JP2003169696A - 生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、グルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素を用いた、反応中間体としてホルムアル
デヒドを生成する化合物の、簡便で高感度な測定方法、
およびそのための試薬組成物に関する。 【解決手段】 試料に、アルコールオキシダーゼを作用
させ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドに、
あるいは、試料に、ウリカーゼを作用させ、該酵素反応
により生成した過酸化水素を、さらにメタノールの存在
下でカタラーゼと作用させることにより生成したホルム
アルデヒドに、グルタチオン及びグルタチオン依存性ホ
ルムアルデヒド脱水素酵素を作用させ、該酵素反応より
生成した化合物を分析することを特徴とする尿酸の測定
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた、ホルムアルデ
ヒドまたは反応中間体としてホルムアルデヒドを生成す
る化合物の、簡便で高感度な測定方法、およびそのため
の試薬キットに関する。さらには、中間生成物としてホ
ルムアルデヒドを経由する、クレアチニン、クレアチン
およびホモシステイン等の生体成分を測定する方法、お
よびそのための試薬キットに関する。本発明はまた、ホ
モシステインおよび他の物質を基質とする転移酵素を用
いたホモシステインの測定方法およびそのための試薬キ
ットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ホルムアルデヒドは、蛋白質、膜、ＤＮ
Ａ等と反応性に富む細胞毒であり、吸引、内服すること
で種々の障害を引き起こすことが知られている。近年、
大気中、工業廃液、食品等に含有されるホルムアルデヒ
ドが問題視されており、これを簡便かつ正確に測定する
方法が要求されている。

【０００３】ホルムアルデヒドの測定法として、Ｈａｎ
ｚ試薬、ＣＴＡ試薬（J.Biol.Chem.231,p813 (195
8)）、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬（Anal.Biochem.234 (1),p5
0(1996)）などを用いて比色分析する方法、フェニルヒ
ドラジン、フェリシアン化カリウム、クロロホルム、メ
タノールを組み合わせた試薬を用いる分析法が知られて
いる。しかしこれらの方法は操作が煩雑で測定に長時間
要する、或いは有害試薬を使用するなどの問題点があ
り、その解決手段として、グルタチオン非依存性のホル
ムアルデヒド脱水素酵素（EC 2.1.1.46）を用いる酵素
法が開示されている（特開平５−４２０００号公報、特
開２０００−２２５０００号公報）。これら酵素法は、
該酵素反応により、ホルムアルデヒドから蟻酸を生成す
る際に、同時に生成される還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、若しくはこれより導いた発色色素を
分析するが、測定感度は還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドや色素の分子吸光係数に依存するため、
微量のホルムアルデヒドの測定には必ずしも十分とは言
えない。

【０００４】一方、微量物質の酵素による高感度定量法
として、測定対象とする基質や、基質に作用する酵素の
補酵素をサイクリング反応により増幅、定量する方法が
知られている（検査と技術、vol.27、No8、1999年7
月）。サイクリング法の１つとして、脱水素酵素と２種
類の補酵素（チオＮＡＤ類とＮＡＤＨ類、またはＮＡＤ
類とチオＮＡＤＨ類）を用いて、可逆反応を利用した酵
素サイクリング法による測定法が報告されている（特公
平６−６１２７８号公報、特公平６−７３４７７号公
報、特公平６−７３４７８号公報、特公平６−７３４７
９号公報、特許第３０２３７００号公報、特許第３０３
４９６９号公報、特許第３０３４９７９号公報、特許第
３０３４９８４号公報、特許第３０３４９８６号公報、
特許第３０３４９８７号公報、特許第３０３４９８８号
公報、特開平８−１０３２９８号公報）。

【０００５】特開平４−３４１１９８号公報にはアルコ
ールデヒドロゲナーゼおよびチオＮＡＤ類とＮＡＤＨ
類、またはＮＡＤ類とチオＮＡＤＨ類を用いるアルコー
ル類またはアルデヒド類の高感度定量法が開示されてい
る。ここで用いられるアルコールデヒドロゲナーゼの代
表的な酵素として下記の反応を触媒するＥＣ１．１．
１．１の酵素が挙げられている。 アルコール ＋ ＮＡＤ（Ｐ）+ ⇔ アルデヒド ＋
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ

【０００６】しかしながら、D.Schomburg,D.Stephan(Ed
s.) Enzyme Handbook 9（Springer-Verlag）には、
本酵素は、基質としてメタノールを酸化するのみなら
ず、その生成物であるホルムアルデヒドをも酸化するこ
とが記載されている。ホルムアルデヒドは水溶液中では
水和にして存在し、アルコールの状態で存在するので、
アルコールデヒドロデナーゼの被酸化基質となってお
り、酢酸まで酸化されるため、この酵素を用いてのホル
ムアルデヒドの高感度測定は成り立たない。

【０００７】またグルタチオン非依存性のホルムアルデ
ヒド脱水素酵素等アルデヒド脱水素酵素は非可逆的にホ
ルムアルデヒドを酸化するので同様にサイクリング反応
による高感度測定には適用できない。

【０００８】一方、分析科学の分野において、ホルムア
ルデヒドを中間生成物として経由して測定できる化合物
があることが知られている。中でも有用なものとして、
臨床検査におけるクレチニン、クレアチンおよびホモシ
ステイン等の測定が挙げられる。

【０００９】クレアチニンは臨床検査において腎機能の
主要な診断マーカーであり、クレアチンの測定は、筋ジ
ストロフィー症、甲状腺機能亢進症などの病態解析に用
いられる。これらの測定法としてはＪａｆｆｅ法が主流
であるが特異性に関する問題点の指摘があった。また、
最近は特異性の高いクレアチニンアミドハイドロラ−
ゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオ
コシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いた酵素法も増加し
ているが、生体内に存在する還元物質の影響を受ける可
能性の指摘があった。また、酵素法においてペルオキシ
ダーゼの代わりにグルタチオン非依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素を用いてサルコシンオキシダーゼ反応によ
り生成するホルムアルデヒドを上記方法にて分析する方
法も報告されている（Clin. Clim. Acta, 122,p181(198
2), Ann.Clin.Biochem,29,p523(1992)）が、上述のよう
に、微量の測定には必ずしも十分ではなかった。

【００１０】ホモシステインは、生体内では必須アミノ
酸であるメチオニンが代謝を受けて生成されるＳＨ基を
有するアミノ酸であり、通常は低濃度で生体内に存在す
るが、血中ホモシステイン濃度の上昇をもたらすこれら
代謝酵素の遺伝疾患であるホモシスチン尿症が動脈硬化
症と関連のあることが知られており、近年では正常値よ
り若干高いレベルのホモシステイン濃度においても脳梗
塞、心筋梗塞、深部静脈血管症と関連付けられることが
明らかにされ、現在では血中ホモシステイン濃度がこれ
ら疾患の独立した危険因子として注目されている。ホモ
システインの測定法はこれまで、ＨＰＬＣを用いた方法
が標準法として用いられており（Clin.Chem.,39,p1590
(1993)）、種々の改良法も報告されているが、ＨＰＬＣ
を用いる方法では精巧な分析装置を必要とする上、多量
の検体を扱うには不適であるという欠点がある。ＨＰＬ
Ｃによる分離を要しない方法として、ホモシステインを
アデノシン、フルオレセイン標識Ｓ−アデノシルホモシ
ステイン存在下でＳ−アデノシルホモシステイン加水分
解酵素と反応させ、反応系に存在するＳ−アデノシルホ
モシステインを、抗Ｓ−アデノシルホモシステイン抗体
を用いて蛍光偏向イムノアッセイを行なうことでホモシ
ステインを測定する方法（特表平８−５０６４７８号公
報）などが知られている。また最近酵素法として、ホモ
システインをホモシステインデスルフラーゼで反応さ
せ、生成するアンモニア、α−ケト酸または硫化水素を
測定する方法（特表２０００−５０２２６２号公報）、
ホモシステインに対して分解作用を有するＬ−メチオニ
ンγ−リアーゼやｏ−アセチルホモセリン−リアーゼを
用いて、チオール化合物の存在下で生成する硫化水素ま
たはチオール化合物置換ホモシステインを測定する方法
（特開２０００−１６６５９７号公報）、ホモシステイ
ンのγ位メルカプト基と置換可能な求核試薬の存在下、
γ−置換−α−アミノ酪酸合成酵素によりホモシステイ
ンから生成する、γ−置換−α−アミノ酪酸または硫化
水素を定量する方法（特開２０００−２２８９９８号公
報）なども報告されている。

【００１１】しかし、イムノアッセイ法でも一般の生化
学検査に比べて時間、費用を要することが知られてお
り、酵素反応を用いた分析法も、一般に血中ホモシステ
イン量が正常値で１０μＭ程度若しくはそれ以下と微量
であるため測定感度が不足していたり、あるいは使用す
る酵素の基質特異性により、検体中のホモシステイン以
外の物質に作用するなどの点で、正確なホモシステイン
量の測定には十分であるとは言えない。

【００１２】服部と川村（特開２００１−１７１９８）
は、ホモシステインと他の物質とを基質とする転移酵素
を、当該他の基質とともにホモシステインを含む試料に
作用させて、生成する化合物を測定することにより、ホ
モシステインをより高感度かつ高精度に測定できること
を開示している。特に、転移酵素としてベタイン−ホモ
システインメチル転移酵素、および他の基質としてベタ
インを使用し、生成するジメチルグリシンを、ジメチル
グリシンオキシダーゼを用いてさらにサルコシン、ホル
ムアルデヒドおよび過酸化水素にまで分解し、これらの
化合物のいずれかを測定することにより、ホモシステイ
ンを高感度かつ高精度に測定できることが記載されてい
る。しかしながら、生体試料において、ホモシステイン
の多くは、ジスルフィド結合により蛋白質やチオール基
を有する他のアミノ酸と結合した状態で存在するため、
総ホモシステインの測定は還元条件下で行う必要がある
が、還元条件下で十分に安定なジメチルグリシンオキシ
ダーゼはこれまでに報告されておらず、したがって、か
かる条件下では試薬性能の低下を引き起こす可能性があ
った。

【００１３】一方、酵素サイクリング法を利用したホモ
システイン測定法として、シスタチオニンβ−シンター
ゼとシスタチオニンβ−リアーゼにより生成するピルビ
ン酸、アンモニアを測定する方法（ＵＳ６１７４６９
６）、ホモシステインデスルフラーゼと２−ケト酪酸脱
水素酵素をもちいて生成、または消費されるＮＡＤ類ま
たはチオＮＡＤ類を分析する方法（特開２００１−１６
１３９９、特開２００１−１４９０９２）などが知られ
ているが、生体内でのホモシステイン量を考慮すると更
に高感度で測定できる方法が望ましい。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ホルムアルデヒド、または反応中間体としてホ
ルムアルデヒドが生成する化合物の高感度且つ簡便な測
定手段を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、酵素サイクリング法を用いたホルムアルデヒド
の高感度測定法の確立を目標とした。そこでまず、当該
方法に使用しうる酵素として、ホルムアルデヒドに可逆
的に作用するグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素（EC 1.2.1.1）に着目し、鋭意研究を重ねた結
果、２種類の異なる酸化還元物質を補酵素として利用す
ることが出来、かつ両者に対する反応性のバランスがサ
イクリング反応の進行を可能ならしめるものである、新
規なグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
スクリーニングすることに成功した。さらにこの酵素
を、グルタチオン、酸化型の補酵素および還元型の他の
補酵素とともに試料に作用させ、該酵素反応よるいずれ
かの補酵素量の変化を測定することにより、ホルムアル
デヒド、ならびに反応中間体としてホルムアルデヒドを
生成する化合物、例えばクレアチニン、クレアチン、ホ
モシステイン、メタノール、尿酸を測定できることを見
出し、本発明を完成させるに至った。一方で、本発明者
らは、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素とジメ
チルグリシンオキシダーゼを用いる測定系における使用
に適した特性を有するジメチルグリシンオキシダーゼを
鋭意探索した結果、チオール化合物に対して耐性であ
り、かつ従来の酵素に比べてジメチルグリシンに対する
Ｋｍ値の小さい、新規なジメチルグリシンオキシダーゼ
を単離精製することに成功した。さらに、本酵素を上記
測定系に適用したところ、ホモシステインをさらに高感
度かつ高精度に測定できることを確認した。

【００１６】即ち、本発明は以下のような構成からな
る。 （１）試料に、アルコールオキシダーゼを作用させ、該
酵素反応により生成したホルムアルデヒドに、グルタチ
オン及びグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素を作用させ、該酵素反応より生成した化合物を分析す
ることを特徴とするメタノールの測定方法。 （２）試料に、ウリカーゼを作用させ、該酵素反応によ
り生成した過酸化水素を、さらにメタノールの存在下で
カタラーゼと作用させることにより生成したホルムアル
デヒドに、グルタチオン及びグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素を作用させ、該酵素反応より生成
した化合物を分析することを特徴とする尿酸の測定方
法。 （３）緩衝液、グルタチオン、グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素およびアルコールオキシダーゼ
を少なくとも含有してなることを特徴とするメタノール
測定用試薬組成物。 （４）緩衝液、グルタチオン、グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素およびウリカーゼ、カタラーゼ
を少なくとも含有してなることを特徴とする尿酸測定用
試薬組成物。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明のホルムアルデヒドの測定
方法は、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類、および
ＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類の２種類の補酵素を利用で
き、且つＮＡＤに対する反応性に対するチオＮＡＤに対
する反応性の比が従来公知のものに比べて高い新規グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を、グルタ
チオンおよび上記いずれかの酸化型補酵素とともに試料
に作用させ、生成もしくは消費される化合物の量を測定
することを特徴とする。

【００１８】本発明において使用されるグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）は、正
確には、酸化型補酵素の存在下、グルタチオンとホルム
アルデヒドより非酵素的に生成するＳ−ヒドロキシメチ
ルグルタチオンを基質として、Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンと還元型補酵素の生成を可逆的に触媒する酵素であ
る。

【００１９】本発明におけるグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素は、補酵素として、チオＮＡＤ類
もしくはチオＮＡＤＰ類、およびＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類を利用することができる。ＮＡＤ類としては、例
えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジン
アデニンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミ
ドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、ＮＡＤＰ類と
しては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸などが例示される。また、チオＮＡＤ類
としては、例えば、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチドなどが、チオＮＡＤＰ類としては、例えば、チオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸など
が具体例として挙げられる。

【００２０】好ましい実施態様においては、本発明のホ
ルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、チオＮＡＤ類
およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの化
合物、および還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させ
て、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化し
た化合物の量を分析することを特徴とする。

【００２１】別の好ましい実施態様においては、本発明
のホルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、還元型チ
オＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、およびＮＡＤ類とＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させ
て、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化し
た化合物の量を分析することを特徴とする。

【００２２】該サイクリング反応では、酸化型補酵素か
ら還元型補酵素、若しくは還元型補酵素から酸化型補酵
素の生成が反応時間に比例して、基質の量に対して増幅
して生成されることからから、補酵素がＮＡＤ類、ＮＡ
ＤＰ類の場合は３４０ｎｍ付近の吸光度を、チオＮＡＤ
類、チオＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸光度を
測定することで、ホルムアルデヒドを高感度に定量する
ことができる。該サイクリング反応に用いるグルタチオ
ン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、ホルム
アルデヒドを分解してサイクリング系外に放出するよう
な夾雑酵素、例えばＳ−ホルミルグルタチオンハイドロ
ラーゼを含まないか測定値に影響を与えない程度に含量
が低いことが望ましい。またＮＡＤ（Ｐ）分解酵素につ
いても全く含まないか測定値に影響を与えない程度に含
量が低いことが望ましい。

【００２３】該サイクリング反応を効率的に行わせしめ
るためには、本発明で使用するグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は、チオＮＡＤ類もしくはチオ
ＮＡＤＰ類に対して十分な反応性を有する必要がある。
具体的には、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡ
Ｄに対する反応性の比が３０％以上であり、好ましくは
６０％以上である。さらに、酸化型補酵素としてチオＮ
ＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応によ
り生成する還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に
対して、添加される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応
性が十分に高いものである。一方、酸化型補酵素として
ＮＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタ
チオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応に
より生成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に対
して、添加される還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反
応性が十分に高いものである。グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は高等動物から微生物まで広く
存在することが知られており、チオＮＡＤに対して比較
的高い作用性を有する該酵素としてはヒト肝臓由来のも
のが報告されているが（Biochem. J., 177, 869-878 (1
979)）、高等動物のグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は通常、微生物由来の酵素と比べて比活性
が低く、また、該酵素を用いてサイクリング反応を行う
ことができたという報告は未だなされていない。

【００２４】従って、本発明は、上記のいずれかの条件
を具備し、サイクリング反応を触媒することができる、
新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
提供する。好ましくは、当該酵素は、さらに下記の理化
学的性質を有する。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０（２５℃で２４時
間処理した後の残存活性が８０％以上のｐＨ範囲） (d) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５で３０分間処
理した後の残存活性が９０％以上の温度範囲）

【００２５】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素は、サイクリング反応を触媒するのに必
要な上記の条件を具備する限り、その由来は特に制限さ
れないが、好ましくは微生物由来であり、より好ましく
はメタノール資化性酵母由来、いっそう好ましくはHans
enula属酵母由来、就中Hansenula nonfarmentans IFO14
73株由来のものが挙げられる。IFO1473株は、（財）発
酵研究所（〒532-8686，日本国大阪市淀川区十三本町2-
17-85）より入手可能である。

【００２６】また、本発明のグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素は、ランダムにもしくは部位特異
的に変異を誘発することにより、サイクリング反応を触
媒するのに必要な、２種類の補酵素に対する反応性のバ
ランスを保持する範囲で、比活性や安定性を向上させる
などの酵素特性の改良をもたらすように遺伝的に改変さ
れたものであってもよい。本発明のグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素は、該酵素を産生する細胞
または組織の培養物を原料として単離精製する方法、あ
るいは当該酵素蛋白質をコードする遺伝子を常法によっ
て単離し、遺伝子組換え技術を用いて適当な宿主中で発
現させる方法によって取得することができる。前者の好
ましい一実施態様として、以下の方法が例示される。

【００２７】まず、上記のいずれかのグルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素生産菌、例えば、Hansen
ula nonfarmentans IFO1473株などを栄養培地中で培養
する。使用する栄養培地としては、使用菌株が資化しう
る炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量
含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも
使用できる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、コハク
酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン
類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化
アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有
化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用され
る。

【００２８】培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃、培養ｐＨは約５〜約９の範囲で、
好ましくは約６〜約８に制御するのが良い。使用する菌
株が生育し得る限り、これら以外の条件下でも実施でき
る。培養期間は通常、約１〜約７日であり、グルタチオ
ン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は通常、菌体内に
生産蓄積される。

【００２９】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素の精製は、一般に使用される精製法を用
いて行うことができる。例えば、菌体を回収後、超音波
破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプ
レス、界面活性化剤による溶解などにより、菌体内画分
を抽出することができる。得られた抽出液を、硫安やぼ
う硝などによる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどによる金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどを用いた凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチ
ルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメ
チル）−セファロースなどによるイオン交換クロマト法
などに付すことにより、グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素を精製することができる。

【００３０】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素によるサイクリング反応を用いたホルム
アルデヒドの測定方法について、酸化型補酵素としてチ
オＮＡＤ（Ｐ）類化合物を用いる場合を例にとって詳述
する。還元型グルタチオン、グルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合
物および還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を試料に接触させ
ると、試料中に含まれるホルムアルデヒド、還元型グル
タチオンおよび酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物からＳ
−ホルミルグルタチオンと還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化
合物が生成する。次いで、グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素は、過剰に存在する還元型ＮＡＤ
（Ｐ）類化合物を補酵素として利用し、生成されたＳ−
ホルミルグルタチオンを再びホルムアルデヒドとグルタ
チオンに戻す。以下、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物
を補酵素とする正反応と、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を補酵
素とする逆反応とが繰り返され、結果として１分子のホ
ルムアルデヒドに対して多数分子の還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類化合物が生成される。一方で、還元型ＮＡＤ
（Ｐ）類化合物は反応サイクルの進行に伴って消費され
る。したがって、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の
増加または還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の減少を、上
記のように吸光度を指標にしてモニタリングすることに
より、低濃度のホルムアルデヒドも感度よく検出するこ
とができる。

【００３１】また、上記測定系において、ＮＡＤ（Ｐ）
類を補酵素として利用し得るがチオＮＡＤ（Ｐ）類を補
酵素として実質的に利用できない他の酵素と当該酵素の
基質をさらに添加することにより、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）
類化合物を還元型に再生することができる。この場合、
ホルムアルデヒドの測定は、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類
化合物の増加を指標にして行われる。このような測定系
に使用される他の酵素およびその基質の組み合わせとし
ては、ＮＡＤ類を利用し得るものとして、例えば、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（例えば、ブタ
やウシの心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.8）（例えば、ウ
サギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン酸、グリ
セロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1
2）（例えば、ウサギ骨格筋もしくは肝、酵母または大
腸菌由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸およびリン
酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.49）（例えば、Leuconostoc細菌由来）とグルコー
ス−６−リン酸、グルコースデヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.47）（例えば、Bacillus細菌、Pseudomonas細菌由
来）とβ−Ｄ−グルコース、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.4.1.3）（例えば、ウシ肝由来）とＬ−グル
タミン酸等が、ＮＡＤＰ類を利用し得るものとして、例
えば、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.1
7）（例えば、Pseudomonas oxalaticus由来）とCoAおよ
びグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.1.1.44）（例えば、ラット肝、ビール酵母また
は大腸菌由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセ
ロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.13）
（例えば、植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド
−３−リン酸およびリン酸、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（例えば、酵母またはL
euconostoc細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グル
コースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、Bac
illus細菌、Pseudomonas細菌由来）とβ−Ｄ−グルコー
ス、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）（例
えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等が挙げられ
る。

【００３２】本発明のグルタチオンホルムアルデヒド脱
水素酵素を用いたサイクリング法によれば、試料中の濃
度が１μｍｏｌ／Ｌ以下の微量のホルムアルデヒドの検
出が可能となる。

【００３３】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素を用いたホルムアルデヒドの測定は、サ
イクリング反応を介さずに、以下のようにして行うこと
もできる。

【００３４】即ち、グルタチオン、グルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素およびチオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる１つの酸化型補酵素を試料に接触させ、生成さ
れるＳ−ホルミルグルタチオンを、紫外部における吸光
度を指標として測定することにより、ホルムアルデヒド
を測定することができる。あるいは、さらにＳ−ホルミ
ルグルタチオンハイドロラーゼ（EC 3.1.1.12）を作用
させて生成するギ酸を、更にギ酸脱水素酵素（EC1.2.1.
2；EC 1.2.1.43）を用いて二酸化炭素に分解し、生成す
る還元型補酵素を測定することによっても、ホルムアル
デヒドの測定が可能である。

【００３５】Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ
は、動物臓器やメタノール資化性酵母、細菌などに存在
することが知られており、これら給源より採取して使用
することができる。また、ギ酸脱水素酵素は、植物種
子、メタノール資化性酵母、細菌などに存在する酵素で
これら給源より採取して使用することができる。市販の
酵素（例えば、シグマ製FORMATE DEHYDROGENASE等）を
使用してもよい。

【００３６】上記の一連の酵素反応により生成される還
元型補酵素（ＮＡＤＨ類またはＮＡＤＰＨ類）は、紫外
部での吸光度、或いは蛍光を測定することにより分析す
ることができる。また、ジアホラーゼやメチルフェナジ
ウムメチルスルフェートのような電子伝達体の存在下で
テトラゾリウム塩を還元する際に生成するホルマザン色
素を測定することによっても、還元型補酵素を測定する
こともできる。

【００３７】本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、
多段階測定の反応中間体としてホルムアルデヒドを生成
する種々の生体成分の測定の最終工程としても、好まし
く使用され得る。

【００３８】例えば、クレアチニンまたはクレアチンの
測定は、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシ
ンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンアミド
ハイドロラーゼを試料に作用させて、クレアチニンまた
はクレアチンをグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸
化水素に分解させ、生成する過酸化水素を発色基質等を
用いて測定することにより行われている。そこで、過酸
化水素の定量用試薬の代わりに、本発明のグルタチオン
依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いてホルムアル
デヒドを測定することにより、クレアチニンまたはクレ
アチンを測定することができる。従って、本発明は、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダ
ーゼおよび必要に応じてクレアチニンアミドハイドロラ
ーゼを試料に接触させてホルムアルデヒドを生成させ、
さらに、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素、グルタチオン、およびチオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる１つの酸化型補酵素、および必要に応じてさら
に該酸化型補酵素とは異なる種類の還元型補酵素を接触
させて、生成もしくは消費される化合物を測定すること
を含む、クレアチニンまたはクレアチンの測定方法を提
供する。

【００３９】使用するクレアチンアミジノハイドロラー
ゼ、サルコシンオキシダーゼおよびクレアチニンアミド
ハイドロラーゼは特に限定されるものではなく、これら
の酵素を生産する微生物などから公知の手法を用いて採
取できる他、各種市販の酵素を用いることもできる。例
えば、クレアチンアミジノハイドロラーゼとしては、バ
チルス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、
アクチノバチルス属、アルカリゲネス属に属する細菌等
由来のものが、クレアチニンアミドハイドロラーゼとし
ては、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、ミク
ロコッカス属、ペニシリウム属に属する細菌等由来のも
のが、サルコシンオキシダーゼとしては、各種動物や、
アルスロバクター属、ペニシリウム属、バチルス属に属
する細菌等由来のものが挙げられる。

【００４０】また、ホモシステインの測定は、ベタイ
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素及びジメ
チルグリシンオキシダーゼを試料に作用させて、ホモシ
ステインをサルコシン、過酸化水素およびホルムアルデ
ヒドに分解し、生成する過酸化水素を発色基質などを用
いて測定することにより行うことができる。そこで、上
記と同様に、過酸化水素定量用試薬のかわりに、本発明
のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用
いてホルムアルデヒドを測定することにより、ホモシス
テインを測定することができる。

【００４１】本発明において使用されるベタイン−ホモ
システインメチル転移酵素（EC 2.1.1.5）は、ベタイン
をもう一方の基質として、ホモシステインに作用し、ジ
メチルグリシンとメチオニンを生成する酵素である。例
えば、哺乳動物やシュードモナス（Pseudomonas）属、
アスペルギルス（Aspergillus）属などの微生物から採
取することが可能である。本酵素のもう一方の基質であ
るベタインは、塩酸塩の形で安価に市販されている。

【００４２】ジメチルグリシンオキシダーゼは、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素により生成したジメ
チルグリシンに作用して、サルコシン、ホルムアルデヒ
ドおよび過酸化水素に分解する酵素であり、例えばシリ
ンドロカーポン（Cylindrocarpon）属、アクロモバクタ
ー（Achromobacter）属、アースロバクター（Arthrobac
ter）属などの微生物から採取することができる。

【００４３】また、ジメチルグリシンオキシダーゼによ
り生成されるサルコシンにサルコシンオキシダーゼを作
用させれば、２倍量のホルムアルデヒドが生成するので
検出感度を増加させることができる。サルコシンオキシ
ダーゼとしてはクレアチニンまたはクレアチンの測定方
法について上記した通りのものを使用することができ
る。

【００４４】反応中間体としてホルムアルデヒドを生成
する他の測定対象として、例えば、メタノール、尿酸な
どが例示される（Clin. Chem., 33/12, 2204-2208 (198
7),Clin. Biochem., 27/2, 93-97 (1994)）。即ち、メ
タノールは、アルコールオキシダーゼ（EC 1.1.3.13）
によりホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。ま
た、尿酸は、ウリカーゼ（EC 1.7.3.3）の反応により生
成される過酸化水素を、メタノールの存在下でカタラー
ゼ（EC 1.11.1.6）と作用させることでホルムアルデヒ
ドを生成するので、これを上記測定方法により分析する
ことができる。

【００４５】本発明はまた、上記のホルムアルデヒドの
測定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発
明におけるホルムアルデヒド測定用試薬キットは、緩衝
液、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素および該酵素反応により生成する化合物を
分析するための試薬を少なくとも含有してなる。当該試
薬キットは、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類およ
びチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型
補酵素をさらに含有する事が好ましい。

【００４６】グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素の反応により生成する化合物を分析するための試
薬としては、Ｓ−ホルミルグルタチオンを分析するため
の試薬として、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラー
ゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元型補酵素を分析
するための試薬が挙げられる。Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンハイドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元
型補酵素を分析するための試薬は、それぞれ上述のもの
が好ましく使用され得る。なお、Ｓ−ホルミルグルタチ
オンは、反応液の紫外部での吸光度を分析することによ
り直接測定することができるので、この場合は上記の試
薬に代えて、吸光度測定に必要な試薬もしくは器具を含
むこともできる。

【００４７】本発明の試薬キットにおいて使用される緩
衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によりｐＨの変動
を受けやすいが、安価という利点がある。一方、ＧＯＯ
Ｄ緩衝液は具体的にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤ
Ａ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯ
ＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示さ
れ、臨床診断薬用として多用されている。これら緩衝液
の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵
素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択される
が、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時の
ｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されること
が好ましい。

【００４８】また、本発明の試薬キットを構成する試薬
には、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸などを安
定化剤として使用することができる。金属塩としてはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、
銅、亜鉛、マンガンなどの塩が挙げられる。蛋白質とし
ては酵素反応に影響を与えないものが望ましいが、例え
ば牛血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチンなどが挙
げられる。アミノ酸としては、グリシン、リジン、グル
タミン酸、グリシルグリシン、ポリリジンなどを挙げる
ことができる。糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多
糖およびこれらの誘導体を用いることができる。具体的
には、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マン
ノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マ
ルトース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトシルシクロデキストリン、α−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、デキストリン、アミロース、グリコーゲ
ン、デンプン、イヌリン、グルコサミン、イノシトー
ル、マンニトール、ソルビトール、リビトール、デオキ
シグルコースなどが挙げられる。有機酸としては、α−
ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、コ
ール酸、デオキシコール酸などが例示される。その他、
ホウ酸、ホウ砂、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
アンモニウム、グリセロール、フィコールなども使用可
能である。

【００４９】更に、本発明の試薬キットを構成する試薬
には、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界
面活性剤を添加してもよい。防腐剤としてはアジ化ナト
リウム、キレート剤、各種抗生物質、防菌剤、防黴剤な
どが挙げられる。具体的にはアジ化ナトリウムの他、Ｅ
ＤＴＡ及びその塩（金属キレートを含む）、ＣｙＤＴ
Ａ、ＧＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＡ、
ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＥＤＴＰＯ、
ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、Me
thyl-ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ
（これらは同仁より市販）等のキレート剤、ＢＮＤ、Ｃ
ＡＡ、ＨＰＯ、ＩＺＵ、ＭＩＴ（ロッシュより市販）、
ProClin150、ProClin300（ローム＆ハースより市販）、
ベンザルコニウムクロリド、KathonCG、ｐ−ヒドロキシ
メチルベンゾエート等の防菌（黴）剤、アンフォテリシ
ンＢ、アンピシリン、ブラスティシジンＳ、クロラムフ
ェニコール、ジヒドロストレプトマイシン、クリンダマ
イシン、シクロヘキシミド、フィリピン、Ｇ４１８、ゲ
ンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リン
コマイシン、ネオマイシン、ロモフンジン、ポリオキシ
ン、ペニシリン、スルファメチゾール、テトラサイクリ
ン等の抗生物質が使用可能である。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰
イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。具
体的には、アデカトール７２０Ｎ、Ｂ−７９５、Ｂ−７
９７、ＬＯ−７、ＮＰ−６９０、ＮＰ−６９５、ＮＰ−
７２０、ＰＣ−８、ＳＯ−１２０、ＳＯ−１４５、ブリ
ジェ３５、９８、７００、エマルゲン１０９Ｐ、４３
０、４６０、７０７、７０９、８１０、９１１、９３
５、９５０、Ａ−６０，Ｂ６６、、ｎ−ドデシルマルト
シド、ゲナポールＸ−０８０，ＭＥＧＡ−７、８、９、
１０、ニッコールＢＬ−９ＥＸ、ＢＬ−２０ＴＸ、ＨＣ
Ｄ−１００、ＭＧＯ、ＭＹＯ−６、ＭＹＬ−１０、ＮＰ
−１８ＴＸ、ＯＰ−１０、ＴＬ−１０、ＴＭＧＯ５、Ｓ
Ｌ−１０、オクチル α―グルコシド、オクチルβ―グ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、オクチルチオガラ
クトシド、ペンタエチレングリコールドデシルエーテ
ル、ポリエチレンエーテルＷ−１、プルロニックＦ−６
８、Ｌ−７１、Ｐ−１０３、ノニデットＰ４０、レオド
ール４６０、ＴＷＬ−１０３、ＴＷＬ−１０６、サポニ
ン、サルコシネートＰＮ、スパン２０、８５、ＳＭ１０
８０、スクロースモノラウレート、テトロニック７０
４、テシット、トリトンＸ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−
３０５、ツイーン２０、４０、８０等の非イオン性界面
活性剤、ビス（ヒドロキシエチル）−（ステアロイルア
ミノメチルカルボニルオキシ）エチルアミンクロリド、
メチル硫酸ベンジルラウリルメチルスルフォニウム、２
−[（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ]エチルモ
ルフォリンクロリド、ラウリルピリジニウムクロリド、
ラウリル（トリ−ｐ−トリル）ホスホニウムクロリド、
ラウリルフェニルシクロテトラメチレンホフホニウムブ
ロミド、セチルピリジウムクロリド、セチルトリメチル
アンモニウムクロリド、（ポリオキシエチレン）ラウリ
ルアミン、などの陽イオン性界面活性剤、コール酸ナト
リウム、デオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン、タウロコール酸などの陰イオン性界面活性剤、ＣＨ
ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｎ，Ｎ−ビス（オクチルアミノ
エチル）グリシン、Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−（ステ
アリルオキシメチル）ピリジウムベタイン、Ｎ−パルミ
チルスルホタウリン、ラウリルジメチルアミンオキシ
ド、Ｎ−（ラウリルチオエトキシ）メチル−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルベタインなどの両性界面活性剤が使用できる。

【００５０】本発明の別のホルムアルデヒド測定用試薬
キットは、グルタチオンおよび本発明のグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素に加えて、チオＮＡＤ
類とチオＮＡＤＰ類から成る群より選ばれる1つの化合
物、並びに還元型ＮＡＤ類と還元型ＮＡＤＰ類からなる
群より選ばれる1つの化合物をさらに含有してなるか、
あるいは、還元型チオＮＡＤ類と還元型チオＮＡＤＰ類
から成る群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類
とＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物をさ
らに含有してなる。

【００５１】これらの試薬キットによれは、上記のサイ
クリング反応によるホルムアルデヒドの高感度測定を簡
便に実施することが可能である。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ
類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類には、それぞれ上述
のようなものを用いることができる。また、当該試薬キ
ットには、サイクリング反応により生成する酸化型補酵
素を還元型に再生する、上述のような酵素およびその基
質をさらに含有させることもできる。

【００５２】本発明のホルムアルデヒド測定用試薬キッ
トは、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存するこ
ともできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に
保存することもできる。したがって、本発明の試薬キッ
トは、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬
組成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与
える成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性
の確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分
割して保存することが好ましい。

【００５３】本発明は、上記のホルムアルデヒド測定用
の試薬税分に加えて、更にクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてク
レアチニンアミドハイドロラーゼを含有してなる、クレ
アチニンまたはクレアチン測定用試薬キットを提供す
る。これら酵素は上述したようなものを適宜利用可能で
ある。

【００５４】また、別の本発明は、上記試薬以外に、更
にベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵
素、ジメチルグリシンオキシダーゼを少なくとも含有し
てなる、ホモシステイン測定用試薬キットを提供する。
これらの酵素および基質としてはそれぞれ上述したよう
なものを好ましく使用することができる。

【００５５】しかしながら、測定される試料が生体試
料、特に血漿や尿の場合、含有されるホモシステイン
は、大部分がアルブミンのような循環蛋白質との結合し
た状態、あるいはシステインや他のホモシステイン分子
とのジスルフィド結合体の状態で存在する。従って、総
ホモシステインを測定する際には、予め試料を還元剤や
酵素反応により処理し、遊離ホモシステインを生成させ
ることが必要となる。

【００５６】この場合に用いられる還元剤としては、例
えばチオール類、水素化ホウ素類、アマルガム、ホスフ
ィンやホスホチオエートなどを例示することができる。
具体的には、チオール類としてはジチオスレイトール、
ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２
−メルカプトメチルアミン、システイン、シスタミン、
システインチオグリコレート、チオグリコール酸、還元
型グルタチオンなど、水素化ホウ素類としては水素化ホ
ウ素ナトリウムなど、アマルガムとしてはナトリウムア
マルガムなどが挙げられる。

【００５７】しかしながら、本発明において使用される
酵素が該チオール化合物により活性阻害を受けた場合、
試薬性能の低下を引き起こす可能性が考えられるが、チ
オール化合物に影響を受けないジメチルグリシンオキシ
ダーゼはこれまでに報告されておらず、本発明によって
初めて単離されたものである。

【００５８】したがって、本発明は、チオール化合物に
対して安定な新規ジメチルグリシンオキシダーゼを提供
する。このようなチオール化合物としては、ジチオスレ
イトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタ
ノール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカ
プトエチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−
アセチルシステイン、チオグリセロール、チオグリコー
ル酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択さ
れる少なくとも一種が挙げられる。

【００５９】ここで、「チオール化合物に対して安定」
とは、試料中の総ホモシステインをすべて遊離型に還元
するのに必要な量のチオール化合物の存在下において、
ホモシステインの正確な測定に影響を与えない程度に酵
素活性が保持されうることをいう。好ましくは、本発明
のジメチルグリシンオキシダーゼは、ジチオスレイトー
ル非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイ
トール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持され
るものである。

【００６０】より好ましくは、本発明のジメチルグリシ
ンオキシダーゼは、さらに下記の理化学的性質を有する
酵素である。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫｍ値：１５ｍＭ以下

【００６１】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ
は、上記の性質を有する限りその由来は特に制限されな
いが、好ましくはアルスロバクター属またはストレプト
マイセス属等の微生物由来であり、特に好ましくは、ア
ルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotia
nae）IFO14234株、またはストレプトマイセス・ミュー
タビリス（Streptomyces mutabilis）IFO12800株由来の
ものが挙げられる。IFO14234株およびIFO12800株は、い
ずれも（財）発酵研究所（〒532-8686，日本国大阪市淀
川区十三本町2-17-85）より入手可能である。

【００６２】また、本発明のジメチルグリシンオキシダ
ーゼは、ランダムにもしくは部位特異的に変異を誘発す
ることにより、上記のチオール化合物に対する耐性を保
持する範囲で、比活性や安定性を向上させるなどの酵素
特性の改良をもたらすように遺伝的に改変されたもので
あってもよい。

【００６３】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ
は、該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料と
して単離精製する方法、あるいは当該酵素蛋白質をコー
ドする遺伝子を常法によって単離し、遺伝子組換え技術
を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得す
ることができる。前者の好ましい一実施態様として、以
下の方法が例示される。

【００６４】まず、上記のいずれかのジメチルグリシン
オキシダーゼ生産菌、例えば、アルスロバクター・ニコ
チアナエ（Arthrobacter nicotianae）IFO14234株また
はストレプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyces
mutabilis）IFO12800株などを栄養培地中で培養する。
使用する栄養培地としては、使用菌株が資化しうる炭素
源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有す
るものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用で
きる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、コハク酸等が
使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エ
キス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が
使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸
ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。

【００６５】培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃、培養ｐＨは約５〜約９の範囲で、
好ましくは約６〜約８に制御するのが良い。使用する菌
株が生育し得る限り、これら以外の条件下でも実施でき
る。培養期間は通常、約１〜約７日であり、ジメチルグ
リシンオキシダーゼは通常、菌体内に生産蓄積される。

【００６６】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの
精製は、一般に使用される精製法を用いて行うことがで
きる。例えば、菌体を回収後、超音波破砕、ガラスビー
ズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化
剤による溶解などにより、菌体内画分を抽出することが
できる。得られた抽出液を、硫安やぼう硝などによる塩
析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどによる金
属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどを用い
た凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）
−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロ
ースなどによるイオン交換クロマト法などに付すことに
より、ジメチルグリシンオキシダーゼを精製することが
できる。

【００６７】本発明はまた、上記の本発明のジメチルグ
リシンオキシダーゼを用いたホモシステインの測定方法
を提供する。当該方法は、ベタイン、ベタイン−ホモシ
ステインメチル転移酵素、および本発明のジメチルグリ
シンオキシダーゼを試料に作用させて、試料中に含まれ
るホモシステインをサルコシン、過酸化水素およびホル
ムアルデヒドに分解し、これらの生成物のいずれかを分
析することを特徴とする。

【００６８】ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素
は、それぞれ上述のものが好ましく使用されうる。

【００６９】ジメチルグリシンオキシダーゼは、下記式
のとおり、酸素の存在下にジメチルグリシンをサルコシ
ン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する酵素
である。ジメチルグリシン＋Ｈ₂Ｏ＋Ｏ₂→サルコシン＋
ホルムアルデヒド＋Ｈ₂Ｏ₂

【００７０】したがって、反応中の酸素消費量を測定す
るか、あるいは過酸化水素センサーを用いて、または直
接もしくはペルオキシダーゼ存在下に酸化還元指示薬を
用いて、過酸化水素の生成量を分析することにより、ジ
メチルグリシンを測定することができる。あるいは、生
成したホルムアルデヒドを、Ｈａｎｚ試薬、ホルムアル
デヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ等を
用いて、紫外部もしくは可視部の吸光度、あるいは蛍光
を計測することにより間接的に測定することが出来る。
例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素によりＮＡＤより
生成する還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、ジアホラーゼや
メチルフェナジウムメチルスルフェートのような電子伝
達体の存在下で、テトラゾリウム塩を還元してホルマザ
ン色素を生じるので、これを測定することによりホモシ
ステインを測定することが出来る。

【００７１】さらに、サルコシンオキシダーゼを追加し
て加えると、サルコシンはグリシン、ホルムアルデヒド
および過酸化水素に分解されるので、ホルムアルデヒド
または過酸化水素を感度的に倍加して測定することが出
来る。また、さらに、ホルムアルデヒドオキシダーゼを
作用させてホルムアルデヒドを過酸化水素に分解するこ
とにより、感度をさらに向上させることが出来る。

【００７２】サルコシンオキシダーゼとしては、上述の
ように、各種動物や、アースロバクター（Arthrobacte
r）属、ペニシリウム（Penicillium）属、バチルス（Ba
cillus）属等の微生物などから採取することが可能であ
る。また、市販の酵素を使用することもできる。

【００７３】また、上記酵素は、それぞれの酵素蛋白質
をコードする遺伝子を取り出し、遺伝子工学的技術によ
り発現させた酵素であってもよい。更に、例えば酵素蛋
白質の比活性や安定性を向上させるなど、酵素特性の改
良をもたらすように遺伝子を改変したものも含まれる。

【００７４】ジメチルグリシンオキシダーゼにより（場
合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼおよびホ
ルムアルデヒドオキシダーゼにより）生成する過酸化水
素は、紫外部の吸光度を直接測定するか、カタラーゼと
酸化チタン試薬（Agric.Biol.Chem.,38 ,p1213 (197
4)）による比色定量分析を行うか、あるいは過マンガン
酸カリウムを用いた滴定定量などにより分析することが
可能であるが、高感度測定の為には、ペルオキシダーゼ
存在下、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−アミノ
アンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンな
どのカップラーと反応させ、生成する色素を測定するこ
とにより定量することが好ましい。使用する発色試薬は
特に制限されるものではなく、各種の市販されているも
のなどを使用することができるが、具体例としてＮ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−
スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３,
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルシアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニリ
ン、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノール、
２,４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香
酸、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ−
（３−スルホプロピル）３,３’,５,５’−テトラメチ
ルベンジジン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”−ヘキサ
（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノ
トリフェニルメタンなどが挙げられる。また、過酸化水
素は直接、またはカタラーゼ共存下で酸素の消費をセン
サーを用いてモニタリングすることでも測定することが
できる。

【００７５】ジメチルグリシンオキシダーゼにより生成
するサルコシンは、サルコシンオキシダーゼを作用させ
ることにより生成するホルムアルデヒドまたは過酸化水
素を上述方法により分析できる他、電子伝達体、発色色
素の存在下でサルコシン脱水素酵素を作用させ、生成す
る色素を測定することでも分析することが可能である。
電子伝達体としては、ジアホラーゼやメチルフェナジウ
ムメチルスルフェート、メチレンブルー、フェリシアン
化カリウムなどが例示される。また、色素としてはテト
ラゾリウム塩、インドフェノールなどが挙げられる。ま
た、サルコシン脱水素酵素は哺乳動物やシュードモナス
（Pseudomonas）属微生物などから直接、もしくは該酵
素の遺伝子を遺伝子工学的手法で作製した組換え体より
採取可能である。

【００７６】ジメチルグリシンオキシダーゼにより生成
するホルムアルデヒドは、好ましくは、グルタチオン、
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および
酸化型補酵素、および必要に応じて当該酸化型酵素とは
異なる種類の還元型補酵素を試料に作用させて、生成も
しくは消費され化合物を測定することにより、測定する
ことができる。

【００７７】グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素としては、本発明において新たに取得された上述
の酵素を用いることが最も好ましいが、哺乳動物、高等
植物、メタノール資化性酵母、細菌などに由来する従来
公知の酵素も同様に使用することができる。例えば、市
販品である、キャンジダ（Candida）属酵母由来の酵素
などを使用することができる。具体的には、シグマ製FO
RMALDEHYDE DEHYDROGENASE (Glutathione dependent)等
が挙げられる。

【００７８】該酵素は酵素蛋白質をコードする遺伝子を
生産菌から単離し、遺伝子工学的技術により発現させた
ものであっても良く、更には、例えば酵素比活性や安定
性を向上させるなど、酵素特性を改変した変異体や化学
修飾酵素も含まれる。

【００７９】補酵素としては、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（ＮＡＤ類）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸類（ＮＡＤＰ類）、チオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（チオＮＡＤ類）ま
たはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類（チオＮＡＤＰ類）が挙げられ、ＮＡＤ類またはＮＡ
ＤＰ類は、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素が補酵素として利用できるものを適宜使用すれば良
いが、公知のものではＮＡＤ類として、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチ
ンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドなどが、ＮＡＤＰ類としてはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニン
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが例示され
る。また、チオＮＡＤ類またはチオＮＡＤＰ類において
も、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が
補酵素として利用可能なものを適宜使用可能であるが、
公知のものとして、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドリン酸などが具体例として挙げられる。

【００８０】従来公知のグルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素を用いた場合のホルムアルデヒドの測
定方法としては、本発明の新規グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素について上述したもののうち、
サイクリング反応を介した測定法を除くいかなる手段も
同様に用いることができる。

【００８１】ベタイン−ホモシステインメチル転移酵
素、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼおよびグル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた本
発明の測定方法によれば、試料中の濃度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下の微量のホモシステインの検出が可能となる。

【００８２】本発明はまた、上記のホモシステインの測
定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発明
のホモシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイ
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチ
ルグリシンオキシダーゼ、および該酵素による反応によ
り生成するホルムアルデヒド、サルコシンまたは過酸化
水素の少なくとも１種を分析するための試薬を含有して
なる。さらにサルコシンオキシダーゼを含んでいてもよ
い。ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチ
ルグリシンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼに関
しては、上述したようなものが好ましいが、特に限定は
されない。ここで、該酵素による反応により生成するホ
ルムアルデヒド、サルコシン、または過酸化水素を分析
するための試薬とは、具体的には上述したような原理に
基づくものが挙げられる。すなわち、ホルムアルデヒド
を分析するための試薬としては、ホルムアルデヒド脱水
素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、Ｈａｎｚ試
薬、ＣＴＡ試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (195
8)）、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1),
50(1996)）やフェニルヒドラジン、フェリアン化カリウ
ム、クロロホルム、メタノールを組み合わせた試薬など
がある。過酸化水素を分析するための試薬としては、ペ
ルオキシダーゼ、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４
−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンなどのカップラー、カタラーゼ、酸化チタン試
薬、過マンガン酸カリウムなどがある。また、サルコシ
ンを分析するための試薬としては、サルコシンオキシダ
ーゼ及び該酵素反応により生成するホルムアルデヒド、
過酸化水素を分析する上記試薬、サルコシン脱水素酵
素、電子伝達体、発色色素などがある。

【００８３】特に好ましい態様においては、本発明のホ
モシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイン、
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグ
リシンオキシダーゼ、グルタチオン、グルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素および該グルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が利用し得る酸化型補
酵素を含有してなる。必要に応じてサルコシンオキシダ
ーゼをさらに含むことができる。ベタイン−ホモシステ
インメチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼ、
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および
酸化型補酵素としては、上述のものが好ましく使用でき
る。また、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素として、本発明において新たに得られた酵素を使用
してサイクリング反応を介してホルムアルデヒドを測定
する場合は、該試薬キットは、上記酸化型補酵素とは異
なる種類の還元型補酵素をさらに含むことが好ましい。

【００８４】緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液など、上記の
ホルムアルデヒド測定用試薬キット中に含まれる緩衝液
として例示されたものが同様に使用可能である。緩衝液
の種類、濃度もしくはｐＨは、各試薬成分のほぞんおよ
び酵素反応など目的に応じて１種もしくは複数が選択さ
れるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応
時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用される
ことが好ましい。

【００８５】また、本発明のホモシステイン測定用試薬
キットを構成する試薬には、上記のホルムアルデヒド測
定用試薬キットを構成する試薬の安定化剤として例示さ
れた、各種の金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸な
どを同様に含有させることができる。更に、試薬性能に
悪影響を及ぼさない範囲で上述のような防腐剤や界面活
性剤を添加してもよい。

【００８６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００８７】実施例１ グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素の取得 本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素の活性測定は以下の試薬及び測定条件にて行った。 〈試薬〉 試薬Ａ １００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５） 試薬Ｂ １０ｍＭ 酸化型ＮＡＤ水溶液 試薬Ｃ ２０ｍＭ ホルムアルデヒド水溶液 試薬Ｄ ２０ｍＭ グルタチオン水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
２．１ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。メタノール資化性酵母ハンゼ
ヌラ・ノンファーメンタンス（Hansenula nonfermentan
s）ＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌ ＹＰＤ培地（１％
Ｄ−グルコース、１％ポリペプトン、１％酵母エキス；
ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、２４時間振と
う培養後、６Ｌのグルタチオン依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素生産培地（２％ メタノール、０．５％ Ｄ
−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６％酵母エキ
ス、０．２％リン酸水素二カリウム、０．７％リン酸二
水素一カリウム）に移し、３０℃、４８時間通気攪拌培
養した。 培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次い
で菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行い上清液
を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除
核酸処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５に
よる脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィ
ー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ハイド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびスーパーデ
ックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精
製し、精製酵素標品約９０ｍｇを得た。該方法により得
た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバン
ドを示し、この時の比活性は約２５０Ｕ／ｍｇ蛋白質で
あった。また、上記方法で得たグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性を、試薬Ｂの酸化型
ＮＡＤの代りに酸化型チオＮＡＤを用いた以外は上記活
性測定条件と同じ条件で測定した結果、この酵素の酸化
型チオＮＡＤに対する反応性は、酸化型ＮＡＤに対する
それの６１％であった。一方、比較例として、市販のグ
ルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（Candid
a boidinii由来；ＳＩＧＭＡ社製）の酵素活性を、同様
に測定した結果、当該酵素の酸化型チオＮＡＤに対する
反応性は、酸化型ＮＡＤに対するそれの２２％であっ
た。

【００８８】実施例２ ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素の取得 本発明のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素の活
性測定は以下の試薬及び測定条件で行った。 〈試薬〉 試薬Ａ ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５） 試薬Ｂ １００ｍＭ ＤＬ−ホモシステイン溶液（試薬
Ａで溶解） 試薬Ｃ １００ｍＭベタイン（試薬Ａで溶解） 試薬Ｄ ０．２％ペンタシアノアンミン鉄（III）ナト
リウム水溶液 試薬Ｅ 酢酸 試薬Ｆ １０％亜硝酸ナトリウム水溶液 〈測定条件〉酵素溶液２．３ｍｌに試薬Ｂ、試薬Ｃを各
０．０７５ｍｌ、０．１２５ｍｌを加えて混和後、３７
℃で１時間反応させる。反応終了後、直ちに試薬Ｄを５
ｍｌ加えて攪拌し、一分間放置後、更に試薬Ｅ、試薬Ｆ
の順に各１ｍｌずつ加えて攪拌する。室温で３０分間放
置後５２０ｍにおける吸光度を測定する。試薬Ａに溶解
したＬ−メチオニンを酵素溶液の代わりに用いて同様の
手順にて測定した吸光度より標準曲線を作成し、これか
ら酵素反応により生成したメチオニンの量を測定する。
上記条件にて１時間に１マイクロモルのメチオニンを生
成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。遺伝子の塩基配列
が公知であるヒト由来のベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素（J. Biol. Chem., 271(37), 22831 (199
8)）をコードする遺伝子の全長を増幅可能な２種のプラ
イマー（配列表の配列番号１および２に記載）を作成
し、これを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック製）
を鋳型として、ポリメラーゼチェーンリアクション（Ｐ
ＣＲ）法によりヒト由来のベタイン−ホモシステインメ
チル転移酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣ
Ｒは以下に示す反応液組成及び反応条件にて実施した。 〈反応液組成〉 ＫＯＤPlus ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製） １Ｕ
ｎｉｔ／５０μｌ １０倍濃度添付バッファー ５μｌ／５０μｌ 鋳型ｃＤＮＡ １．５μｇ／５０μｌ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ 各０．２ｍＭ プライマー 各２５pmols／５０μｌ 〈反応条件；下記（２）〜（４）を計３０サイクル実施
した〉 （１）９５℃、２分間（変性） （２）９５℃、３０秒間（変性） （３）６０℃、３０秒間（アニーリング） （４）６８℃、１分間（伸長反応） ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動
に供し、約１．２Ｋｂｐの単一の増幅バンドを確認し
た。この増幅断片をＤＮＡ断片精製キット（MagExtract
or PCR&Gel Clean Up；東洋紡績製）を用いて回収した
後、このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵
素にて処理した。次いで、ｐＥＴ１１ａプラスミド（ス
トラタジーン製）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素
で処理し、これを上記ＤＮＡ断片とＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（東洋紡績製）を用いて連結した。これを用いてEpic
urian Coli BL21（DE3）-CodonPlusTM-RIL コンピテン
トセル（ストラタジーン製）を形質転換し、アンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵
母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン；ｐＨ７．２）に塗布し、３７℃で１６時間培養
した。得られたコロニーは、アンピシリンを含むＬＢ培
地６０ｍｌで３０℃、１６時間振とう培養後、塩化亜鉛
およびアンピシリンを含む×２ＹＴ培地（１．６％ポリ
ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、３４μ
ｇ／ｍｌ塩化亜鉛、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン；ｐ
Ｈ７．２）６Ｌに接種し、３７℃で通気攪拌培養した。
約２．５時間後、培養液の６００ｎｍの吸光度が約１．
０に達した時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシドを１ｍＭになるように添加し、更に４時間
培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、菌体
を５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に
懸濁した。次いで菌体フレンチプレスで破砕し、遠心分
離を行い、上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレ
ンイミンによる除核酸処理後、セファデックスＧ−２５
による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフ
ィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、スー
パーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより
分離精製し、精製酵素標品約５０ｍｇを得た。該方法に
より得た標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単
一なバンドを示し、この時の比活性は約２．１Ｕ／ｍｇ
−蛋白質であった。

【００８９】実施例３ ジメチルグリシンオキシダーゼ
の取得 本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの活性測定は以
下の試薬及び測定条件により行った。 〈試薬〉試薬Ａ １００ｍＭジメチルグリシン溶液（１
００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解） 試薬Ｂ ０．１％４−アミノアンチピリン水溶液 試薬Ｃ ０．１％フェノール水溶液 試薬Ｄ ２５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡績製；
ＰＥＯ−３０１）水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
１．５ｍｌ、０．３ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。 （１）Arthrobacter nicotianae IFO14234株からの単離 アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicot
ianae）IFO14234株を６０ｍｌ ＬＢ培地（１％ポリペ
プトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ
７．２）に一白金耳植菌し、３０℃、１６時間振とう培
養後、６Ｌのジメチルグリシンオキシダーゼ生産培地
（２％ベタイン、１％ポリペプトン、１．６％酵母エキ
ス、１．４％リン酸水素二カリウム、０．５５％リン酸
二水素一カリウム）に移し、３０℃、４０時間通気攪拌
培養した。 培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次
いで菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行い上清
液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる
除核酸処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５
による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフ
ィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、スー
パーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより
分離精製し、精製酵素標品約１１０ｍｇを得た。該方法
により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単
一なバンドを示し、この時の比活性は約９．３Ｕ／ｍｇ
蛋白質であった。また、上記方法で得たジメチルグリシ
ンオキシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジ
チオスレイトール存在下で測定した以外は上記活性測定
条件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチオス
レイトール非存在下と比べて７１％であった。 （２）Streptomyces mutabilis IFO12800株からの単離 ストレプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyces m
utabilis）IFO12800株を、６０ｍｌジメチルグリシン生
産培地（２％ベタイン、１％ポリペプトン、１．６％酵
母エキス、１．４％リン酸ニ水素カリウム、０．５５％
リン酸水素ニカリウム）に一白金耳接種し、３０℃、７
２時間振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離
し、回収した菌体を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁した。次いで菌体をガラスビーズで破
砕し、遠心分離を行い、得られた抽出液をセファデック
スＧ−２５により脱塩処理した。また、上記抽出液につ
いて、ジメチルグリシンオキシダーゼの酵素活性を、
０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で測定
した以外は上記活性測定条件と同じ条件で測定した結
果、その活性値はジチオスレイトール非存在下と比べて
９８％であった。さらに、上記２種のジメチルグリシン
オキシダーゼのジメチルグリシンに対するＫｍ値を測定
した結果、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthroba
cter nicotianae）IFO14234株由来の酵素は１３．６ｍ
Ｍ、ストレプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyc
es mutabilis）IFO12800株由来の酵素は１４．３ｍＭで
あった。

【００９０】実施例４ ホルムアルデヒド標準液の測定
（１） 本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチオンハイドロ
ラーゼの活性測定はBiochimica. et Biophysica Acta,6
14(1980)p81-91記載の、またギ酸脱水素酵素の酵素活性
はEur.J.Biochem.(1976)Feb 2;62(1)p151-160記載の方
法にそれぞれ従って実施した。本実施例で使用するＳ−
ホルミルグルタチオンハイドロラーゼは以下にようにし
て取得した。メタノール資化性酵母キャンジダ・ボイデ
ィニイ（Candida boidinii）ＩＦＯ１４７３株を６０ｍ
ｌ ＹＰＤ培地（１％ Ｄ−グルコース、１％ポリペプ
トン、１％酵母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌
し、３０℃、２４時間振とう培養後、６ＬのＳ−ホルミ
ルグルタチオンハイドロラーゼ脱水素酵素生産培地（２
％ メタノール、０．５％ Ｄ−グルコース、１％ ポ
リペプトン、１．６％酵母エキス、０．２％リン酸水素
二カリウム、０．７％リン酸二水素一カリウム）に移
し、３０℃、４８時間通気攪拌培養した。 培養終了
後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで菌体をガラスビー
ズで破砕した後、遠心分離を行い上清液を得た。得られ
た酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および
硫安分画後、セファデックスＧ−２５による脱塩処理、
ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、フェニルセ
ファロースクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイ
トクロマトグラフィーおよびスーパーデックス２００ゲ
ル濾過クロマトグラフィーにより分離精製し、精製酵素
標品約１０ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示し、
この時の比活性は約９００Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。種
々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料に、
１０／ｍｌグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ酸化型ＮＡＤ、３ｍＭ
グルタチオン、５Ｕ／ｍｌＳ−ホルミルグルタチオンハ
イドロラーゼ（上記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌギ酸
脱水素酵素（シグマ製）をそれぞれ含む５０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌと混合し、３
７℃で１０分間反応させ、３４０ｎｍの吸光度を測定し
た。盲検はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を
試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。
反応終了時の吸光度と試料のホルムアルデヒド濃度の関
係は表１および図１に示す通りであり、ホルムアルデヒ
ド濃度が０〜５００μＭの範囲において直線性を示し、
定量が可能であった。

【００９１】

【表１】

【００９２】なお、この測定系はサイクリング法ではな
い。

【００９３】実施例５ ホルムアルデヒド標準液の測定
（２） 種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料
に、１００Ｕ／ｍｌグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ酸化型チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド、０．５ｍＭ還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、３ｍＭグル
タチオン、０．１％トリトンＸ−１００をそれぞれ含む
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌ
と混合し、３７℃で５分間サイクリング反応を実施し、
４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はホルムアルデヒ
ド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同
様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分後と５分後
の吸光度の増加と、試料中のホルムアルデヒド濃度の関
係は図２に示す通りであり、ホルムアルデヒド濃度が０
〜５０μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能で
あった。さらに、表２および図２からは、サイクリング
法において１μｍｏｌ／Ｌのホルムアルデヒドが測定で
きていることがわかる。

【００９４】

【表２】

【００９５】実施例６ クレアチニン標準液の測定 種々の濃度のクレアチニン水溶液５μＬを試料に、１０
０Ｕ／ｍｌクレアチニンアミドハイドロラーゼ（東洋紡
績製；ＣＮＨ−３１１）、５０Ｕ／ｍｌクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ（東洋紡績製；ＣＲＨ−２２１）、
１０Ｕ／ｍｌサルコシンオキシダーゼ（東洋紡績製；Ｓ
ＡＯ−３４１）、０．１％トリトンＸ−１００をそれぞ
れ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２０
０μｌと混合し、３７℃で５分間反応させた後、３００
Ｕ／ｍｌグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素（実施例１で調製）、３ｍＭ酸化型チオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド、１．５ｍＭ還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド、９ｍＭグルタチオン、
０．１％トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加え、３
７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの
吸光度を測定した。盲検はクレアチニン水溶液の代わり
に蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を
測定した。反応開始後１分後と５分後の吸光度の増加
と、試料中のクレアチニン濃度の関係は図３に示す通り
であり、クレアチニン濃度が０〜１００μＭの範囲にお
いて直線性を示し、定量が可能であった。さらに、表３
および図３からは、サイクリング法において１０μｍｏ
ｌ／Ｌのクレアチニンが測定できていることがわかる。

【００９６】

【表３】

【００９７】実施例７ ホモシステイン標準液の測定 ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチ
ルグリシンオキシダーゼは、それぞれ実施例２および実
施例３（１）で取得したものを使用した。また、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリ
シンオキシダーゼの活性測定は、それぞれ実施例２およ
び実施例３と同様にして行った。種々の濃度のＬ−ホモ
シスチン水溶液を０．５ｍＭジチオスレイトール中で、
３７℃、３０分間加温して生成したＬ−ホモシステイン
１０μＬを試料に、２０ｍＭベタイン、１Ｕ／ｍｌベタ
イン−ホモシステインメチル転移酵素（上記で調製した
もの）、７Ｕ／ｍｌジメチルグリシンオキシダーゼ（上
記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌサルコシンオキシダー
ゼ（東洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）をそれぞれ含む２０
ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２００μｌと混
合し、３７℃で５分間反応させた後、３００Ｕ／ｍｌグ
ルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例
１で調製）、３ｍＭ酸化型チオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド、１．５ｍＭ還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、９ｍＭグルタチオン、０．１％ト
リトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ８．２）１００μｌを加え、３７℃で５分
間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測
定した。盲検はＬ−ホモシステイン溶液の代わりに０．
５ｍＭジチオスレイトールを試薬混液に加えて、以下同
様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分後と５分後
の吸光度の増加と、試料中のホモシステイン濃度の関係
は図４に示す通りであり、ホモシステイン濃度が０〜１
００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能であ
った。さらに、表４および図４からは、サイクリング法
において１μｍｏｌ／Ｌのホモシステインが測定できて
いることがわかる。

【００９８】

【表４】

【００９９】

【発明の効果】本発明によれば、ホルムアルデヒドまた
は反応中間体としてホルムアルデヒドカが生成するクレ
アチニン、クレアチン、ホモシステインの高感度且つ簡
便な測定が可能である。

【０１００】

【配列表】 <110> TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120> METHOD OF FORMALDEHYDE ASSAY AND COMPOSITION OF REAGENT FOR FORMAL DEHYDE ASSAY <130> 01-1031 <141> 2001-12-05 <160> 2 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer <400> 1 gcaattccat atgccacccg ttgggggcaa aaaggccaag 40

【０１０１】 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer <400> 2 atcgcggatc caggctactg tgatttgaat ttttgttttt 40

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４における、吸光度とホルムアルデヒド
濃度との関係を示す図である。

【図２】実施例５における、吸光度とホルムアルデヒド
濃度との関係を示す図である。

【図３】実施例６における、吸光度とクレアチニン濃度
との関係を示す図である。

【図４】実施例７における、吸光度とホモシステイン濃
度との関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡 正則 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA05 HA11 4B063 QA01 QQ03 QQ64 QQ92 QR03 QR04 QX01

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料に、アルコールオキシダーゼを作用さ
   せ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドに、グ
   ルタチオン及びグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
   水素酵素を作用させ、該酵素反応より生成した化合物を
   分析することを特徴とするメタノールの測定方法。
2. 【請求項２】試料に、ウリカーゼを作用させ、該酵素反
   応により生成した過酸化水素を、さらにメタノールの存
   在下でカタラーゼと作用させることにより生成したホル
   ムアルデヒドに、グルタチオン及びグルタチオン依存性
   ホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させ、該酵素反応よ
   り生成した化合物を分析することを特徴とする尿酸の測
   定方法。
3. 【請求項３】緩衝液、グルタチオン、グルタチオン依存
   性ホルムアルデヒド脱水素酵素およびアルコールオキシ
   ダーゼを少なくとも含有してなることを特徴とするメタ
   ノール測定用試薬組成物。
4. 【請求項４】緩衝液、グルタチオン、グルタチオン依存
   性ホルムアルデヒド脱水素酵素およびウリカーゼ、カタ
   ラーゼを少なくとも含有してなることを特徴とする尿酸
   測定用試薬組成物。