JPH04640B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、トランスアミナーゼ活性をより高感
度で定量分析するのに適した改良型多層分析フイ
ルムに関する。 種々のトランスアミナーゼがアミノ基転移酵素
として知られている。そのなかでも、特に、グル
タミツクピルビツクトランスアミナーゼ（GPT）
とグルタミツクオキサロアセチツクトランスアミ
ナーゼ（GOT）は、その血中濃度の増減が肝疾
患の目安となるので、肝疾患の診断にあたつて
は、GPT及びGOTの活性の定量分析が重要な役
割を担つている。 GPTとGOTはそれぞれ次の反応を触媒する酵
素である。 α−ケトグルタル酸＋Ｌ−アラニンGPT ―――→ ←――― ピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸 〔１〕 α−ケトグルタル酸＋Ｌ−アスパラギン酸GOT ――→ ←―― オキザロ酸＋Ｌ−グルタミン酸 〔２〕 従来法では、上記〔１〕又は〔２〕式に従つて
生成したピルビン酸又はオキザロ酢酸をジアゾ染
料とカツプリングさせて、その呈色反応により、
トランスアミナーゼ活性が測定されていた（特開
昭51−40191号）。この方法においては、その一態
様として、上記の連続反応を相接する二つの試薬
層で各別に行なうように意図された多層フイルム
が提案されているが、これは、連続反応に適当な
時間的間隔を与えることにより、第二段階のカツ
プリング反応が開始する前に、第一段階の酵素反
応を平衡に到達させることを目的としたものであ
る。これは第一段の酵素反応にくらべて、続くカ
ツプリング反応の方が反応速度がより早いため
に、反応時間を犠牲にしても、反応効率を向上さ
せる必要があるという事情への対応策であつた。
従つて、この方法は、反応時間（検査時間）の可
及的短縮という時代の要請に逆行するものであ
り、また、分析感度も決して満足すべきものでは
ない。 次いで、上記〔１〕式のように直接、あるい
は、〔２〕式において生成したオキザロ酢酸から
更に他の酵素が関与し、あるいは関与しない化学
反応を介して間接に、ピルビン酸を生成させ、生
成したピルビン酸に、ピルビン酸オキシダーゼと
ペルオキシダーゼを含む過酸化水素検出呈色指示
薬組成物とを作用させて、比色法によつてピルビ
ン酸を測定することにより、種々のトランスアミ
ナーゼ活性を定量する方法が提案された（特開昭
55−13068号等）。 この方法の原理を代表的反応式をもつて示せ
ば、次のとおりである。 式中の符号は下記を表わす。 GOT：グルタミツクオキサロアセチツクトラ
ンスアミナーゼ GPT：グルタミツクピルビツクトランスアミ
ナーゼ Pi：無機燐酸 POP：ピルビン酸オキシダーゼ FAD：フラビンアデニンジヌクレオチド TPP：チアミンピロリン酸 M²⁺：二価の金属 POD：ペルオキシダーゼ すなわち、式〔１〕のGPT酵素反応で生成し
たピルビン酸、又は、式〔２〕のGOT酵素反応
で生成したオキザロ酢酸が、更に、式〔４〕に示
すようにオキザロ酢酸脱炭酸酵素の働きにより、
変換されて生じたピルビン酸は、それぞれに共役
したPOP酵素反応〔３〕に従い、過酸化水素に
変換される。 この過酸化水素を基質とするPOD酵素反応に
より、水素供与体とカプラーとのカプリング反応
〔５〕が生じ、こうして生成された染料を比色定
量するものである。 この方法によれば、上記一連の化学反応は水溶
液中で進行する。これら複雑な共役連続反応を効
率よく完結させるためには、厳密な重量または容
量の制御と煩雑な水溶液の取扱いを要し、しか
も、分析操作に長時間を要するので、迅速さと測
定結果の正確さが要求される臨床検査法としては
未だ不十分な方法である。 健康な人間のトランスアミナーゼの正常値域
は、全血中で高々20IU／程度であり、従来実
施されている測定方法における数十分の測定時間
の間にトランスアミナーゼの触媒作用をうける基
質量は、最適条件下でも10^-4mole／の桁の濃
度である。この様な微量の基質または生成物を、
共役酵素反応を利用して比色測定する方法におい
て、測定結果の正確さを維持しつつ、あるいは更
に高い精度を達成する一方、分析操作時間の短縮
をも実現するには、各反応が充分に進行する、
生成する染料の吸光度が大きい、染料が測光
時まで安定である、定量分析フイルムで比色測
定する場合には泳動や拡散により生成した染料が
測定するまでに失われないようにする必要があ
る。本発明者らはこの観点からさらに引続き鋭意
研究を続けた結果、酸化酵素の基質の一つである
酵素の供給が、上記連続反応全体の律速段階であ
ること、そして又、この連続反応において基質の
一つとなる過酸化水素が多層フイルムの各層間を
泳動していく速度が他の基質や生成物の泳動速度
に比して格段に早いことを見出し、本発明に到達
した。 本発明の目的は、共役酵素反応を利用して、過
酸化水素を発生するように設計されたトランスア
ミナーゼ活性の定量分析成分を、本発明者らの知
見にもとづいて、特定の層に存在させるべく層構
成した多層分析フイルムを提供することにある。 本発明の多層分析フイルムは、トランスアミナ
ーゼ基質を含有する多孔質層、過酸化水素検出呈
色指示薬層及び透明支持体がこの順に積層一体化
された構成を有し、多孔質層は更にピルビン酸オ
キシダーゼ（以下POPという）を含有する。
POPは、常に基質と共存する必要はなく、多孔
質層に流体（気体又は液体を介して）接触し、か
つ、指示薬層の上に位置する別の層（酵素層とい
う）として形成してもよい。 このように、POPを多層分析フイルムの上層
あるいは垂直方向浅部に存在させると、POPの
基質の一つである酸素が、検査液に溶存している
酸素として供給される外、空気中からももつと効
率よく供給される（式〔３〕参照）。その結果、
式〔３〕の反応に共役するPOD酵素反応（式
〔５〕参照）において、PODの基質となる過酸化
水素が充分、かつ、迅速に生成する。 こうして生成した過酸化水素は直ちに指示薬層
へと拡散泳動して、そこでカプラー等の呈色試薬
により、呈色反応生成物を与える。 本発明の多層分析フイルムにおいては、系全体
の反応律速を、空気中からの酸素の供給によつて
行ない、最も素早い層間泳動度を有する過酸化水
素に層間泳動の役割を分担させることが重要であ
るから、そのような目的及び機能を達成する限
り、POPはどこに存在してもよいが、一般には、
トランスアミナーゼ基質を含有する上層部の多孔
質層、または、これに隣接する支持体側の層であ
る。これらの層は、空気に接しているか、あるい
は事実上空気と接触している状態にあるから、式
〔３〕の反応が迅速に進行する。 反応生成物たる過酸化水素は、無色であり、従
つて、比色定量においては検出不能の状態で泳動
を開始し、直ちに指示薬層に到達し、そこで始め
て検出可能な発色生成物を与える。本発明におけ
るように、層間泳動物が検出不能であることは非
常に重要である。 前記の公知技術においては、反応試薬層におい
て発色した反応生成物が、遅い泳動速度で検出層
へ移動していくので、移動が完了して検出層へ固
定されてしまうまでの相当の待ち時間を経なけれ
ば、移動中の呈色反応生成物までも比色定量して
しまうおそれがあるのに対し、可視域に吸収をも
たない、従つて、検知不能な物質が泳動物質であ
る本発明においては、そのような懸念が存しない
からである。 本発明において、その活性を測定することがで
きるアミノ基転移酵素は、国際生化学連合（I.U.
B.）承認の酵素の分類及び命名法（エンザイ
ム・ノーメンクレイチヤー、1972年版、エルセビ
ア社刊、1973年）において、分類番号2.6.1に具
体的に記載されているもののうち、直接又は間接
にピルビン酸を生成するものであり、例えば、グ
ルタミツクオキサロアセチツクトランスアミナー
ゼ（GOT）、グルタミツクピルビツクトランスア
ミナーゼ（GPT）、Ｌ−Aspartate：２−
oxoglutarate aminotransferase（EC2.6.1.1）、Ｌ
−Alanine：２−oxoglutarate
aminotransferase（EC.2.6.1.2）、アラニン−グリ
オキシル酸トランスアミナーゼ（EC2.6.1.44）、
β−アラニントランスアミナーゼ（EC2.6.1.18）
を挙げることができる。 ピルビン酸を生成する間接反応とは、前記式
〔４〕に示す如き、他の酵素反応を介するもので
あつてもよいし、酵素を介さない化学反応であつ
てもよい。いずれにせよ、トランスアミナーゼ酵
素反応と共役する他の酵素反応又は化学反応と組
合せにより、反応生成物がピルビン酸を介して過
酸化水素となるように選択することができるもの
であればよい。 このなかでも、GOT及びGPT活性の測定は診
断学上最も重要である。 上記のトランスアミナーゼ酵素の基質となる物
質は、その構造中にアミノ基を含むものであれば
足り、基質−酵素の相関関係は当業者に周知であ
るから、詳細な説明は無用であろう。 本発明の多層分析フイルムに使用されるPOP
は、その活性を賦活するため、POP賦活剤を共
存させて反応を進行させるのが普通である。
POP賦活剤としては、補酵素、無機リン酸、二
価の金属イオン等を挙げることができる。 補酵素として代表的なものは、フラビンアデニ
ンジヌクレオチド、チアミンピロホスフエート
等；無機リン酸源としては、リン酸水素−ナトリ
ウム、リン酸二水素−ナトリウム、リン酸二水素
−カリウム、リン酸二水素カリウム等があり、二
価の金属イオンとしては、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、
Co²⁺等である。 本発明における多孔質層は、繊維質及び非繊維
質いずれであつてもよい。繊維多孔質材料として
は、紙（紙、合成紙、不織布、ポリエチレンパ
ルプ等）や布（天然又は合成の織物、特に平織）
等を使用することができる。これらの具体例は、
特開昭55−164356号に詳細に記載されている。
又、非繊維多孔質材料としては、メンブランフイ
ルターや粒子結合体（ガラス、ポリマー、セラミ
ツクス又はこれらの混合物等）を使用することが
できる。その具体例は、特公昭53−21677号に記
載されている。 これらの多孔質材料を、トランスアミナーゼ基
質又はトランスアミナーゼ基質とPOPとの混合
液に含浸し、多孔質層とする。多孔質層がトラン
スアミナーゼ基質のみを含有する場合には、
POPを塗布することにより、多孔質層に隣接す
るPOP塗布層（酵素層）を設けることができる。 多孔質層への含浸は、多孔質層を他の層と合体
させてから後に行なつてもよい。 過酸化水素検出呈色指示試薬層は、カプラー及
び水素供与体を、ゼラチン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、アガロース、ポリビ
ニルベンゼンスルホン酸ナトリウムなど公知の親
水性バインダー中に分散包含させた組成物を1μ
ｍから100μｍの厚さに設けたものが好ましい。 過酸化水素検出呈色指示薬系としては、カチオ
ン性染料を形成する系を選び、カチオン性染料を
形成する過酸化水素検出呈色指示薬系中に、水素
供与体として、４−アミノアンチピリンまたは
Ｎ，Ｎ−ジ置換−ｐ−フエニレンジアミン、カプ
ラーとしてＮ，Ｎ−ジ置換アニリン誘導体及びア
ニオンポリマーの組合せを用いることが特に好ま
しい。 このような組合せにおいては、呈色反応生成物
への変換効率が高く、生成するカチオン性染料の
吸光度も大きい上、生成した呈色反応物（染料）
を効率よく固定することが可能となり、測定感度
が著しく高くなるので好ましい。 支持体としては、ポリエチレンテレフタレー
ト、セルロースエステル（セルロースジアセテー
ト、セルローストリアセテート、セルロースアセ
テートプロピオネートなど）、ポリカルボネート、
ポリメチルメタクリレートなどのフイルム類やガ
ラス板など厚さ約50μｍから約５mmまでの公知の
水不滲透性透明支持体を用いることができる。 なお、上記の透明支持体にカーボンブラツク、
酸化チタン、フタロシアニン銅等の顔料を分散し
たものや、離型紙等を設けた不透明支持体も使用
することができる。この場合には、分析反応終了
後、支持体をはく離した後で、以後の測定を行な
う。 本発明の多層分析フイルムは、上記の基本的な
構成（第１図、第２図参照）の外に、種々の構造
又は機能補助層（例えば、色遮へい層、光反射
層、接着層、媒染層など）を、常法に従つて設け
ることができる。このような補助層を有する本発
明の代表的な態様を第３図乃至第９図に図示し
た。 本発明の多層分析フイルムは、例えば、各層を
密着させ、必要ならば、水または界面活性剤水溶
液にて層の表面を湿潤した後、加圧ローラー間を
通過させてラミネートすることにより作製するこ
とができる。 このようにして得られた本発明のトランスアミ
ナーゼ多層分析フイルムは、下記の如き利点を有
する。 反応律速段階である酸素の供給が効率よく行
われるため、全体の操作時間が短縮できる。 比色検知不能な化学種である過酸化水素を泳
動主体とすることにより、即ち、酸化酵素の反
応過程までを拡散泳動距離の少い上層において
実施し、呈色反応は検出効率の良い透明支持体
に隣接した指示薬層内で実施させることによ
り、著しく感度を上昇させることができる。 トランスアミナーゼ反応生成物が、検出染料
へ変換される効率が高いので、高い精度が得ら
れる。 以上のような効果の総合的結果として、トラ
ンスアミナーゼ活性の定量測定域が拡大され
る。 実施例 １ 写真支持体用の無色透明ポリエチレンテレフタ
レート（PET）フイルム上に、乾燥後の厚さが
10μｍとなるように、下記組成を有する染料固定
層を設けた。 染料固定層塗布液の組成： ゼラチン 5.0ｇ ポリスチレン−４スルホン酸カリウム 2.5ｇ サーフアクタント10G 0.50ｇ （Olin Chemicals社製ノニオン界面活性剤。
Ｐ−オクチルフエノキシポリエトキシエタノー
ル）ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
0.20ｇ グリセリン １ｇ 水 100ml 次いで、染料固定層の上に、呈色試薬層とし
て、乾燥後の厚さが15μｍになる様に下記の呈色
試薬層組成液を塗布した。 呈色試薬層塗布液の組成： Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシエチル）−ｍ
−トルイジン 0.20ｇ ４−アミノアンチピリン塩酸塩 0.24ｇ ゼラチン 15ｇ POD 7500単位 サーフアクタント10G 0.50ｇ ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
0.38ｇ 水 100ml 更にこの上に、光ブロツキング層として、下記
組成の酸化チタン分散層を乾燥後の膜厚が、7μ
ｍとなるように塗布した。 光ブロツキング層塗布液組成： TiO₂微粉末 19.5ｇ ゼラチン 6.8ｇ スルホこはく酸ジオクチルナトリウム 1.0ｇ 水 87 この光ブロツキング層の上に、ピルビン酸オキ
シダーゼ層（POP層）として、乾燥後の膜厚が
10μｍになる様に、下記組成のPOP層塗布液を塗
布した。 POP層塗布液組成： ゼラチン 10ｇ POP 5000単位 FAD 4.1mg TPP 92mg MgCl₂ 47mg サーフアクタント10G 0.50ｇ 水 100ml 次の組成のGPT基質組成物を含む溶液を調整
した。 α−ケトグルタル酸ナトリウム塩 3.8ｇ Ｌ−アラニン 35.6ｇ 燐酸水素二ナトリウム12水塩 10.9ｇ 燐酸水素一ナトリウム ３ｇ ポリアクリルアミド ２ｇ サーフアクタント10G ２ｇ 水 400ml このGPT基質組成物溶液に、表面が平滑な電
気泳動用紙（厚さ400μｍ）を浸し、ローラー
間隔が500μｍのシリコンゴムローラー間を通過
させて、均一に塗布液を浸み込ませる。次いで、
平面ガラス板の表面の上で自然乾燥させた。 GPT基質組成物が含浸された紙をTA基質組
成物含有多孔性層として、サーフアクタント10G
の50倍希釈水溶液で湿らせた、上記多層塗布
PETフイルム上に圧着し、次いで、乾燥して固
定した。こうして、GPT定量分析用多層分析フ
イルムＡが得られた。 参考例 １ 前記GPT定量分析用多層分析フイルムＡにお
いて、POP層を設ける代りに、呈色試薬層に
POPを添加した下記組成のPOP−呈色試薬層塗
布液を、乾燥膜が18μｍになる様に塗布し、呈色
試薬層とした。ここで、POPの量は実施例１に
おけるそれの1.5倍量に設計されているので、こ
れに比例して、ピルビン酸オキシダーゼ賦活剤で
あるFAD、TPP及びMgCl₂も増量されている。
なお、最終的に測定される発色濃度は、POPの
酵素作用により変換されたH₂O₂に対するPODの
酵素反応を利用するものであるので、PODの量
は実施例１におけるそれと同量とした。 POP−呈色試薬層塗布液の組成： Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシエチル）−ｍ
−トルイジン 0.20ｇ ４−アミノアンチピリン塩酸塩 0.24ｇ ゼラチン 15ｇ POD 7500単位 POP 8000単位 FAD 6.2mg TPP 0.138ｇ MgCl₂ 70.7mg サーフアクタント10G 0.50ｇ ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
0.38ｇ 水 100ml このようにして得られた多層塗布フイルムに、
前記のTA基質組成物含有多孔性層としてのGPT
基質組成物含浸紙を湿式圧着して、GPT定量
分析フイルム用多層分析フイルムＢを得た。 この様にして得られた定量分析フイルムＡ及び
Ｂの各々を0.5cm²（0.7cm角）の形に裁断し、各種
の濃度にGPT酵素を添加した市販コントロール
血清をTA基質層に点着した。 試験方法： 上記フイルムを水分の蒸発を防ぐ為にプラスチ
ツク製のスライドフレーム内に設置し、37℃でイ
ンキユベートした。 時間経過と共に変化する発色濃度反射光学濃度
として測光した。 得られた結果を第１０図に示す。 図から明らかなように、公知技術によるGPT
分析フイルムＢでは、1.5倍量のPOPが使用され
たにも拘らず、本発明によるGPT分析フイルム
Ａにくらべて発色濃度が劣るばかりでなく、定量
域よりも狭い範囲に限られている。 参考例 ２ 参考例１と同様にして、以下に示す条件で
GPT分析フイルムB′を得た。 (1) POP賦活剤であるFAD、TPP及びMgCl₂を
それぞれ実施例１と同量とする。 (2) POP賦活剤の量に比例するPOPの量は3400
単位であるので、この量のPOPを呈色試薬層
に添加する。 (3) 上記の条件以外は、参考例１と同じである。 従つて、PODの量は本発明の分析フイルム
Ａ、比較のための分析フイルムＢ及びB′全例
において同じ量である。 比較用分析フイルムＢ及びB′について、発色
速度を観察した。 分析フイルムＢ及びB′のそれそれに、10^-3Mピ
ルペート水溶液20μを点着し、参考例１と同様
に反射濃度計にて発色を観察したところ、分析フ
イルムB′の発色濃度は、分析フイルムＢのそれ
の８割にすぎなかつた。 同様に、140IU／のGPTを含むコントロール
血清を用いた場合にも、これに対応する結果が得
られた。 以上、実施例１、参考例１及び２に示す結果か
ら、本発明による分析フイルムＡは、比較用分析
フイルムＢの2/3のPOP使用量でも、分析フイル
ムＢよりはるかに高い発色濃度を与えることがで
き、より広い範囲の定量域を示すことができるこ
と、POP賦活剤の量が同じであるときには、本
発明の上記効果はさらに大きい差となつて発現さ
れることがわかる。 実施例 ２ 実施例１に記載したGPT分析フイルムＡの
POP基質層の代りに、ゼラチンのみから成る中
間層を5μｍの膜厚になる様に塗布する。 次いで、厚さ400μｍの電気泳動用平滑面の
紙を0.5cm²（0.7cm角）に裁断し、この重層塗布フ
イルム上に実施例１と同様に湿式圧着した。 実施例１のGPT基質組成物中にPOP及びその
補酵素類を添加し、下記組成のGPT基質−POP
組成物溶液を調製した。 GPT基質−POP組成物溶液： α−ケトグルタル酸ナトリウム塩 3.8ｇ Ｌ−アラニン 35.6ｇ 燐酸水素二ナトリウム12水塩 10.9ｇ 燐酸二水素一ナトリウム２水塩 ３ｇ POP 40000単位 FAD 0.033ｇ TPP 0.74ｇ MgCl₂ 0.37ｇ ゼラチン ２ｇ サーフアクタント10G ５ｇ 水 400ml ０℃に冷したGPT基質−POP組成物溶液を20μ
取り、上記の重塗フイルム上に接着している
紙に点着し、次いで減圧下急速凍結乾燥して
GPT定量分析フイルムＣを得た。 GPT定量分析フイルムＣの性能試験を実施例
１と同様に実施した。その結果を第１０図に示
す。 実施例 ３ 実施例２に記載したGPT定量分析フイルムＣ
において、光ブロツキング層を設ける代りに、直
径９mmの円形に切断したメンブランフイルター
（フジミクロフイルターFM−500 、富士写真フ
イルム製）を、実施例２と同様に湿式圧着法によ
り接着した。 次いで、実施例２に記載したGPT−POP組成
物溶液を10μ点着、凍結乾燥してGPT定量分析
フイルムＤを得た。 実施例１と同様の方法を用いて105IU／dlの
GPT活性を有する市販コントロール血清を10μ
点着して、37℃でインキユベートした。GPT活
性を発色速度の時間経過で追跡したところ、発色
は20分間以上直線的に増加しており、GPT定量
分析フイルムＣの約３倍のスピードであつた。 実施例 ４ 実施例３に記載した多層塗布フイルム上に、メ
ンブランフイルターの代りに、500μｍの電気泳
動用紙を、実施例１の方法に従つて、次の
GPT基質−酵素溶液に含浸・乾燥した後、湿式
圧着して接着した。 GOT基質−酵素溶液： Ｌ−アスパラギン酸 50ｇ α−ケトグルタル酸ナトリウム塩 3.0ｇ 燐酸水素二ナトリウム12水塩 10.9ｇ 燐酸二水素一ナトリウム２水塩 3.0ｇ POP 40000単位 オキザロ酢酸脱炭酸酵素 50000単位 FAD 0.033ｇ TPP 0.74ｇ 塩化マンガン（） 0.29ｇ ゼラチン １ｇ トリトンＸ−100（Rohm and Haas社製ノニオ
ン界面活性剤。ｐ−オクチルフエノキシポリエ
トキシエタノール） ５ｇ 水 400ml ここで得られたGOT定量分析フイルムを、一
辺が0.8cmの正方形になるように裁断し、ドライ
分析フイルム用に設計されたプラスチツクスライ
ド中に挿入して、37℃で２分間前加熱する。 次いで、GOT生理食塩水溶液（53、104、210、
401IU／含有）を30μづつ付着し、プラスチ
ツクスライド付着開口部を粘着テープでシール
し、更に、37℃で10分間インキユベートしたの
ち、反射測光により発色濃度を測定した。結果を
第１表に示す。

【表】 度値
本発明のGOT定量分析フイルムを使用するこ
とにより、GOT活性の高感度、広濃度域で定量
分析された。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第９図は、本発明の多層分析フイル
ムの実施態様を示す拡大断面図である。第１０図
は、実施例１及び２並びに比較例１で得られた
GPT定量分析フイルムＡ，Ｂ及びＣのインキユ
ベーシヨン10分間後に測定した発色濃度を示すグ
ラフで、横軸に酵素活性（IU／）、縦軸に測定
波長550nｍにおける光学濃度をとつたものであ
る。 なお、図中に用いた符号は、下記のとおりであ
る。 １：TA（トランスアミナーゼ、以下同じ）基
質−POP含有多孔質層、１１：TA基質含有多孔
質層、１２：POP酵素層、２：呈色指示薬層、
２１：媒染剤含有呈色指示薬層、２２：媒染剤−
TiO₂含有呈色指示薬層、３：支持体、４０：
TiO₂光しやへい層、５０：媒染層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ トランスアミナーゼ基質、ピルビン酸オキシ
   ダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ賦活剤及び過酸
   化水素検出呈色指示薬より成る、トランスアミナ
   ーゼ定量分析試薬を水浸透性層に含み、少なくと
   もトランスアミナーゼ基質を含有する水浸透性
   の多孔質層、過酸化水素検出呈色指示薬を含有
   する水浸透性層及び透明支持体がこの順に積層
   一体化されている多層分析フイルムであつて、ピ
   ルビン酸オキシダーゼ及びピルビン酸オキシダー
   ゼ賦活剤が、前記多孔質層または前記多孔質層と
   前記指示薬を含有する層とに実質的に接触するよ
   うに設けられた水浸透性層に含有されていること
   を特徴とするトランスアミナーゼ定量多層分析フ
   イルム。 ２ 前記ピルビン酸オキシダーゼ及びピルビン酸
   オキシダーゼ賦活剤を含む層に、オキザロ酢酸脱
   炭酸酵素を含む特許請求の範囲第１項記載の多層
   分析フイルム。 ３ 前記ピルビン酸オキシダーゼ賦活剤が補酵素
   である特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   多層分析フイルム。 ４ 前記補酵素がフラビンアデニンジヌクレオチ
   ドである特許請求の範囲第３項記載の多層分析フ
   イルム。 ５ 前記ピルビン酸オキシダーゼ賦活剤がフラビ
   ンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフ
   エート、無機リン酸源及び２価又は３価の金属イ
   オンである特許請求の範囲第１項記載の多層分析
   フイルム。