JP4003993B2 - 乾式分析要素の製造方法及び乾式分析要素 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれる成分を定量するための乾式分析要素、及びその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
血液中の成分を定量するための乾式分析要素は広く知られており、例えば富士ドライケム(富士写真フイルム株式会社)、ビィトロス(ジョンソン・アンド・ジョンソン)等の名称で市販されている。富士ドライケムの場合、血液中の総コレステロ−ル、中性脂肪、グルコ−ス、総ビリルビン、総蛋白、尿酸、カルシウム、無機リンといった一般化学物質を定量する乾式分析要素、血液中のクレアチンキナ−ゼ、アミラ−ゼ、トランスアミナ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、乳酸脱水素酵素、トランスペプチタ−ゼといった酵素の活性を測定する乾式分析要素等がある。
【0003】
血液中の成分の一つであるコレステロールを定量分析する有用な方法として、例えばコレステロールオキシダーゼの存在下にコレステロールを酸化し生ずる過酸化水素又はコレステノンを定量する方法が特公昭54−8318号(出願人:ナショナル リサーチ アンド ディベロプメント コーポレイション)で知られている。
【0004】
また結合コレステロールを含めた総コレステロールの定量に適用するために、この方法をコレステロールエステラーゼによるコレステロールの遊離と組みあわせることも、米国特許3,925,164号(ベーリンガー・マンハイム社)によって知られている。上記方法はコレステロールから生じるコレステノンとH202のいずれかを公知の方法で定量するものである。H202を定量するにはトラインダー試薬が有用であるが、共存するビリルビンが分析結果に誤差を与える。このビリルビンの干渉を防ぐ方法として、フェロシアン塩を共存させることが、米国特許4,291,121号(マイルズ・ラバラトリーズ社)で知られているが、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトラインダー試薬(または類似の過酸化水素検出試薬系)を含む乾式分析要素にフェロシアン塩を含有させると、分析要素の保存安定性が著しく損なわれることが判明した。
【0005】
血液中の成分の他の1つであるCPK(クレアチンキナーゼ)を定量分析する有用な方法としてクレアチンリン酸(以下CPと略す)とADPを基質とし、生成するATPをグルコースとヘキソキナーゼ(以下、HKと略す)によりグルコース−6−リン酸(G6P)へ、さらにNAD+またはNADP+とグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下、G6PDHと略す)によりNADHまたはNADPHに変換し、NADHまたはNADPHの増加を波長340nmで測定することによりCPK酵素活性を測定する方法が特公昭46−9988号により知られ、SSCC法等として広く用いられている。
【0006】
しかしこの方法は、紫外線領域の測光を必要とするので機器が高価なものになり、また紫外線域に吸収を有する多くの化合物の干渉を受ける欠点があった。
【0007】
酵素反応で生成したNADHを、電子受容性の色素前駆体と電子伝達剤から、可視域に吸収スペクトルを有するフォルマザン染料を形成させる比色分析法を用いれば可視域の分光測光によりNADHの定量ができる。溶液法と比較して煩雑な調液作業を必要とせず迅速簡便な分析ができる乾式分析要素に、前記のCPK活性測定に用いられる反応系を導入する試みがなされており、特開昭59−88097号、特開昭61−254199号に開示されている。
【0008】
これら公知のCPK活性測定要素は、多孔性担体を有し、該多孔性担体またはこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ADP、CPK活性化剤であるチオール化合物、グルコース、HK、NAD+、G6PDH、電子伝達剤、及びフォルマザン染料形成テトラゾリウム塩とゼラチンを含有する。さらに好ましくは、多孔性層、該多孔性層と液体接触関係にある水浸透性層及び水不浸透性・光透過性支持体がこの順に一体に積層され、該多孔性層またはこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ADP、CPK活性化剤であるチオール化合物、グルコース、HK、NAD+、G6PDH、及び電子伝達剤を含み前記 水浸透性層(多孔性層と液体接触関係にある)の少なくとも1つがゼラチンから成り、かつフォルマザン染料形成テトラゾリウム塩を含む、CPK酵素活性測定用乾式多層分析要素である。しかし、これらの分析要素においても、保存性能が十分とは言い難かった。
【0009】
糖類を用いて酵素や蛋白質等の巨大分子を安定化する技術はいくつか知られている。例えば、特開平8−187095号(東洋紡)には、糖類を用いた凍結乾燥によるコレステロ−ルオキシダ−ゼの安定化法およびコレステロ−ル測定試薬キットが開示されている。また、特公平7−79694号(カドラント)は、トレハロ−スの存在のもとで氷点を超える温度で乾燥することによって行われることからなる蛋白質の保護法、およびそれに用いられるトレハロ−スで含浸されている多孔質基質が開示されている。しかし、これらの公報に開示されているのは乾燥時における巨大分子活性の失活を防止する技術であり、マトリクス構造体の中に室温付近から70度程度の熱風で乾燥して固定化された酵素を有する乾式分析要素において、二糖類の添加により分析要素の保存安定性が向上するという技術は示唆されていない。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれる成分を定量する、酵素を含有する乾式分析要素の製造方法及び当該方法によって製造された、保存性が改良された乾式分析要素を提供することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、透明支持体上に少なくとも発色試薬層と展開層を有する乾式分析要素の製造方法において、該展開層に少なくとも酵素及び二糖類を含有する水溶液を供給し、約30〜70℃の温風を当てて乾燥することを特徴とする乾式分析要素の製造方法及び当該製造方法によって製造された乾式分析要素によって達成された。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明は、酵素を含有する公知の多種の乾式分析要素に適用することが出来る。特に検出試薬系と被検液がいずれも透過し得る固体担体を含む要素に適用することが出来る。要素は光透過性・液不透過性の支持体上に、多孔性液体展開層のほかに下塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、光遮蔽層、濾過層、および公知のその他の層を有する多層構造であってもよい。このような分析要素は例えば、特開昭63−119697号、同63−158000号、特開昭63−32499号、同63−283600号等に記載されている。
【0013】
本発明において使用できる二糖類としては、トレハロース、シュクロース、マルトース、ラクトース等が挙げられるが、これらの中でトレハロース、シュクロースが好ましい。これらの二糖類は、0.5〜40g/m2、好ましくは4〜20g/m2の量で存在させる。
【0014】
以下に、本発明を適用することができる例の一つとして、血液中のコレステロールを定量する乾式分析要素について説明する。このような乾式分析要素は、例えば特開昭63−119697号に記載されているが、支持体を用いる場合、当該乾式分析要素の実用的に採りうる構成は、
【0015】
(1)支持体上に液体展開層を有するもの。支持体と液体展開層の間に吸水層を有してもよい。
【0016】
(2)支持体上に試薬層、液体展開層をこの順に有するもの。支持体と試薬層の間に吸水層を有してもよい。この場合、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、二糖類が液体展開層に含まれるのが好ましい。
【0017】
コレステロールエステラーゼ(E.C.3.1.1.13)は試料中に含まれているコレステロールエステルをコレステロールに変える酵素であり、コレステロールオキシダーゼ(E.C.1.1.3.6)はコレステロールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素である。ペルオキシダーゼ(E.C.1.11.1.7)はこの過酸化水素を利用して発色試薬組成物を酸化発色させる反応に関与する酵素である。コレステロールエステラーゼとしてはE.C.3.1.1.13に分類される酵素を用いることができるだけでなく、コレステロールエステラーゼ活性を有する他の単独の酵素(例、特公昭56−45599号に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパーゼMR、リパーゼ3000R)、およぴ2種以上の酵素の組合せ(例、特公昭56−45599号に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパーゼ(例、リパーゼMR、リパーゼ3000R)、とプロテアーゼ(例、キモトリプシン(E.C.3.4.21.1)、パパイン(E.C.3.4.21.2)、プロメライン(E.C.3.4.22.4)、プロナーゼR)との組合せを用いることができる。
【0018】
コレステロールオキシダーゼ(E.C.1.1.3.6)はコレステロールを酸化して過酸化水素を発生させる酵素である。コレステロールオキシダーゼとしては、市販の酵素から適宜に選択して用いることができる。必要に応じて補酵素FDA(フラビンアデニン ジヌクレオチド)とともに用いることができる。
【0019】
ペルオキシダーゼとしては特公昭56−45599号、特公昭57−5520号等に記載の植物起源およぴ動物起源のペルオキシダーゼ(E.C.1.11.1.7)、特公昭58−5034号等に記載の微生物起源のペルオキシダーゼ(E.C.1.11.1.7)を用いることができる。これらのうちでは植物起源または微生物起源の非特異性ペルオキシダーゼが好ましい.好ましいペルオキシダーゼの例として西洋わさび、大根から抽出したペルオキシダーゼ、Cochliobolus属、Curvularia属の微生物から抽出したペルオキシダーゼ等がある。
【0020】
発包試薬層は発色試薬組成物の全部または一部を含み、親水性ポリマーで形成される層である。試薬層に用いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約1.5から約20、好ましくは約2.5から15の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。例として、ゼラチン(例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン等)アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。試薬層の乾燥時の厚さは通常約1μmから約100μmの範囲、好ましくは約3μmから30μmの範囲である。試薬層には、必要に応じて界面活性剤(カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性)や緩衝剤を含有させることもできる。
【0021】
発色試薬層に含有させる発色試薬組成物は▲1▼色原体とカプラーを含み、ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカプラーが酸化カプリングしてキノンイミン染料を形成して発色する組成物、または▲2▼ロイコ色素でペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色する化合物である。
【0022】
色原体としては、Ann.Clin.Biochem.,6,24−27(1969)に記載の4−アミノアンチピリン(別名4−アミノフエナゾン、すなわち1−フェニルー2,3−ジメチルー4−アミノー3ーピラゾリン−5一オン)、特開昭59−54962号等に記載の1−(2,4,6−トリクロロフエニル)−2,3−ジメチル−4−アミノ−3−ピラゾリン−5 −オン、1−(3,5−ジクロロフエニル)−2,3−ジメチル−4−アミノ−3−ピラゾリン−5−オン等のトリ置換−4−アミノ−3−ピラゾリン−5−オン、特公昭55−25840号等に記載の1−フエニル−2,3−ジメチル−4−ジメチルアミノ−3−ピラゾリン−5−オン等の4−アミノアンチピリン類似体を用いることができる。これらの化合物のうちでは、4−アミノアンチピリン、1−(2,4,6−トリクロロフエニル)−2,3−ジメチルー4−アミノ−3−ピラゾリン−5−オン、1−(3,5−ジクロロフエニル)−2,3−ジメチル−4−アミノ−3−ピラゾリン−5−オン等が好ましい。
【0023】
カプラーとしては、Ann.Clin.Biochem.6,24−27(1969)、特公昭55−25840号、特公昭58−45599号、特公昭58−18628号、特開昭55−164356号、特開昭56−124398号、特開昭56−155852号等に記載のフエノール;2−ヒドロキシ−1−ベンゼンスルホン酸、4−ヒドロキシ−1−ベンゼンスルホン酸、3,5−ジクロロ−2−ヒドロキシ−1−ベンゼンスルホン酸、2−ヒドロキシ−3−メトキシ−1−ベンゼンスルホン酸等のフエノールスルホン酸(アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を含む);1−ナフトール、2−ナフトール;1,7−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキシナフタレン;1−ヒドロキシ−2−ナフタレンスルホン酸、1−ヒドロキシ−4−ナフタレンスルホン酸等のナフトールスルホン酸(アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を含む);その他のフエノールまたはナフトール誘導体がある。これらの化合物のうちでは、1,7−ジヒドロキシナフタレン、1−ヒドロキシ−2−ナフタレンスルホン酸(Na塩、K塩、Li塩を含む)、3,5−ジクロロー2−ヒドロキシー1−ベンゼンスルホン酸(Na塩、K塩、Li塩を含む)が好ましい。
【0024】
ロイコ色素としては、特公昭57−5519号に記載の2−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフエニル)−4,5 −ビス〔4−(ジメチルアミノ)フエニル〕イミダゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素;特開昭59−193352号に記載の2−(3,5−ジメトキシー4−ヒドロキシフエニル)−4−〔4−(ジメチルアミノ)フエニルト5−フエネチルイミダゾール等のジアリールイミダゾールロイコ色素;特開昭61−4960号に記載の2−(2−フエニルー3−インドリル)−4,5−ジ「4−(ジメチルアミノ)フエニルイミダゾール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素;特開昭61−229868号に記載の2−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフエニル)−3−アセチル−4,5−ビス〔4−(ジエチルアミノ)フエニル〕イミダゾール等のトリアリールモノアシルイミダゾールロイコ色素;2−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフエニル)−3−メチル−4,5−ビス〔4−(ジエチルアミノ)フエニル〕イミダゾール等のトリアリールモノアルキルイミダゾールロイコ色素等がある。
【0025】
当該乾式分析要素に用いることができる光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル(例、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等)等のポリマーからなる厚さ約50μmから約1mm、好ましくは約80μmから約300μmの範囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる検出層あるいはその他の層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面に物理的(たとえばグロー放電、コロナ放電)あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。
【0026】
当該分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の上に(場合によっては下塗層等の他の層を介して)吸水層を設けることができる。吸水層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しない層で、水を吸収して膨潤する親水性ポリマーから成る。吸水層に用いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約1.5から約20、好ましくは約2.5から15の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。例として、ゼラチン(例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン等)アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。吸水層の乾燥時の厚さは通常約1μmから約100μmの範囲、好ましくは約3μmから30μmの範囲である。吸水層には、必要に応じて界面活性剤(カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性)や緩衝剤を含有させることもできる。
【0027】
当該分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の上に(場合によっては下塗層等の他の層を介して)検出層を設けることができる。検出層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層である。検出層は、吸水層と同種の親水性ポリマーにより構成することができる。検出層には、硬膜剤、界面活性剤(カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性)、緩衝剤、光遮蔽性(反射性または吸収性)微粒子を必要に応じて含有させることができる。
【0028】
吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の上には、展開層を接着し積層するための接着層を設けてもよい。接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤したときに展開層を接着することができるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層に用いることができる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いられると同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μmから約20μm、好ましくは約1μmから約10μmの範囲である。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層等の上に塗布する方法により設けることができる。
【0029】
当該分析要素の試薬層その他の層に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やBiochemistry誌 第5巻(第2号)、467ページより477ページ(1966年)に記載されているグッド(Good)の緩衝剤などがある。これらの緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎実験法』(堀尾武一、他著、南江堂、1981年)等の公知文献を参考にして選択し、使用することができる。
【0030】
光遮蔽層は、親水性ポリマーをバインダーとして、光反射性微粒子が分散されている水浸透性の層であることが好ましい。光反射性微粒子は、試薬層(または吸水層)に生じた検出可能な変化(色変化、発色等)を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。光反射性を有する微粒子の例としては、顔料微粒子たとえば二酸化チタン微粒子(ルチル型、アナターゼ型またはブルッカイト型の、粒子径が約0.1μmから約1.2μmの微結晶粒子等)、硫酸バリウム微粒子等を挙げることができる。好ましいのはルチル型二酸化チタン微粒子である。親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の吸水層に用いられる種類の親水性ポリのほか、弱親水性の再生セルロース等を挙げることができる。これらのうちゼラチン、ポリアクリルアミド等が好ましい。なおゼラチン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加することができる。光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により吸水層、試薬層等の上に塗布し乾燥することにり設けることができる。
【0031】
当該分析要素には、必要に応じ展開層中にも上記のごとき光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。展開層は、液体計量作用を有する展開層であるとが好ましい。液体計量作用を有するとは、その表面に点着供給された液体試料を、その中に含有している部分を実質的に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用を有することである。
【0032】
展開層のマトリックスを構成する材料としては、紙、不織布、織物生地(例えばブロード等の平織等)、編物生地(例、トリコット編、ダブルトリコット編等)、ブラッシュポリマーより形成されるメンブランフイルター、あるいはポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用いることができる。これらのうちでは、織物生地および編物生地に代表される繊維質層が好ましい。これらの詳細については特開昭55−164356号、同57−66359号および同60−222769号を参照すればよい。これらの織物生地や編物生地は水洗等の脱脂処理により糸、織物あるいは編物の製造時等に付着した油脂類が実質的に除去されていることが好ましい。
【0033】
これらの層は、水溶性高分子例えばゼラチンを含む水溶液を塗布することにより、あるいは不織布等をラミネートすることにより、積層することができる。
【0034】
酵素及び二糖類は、同じ層に含有させることが好ましい。総コレステロール用スライド、CPK用スライドにおいては、特に展開層に含有させることが好ましい。この場合には、酵素及び二糖類を含有する溶液を展開層の上に塗布、乾燥することで製造できる。
【0035】
酵素及び二糖類を含有する溶液を塗布後乾燥する場合には、乾燥条件は重要であり、一般的には室温付近〜70℃の温風を当てて乾燥する。例えば、温度30〜70℃、露点0〜10℃に調整された温風を用いることができる。
【0036】
この乾燥温度は製造する乾式分析要素によっても異なる。例えば、総コレステロールの定量に用いる分析要素においては約30〜70℃、好ましくは約40〜70℃、更に好ましくは約55〜70℃である。一方、CPKの定量に用いる分析要素においては約30〜70℃、好ましくは約30〜45℃の範囲である。
【0037】
本発明で製造される一体型多層分析要素は、一辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズ円形等の小片に裁断し、特開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭56−125424号、実開昭55−32350号および特表昭58−501144号公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スライドとして用いることができる。
【0038】
また、特開平6−50959号、同6−273424号公報等に開示された、スライド枠を有しない分析要素にも適用することができる。
【0039】
本発明で製造される乾式分析要素は、約5μlから約30μl、好ましくは約8μlから約15μlの水性液体試料を展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45℃、好ましくは35℃から40℃の範囲の実質的に一定の温度でインキュベーションする。その後、一方の側から(一体型多層分析要素においては光透過性支持体側から)乾式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測定対象成分を分析する。
【0040】
以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0041】
【実施例】
実施例1
〔総コレステロール測定用分析要素の作成〕
ゼラチン下塗りを施されている厚さ180μmの無色透明のPET(ポリエチレンテレフタレート)平滑フィルムの上に、下記組成のロイコ色素溶液を塗布(190cc/m2)、乾燥し、乾燥厚さ約20μmの発色試薬層を形成した。
【0042】
ゼラチン 25g/m2
下記に示したロイコ色素 474mg/m2
【0043】
【化1】
【0044】
上記発色試薬層の上に下記組成の水溶液を塗布(50cc/m2)、乾燥し、乾燥厚さ約3μmの反射層を形成した。
【0045】
ゼラチン 3g/m2
酸化チタン 930mg/m2
フェロシアン化カリウム 712mg/m2
【0046】
上記反射層に約30mg/m2の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、50デニール相当のPET紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編物布地(厚さ約250μm)を軽く圧力をかけて重ね合わせ、乾燥させて編物布地展開層を形成した。
【0047】
こうして形成した展開層に、下記組成になるように試薬を水溶液とした酵素含有水溶液、及び当該水溶液にm2あたりの含量が各0.75、1.5、4.5、9.0もしくは15.0gとなるようにトレハロースを添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ(150cc/m2)、温度60℃、露点10℃に調整した温風を当てて乾燥して、総コレステロール測定用分析要素を作成した。
【0048】
ペルオキシダーゼ 43500U/m2
コレステロールエステラーゼ 2300U/m2
コレステロールオキシダーゼ 4600U/m2
アスコルビン酸オキシダーセ 13000U/m2
リン酸カリウム 5g/m2
【0049】
〔スライド保存性能の評価〕
上記の分析要素を湿度10%の環境下でアルミニウムラミネート袋内に密封包装し、45℃で7日保管した後、総コレステロール量200mg/dlの液を10μl点着し、密閉容器内で37℃に保った際の6分後の反射光学濃度(ODr(6))を、波長505nmで測定した。図1に、45℃で7日間保管前のスライドでのODr(6)に対する45℃で7日間保管後のスライドでのODr(6)の比とトレハロース含量との関係を示す。
【0050】
図1から、本発明になる総コレステロール分析要素は、従来の分析要素と比べて経時保存性能が優れていることが明らかである。
【0051】
また、図2に45℃7日間保管する前の分析要素について、トレハロース含量とODr(6)との関係を示す。これから、保管前の分析要素においては、トレハロースを添加しなくても十分な性能を示していることが判る。
【0052】
実施例2
実施例1と同様にして、PETフィルムの上に発色試薬層、反射層を形成し、その上に、実施例1と同様にして編物布展開層を形成した。次いで実施例1で調製したと同じ組成の酵素含有水溶液を調製し、当該液及び当該液にグルコース、マンニトール、シュクロース、マルトース、トレハロースを、m2当たりの含量が各4.5gとなるように添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ(150cc/m2)、実施例1と同様の条件で乾燥して、各種の総コレステロール測定用分析要素を作成した。
【0053】
上記のようにして作成した各分析要素を45℃で7日間保管した後、実施例1と同様の方法で保存性能を評価した。結果を図3に示す。
【0054】
図3より、総コレステロール分析要素に二糖類を添加すると保存性能が良化し、中でもトレスロースの効果が大きいことが判る。
【0055】
実施例3
〔クレアチンキナーゼ測定用分析要素の作成〕
ゼラチン下塗りを施されている厚さ180μmの無色透明のPET平滑フィルムの上に、下記組成のフォルマザン染料前駆体溶液を塗布(163cc/m2)、乾燥し、乾燥厚さ約20μmの発色試薬層を形成した。
【0056】
ゼラチン 20g/m2
下記に示したフォルマザン染料前駆体 800mg/m2
【0057】
【化2】
【0058】
上記発色試薬層に約30mg/m2の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、50デニール相当のPET紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編物布地(厚さ約250μm)を軽く圧力をかけて重ね合わせ、乾燥させて編物布地展開層を形成した。
【0059】
こうして形成した展開層に、下記組成になるように試薬を水溶液とした酵素含有水溶液、及び当該水溶液にm2あたりの含量が各1.3、6.3gとなるように二糖類を添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ(126cc/m2)、温度35℃、露点0℃に調整した温風を当てて乾燥して、クレアチンキナーゼ測定用分析要素を作成した。
【0060】
ヘキソキナーゼ 9762U/m2
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ 13938U/m2
ジアホラーゼ 1132U/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ 4993U/m2
クレアチンリン酸 1.85g/m2
【0061】
上記の様にして作成した各分析要素を45℃で74日間保管したものに、クレアチンキナーゼを70U/l含有する液を各10μl点着し、引き続き密閉容器中で37℃に保った際の540nmにおける吸光度を、2.5分及び4.0分において測定し、その変動を算出した。結果を図4に示す。
【0062】
また、二糖類としてシュクロースを用いた分析要素に含まれる酵素G6PDHの残存活性の変化を図5に示す。
【0063】
上記結果から、本発明になるクレアチンキナーゼ分析要素は、従来のクレアチンキナーゼ分析要素に比べて保存性能が優れていることが明らかである。
【0064】
【発明の効果】
本発明により、保存性能の優れた酵素含有乾式分析要素が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 総コレステロール分析要素に含有されるトレハロースの量と分析要素の保存前後の発色濃度(ODr(6))比の関係を示す。
【図2】 経時保存をする前の分析要素について、トレハロースの量と発色濃度(ODr(6))との関係を示す。
【図3】 各種二糖類を含有する総コレステロール分析要素の保存性能を示す。
【図4】 クレアチンキナーゼ分析要素の保存性に対する二糖類添加の効果を示す。
【図5】 クレアチンキナーゼ分析要素における保存中の酵素活性の低下に対するシュクロース添加の効果を示す。
Claims (7)
- 透明支持体上に少なくとも発色試薬層と展開層を有する乾式分析要素の製造方法において、該展開層に少なくとも酵素及び二糖類を含有する水溶液を供給し、約30〜70℃の温風を当てて乾燥することを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
- 請求項1において、該酵素がペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼであり、かつ、該二糖類がトレハロース、シュクロース及びマルトースから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
- 該温風が約40〜70℃であることを特徴とする請求項1もしくは請求項2記載の乾式分析要素の製造方法。
- 該温風が約55〜70℃であることを特徴とする請求項1もしくは請求項2記載の乾式分析要素の製造方法。
- 請求項1において、該酵素がヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼであり、かつ、該二糖類がシュクロースであることを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
- 該温風が約30〜45℃であることを特徴とする請求項1もしくは請求項5記載の乾式分析要素の製造方法。
- 請求項1、請求項2、請求項3、請求項4、請求項5もしくは請求項6に記載の方法で製造されたことを特徴とする乾式分析要素。
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