JPH045436B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵
素を作用させることを特徴とする光学活性なアル
コールの新規な製造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

光学活性アルコールは医薬、農薬、生理活性物
質の合成中間体および強誘電性材料に用いられて
いる。たとえば４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシ
ブタン酸エチルの誘導体であるＤ−カルニチンは
カルニチンアセチルトランスフエラーゼを拮抗的
に阻害するような生理活性を有する。また光学活
性なＲ−（−）−２−オクタノールや２−メチル−
４（Ｓ）−ヒドロキシペンタンは強誘電性材料の素
材に用いることができる。

従来、ケトン化合物を光学活性なアルコールに
変換する方法としては、化学触媒を用いる方法、
あるいは生体触媒を用いる方法が知られている。
化学触媒を用いる方法はNaBH₄やLiAlH₄を用い
て還元した場合、光学収率が非常に低くラセミ体
ができる。すなわちこのラセミ体を酒石酸やＤ−
マンデル酸のような光学分割剤を用いて光学分割
したのち、光学活性なアルコールを得るという繁
雑なステツプを踏まざるを得ない。また最近では
光学活性な配位子を持つたキラル触媒を用いて光
学活性なアルコールを得ようと試みられている
が、極低温で反応する必要のあることやキラル触
媒が高価でかつ再生が困難であることが問題とな
つている。

一方、微生物、植物、動物などの生体触媒を用
いる方法は、一般に光学収率が高いという利点を
有する。たとえば４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキ
シブタン酸エチルは「アニユアル・ニユーヨー
ク・アカデミツク・サイエンス434巻、186−193
（1984）」に記載されているように、種々の微生物
によつて発酵生産されることが明らかになつてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

このように化学触媒を用いて光学活性なアルコ
ールを合成するのは、現在のところ技術的に困難
な問題が横たわつている。一方、微生物による発
酵生産の方法では原料あるいは生産物による菌体
の成育阻害が起こるため、原料を多く仕込めない
という問題点がある。また発酵液から生産物を採
取する際、副産物を除去しなければならないなど
精製に手間がかかるという問題点がある。

本発明の目的は、このような問題点を解決し、
副産物が少く、効率よく光学活性アルコールを製
造する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは微生物由来の酵素を用いて、光学
活性なアルコールを製造する方法を鋭意検討した
結果、3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を
用いれば効率よくケトン化合物を光学活性なアル
コールに変換することを見い出し、本発明を完成
した。

即ち、本発明は、3α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素を用いて、一般式〔１〕 （式中、R₁はメチル基又はハロゲン置換メチル
基を、R₂は炭素数１〜５のアルキル基を示す）、
または、一般式〔２〕 （式中、ｎは１〜10の整数を示す）で示されるケ
トン化合物を光学活性アルコールに変換すること
を特徴とする光学活性アルコールの製造方法であ
る。

本発明に使用する3α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素（以後3α−HSDHと略す）は、セル
ロモナス・ツルバタKE31株〔微工研菌寄第9059
号〕由来のものが好ましい、これに限定されな
い。この酵素は、特願昭62−69598号に記載され
ている精製法によつて純品のものが得られる。こ
の純品の酵素はもちろん使用することができる
が、硫安分画あるいはDEAE−セフアロースクロ
マトグラフイーで得られる半精製品も使うことが
できる。このような酵素を用いて光学活性なアル
コールを製造するにあたり、例えば精製酵素0.01
〜200mgをPH5.5〜8.0、好ましくはPH6.5〜7.5の
0.1Mリン酸緩衝液１mlにとかし、原料のケトン
化合物（例えば４−クロロアセト酢酸エチル、２
−オクタノン、メチルイソブチルケトンなど）お
よび原料と等モルの還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH）を添加する。この
反応では、添加したNADHは酸化されてニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）にな
るため、生産物と等モルのNADHを加える必要
がある。しかし、高価なNADHを有効に利用す
るためには、NADをNADHにするような酵素、
例えばグルコース脱水素酵素（以下GDHと略す、
アマノ製薬社製）や耐熱性のグルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素（ユニチカ社製）、蟻酸脱水素酵
素（天野製薬社、ベーリンガー社、メルク社製な
ど）、あるいは3α−HSDH（KE3株由来精製酵素
やシグマ社製）などを共存させれば原料の1/10〜
１／１００００モルのNAD（Ｈ）を添加するだけで反応
させることもできる。ケトン化合物の添加量は、
その種類によつて異なるが、酵素重量の約10〜
1000倍である。これらを加えて、15〜40℃、好ま
しくは25〜35℃で１時間から１週間攪拌しながら
反応を行う。反応液にアエロゾルOTやツイーン
80などの界面活性剤を添加した場合、より効率良
く反応させることができる。またDEAE−セフア
ロースやデユオライトA561のようなイオン交換
樹脂を反応系に加えることによつて、反応速度を
向上させたり酵素を安定に保ちながら反応を続け
ることもできる。反応の経時変化をガスクロマト
グラフイー（PEG2キヤピラリーカラム、25ｍ、
50→150℃、10℃／minで昇温分析）で追跡し、
原料がほぼ失くなつた時点で反応を止め、遠心分
離することによつて、水層を分け生成物を採取す
る。回収率を高めるためには水中に溶けている生
産物を酢酸エチル、ヘキサン、ジエチルエーテ
ル、１，２−ジクロロエタン、クロロホルムなど
の溶媒を用いて抽出する。精製品が必要であれ
ば、これらの生産物を蒸留等によつて精製し、目
的の光学活性なアルコールを得ることができる。

〔実施例〕

実施例 １ 光学活性４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブタ
ン酸エチルの製法 0.2MNaclを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
18mlに1.5ｇ（8.33ミリモル）のグルコース、７
mgの3α−HSDH（KE31株由来の精製酵素、
20U／mg蛋白）、NADH再生用酵素として2.5mgの
GDH（40U／mg蛋白）および191mg（0.25ミリモ
ル）のNADHを溶かし、これに1.2ｇ（7.29ミリ
モル）の４−クロロアセト酢酸エチルを添加して
良く攪拌しながら20℃で反応した。反応が進むに
つれてPHが低下するので、1MのNa₂CO₃でPHを
7.0に調整し反応を続けた。3.5時間反応後、反応
液に酢酸エチル（20ml／２回）を加えて生成物を
抽出した。抽出液にNa₂SO₄を入れて水分を除去
した後、さらにモルキユラーシーブを加えて乾燥
した。標品に混在する酢酸エチルを減圧下で除去
し、750mg（4.5ミリモル）の４−クロロ−３−ヒ
ドロキシブタン酸エチルを得た。これを３，５−
ジニトロフエニルイソシアネート（以下DNPIと
略す）で誘導体化したあと液体クロマトグラフイ
ー（カラム：OA−2100、住友化学製、溶媒：ヘ
キサン／クロロホルム／エタノール＝50／15／
１、流速１ml／ｍin）によつて分析した。上述の
酵素反応によつて生成した３−ヒドロキシン体中
には99.1％の４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブ
タン酸エチルと0.9％の４−クロロ−３（Ｒ）−ヒ
ドロキシブタン酸エチルが含まれており、３（Ｓ）
−ヒドロキシ体が優先的に生成した。４−クロロ
−３（Ｓ）−ヒドロキシブタン酸エチルの収率は62
％であつた。

実施例 ２ 光学活性４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブタ
ン酸エチルの製法 NADH再生用酵素として3α−HSDH（実施例
１と同様の精製酵素）、NADH再生用基質として
メチルイソブチルカルビノールを用いた。25μ
の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に2.33mgの3α−
HSDHおよび25μの５ｍＭ NADH（0.125μモ
ル）を加えて溶解し、260μメチルイソブチル
カルビノールおよび40μ（295μモル）の４−ク
ロロアセト酢酸エチルを加えて攪拌しながら30℃
で反応した。反応開始後66時間目に40μの４−
クロロアセト酢酸エチル、21時間目には40μの
４−クロロアセト酢酸エチルおよび260μのメ
チルイソブチルカルビノール、10μのリン酸緩
衝液を加えて、さらに60時間反応を続けた（総反
応時間は81時間）。反応終了後、ガスクロマトグ
ラフで分析した結果、810μモルの３−ヒドロキ
シ体が生成していた。この溶液に混在するメチル
イソブチルカルビノール、メチルイソブチルケト
ンを減圧下40℃で除去したあと、施光度の測定及
び液体クロマトグラフによつて異性体純度の測定
を行つた。クロロホルムに溶かした場合の比旋光
度は［α］²⁵ ₅₈₉＝−20.63degであり４−クロロ−３
（Ｓ）−ヒドロキシブタン酸エチルが優先的に生成
していた。またDNPIで誘導体化した標品を液体
クロマトグラフで分析した結果、99％の４−クロ
ロ−33（Ｓ）−ヒドロキシブタン酸エチルと１％の
４−クロロ−３（Ｒ）−ヒドロキシブタン酸エチル
が生成していた。４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキ
シブタン酸エチルの収率は91％であつた。

実施例 ３ 光学活性４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブタ
ン酸エチルの製法 酵素の反応速度および安定性を高めるために70
mgの膨潤状態のDEAE−セフアロースを添加し
て、実施例２と同様にして反応を行なつた。反応
終了液をガスクロ分析したところ860μモルの３
−ヒドロキシ体が生成していた。またメチルイソ
ブチルカルビノール、メチルイソブチルケトンを
除去したあと、旋光度の測定および液体クロマト
グラフによつて異性体純度の測定を行つた。クロ
ロホルム中におけ比旋光度は［α］²⁵ ₅₈₉＝−
20.71degであり４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシ
ブタン酸エチルが優先的に生成していた。また
DNPI誘導体を液体クロマトグラフで分析した結
果、99.2％の４−クロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブ
タン酸エチルと0.8％の４−クロロ−３（Ｒ）−ヒ
ドロキシブタン酸エチルが生成していた。４−ク
ロロ−３（Ｓ）−ヒドロキシブタン酸エチルの収率
は97％であつた。

実施例 ４ 光学活性Ｒ−（−）−２−オクタールの製法 0.2M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
１mlに0.51ｇ（2.83ミリモル）のグルコース、１
mgの3α−HSDH（KE31株由来の精製酵素、2.6mg
のGDHおよび10mgのNADH（13μモル）を溶か
し、これに0.1ml（82mg、640μモル）の２−オク
タノンを添加して２℃で反応を行つた。反応と共
にPHは低下するので絶えずスターラーで攪拌し、
1MのNa₂CO₃でPH7.0に調整しながら反応させた。
15時間反応後（途中６時間目に１mgのGDHおよ
び６mgのNADHをさらに添加した）、反応液に
１，２−ジクロロエタン（1.5mm×２回）を加え
て生産物を抽出した。遠心分離後１，２−ジクロ
ロエタン層（油層）回収し、ガスクロマトグラフ
を用いて分析した。油層中には64mg（490μモル）
の２−オクタノールが生成していた。この標品の
旋光度を測定したところ、比旋光度［α］²⁵ ₅₈₉＝−
6.7degであり、Ｒ体が優先的に生成していた。一
方、純品のＲ−（−）−２−オクタノールの比旋光
度は［α］²⁵ ₅₈₉＝−9.745degであつた。次に前述の
油層に1.6ｇのNa₂SO₄を加えて１夜、攪拌したの
ち0.3ml採取してモルキユラシーブを入れてさら
に１夜放置した。この液に33mgのDNPIを加えて
よく攪拌し、さらに30μの乾燥ピリジンを加え
て攪拌したのち４時間放置した。この誘導体を液
体クロマトグラフイーで分析したところ、生成し
た２−オクタノールのうち84.5％はＲ−（−）−２
−オクタノールであり、15.5％はＳ−（＋）−２−
オクタノールであつた。Ｒ−（−）−２−オクタノ
ールの収率は67％であつた。

実施例 ５ 光学活性２−メチル−４（Ｓ）−ヒドロキシペン
タンの製法 0.1M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
2.8mlに1.99ｇ（11.1ミリモル）のグルコース、
2.6mgの3α−HSDH（K31E株由来精製酵素）、2.7
mgのGDHおよび20mgのNADH（26μモル）を溶か
し、これに0.6ml480mg、4.97ミリモル）のメチル
イソブチルケトンを添加してPH7.0に調整しなが
ら25℃で反応を行なつた。15時間反応後（途中６
時間目に２mgのGDHおよび12mgのNADHをさら
に添加した）、反応液に１，２−ジクロロエタン
（2.5ml×２回）を加えて抽出し、遠心分離して
１，２−ジクロロエタン層（油層）を回収した。
これをガスクロマトグラフで分析したところ215
mgのメチルイソブチルカルビノールが生成してい
た。この標品の旋光度を測定したところ、比旋光
度［α］²⁵ ₅₈₉＝＋0.127degであつた。またDNPIで
誘導体化した後、液体クロマトグラフによつて、
異性体の純度を測定した結果、２−メチル−４
（Ｓ）−ヒドロキシペンタンは62.4％、２−メチル
−４（Ｒ）−ヒドロキシペンタンは37.6％含まれて
おり、４（Ｓ）−ヒドロキシ体が優先的に生成して
いた。２−メチル−４（Ｓ）−ヒドロキシペンタン
の収率は27.8％であつた。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、副産物が少なく効よく、
光学活性アルコールを製造することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を用
   いて、一般式〔１〕 （式中、R₁はメチル基又はハロゲン置換メチル
   基を、R₂は炭素数１〜５のアルキル基を示す）、 または、一般式〔２〕 （式中、ｎは１〜10の整数を示す） で示されるケトン化合物を光学活性アルコールに
   変換することを特徴とする光学活性アルコールの
   製造方法。 ２ 3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素がセ
   ルロモナス属由来の酵素である請求項１記載の製
   造方法。