样本中Covid-19 RNA提取产物的OFR1ab荧光定量PCR的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

定义

在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

当本文提供值的范围时，除非另有明确说明，否则所述范围意在包括起始值和结束值，以及其间的值或值的范围。例如，“从0.2-0.5”是指0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量如0.25、0.35、0.220、0.325、0.49；其间的增量范围如0.26-0.39等诸如此类。

本文使用的术语“样本”或“样品”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标核酸物质的样品，术语“样本”或“样品”或可包括血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、拭子洗脱物或其中一种或多种的组合。

应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解的是，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。

除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。

“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起，以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。

在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样品组分中至少70％或至少80％或至少90％的目标核酸。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

制备例1核酸提取或纯化试剂盒：

本制备例提供一种核酸提取或纯化试剂盒，包括用于配制裂解结合液的试剂、用于配制磁珠悬浮液的试剂、用于配制第一通用清洗液的试剂、用于配制第二通用清洗液的试剂和用于配制洗脱液的试剂。

1)裂解结合液组成为：100mM Tris-HCl、3M盐酸胍、3M高氯酸钠、100mM氯化铵、10mM EDTA-Na₂、2％Brij 30，0.25％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物(分子量＝4400)，余量的水，裂解结合液的pH为6.5。

2)磁珠悬浮液组成为质量分数为15％的0.5-5μm粒径的超顺磁性硅颗粒，磁珠悬浮液pH 5.0，分散液为质量分数为20％PEG300的无核酸酶水。

3)第一通用清洗液由以下成分组成：50mM Tris-HCl，100mM氯化锂，2mM EDTA-Na₂，3M盐酸胍，50％无水乙醇。

4)第二通用清洗液由以下成分组成：10mM Tris-HCl，20mM氯化钠，50％PEG300。

5)所述洗脱液组成为：包含10mM Tris-HCl的水溶液(pH8.5)。

对比制备例1：

裂解结合液中不含有聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例2：

裂解结合液中Brij 30替换成等体积的吐温20，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例3：

裂解结合液中Brij 30替换成等体积的曲拉通X-100，其余组分与制备例1的一致。

实施例1：血液基因组DNA提取

本实施例以制备例1和对比制备例2和对比制备例3的核酸提取或纯化试剂盒对不同血液样本中的基因组DNA进行提取，具体的步骤如下：

(1)样本准备：混匀样本，取200μL血液样本加入2mL离心管中；

(2)样本裂解：向步骤(1)样本中加入2倍体积的本申请的裂解结合液，60℃加热10min，得到样品裂解液；

(3)核酸吸附：向步骤(2)所述的样品裂解液中加入15μL磁珠悬浮液，混匀1min后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得的吸附后磁珠中加入500μL第一通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，得到第一清洗磁珠；

(5)第二清洗：向步骤(4)所得的第一清洗磁珠中加入500μL第二通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，得到第二清洗磁珠；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得的第二清洗磁珠中加入100μL洗脱液，震荡混匀60℃加热5min后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

对比上述提取的6份人体血液样本后进行核酸浓度和纯度的检测，并将制备例1与对比制备例进行核酸提取的结果比较，检测结果如下表1所示。由表1的结果可以看出，本发明的核酸提取或纯化试剂盒的提取或纯化效果显著优于对比制备例相比效果。此外，本发明人观察到对比制备例2和对比制备例3提取得到的DNA洗脱物颜色不澄清，显示出浅黄或浅红色，而制备例1的DNA洗脱物澄清且无色。

表1.实施例1血液样本的基因组DNA提取检测结果

实施例2：唾液样本和拭子洗脱物样本的基因组DNA提取

实验以制备例1的核酸提取或纯化试剂盒和对比试剂盒(QIAamp DNA mini Kits,Qiagen，Cat#51304)进行对不同唾液样本和试子洗脱物样本中的基因组DNA进行提取，具体的步骤与实施例1基本相同，但是在步骤(1)样本准备中，取受试者唾液样本为200μL，在步骤6中的洗脱步骤中，洗脱液体积为50μL。此外，拭子洗脱物为新鲜采集，通过植绒拭子刮取口腔细胞后重悬于600μL生理盐水，本发明制备例1的试剂盒与对照试剂盒都取200μL进行核酸提取。在步骤6中的洗脱步骤中，洗脱液体积为50μL。

对比上述提取的6份人体唾液样本和6份拭子洗脱物进行核酸浓度和纯度的检测，并与对对比试剂盒进行核酸提取的结果比较，检测结果如下表2所示。由表2可以看出，本发明的核酸提取或纯化试剂盒的提取效果显著优于对比进口试剂盒。

表2.实施例2唾液样本和拭子样本的基因组DNA提取检测结果

实施例3：多样本类型中病毒DNA和RNA共提取

本实施例以制备例1的核酸提取或纯化试剂盒和对比制备例1的试剂试剂盒进行多样本类型的病毒DNA和RNA共提取，DNA病毒选择猪流行性腹泻病毒(PEDV质控品)，RNA病毒选择Covid-19假病毒质控品。血液、血浆、唾液、拭子洗脱液中分别加入同等滴度的DNA病毒或RNA病毒，每200μL中加入约5000拷贝浓度的病毒，具体的步骤如下：

(1)样本准备：混匀样本不同类型的样本，分别取200μL血液、血浆、唾液、拭子洗脱液加入2mL离心管中(已经添加了病毒质控品)；

(3)核酸吸附：向步骤(2)所述的样品裂解液中加入10μL磁珠悬浮液，混匀1min后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得磁珠中加入500μL第一通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，得到第一清洗磁珠；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得的第二清洗磁珠中加入60μL洗脱液，震荡混匀60℃加热5min后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

对上述提取的4份血液、4份血浆、4份唾液样本和4份拭子洗脱物中的病毒DNA和RNA，进行荧光定量PCR进行核酸浓度的检测，PEDV荧光定量PCR试剂盒Covid-19荧光定量PCR试剂盒(OFR1ab基因)分别来自于深圳生科源生物科技有限公司和广州达安基因股份有限公司，通过Ct值比较，并与对比试剂进行核酸提取的结果比较，检测结果如下表3所示。由表3可以看出，本发明的核酸提取或纯化试剂盒的提取效果显著优于对比制备例1的提取效果，这可以归因于聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物的加入，其改善了对于痕量病毒核酸的富集能力。

表3.实施例3多样本类型的的病毒DNA和RNA提取检测结果

实施例4：拭子样本病毒RNA提取的重复性

本实施例以制备例1的核酸提取或纯化试剂盒对新鲜制备的20份拭子样本重悬液(生理盐水)中加入Covid-19假病毒质控品。每200μL中加入约5000拷贝浓度的病毒，具体的提取的步骤如下：

(1)样本准备：混匀样本拭子重悬液样本，分别取300μL拭子洗脱液加入2mL离心管中(已经添加了病毒质控品)；

(2)样本裂解：向步骤(1)样本中加入2倍体积的本申请的裂解结合液，60℃加热5min，得到样品裂解液；

对上述提取的20份拭子洗脱物中的病毒RNA，进行荧光定量PCR进行核酸浓度的检测，通过Ct值和曲线比较，结果如图1所示。从图1可以看出，20次的重复验证结果非常好，Ct值的CV值为1.8％，说明本发明对于新冠病毒RNA的提取具有非常好的稳定性和灵敏度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液包含：Tris-HCl、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、EDTA-Na₂、Brij 30、聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和水。

2.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于：

所述裂解结合液包含：20-600mM Tris-HCl、1-5M盐酸胍、1-10M高氯酸钠、100-500mM氯化铵、1-50mM EDTA-Na₂、0.1-20％Brij 30、0.1-20％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为5.0-8.5；

优选的是，所述裂解结合液包含：50-500mM Tris-HCl、2-4M盐酸胍、1-5M高氯酸钠、100-300mM氯化铵、5-50mM EDTA-Na₂、0.5-10％Brij 30，0.1-10％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为6.0-8.0；

更优选的是，所述裂解结合液包含：100-200mM Tris-HCl、2-3M盐酸胍、2-5M高氯酸钠、100-200mM氯化铵、10-40mM EDTA-Na₂、1-5％Brij30，0.2-2％的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为6.5；

进一步优选的是，所述裂解结合液包含100mM Tris-HCl、3M盐酸胍、3M高氯酸钠、100mM氯化铵、10mM EDTA-Na₂、2％Brij 30，0.25％的分子量为4400的聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物和余量的水，所述裂解结合液的pH为6.5。

3.根据权利要求1或2所述的裂解结合液，其特征在于：

所述聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物分子量为2000-20000；

优选的是，所述聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇嵌段共聚物分子量为4000-10000。

4.一种核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制权利要求1至3中任一项所述的裂解结合液的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于配制磁珠悬浮液的试剂、用于配制清洗液的试剂和用于配制洗脱液的试剂。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：

所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为5-20％的、粒径为0.1-10μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为4.0-8.0，所述分散液包含10-50体积％的PEG300和余量的水；优选的是，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为10-15％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0-6.0，所述分散液包含20体积％的PEG300和余量的水；更优选的是，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为15％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0，所述分散液包含20体积％的PEG300和余量的水；

所述第一通用清洗液包含10-100mM Tris-HCl，10-200mM氯化锂，1-20mM EDTA-Na₂，1-5M盐酸胍和50-80％无水乙醇；优选的是，所述第一通用清洗液10-50mM Tris-HCl，50-100mM氯化锂，2-10mM EDTA-Na₂，2-4M盐酸胍和50％无水乙醇；更优选的是，所述第一通用清洗液包含50mM Tris-HCl，100mM氯化锂，2mM EDTA-Na₂，3M盐酸胍和50％无水乙醇；

所述第二通用清洗液包含：5-100mM Tris-HCl，5-100mM氯化钠和40-60％PEG300；优选的是，所述第二通用清洗液包含10-20mM Tris-HCl，10-25mM氯化钠好50％PEG300；更优选的是，所述第二通用清洗液包含10mM Tris-HCl，20mM氯化钠和50％PEG300；和/或

所述洗脱液包含10mM Tris-HCl，并且pH为8.5。

7.一种从生物样本中提取或纯化核酸的方法，其特征在于：

所述方法采用权利要求1至3中任一项所述的裂解结合液进行提取或纯化；

优选的是，所述方法采用权利要求4至6中任一项所述的试剂盒进行提取或纯化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：将生物样本加入到离心管中；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

在所述生物样本选自由血液、血浆、血清和唾液组成的组的液体生物样本的情况下，所述生物样本的体积用量为200μL，在所述生物样本为各种拭子洗脱物的情况下，所述生物样本的体积用量为200--400μL；

在步骤(2)中，加入以所述生物样本的体积用量计为1-2倍的所述裂解结合液；

在步骤(3)中，加入5-30μL的所述磁珠悬浮液；

在步骤(4)中，加入200-1000μL的所述第一通用清洗液；

在步骤(5)中，加入200-1000μL的所述第二通用清洗液；

在步骤(6)中，加入40-100μL的所述洗脱液。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

在步骤(1)中，在所述生物样本选自由血液、血浆、血清和唾液组成的组的液体生物样本的情况下，所述生物样本的体积用量为200μL；在所述生物样本为各种拭子洗脱物的情况下，所述生物样本的体积用量为300μL；

在步骤(2)中，加入2倍体积的所述裂解结合液，并且50-80℃加热5-10min；

在步骤(3)中，加入10-20μL的所述磁珠悬浮液；

在步骤(4)中，加入500-600μL的所述第一通用清洗液；

在步骤(5)中，加入500-600μL的所述第二通用清洗液；

在步骤(6)中，在60℃孵育洗脱5min。