JPH0394698A - アンモニア測定試薬組成物を含む一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は尿素窒素、アンモニア、タレアチニン等のアン
モニウムイオンを生或しうる被分析或分（アナライト）
を測定する・ための試薬系を含む一体型多層分析要素及
びそれを用いるための試薬分析方法に関するものである
． 〔従来の技術〕 蛋白質代謝の中間体及び最終生成物である尿素窒素（Ｂ
ＵＮ）　、アンモニア、タレアチ二ン等の測定は腎疾患
の診断、治療経過の判断等のために必要である。従来、
これらは湿式法で分析され、例えば尿素窒素は強酸性条
件下でテレフタルアルデヒド及びフェニレンジアミン誘
導体を直接反応させて発色を比色定量する方法（Ｄ．Ｊ
．Ｊｕｎｇ＋　ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．．２１．　１１３
６（１９７５））　、尿素にウレアーゼを作用させて生
或したアンモニウムイオンをネスラー試薬を用いるかあ
るいはインドフェノール法で比色定置する方法で定量さ
れていた。インドフェノール法はその後多くの研究者に
よって改良がなされている（例えば、Ｈ．Ｏｋｕｄ．ａ
　ｅｔ　ａｌ，　Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ　Ｊ．Ｅｘｐｔｌ
．Ｍｅｄ．．１２．（１）　　１１−２３（１９６５）
）．この方法は強酸性条件下で反応させるので装置が腐
蝕しやすいという問題があり、感度が低いこと及び測定
に時間を要することも問題であった． 酵素法についても、グルタξン酸脱水素酵素を利用して
ＮＡＤＰＨの減少量をＵＶ吸収の測定して求める方法が
開発されている（Ａ．Ｍｏｎｄｚａｃ　ｅｔａｌ，　Ｊ
．Ｌａｂ．ＣＩｉｎ．Ｍｅｄ．．６６，　５２６．（１
９６５））　．この方法も感度及び精度に問題があった
。グルタミン酸及びＡＴＰの存在下でグルタくン合戚酵
素を作用させ、さらにピルビン酸キナーゼ及びピルビン
酸オキシダーゼを作用させて生或した過酸化水素をベル
オキシダーゼと４−アミノアンチピリンを利用して比色
定置する方法も開発されている（特開昭６２　−　３８
００号公報）。

一方、簡便な操作で迅速に定量できる方法として乾式法
も知られている。乾式法に用いる分析器具の例として、
日本分析化学会編分析ライブリー３「臨床化学分析■含
窒素威分」第２版（東京化学同人、１９７９年発行）１
３〜ｌ４頁、「臨床検査」第５巻（第６号）３８７〜３
９１頁（１９６１年発行）米国特許３０１１８７４号等
には、濾紙片に細帯状の試薬層（ウレアーゼとアルカリ
剤を含み、尿素からアンモニアガスを生成させる）、細
帯状の障壁物層、細帯状の指示薬層（ｐＨ指示薬ブロム
クレゾールグリーンを含む）がこの層に設けられたＢＵ
Ｎ定量分析用試薬片が開示されている。特開昭５０　−
　９３４９４号公報には、濾紙片にｐＨ支持薬プロムチ
モールブルーを含浸し、ついでウレアーゼと親水性ポリ
マーからなる障壁形威体との混合物をさらに含浸し、最
後にエチルセルロース半透膜を設けたＢＵＮ定量分析用
試験片が開示されている。また、特開昭５２　−　３４
８８号公報（特公昭５８−１９０６２号）には水不浸透
性の透明支持体の上に支持薬層、アンモニア蒸気が均一
に浸透可能で液体状水およびアルカリ性妨害物が浸透不
可能なセルロースアセテートプチレート等の疎水性ボリ
マーの均質（非孔性）薄層からなる障壁物層、ウレアー
ゼおよびアルカリ剤を含む試薬層、および多孔性展開層
をこの順に一体に積層してなるＢＵＮ定量分析用一体型
多層分析要素等が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の乾式法においてはいずれもアンモニアガスを試験
片ないし分析要素内を拡散させており、この拡散が定量
性に欠けるという問題があった．本発明の目的は蛋白質
代謝の中間体及び最終生成物である尿素窒素（ＢＵＮ）
、タレアチニン、アンモニア等を簡便な方法で高精度で
定量できる分析要素を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記目的を達戒するべく鋭意検討を行った
結果、基本的には蛋白質代謝中間体や最終生戒物の測定
に共通的に利用できるアンモニウムイオン検出法であっ
て発色反応に結びつけられる反応原理として、前述のグ
ルタごン合或酵素にピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸
オキシダーゼを組合せ、生戒した過酸化水素を比色定置
する方法に着目するに至った。しかしながら、この反応
系を乾式分析要素に組込んだ場合に試料に含まれている
ピルビン酸が同時に検出されてこれが誤差になるという
問題を新たに生じた。そこで本発明者らはさらに検討を
進め、前記のグルタミン合戒酵素とピルビン酸キナーゼ
のうち少なくとも一方の含有量を規制してレートアッセ
イすることによって試料中のピルビン酸による発色分を
差し引いて被分析物を正遣に定量しうる手段を案出する
に至り、これによって前記目的を達成することができた
。

かかる本発明は、少なくとも光透過性水不透過性支持体
、試薬層及び展開層がこの順に積層されている一体型多
層分析要素において、グルタミン合成酵素、ピルビン酸
キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及び過酸化水素検出
試薬組成物を含有し、かつ前記グルタミン合或酵素又は
ピルビン酸キナーゼの含有量が速度限定量であることを
特徴とするアンモニア測定試薬組成物を含む一体型多層
分析要素に関するものである。

光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。

その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１
ｍｍ、好ましくは約８０ｐＩＱから約３００ｎの範囲の
透明支持体を用いることができる。支持体の表面には必
要により前記の諸特許明細書等により公知の下塗層また
は接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等と
の接着を強固にすることができる。

試薬層は前記の酵素及び試薬組成物の全部又は一部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性ボ
リマーバインダーは水吸収時の膨潤率が３０″Ｃで約１
５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約
１５００％の範囲の天然または合或親水性ポリマーであ
る。その例として、ゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イオ
ンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロ
ース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルア亀ド
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあ
げることができる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚さ
は約３Ｉｒｍから約５０−、好ましくは約５ｆｍから約
３０一の範囲であり、被覆量で約３ｇ／ボから約５０ｇ
／　ｒｄ、好ましくは約５ｇ／ｒｒｆから約３０ｇ／　
ｒｄの範囲である。

試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

微多孔性で水浸透性の試薬層は後述する布地層間層と同
様の布地、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ボリ
マー繊維バルブ含有抄造紙、特開昭５７−１２５８４７
等に記載の繊維と親水性ボリマーの分散液を塗布して形
威した多孔性層等の繊維質多孔性層；特公昭５３−２１
６７７、米国特許３　９９２　１５８等に記載のメンプ
ランフィルター層（ブラッシュポリマー層）、ボリマー
ミクロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダーで
点接触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性
層、特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーミクロビ
ーズが水で膨潤しないボリマー接着剤で点接触状に接触
されてなる連続空隙含有等方的多孔性Ｎ（三次元格子状
粒状構造物層）等の非繊維等方的多孔性層等の微多孔性
層に試薬組戒物を含有させた層又は固体微粒子と親水性
ポリマーバインダーから構成される微多孔性構造体に試
薬組威物を含有させた層である。微多孔性試薬層の乾燥
時の層厚は約７μｍから約２５０μｍ、好ましくは約１
０μｍから約２５０μｍの範囲である。

微多孔性試薬層の上に展開層を設ける場合には、両層の
間は特開昭６１−４９５９　、特開昭６２−１３８７５
６等に記載の多孔性接着によるのが好ましい。

本発明の多層分析要素のｌ態様として、展開層に前述の
試薬組戒物を含有させ、展開層の下に（必要におうして
接着層を介して）吸水層又は検出層を設けた構威の多層
分析要素がある。別の１態様として、試薬層のポリマー
バインダーとして、水性液体試料の溶媒に溶解又はゾる
化するポリマ、例エばポリビニルアルコール、ポリビニ
ルビロリドン、カルボキシミチルセルロース、アルギン
酸ナトリウム、非硬化ゼラチン、寒天等を用いて試薬層
を形威し、その上に前記の微多孔性試薬層として用いる
微多孔性の薄シート状部材を多孔性検出層として積層接
着した構成の多層分析要素がある。

試薬層には公知のｐＨ緩衝剤組威物、高分子ｐＨ緩衝剤
、塩基性ボリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を含
有させることができる。

展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンプランフィルタ（プラッシュボリマーＮ）、ポリ
マーくクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻上が親水
性ボリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５　−　９０８５９号公報に開示の
ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ等で水が膨
潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連
続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等
の非繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３
５６号公報、特開昭５７　−　６６３５９号公報等に開
示の織物展開層、特願昭５９−７９１５８号明細書に開
示の織物展開層、特願昭５７　−　１４８２５０号公報
に開示の有機ボリマー繊維バルブを含む抄造紙からなる
展開層等の繊維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して積層さ
れる。

多層分析要素には前述の諸層のほかに必要に応じて特開
昭５１−４０１９１、特開昭５３−１３１０８９等に開
示の検出層または媒染層、特開昭５４−２９７００等に
開示のξグレーション阻止層、特開昭５１−４０１９１
等に開示の中間層、特開昭５６−８５４９に開示の試薬
含有微粒子分散層等を組み込んで設けることができる。

本発明の分析要素においてアンモニウムイオンを検出す
る反応系は下記のように進行する。

Ｃ（ ＧＳ：グルタミン合戒酵素 ＰＫ：ピルビン酸キナーゼ ＰＯＰ　：ピルビン酸オキシダーゼ ＰＯＤ　：ペルオキシダーゼ グルタミン合威酵素（ＥＣ６・３・１・２〕は大腸菌（
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ＡＴＣＣ９６３７等）
、Ｓａｃ　ｉ目ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ等が産生し、羊脳、牛脳等からも分離しうる。Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓの産
生ずる酵素は耐熱性酵素であって市販されており、本発
明の分析要素に特に好ましい。ピルビン酸キナーゼ（Ｅ
Ｃ２　・７　−　１　・４０）はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓＳＢａｃｉｌｌｕｓ
　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓｕ等が産生しうるほか、
ラット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等の動物の筋肉、ブタ
の心臓などから取得しうる。ピルビン酸オキシダーゼ［
ＥＣ　１・２・３・６］はＬａｃｔｏｂａｃｔｌｌｕｓ
　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉをはじめとして種々の菌が産
生しうる。これらの酵素はいずれも市販されておりそれ
らを購入して使用することができる。一方、本発明の分
析要素用としてはこれらの酵素は純品でなくともよく、
例えば微生物の発酵液あるいはそれから沈澱等の手段で
得た粗製酵素を利用することもできる。

過酸化水素検出試薬組戒物としてはベルオキシターゼを
含む試薬組戒物が好ましい。ベルオキシダーゼはワサビ
、ジャガイモ、大根、イチジク等の植物起源のもの、白
血球、乳汁等の動物起源のもの、コクリオボルス（Ｃｏ
ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、タルプラリア（Ｃｕｒｖｕ
ｌａｒｉａ）属等の微生物起源のもの等が知られており
、これらのいずれであっても使用できるが市販品を利用
するのが簡便である。

また、この試薬組成物はさらに発色試薬組戒物を含む、
発色試薬組戒物は色原体（水素供与体ともいわれる）と
カプラーを含みベルオキシダーゼの存在下に過酸化水素
により色原体とカブラーが酸化カブリングしてキノンイ
ミン染料を形威して発色する組戒物、またはロイコ色素
または自己酸化発色性色原体でベルオキシダーゼの存在
下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色する化
合物である。

色原体としては、Ａｎｎ．ＣＩｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，　６．　２４−２７　（１９６９）に記載の４−アミ
ノアンチビリン（別名４−アミノフェナゾン、すなわち
１−フエニルー２．３−ジメチル−４−アξノー３−ビ
ラゾリンー５−オン）、特開昭５９　−　５４９６２等
に記載の１−（２．４．６−｝リクロロフエニル）−２
．３−ジメチル−４−アミノー３−ビラゾリンー５−オ
ン、１−（３．５−ジクロロフェニル）−２．３−ジメ
チル−４−アごノー３−ビラゾリンー５−オン等のトリ
置換−４−アミノー３−ビラゾリンー５−オン、特公昭
５５　−　２５８４０等に記載の１−フェニルー２．３
−ジメチルアξノ−３−ビラゾリンー５一オン等の４−
アξノアンチピリン類似体を用いることができる。これ
らの化合物のうちでは、４一アミノアンチビリン、１−
（２．４．６−｝リクロ口フェニル）−２．３−ジメチ
ル−４−アミノー３−ビラゾリンー５−オン、１−（３
．５−ジクロロフエニル）−２．３−ジメチル−４−ア
ミノー３−ビラゾリンー５−オン等が好ましい。

カプラーとしては、Ａｎｎ．ＣＩｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｎ
．，　６１　２４−２７　（１９６９）、特公昭５５　
−　２５８４０、特公昭５Ｂ　−　４５５９９、特公昭
５Ｂ−１８６２８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭
５６−１２４３９８、特開昭５６−１５５８５２等に記
載のフェノール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホ
ン酸、４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３，
５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン
酸、２−ヒドロキシー３−メトキシ−１−ベンゼンスル
ホン酸、２−ヒドロキシ−３−メトキシ−■−ベンゼン
スルホン酸等のフェノールスルホン酸（アルカリ金属塩
、アルカリ土類金属塩を含む）、１−ナフトール、２−
ナフトール、１，７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒ
ドロキシナフタレン；ｌ−ヒドロキシ−２−ナフタレン
スルホン酸、１−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホン
酸等のナフトールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカ
リ土類金属塩を含む）。その他のフェノールまたはナフ
トール誘導体がある．これらの化合物のうちでは、１．
７−ジしドロキシナフタレン、１−ヒドロキシ−２−ナ
フタレンスルホン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、
３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスル
ホン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。

ロイコ色素として、特公昭５７−５５１９に記載の２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）４，
５−ビス（４−（ジメチルアξノ）フェニル〕イ藁ダゾ
ール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭
５９−１９３３５２に記載の２−（３．５−ジメトキシ
ー４−ヒドロキシフェニル）−４−〔４−（ジメチルア
ミノ）フエニル〕−５−フェネチルイξダゾール等のジ
アリールイミダゾールロイコ色素；特開昭６１−４９６
０に記載の２−（２−フェニルー３−インドリル）−４
．５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フエニル〕イミダゾ
ール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素
、特開昭６１−２２９８６８に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３．５−ジメトキシフェニル）−３−アセチルー
４．５−ビス〔４−（ジェチルアごノ）フェニル〕イミ
ダゾール等のトリアリールモノアシルイミダゾールロイ
コ色素；２−（４−ヒドロキシ−３．５　−’；メトキ
シフェニル）−３−メチル−４，５−ビス〔４一（ジエ
チルアξノ）フエニル〕イミダゾール等のトリアリール
モノアルキルイミダゾールロイコ色素等がある。

グルタミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼ及び過酸化水素検出用試薬組成物はすべて
試薬層に含有せしめてもよく、またその一部を他の層、
例えば展開層等へ含有せしめてもよい。

本発明の分析要素においてはグルタ亀ン合成酵素又はピ
ルビン酸キナーゼの含有量の少なくとも一方を速度限定
量（　ｒａｔｅ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ａｍｏｕｎｔ　）
とする。これはピルビン酸オキシダーゼとべルオキシダ
ーゼの量（活性値）に対してグルタミン合成酵素又はピ
ルビン酸キナーゼのＭ（活性値）が前記の反応の進行す
る速度を支配するような量であることを意味する。

速度限定量は試料が血漿または血清の場合には一般に、
グルタミン合或酵素は２００〜２万ＩＵ／ｒｒｆ程度、
そしてピルビン酸キナーゼは２００〜２万１０／ボ程度
である。ピルビン酸オキシダーゼは充分量あればよく、
通常ｓｏｏｏ〜４万ＩＵ／　ｒｒｆ程度、好ましくは１
万〜２万１０／程度である。

展開層、試薬層、吸水層、検出層、接着層等には界面活
性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含有させるこ
とができる。ノニオン性界面活性剤の例として、ｐ−オ
クチルフエノキシボリエトキシエタノール、Ｐ−ノニル
フェノキシポリグリシドール、ポリオキシェチレンオレ
イルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、オキチルグルコシド等がある。ノニオン性界面
活性剤を試薬層、吸水層又は検出層に含有させることに
より分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層、吸水層
又は検出層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また
展開層との液体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノ
ニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水
性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好
になる。ノニオン性界面活性剤の展開層における含有量
は展開層１ｒｒｆ当り約１０■〜約３．０ｇ、好ましく
は約２０■〜約２．０ｇの範囲である。

本発明の分析要素を尿素窒素分析用とする場合には例え
ばウレアーゼを、タレアチニン分析用とする場合にはク
レアチニンディくナーゼあるいはクレアチニンアミドヒ
ドロラーゼ、タレアチンアミジノヒドロラーゼ及びウレ
アーゼを試薬層、展開層あるいはその他の適当な層へ含
有せしめればよい。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍ
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１、実公昭５６−１４２４５４、
特開昭５７　−　６３４５２、実開昭５８　−　３２３
５０、特表昭５８　−　５０１１４４等に記載のスライ
ド粋に収めて化学分析スライドとして用いることが、製
造、包装、輸送、保存、測定操作等諸種の観点で好まし
い。使用目的によっては長いテープ状でカセットまたは
マガジンに収めて用いること、または小片を開口のある
カードに貼付または収めて用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。例えば約５μｅから約３０ａｌｌ、好ましくは８μｉ
から１５＃ｇの範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液
体試料滴を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、
約２０゜Ｃから約４０゜Ｃの範囲の実質的に一定の温度
で、好ましくは３７℃近傍の実質的に一定の温度でイン
クベーションし、要素内の発色または変色を可視光又は
紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用い
て光透過性支持体側から反射測光し、レートアッセイす
る。これは反射光学濃度を連続的に測定して求めてもよ
く、経時的に２回以上測定して求めてもよい。本発明の
分析要素における発色はまず試料に予め含まれているピ
ルビン酸に起因して起こり、次に尿素窒素、アンモニア
、クレアチニン等の被分析物に基づく発色が始まる。試
料中のピルビン酸による発色は通常反応開始後３０秒位
で起こり、１分半ないし２分程度まで一定の発色濃度状
態が続くので反応開始後１分から１分半位の間に反射光
学濃度を測定してこれを試料に予め含まれていたピルビ
ン酸による発色とすることができる。被分析物に基づく
発色は反応開始後１分半ないし２分後にはじまり、その
発色速度が被分析物の濃度と相関しているので、この発
色速度を求める。この発色速度は２回の測定で求めても
よく、３回あるいはそれ以上測定して求めてもよい。測
定時期は２回の場合には通常反応開始後３分以降がよく
、例えば３分後と５分後に測定することができる。被分
析物濃度の決定は予め求めておいて被分析物の濃度と発
色速度との関係から算出する。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開昭６０　−
　２２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５
８−１６１８６７、特開昭６３−３１３０６３等に記載
の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量
分析を実施できる。

〔作用〕

本発明の分析要素で採用されているアンモニア測定用の
反応系はアンモニウムイオンをグルタミン合成酵素がグ
ルタミン酸と反応させてグルタミンに変換し、その際生
成したＡＤＰをピルビン酸キナーゼがフォスフォエノー
ルピルビン酸と反応させてピルビン酸を生戒させる。こ
のピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼがアセチル燐酸
に変えその際に過酸化水素が生戒する。この過酸化水素
を過酸化水素検出試薬組成物によって比色定量するので
ある。このような反応系では試料中に予め含まれている
ピルビン酸も検出されて誤差の原因となる。本発明の分
析要素においてはグルタミン合成酵素あるいはピルビン
酸キナーゼの含有量を規制することによって被分析物の
発色速度を規制し、この発色速度を求めることによって
試料中に含まれているピルビン酸による発色の影響を排
除している。

〔実施例〕

実施例１ ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５ｎの無色透明ＰＥＴ
フィルム支持体上に下記組戒の第２試薬層を乾燥後の層
厚が約　　一になるようにして塗布して乾燥した。

ピルビン酸オキシダーゼ　　１３０００　　　［１／％
ベルオキシダーゼ　　　　　２２０００　　　Ｕ／ボチ
アミンピ口燐酸　　　　　０．８５　　ｍｍｏｌ／ｒｒ
ｒＦＡＤ　　　　　　　　　　　４．０　　μｍｏ／ｎ
？燐酸２水素カリウム　　　　　１０　　ｍｍｏ　／ｒ
ｄＭ　ｇ　”（硫酸マグネシウム）　３．０　　ｍｍｏ
　／ｒｄフェノール　　　　　　　　５．０　　ｍｍｏ
　／ｒｒｆ４−アごノアンチピリン　　２．Ｏ　　ｍｍ
ｏｌ／ｎ｛ゼラチン　　　　　　　　　１４　　ｇ／ボ
第２試薬層の上に下記組或の第１試薬層を乾燥後の層厚
が約２０ｎになるように塗布して乾燥した。

グルタミン合威酵素　　　　　５００　　　Ｕ／ボピル
ビン酸キナーゼ　　　　　９５００　　　Ｕ／ボＬ−グ
ルタミン酸　　　　　　６．０　　ｍｍｏｌ／　％フォ
スフォエノールピルビン酸４．Ｏ　　ｍｍｏｌ／　ｒｈ
ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　５．４　　ＩＩＩｒａ
ａｌ／　ｒｒｆゼラチン　　　　　　　　　１９　　　
　ｇ／　ｒｒｆついで第１試薬層の表面に水をほぼ一様
に供給して湿潤させ、その上にセルロースアセテート多
孔質１ｌ９（公称孔径３．０μｍ、空隙率約８５％、厚
さ１４０μｍ）をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネー
トし、この多孔質膜にＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
３０　Ｂ　ｍｏｌ　とノニルフェノキシポリエトキシエ
タノール（平均１０オキシエチレン単位含有）０．２■
を塗布により含浸させ乾燥して、本発明の分析要素■を
作威した。

実施例２ 実施例１において、過酸化水素検出用組底物として第２
試薬層中のフェノール及び４−アミノアンチピリンを、
２−（３．５−ジメトキシー４−ヒドロキシフエニル）
−４．５−ビス（４−ジメチルアごノフェニル）イミダ
ゾール４　ｍｍｏｌ／　ｒｄに変更して、本発明の分析
要素■とした。

比較例１ 実施例２において第二試薬層中のグルタミン合戒酵素を
１５００００／　ｎｆに増量した以外は実施例１と全く
同じ分析要素（比較例■）を作成した。

実施例３〜６ 上記の各或分を含有する試薬層を実施例ｌと同様にして
塗布し、次いで、ポリエステル繊維からなるトリコット
編物を実施例１と同様にしてラξネートした。

実施例７ 上記実施例及び比較例の分析要素を１５ｍｍＸ１５ｍｍ
の正方形のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２に
記載のプラスチックマウントに入れて測定に供した。

検体にはピルビン酸濃度及びアンモニア濃度を予め測定
した下記の５種のヒト血清を用いた。

？：１ｎ？当りの被覆量　←左爛と同じ量　　■不合＊
２−＜２−フェニル−３−インドリル）−４．５−ジ〔
４−（ジメチルアミノ）フェニル］イミダゾール （　’ｌｔＲＦｌ｛６１−４９６０　、ＩＪＳ　４　７
２１　６７ｆＣ記戦）１　　　　　　　１．０　　　　
　　　　　　１５０２　　　　　　　２．０　　　　　
　　　　　１５０３　　　　　　　０．５　　　　　　
　　　　１５０４　　　　　　　０．５　　　　　　　
　　　３００５　　　　　　　０．５　　　　　　　　
　　６００各分析要素に上記の血清を１０ｕｅ点着して
３７゜Ｃでインクベーションし、３分後（ＯＤ．）と５
分後（○Ｄ，）に反射光学濃度を測定した。測定波長は
分析要素■、■、■については５１０ｎｍであり、分析
要素Ｖ及び■については５７０ｎｍである。また、分析
要素■及び比較品■の分析要素の測定波長は６２５ｎｍ
である。

各分析要素について得られた発色速度を下表に示す。

発色速度＝ＯＤｓ−００３ 発色速度（００／ｍｉｎ） ０．１１２ ０．２２２ 〔発明の効果〕 本発明の分析要素を用いてことにより試料に含まれてい
るピルビン酸の影響を排除してアンモニア及びその測定
系を利用した尿素窒素、クレアチニン等を正確に定量す
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性水不透過性支持体の上に試薬層及び展開
   層がこの順に積層されている一体型多層分析要素であっ
   て、前記試薬層にグルタミン合成酵素、ピルビン酸キナ
   ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及び過酸化水素検出試薬
   組成物を含むアンモニア測定試薬組成物の全成分又は一
   部の成分が含有されており、前記グルタミン合成酵素又
   はピルビン酸キナーゼの含有量が速度限定量であること
   を特徴とするアンモニア測定試薬組成物を含む一体型多
   層分析要素。