DE69720230T2 - Auftrennen von cholesterin und fluoreszenzanalyse - Google Patents
Auftrennen von cholesterin und fluoreszenzanalyseInfo
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Description
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Reagenzien und Verfahren für die quantitative Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Serumlipoproteinen. Sie findet spezielle Anwendung auf medizin- und labordiagnostischen Gebieten, wo sich die Notwendigkeit zur Durchführung von Tests und Analysen an biologischen und chemischen Substanzen ergibt.
- Der Zusammenhang zwischen HDL-Cholesterin und der koronaren Herzkrankheit wurde von D. P. Barr et al. in einem Artikel des Titels: "Protein-lipid Relationships in Human Plasma" [Protein-Lipid-Zusammenhänge im menschlichen Plasma], Am. 3. Med., 11: 480-493 (1951) und von G. J. Miller und N. E. Miller in einem Artikel des Titels: "Plasma High Density-Lipoproteins Concentration und Development of Ischemic Heart Disease" [Konzentration von Lipoproteinen hoher Dichte im Plasma und Entwicklung einer ischämischen Herzkrankheit], Lancet, 1: 16-19 (1976) berichtet. Die Arbeit von W. P. Castelli et al., wie in "HDL Cholesterol and Other Lipids in Coronary Heart Disease - The Cooperative Lipoprotein Phenotyping Study" [HDL-Cholesterin und andere Lipide bei der koronaren Herzkrankheit - Die 'Cooperative Lipoprotein Phenotyping Study'], Circulation, 55(5): 767-772 (1977) berichtet, lenkte die Aufmerksamkeit auf die Beurteilung von HDL-Cholesterin als definitiven Labortest bei der Ermittlung des Risikos für eine koronare Herzkrankheit. [Zu anderen Arbeiten, in denen die Beurteilung des HDL-Cholesterins als der definitive Labortest bei der Ermittlung des Risikos für eine koronare Herzkrankheit besprochen werden, zählen: W. B. Kannel et al., "Serum Cholesterol, Lipoproteins, and the Risk of Coronary Heart Disease" [Serumcholesterin, Lipoproteine und das Risiko für eine koronare Herzkrankheit], Ann. Inter. Med. 74(1): 1-12 (1971); T. Gordon et al., "High Density Lipoprotein As a Protective Factor Against Coronary Heart Disease" [Lipoprotein hoher Dichte als ein Schutzfaktor gegen koronare Herzkrankheit], Die Framingham-Studie, Am. J, Med., 62: 707-714 (1977) und R. S. Galen, "HDL Cholesterol, How Good a Risk Faktor" [HDL-Cholesterin, wie gut ist der Risikofaktor?], Diag. Med. 39-58, Nov./Dez. (1979).] Der Cholesteringehalt der Lipoproteinfraktionen wurde mittels Ultrazentrifugation, selektiver Präzipitation und Elektrophorese an mehreren Medien bestimmt. [O. F. Delalla, et al., "Ultracentrifugal Analysis of Serum Lipoprotein" [Analyse von Serumlipoprotein mittels Ultrazentrifugation], Methods of Biochemical Analysis, Vol. 1. 459-478 (1954); M. Burstein et al., "Precipitation of chylomicrons and very low density lipoproteins from human serum with sodiom lauryl sulfate" [Präzipitation von Chylomikronen und Lipoproteinen sehr geringer Dichte aus menschlichem Serum mit Natriumlaurylsulfat], Life Science, 11: 177-184 (1972) und S. A. Cobb et al., "Enzymic Determination of Cholesterol in Serum Lipoproteins Separated by Electrophoresis" [Enzymatische Bestimmung von Cholesterin in elektrophoretisch getrennten Serumlipoproteinen], Clin. Chem., 24(7): 1116-1120 (1978).]
- Die Messung der Serumlipoproteine im klinischen Labor erfolgt primär aufgrund ihrer prädiktiven Assoziation mit dem Risiko für eine koronare Herzkrankheit. Die aktuellen Praxisrichtlinien zur Messung im Labor von Gesamtserumcholesterin, Triglyceriden, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin leiten sich von Empfehlungen von Expertengremien her, die vom National Cholesterol Education Program (NCEP) einberufen wurden. Die Expertengremien zogen epidemiologische, klinische und Interventionsstudien bei der Ausarbeitung von Empfehlungen für 'Cutpoints' bezüglich der Entscheidung zur Behandlung und empfohlene Verarbeitungssequenzen für Erwachsene und Kinder in Erwägung.
- Die klinischen Empfehlungen von NCEP-Gremien halten klinische Laboratorien dazu an, Messungen von Gesamtcholesterin (HDL- und LDL-Cholesterin) und Triglyceriden durchzuführen. Die Triglyceride werden primär mit Chylomikronen, Lipoproteinen sehr geringer Dichte (VLDL) und mittlerer Dichte (IDL), von denen angenommen wird, dass sie atherogen sind, in Verbindung gebracht, die Assoziation von Triglyceriden mit dem Risiko für koronare Herzkrankheit in epidemiologischen Studien ist jedoch zweideutig. LDL als das validierte atherogene Lipoprotein, basierend auf seinem Cholesteringehalt, ist die primäre Basis für Entscheidungen zur Behandlung in den klinischen NCEP-Richtlinien. [National Cholesterol Education Program, zweiter Bericht des Expertengremiums zu Nachweis, Bewertung und Behandlung von Erwachsenen mit hohem Blutcholesterin (Adult Treatment Panel II [Gremium II für die Behandlung von Erwachsenen]), NCEP (1993).] Die wichtigste Proteinkomponente von LDL ist Apolipoprotein B-100 (ApoB), das zuvor mittels Immunoassay gemessen wurde. Das häufige in der Forschung angewendete Verfahren für die genaue Quantifizierung von LDL-Cholesterin und die Basis für das Referenzverfahren wird als β-Qantifizierung bezeichnet, wobei sich β auf den elektrophoretischen Begriff für LDL bezieht. Die β-Quantifizierungstechnik beinhaltet eine Kombination aus Ultrazentrifugation und chemischer Präzipitation. [US Department of Health and Human Services, "Lipid Research Clinics Program" [Klinisches Programm der Lipidforschung], Manual of Laboratory Operations [Handbuch für Arbeitsweisen im Labor], zweite Auflage, NIH-Publikation (1983) und J. D. Belcher et aL, "Measurement of low density lipoprotein cholesterol concentration" [Messung der LDL-Chlolesterinkonzentration], Methods for Clinical Laboratory Measurement of Lipid and Lipoprotein Risk Factors [Verfahren für die Messung der Lipid- und Lipoprotein-Risikofaktoren im klinischen Labor], Washington D. C., ACC Press, 75-86 (1991).] Das β-Quantifizierungsverfahren ergibt ein sogenanntes 'broadcut' LDL, welches das Lp(a)-Lipoprotein einschließt, [G. Utermann, "The mysteries of lipoprotein(a)" [Die Geheimnisse von Lipoprotein(a)], Science, 246: 904-910 (1989) und J. Loscalzo, "Lipoprotein(a): a unique risk factor for atherothrombotic disease" [Lipoprotein(a): ein einzigartiger Risikofaktor für Atherothrombose], Arteriosclerosis 10: 672-679 (1990).] auf das häufig als "Lipoprotein mit kleinem a" verwiesen wird. Die National Cholesterol Education Program Lipoprotein Measurement Working Group (NCEP-Gremium) kam in seinen "Recommendations for measurement of low density lipoprotein cholesterol" [Empfehlungen für die Messung von LDL-Cholesterin" (Null-Publikation im Druck) zu der Schlussfolgerung, dass alternative Verfahren für den Gebrauch in der Routinediagnostik benötigt werden, bevorzugt die, die LDL für die Cholesterin-Quantifizierung direkt trennen. Eines dieser direkten Verfahren beinhaltet die Elektrophorese. Elektrophoretische Verfahren, die in L. A. Lewis und J. J. Oppit, CRC Handbook of Electrophoresis [CRC-Handbuch der Elektrophorese], Vol. 1 und 2, Boca Raton, CRC Press, Inc. (1980) besprochen werden, haben eine lange Geschichte des Einsatzes bei der qualitativen und quantitativen Analyse von Lipoproteinen. Elektrophorese erlaubt nicht nur die Trennung und Quantifizierung von wichtigen Lipoprotein-Klassen, sondern sieht zusätzlich eine visuelle Anzeige vor, die bei dem Nachweis ungewöhnlicher oder varianter Muster nützlich ist. Agarose ist das bevorzugte Medium für die Trennung intakter Lipoproteine gewesen, die einen klaren Hintergrund und Zweckmäßigkeit vorsah. [R. P. Nobe, "Electrophoretic separation of Plasma lipoproteins in agarose gel" [Elektrophoretische Trennung von Plasmalipoproteinen in Agarosegel], J. Lipid Res. 9: 693 (1968); F. T. Lindgren et al., "A comparison of simplified methods for lipoprotein quantitation using the analytic ultracentrifuge as a standard" [Ein Vergleich vereinfachter Verfahren für die Quantifizierung von Lipoproteinen unter Verwendung der analytischen Ultrazentrifuge als Standard], Lipids, 12: 278 (1977); D. Conlon et al., "Quantitative determination of high-density lipoprotein cholesterol by agarose gel eleetrophoresis updated" [Aktualisierte quantitative Bestimmung von HDL-Cholesterin durch Agarosegel-Elektrophorese, Clin. Chem. 24: 227 (1979) und N. M. Papadopoulos, "Hyperlipoproteinemia phenotype determination by agarose gel eleetrophoresis updated" [Aktualisierte Bestimmung des Hyperlipoproteinämie-Phänotyps mittels Agarosegel-Elelektrophorese], Clin. Chem., 24: 227-229 (1978).] Frühe elektrophoretische Verfahren wurden im Allgemeinen für die qualitative Analyse als nützlich gehalten, aber als weniger wünschenswert für die Quantifizierung von Lipoprotein aufgrund der unzureichenden Präzision und der großen systematischen Verzerrungen (Bias) im Vergleich zu anderen Verfahren, wie in einem Artikel von G. R. Warnick et al., "Lipoprotein quantification: An electrophoretic method compared with the lipid research clinics method" [Lipoprotein-Quantitizierung: Ein elektrophoretisches Verfahren im Vergleich mit dem Verfahren der klinischen Lipidforschung], Clin. Chem, 28: 2116-20 (1982) berichtet wurde.
- EP-0183 381 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, welches die Inkubation einer Probe, einer Cholesterin-Dehydrogenase und NAD oder NADP bei Vorliegen eines oberflächenaktiven Mittels und dann die kinetische Messung der sich ergebenden nachweisbaren Veränderung berichtet; JP-58089 183 offenbart das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das Cholesterin enthält, unter aeroben Bedingungen und Trennen von NAD(P)-abhängiger Cholesterin-Dehydrogenase von den kultivierten Zeilen und der Kulturflüssigkeit; JP-58210 000 offenbart das Fraktionieren von Blutserum, um Lipoprotein-Cholesterin zu erhalten und Behandlung mit einem Farbreagenz; WO-82/0083 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamtcholesterins und DE-3640349 offenbart die Bestimmung der Cholesterinverteilung und Proteinfraktionen nach der elektrophoretischen Trennung.
- Die vorliegende Erfindung ist zum Gebrauch bei der quantitativen Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in den Lipoproteinen von Serum nach der Elektrophorese bestimmt. Es ist beabsichtigt, dass die Erfindung für die Beurteilung des Cholesteringehaltes der Lipoproteine hoher Dichte (HDL), Lipoproteine geringer Dichte (LDL) und Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) verwendet wird. Die Verfahren und Reagenzien der Erfindung sehen eine preisgünstige, schnelle und effiziente Fluoreszenzanalyse des Cholesteringehaltes elektrophoretisch getrennter Lipoproteinbanden vor.
- Das vorliegende System und die vorliegende Erfindung trennen die wichtigen Lipoproteinklassen unter Verwendung der Elektrophorese. Die α-Bande, die am weitesten in Richtung der Anode wandert, entspricht HDL. Die nächste Bande, Prä-β, entspricht VLDL, und die sich am langsamsten bewegende β-Bande entspricht in etwa LDL. Wenn eine Bande zwischen α und dem Startpunkt, mit einer schnellen Prä-β-Mobilität erscheint, dann entspricht sie LDL und sollte mit der LDL-Bande quantifiziert werden. Diese Bande kann nicht in jeder Probe beobachtet werden. Chylomikronen, falls vorliegend, bleiben am Startpunkt zurück.
- Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Lipoproteinbanden mit Enzymreagens der vorliegenden Erfindung gefärbt, so dass der Cholesteringehalt der Banden mittels fluorometrischer Densitometrie quantifiziert werden kann. Diese aktiven Bestandteile des Reagens und die Richtung der Reaktion, wenn der pH des Reagens 7,5-9,5 beträgt, wird wie folgt dargestellt:
- * Die aktiven Bestandteile des Reagens sind im Fettdruck angegeben.
- Die gebildete NADH-Menge verhält sich direkt proportional zu der Cholesterin und Cholesterinestermenge, die ursprünglich in der Probe vorliegen. Der relative Prozentanteil von Cholesterin in jeder Fraktion wird durch Scanning im Fluoreszenzmodus unter Verwendung eines Scanning-Densitometers erhalten, der die Emissionen von angeregten NADH-Molekülen nachweist.
- Folglich schließt die Erfindung breitgefasst ein Reagenz zum Färben von Lipoproteinen für die fluorometrische Analyse von elektrophoretischen Banden ein, wobei genanntes Reagens Enzymkomponenten und eine Oxidationsmittelkomponente umfasst.
- Die Erfindung schließt ferner ein Verfahren zur Fluoreszenzanalyse des Cholesteringehaltes von Lipoproteinen hoher Dichte (HDL), Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) und Lipoproteinen sehr geringer Dichte (VLDL) auf einer Elektrophoreseplatte ein, wobei genanntes Verfahren Folgendes umfasst:
- (1) Elektrophoretische Trennung der Lipoproteine;
- (2) Färben der getrennten Proteine mit einem Reagens, das mindestens eine Enzymkomponente und eine Oxidationskomponente umfasst und
- (3) Anregen der gefärbten Proteine mit einer geeigneten Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung und
- (4) Scanning der angeregten Proteine mit einem Densitometer mit fluorometrischen Fähigkeiten.
- Jedes konventionelle Elektrophorese-Instrument kann zur praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei der praktischen Ausführung der unten beschriebenen bevorzugten Ausführungsform wurden die im Handel erhältlichen Instrumente Rapid ElectroPhoresis (REP®) und Rapid ElectroPhoresis 3 (REP® 3) von der Helena Laboratories Corporation verwendet. Das REP®-Instrument und die Verwendung dieses Instrumentes werden in den US-Patenten Nr. 4,810,348 und 4,909,920 beschrieben.
- Das REP® 3-Instrument ist dem REP®-Instrument ähnlich, schließt aber einen Fluoreszenz-Scanner in situ ein. Das REP®-Instrument und die Verwendung dieses Instrumentes werden in US-Patent Nr. 6,068,753 beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung wird im Kontext eines REP® 3-Scanning-Elektrophorese- Apparates erklärt, der von der Helena Laboratories Corporation auf dem Markt angeboten wird.
- In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden frische Serumproben unter Verwendung einer Agarosegel-Matrix oder -Platte elektrophoretisch getrennt. Die Elektrophorese wird unter nativen Bedingungen durchgeführt. Außer der Agarose schließt das verwendete Gel Quanidinhydrochlorid, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat, Natriumazid und andere Konservierungsmittel und einen Elektrophorese-Puffer, bevorzugt Natriumbarbital mit EDTA bei einem pH-Bereich von 7,6 bis 9,6 ein. In der bevorzugten Ausführungsform weist das Natriumbarbital einen pH von ca. 8,6 auf. Unter Verwendung eines Rep®-Elektrophoresesystems von der Helena Laboratories Corporation wird die Frobe bei 225 Volt 40 Minuten bei 12ºC elektrophoretisch getrennt. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass andere Analysatoren und Systeme wahrscheinlich andere Bedingungen für die Optimierung des Assays erfordern.
- Nach dem Elektrophoreseschritt wird die Agaroseplatte ca. 5 Minuten lufttrocknen lassen. Der Lufttrocknungsschritt ist für den Zweck der Entfernung übermäßiger Feuchtigkeit von der Oberfläche des Gels gedacht, bevor das Reagens aufgebracht wird. Die Platte wird bei diesem Schritt nicht vollkommen getrocknet. Das Färbemittel oder -reagens der vorliegenden Erfindung wird dann aufgebracht.
- Die Konzentration der reaktiven Bestandteile des Reagens ist wie folgt:
- Cholesterinesterase (Pseudomonas sp.) 4,5 U/ml*
- Cholesterin-Dehydrogenase (Nocardia sp.) 0,9 U/ml*
- NAD 29 mM
- *U/ml bedeutet Einheiten pro Milliliter in dem rekonstituierten Reagens (das unten besprochen wird).
- NAD ist Nicotinamid-adenin-dinucleotid, bei dem es sich um ein Oxidationsmittel handelt. NAD ist spezifischer ein Protonenakzeptor-Coenzym. In reduzierter Form fluoresziert NADH, wenn es mit einer geeigneten Wellenlänge einer elektromagnetischen Strahlung angeregt wird.
- Vor Gebrauch werden die aktiven Bestandteile des Reagens von dem Puffer des Reagens entfernt gelagert. Zum Rekonstituieren der aktiven Bestandteile und Herstellung des Reagens zum Gebrauch, werden die aktiven Bestandteile in den oben angegebenen Mengen in dem inaktiven Bestandteil aufgelöst; 885 mM Tricin-Pufer mit einem pH in dem Bereich von 7,5-9,5. Die aktiven Bestandteile müssen vorsichtig verwirbelt werden, bis alle aktiven Bestandteile aufgelöst sind. Das rekonstituierte Reagens ist ca. 2 bis 4 Stunden bei 2 bis 6ºC stabil.
- Sobald das Reagens auf die elektrophoretisch getrennte Platte aufgebracht ist, wird sie mit dem Cholesterin und Cholesterinestern ca. 3 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wird die elektrophoretisch getrennte Platte 3 Minuten bei 54ºC getrocknet. Es sollte wiederum zur Kenntnis genommen werden, dass andere Analysatoren und Systeme wahrscheinlich andere Bedingungen zur Optimierung des Assays erfordern. Danach wird die Platte fluorimetrisch gescannt. Die Quantifizierung der Fluoreszenz Muster wurde unter Verwendung des sich am REP® 3 von der Helena Laboratories Corporation in situ befindenden Scanners erhalten, aber jedwedes Densitometer mit fluorometrischer Fähigkeit kann verwendet werden. Die Fraktionen fluoreszieren bei einer Peak-Anregungswellenlänge von 356 nm aufgrund des Vorliegens von NADH, der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid.
- Insgesamt 57 Patienten mit Gesamtcholesterinwerten* im Bereich von 124-200 mg/dl wurden unter Verwendung des oben identifizierten Reagens und Verfahrens mit dem REP® 3-Instrument von der Helena Laboratories Corporation getestet. [Lipoprotein-Cholesterinwerte variieren dem Alter und Geschlecht entsprechend, und weite Variationen wurden unter verschiedenen geographischen Orten und Rassen berichtet. Deshalb ist es unerlässlich, dass jedes Labor seinen eigenen erwarteten Bereich für seine jeweilige Population festlegt.] Dreiundzwanzig (23) dieser Proben wiesen schnelle Prä-β mit normalem Gesamtcholesterin auf. Die folgenden Daten wurden erhalten:
- N = 57
- BEREICH ( + SD)
- HDL (%) 20,5-49,7
- VLDL (%) 0-27,3
- LDL + Prä-β (%) 36,6-69,4
- * Die Gesamtcholesterine wurden unter Verwendung eines Gesamtcholesterin-Verfahrens bei 37ºC laufen lassen.
- Das REP® 3 Auto-Flur-Cholesterinsystem trennt die wichtigen Lipoproteinklassen. Die α-Bande, die am weitesten in Richtung der Anode wandert, entspricht HDL. Die nächste Bande, Prä-β, entspricht VLDL, und die sich am langsamsten bewegende β-Bande entspricht in etwa LDL. Erscheint eine Bande zwischen α und dem Startpunkt, mit schneller Prä-β-Mobilltät, entspricht sie LDL und sollte der LDL-Quantifizierung zugefügt werden. Diese Bande kann nicht in jeder Probe beobachtet werden. Chylomikronen, wenn sie vorliegen, bleiben am Startpunkt zurück.
- Das Helena REP® 3 berechnet und druckt automatisch die relativen Prozent- und die absoluten Werte für jede Bande, wenn das Gesamtcholesterin der Probe eingegeben wird.
- Dieses Verfahren ist zur Trennung und Quantifizierung von Lipoproteinklassen beabsichtigt. Für die Proben, welche eine Bande zwischen α und dem Startpunkt, mit schneller Prä-β-Mobilität, aufweisen, sollte sie als Teil der Gesamt-LDL-Fraktion berichtet werden. Diese Bande sollte nicht als Lp(a) berichtet werden, da nicht genügend klinische Studien durchgeführt wurden, um diese Entscheidung zu substanziieren.
- Das System ist bis 400 mg/dl Gesamtcholesterin oder mindestens 250 mg/dl pro Bande, mit einer Empfindlichkeit bis 2 mg/dl pro Bande, linear. Quantifizierungen von Patientenproben, die über die Linearität des Systems hinausgehen, sollten mit Kochsalzlösung verdünnt und erneut getestet werden.
- Behandlungsentscheidungen der NCEP-Richtlinien basieren primär auf LDL-Cholesterinspiegeln (Tabelle 1). Die in dem Klassifikationsschema berücksichtigten Risikofaktoren sind: Alter (Männer gleich oder älter als 45 Jahre und Frauen gleich oder älter als 55), Familiengeschichte einer prämaturen KHK, Rauchen, Hypertonie und Diabetes. Eine Behandlung ist angemessen, wenn das LDL-Cholesterin bei oder über den folgenden 'Cutpoints' liegt: alle Patienten bei oder über 160 mg/ml mit zwei oder mehr Risikofaktoren mit einem Wert über 130 mg/dl.
- HDL-Cholesterin wird bei oder unter 35 mg/dl als hohes Risiko erachtet und als einer der Risikofaktoren in dem Klassifikationsschema gezählt. Ein HDL-Cholesterinwert über 60 mg/dl wird als protektiv erachtet und subtrahiert einen Risikofaktor von der Gesamtzahl der Risikofaktoren.
- Erwünschtes Blutcholesterin < 200 mg/dl
- Borderline für hohes Blutcholesterin 200-239 mg/dl
- Hohes Blutcholesterin ≥240 mg/dl LDL-Cholesterin LDL-Cholesterin
- Niedriges HDL-Cholesterin < 35 mg/dl
- Protektives HDL-Cholesterin > 60 mg/dl
- Wünschenswert < 250 mg/dl
- Borderline 250-500 mg/dl
- Erhöht 500-1000 mg/dl
- Stark erhöht/Pankreatitis > 1000 mg/dl
- Eine Probe von einem einzelnen Patienten wurde insgesamt 30-mal auf einem Gel laufen lassen. Diese Präzisionstudie ergab VK von weniger als 5%. In dieser Probe wurden keine VLDL beobachtet.
- N = 30
- Drei verschiedene Patientenproben, die niedrige, mittlere und hohe LDL-Spiegel darstellen, wurden in Wiederholungsbestimmung getestet, die eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit zeigte.
- Von einer Probe mit erhöhtem Cholesterin wurden Reihenverdünnungen angefertigt und unter Verwendung der Verfahren und des Reagens der vorliegenden Erfindung getestet. Die Linearitätsstudie zeigte, dass das System bis 400 mg/dl Gesamtcholesterin oder mindestens 250 mg/dl pro Bande linear ist und dass das System bis 2,0 mg/dl pro Bande empfindlich ist.
- Patientenproben wurden für die Korrelationsstudie laufen lassen, die in Verbindung mit dem REP® 3 Auto-Flur-Cholesterinsystem und dem REP®-Cholesterin-Profilsystem durchgeführt wurde. Der Bereich von Gesamtcholesterin für die Proben lag bei 115 mg/dl-315 mg/dl. Bei allen Patienten fanden sich Triglycerid-Spiegel unter 500 mg/dl. Das Folgende sind die Korrelationsdaten für einzelne Banden an den beiden Systemen.
- X = REP® Cholesterin-Profil
- Y = REP® Auto-Flur-cholesterin
- n = 20
- Die Verweise auf REP® Cholesterin beziehen sich auf ein System, bei dem die Fraktionen sichtbar sind und sich der Verweis auf REP® 3 Auto-Flur-Cholesterin auf den Labortest der vorliegenden Erfindung bezieht. [Ab dem Einreichungsdatum der Prioritätsanmeldung.]
Claims (14)
1. Verfahren für die Fluoreszenzanalyse des Cholesteringehaltes von Lipoproteinen
hoher Dichte (HDL), Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) und Lipoproteinen sehr
geringer Dichte (VLDL) auf einer Elektrophoreseplatte, wobei genanntes Verfahren
Folgendes umfasst:
Elektrophoretische Trennung der Lipoproteine;
Färben der getrennten Proteine mit einem Reagens, das mindestens eine
Enzymkomponente und eine Oxidationskomponente umfasst,
Anregen der gefärbten Proteine mit einer geeigneten Wellenlänge elektromagnetischer
Strahlung und
Fluoreszenz-Scanning der angeregten Proteine mit einem Densitometer mit
fluorometrischen Fähigkeiten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin genanntes Verfahren ferner den Schritt des
Trocknens der Elektrophoreseplatte vor dem Färben der Proteine und den Schritt des
Trocknens der Elektrophoreseplatte nach dem Färben der Proteine, aber vor ihrem
Scanning umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin genannte mindestens eine
Enzymkomponente mindestens zwei Enzyme umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin eines von mindestens zwei Enzymen eine
Cholesterin-Dehydrogenase ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin genannte Cholesterin-Dehydrogenase aus
Nocardia sp. isoliert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, worin ein zweites von genannten mindestens zwei
Enzymen eine Cholesterinesterase ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Oxidationsmittel ein
Protonenakzeptor-Coenzym ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7 worin genanntes Reagens ferner einen alkalischen
Puffer umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin genanntes Protonenakzeptor-Coenzym
Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin genannter Puffer einen pH von 7,5 bis 9,5
aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Puffer Tricin ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, worin genannte
Cholesterin-Dehydrogenase in einer Menge von 0,9 U/ml vorliegt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin genannte NAD in einer
Menge von 29 mM vorliegt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 13, worin genannte Cholesterinesterase
in einer Menge 4,5 U/ml vorliegt.
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