JPH0753116B2 - 光学活性なシアンヒドリンの酵素的製造方法 - Google Patents
光学活性なシアンヒドリンの酵素的製造方法Info
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- JPH0753116B2 JPH0753116B2 JP1015199A JP1519989A JPH0753116B2 JP H0753116 B2 JPH0753116 B2 JP H0753116B2 JP 1015199 A JP1015199 A JP 1015199A JP 1519989 A JP1519989 A JP 1519989A JP H0753116 B2 JPH0753116 B2 JP H0753116B2
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/002—Nitriles (-CN)
- C12P13/004—Cyanohydrins
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、オキソ化合物とシアン化水素酸とをオキシニ
トリラーゼの存在下に酵素的に反応させることによる光
学活性なシアンヒドリンの製造方法に関する。
トリラーゼの存在下に酵素的に反応させることによる光
学活性なシアンヒドリンの製造方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） アルデヒドまたはケトンからオキシニトリラーゼ触媒作
用により形成されるような光学活性なシアンヒドリン
は、例えばｍ−フェノキシベンズアルデヒドの誘導体お
よび置換された類似体のように、光安定性ピレトロイデ
ンを合成するための構成物質として用いられる。
用により形成されるような光学活性なシアンヒドリン
は、例えばｍ−フェノキシベンズアルデヒドの誘導体お
よび置換された類似体のように、光安定性ピレトロイデ
ンを合成するための構成物質として用いられる。
さらに当該シアンヒドリンは光学活性なα−ヒドロキシ
カルボン酸の合成に使用されている。これらはまた、食
料へのまたは薬剤学的作用物質、ビタミンおよび液晶を
製造する際の添加物として使用されている。
カルボン酸の合成に使用されている。これらはまた、食
料へのまたは薬剤学的作用物質、ビタミンおよび液晶を
製造する際の添加物として使用されている。
これらの光学活性なα−ヒドロキシカルボン酸は、F.Ef
fenbergerら,Angew.Chem.95（1983）No.1,第50頁に従っ
て、製造が非常に困難なＮ−置換の光学活性なα−アミ
ノ酸に有利に変換され得る。
fenbergerら,Angew.Chem.95（1983）No.1,第50頁に従っ
て、製造が非常に困難なＮ−置換の光学活性なα−アミ
ノ酸に有利に変換され得る。
同様に、光学活性なシアンヒドリンから、光学活性なα
−アミノアルコールやさらにそれから誘導できる、作用
物質合成に重要な光学活性な化合物が容易に入手でき
る。
−アミノアルコールやさらにそれから誘導できる、作用
物質合成に重要な光学活性な化合物が容易に入手でき
る。
ドイツ連邦共和国特許第1,300,111号明細書から、アル
デヒドをオキシニトラーゼの存在下にシアン化水素酸と
反応させる、光学活性な（Ｒ）−シアンヒドリンの製造
方法が既に知られている。この既知の方法によれば、当
該反応は水性または水アルコール性（50％V/V）反応環
境中でpH値5.4（あるいは4.8〜5.4;Beckerら,JACS1966
第4299頁参照）で、即ち5.6〜６の間にある酵素活性のp
H最適条件より僅かに低いpHで、行われる。この方法に
より得られる（Ｒ）−シアンヒドリンの光学純度は確か
に唯一の欠点である。
デヒドをオキシニトラーゼの存在下にシアン化水素酸と
反応させる、光学活性な（Ｒ）−シアンヒドリンの製造
方法が既に知られている。この既知の方法によれば、当
該反応は水性または水アルコール性（50％V/V）反応環
境中でpH値5.4（あるいは4.8〜5.4;Beckerら,JACS1966
第4299頁参照）で、即ち5.6〜６の間にある酵素活性のp
H最適条件より僅かに低いpHで、行われる。この方法に
より得られる（Ｒ）−シアンヒドリンの光学純度は確か
に唯一の欠点である。
F.Effenbergerら（Angew.Chem.99（1987）第491−２
頁）は、酵素触媒的付加に加えて平行して起こる、ラセ
ミ化合物へ誘導する、シアン化水素酸のアルデヒド基へ
の化学的付加を極力抑制することを顧慮して、水アルコ
ール系でpH値、温度および濃度を変えて酵素的にシアン
ヒドリンを形成することを研究している。このようにし
ても満足できる最善の状態にする条件を見出すことがで
きなかったので、F.Effenbergerらは化学的反応を水と
混合し得ない有機溶剤の使用により抑制することを提案
している。特に、エチルアセタートを用い、担体に固定
した（Ｒ）−オキシニトリラーゼを使用して行なわれ
た。この方法で高い光学純度を有する生成物が得られた
が、特に酵素の活性と安定性がこの環境で低下するの
で、純粋な有機環境におけるこの反応は方法技術上確か
に不利である。
頁）は、酵素触媒的付加に加えて平行して起こる、ラセ
ミ化合物へ誘導する、シアン化水素酸のアルデヒド基へ
の化学的付加を極力抑制することを顧慮して、水アルコ
ール系でpH値、温度および濃度を変えて酵素的にシアン
ヒドリンを形成することを研究している。このようにし
ても満足できる最善の状態にする条件を見出すことがで
きなかったので、F.Effenbergerらは化学的反応を水と
混合し得ない有機溶剤の使用により抑制することを提案
している。特に、エチルアセタートを用い、担体に固定
した（Ｒ）−オキシニトリラーゼを使用して行なわれ
た。この方法で高い光学純度を有する生成物が得られた
が、特に酵素の活性と安定性がこの環境で低下するの
で、純粋な有機環境におけるこの反応は方法技術上確か
に不利である。
従って、本発明の目的は、水性環境で行われ、それにも
かかわらず高い光学純度を得ることができるシアンヒド
リンの酵素的製造方法を提供することである。
かかわらず高い光学純度を得ることができるシアンヒド
リンの酵素的製造方法を提供することである。
（課題を解決するための手段） この目的を達成する本発明による方法は、脂肪族、芳香
族またはヘテロ芳香族とアルデヒドまたはケトンから誘
導された（Ｒ）−シアンヒドリンまたは（Ｓ）−シアン
ヒドリンを、対応するオキソ化合物とシアン化水素酸と
を純粋な水性環境中で（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（4.
1.2.10）またはオキシニトリラーゼ（4.1.2.11）の存在
下に、化学的競合反応とラセミ化が酵素的合成に比べて
無視できるような酸性条件下でかつ−５〜＋50℃の温度
で反応させることにより製造することを特徴とする。
族またはヘテロ芳香族とアルデヒドまたはケトンから誘
導された（Ｒ）−シアンヒドリンまたは（Ｓ）−シアン
ヒドリンを、対応するオキソ化合物とシアン化水素酸と
を純粋な水性環境中で（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（4.
1.2.10）またはオキシニトリラーゼ（4.1.2.11）の存在
下に、化学的競合反応とラセミ化が酵素的合成に比べて
無視できるような酸性条件下でかつ−５〜＋50℃の温度
で反応させることにより製造することを特徴とする。
Sorghum biocolor由来のオキシニトリラーゼ（4.1.2.1
1）は例えばE.Bove′らによってJ.Biol.Chem.236（196
1）207に記載されている。しかしながら、光学手に純粋
なＳ−シアンヒドリンの製造に関する該オキシニトリラ
ーゼの有効性は従来知られていなかった。以下、このオ
キシニトリラーゼを（Ｓ）−オキシニトリラーゼと略称
する。
1）は例えばE.Bove′らによってJ.Biol.Chem.236（196
1）207に記載されている。しかしながら、光学手に純粋
なＳ−シアンヒドリンの製造に関する該オキシニトリラ
ーゼの有効性は従来知られていなかった。以下、このオ
キシニトリラーゼを（Ｓ）−オキシニトリラーゼと略称
する。
驚くべきことに、該酵素のシアンヒドリン合成に関する
活性は、比較的低いpH値で確かに低下するがなお十分で
あり、その際シアン化水素の化学的付加および形成され
た生成物のラセミ化反応が抑制され得ることが見出され
た。更に、それぞれの最適pH範囲は用いられた基質によ
ってある一定の範囲に決まり、その際一般的には最大約
4.5までのpHが望ましい。
活性は、比較的低いpH値で確かに低下するがなお十分で
あり、その際シアン化水素の化学的付加および形成され
た生成物のラセミ化反応が抑制され得ることが見出され
た。更に、それぞれの最適pH範囲は用いられた基質によ
ってある一定の範囲に決まり、その際一般的には最大約
4.5までのpHが望ましい。
酵素活性は少量の有機溶剤（例えばエタノール）の存在
だけでもかなり低下するので、オキソ化合物とシアン化
水素酸との反応は、いかなる溶剤も添加しないで、純粋
な水性環境中で行なわなければならない。
だけでもかなり低下するので、オキソ化合物とシアン化
水素酸との反応は、いかなる溶剤も添加しないで、純粋
な水性環境中で行なわなければならない。
カルボニル化合物の化学的反応性および酵素に対するそ
の親和性は、pH値を温度に応じてどれほど低下すること
ができるか、それと共に化学的シアンヒドリン合成を酵
素的合成と比較してどれほど無視することができるか決
定する。2.8未満のpH値は、この場合オキシニトリラー
ゼが速やかに不活性化されるのでもちろん不適当であ
る。
の親和性は、pH値を温度に応じてどれほど低下すること
ができるか、それと共に化学的シアンヒドリン合成を酵
素的合成と比較してどれほど無視することができるか決
定する。2.8未満のpH値は、この場合オキシニトリラー
ゼが速やかに不活性化されるのでもちろん不適当であ
る。
純粋な水性環境で行うことはそれぞれの酵素を溶解して
添加することを可能にし配量を著しく容易にする。さら
に、従って、連続的作業、特に酵素膜反応器での連続的
作業は簡単に行なうことができ、そして後処理は、形成
されたシアンヒドリンを水不溶性または水と混和しない
溶剤、例えばメチレンクロリド、クロロホルム、1,2−
ジクロロエタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メチ
ルｔ−ブチルエーテルで抽出することにより、簡単に行
なうことができる。
添加することを可能にし配量を著しく容易にする。さら
に、従って、連続的作業、特に酵素膜反応器での連続的
作業は簡単に行なうことができ、そして後処理は、形成
されたシアンヒドリンを水不溶性または水と混和しない
溶剤、例えばメチレンクロリド、クロロホルム、1,2−
ジクロロエタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メチ
ルｔ−ブチルエーテルで抽出することにより、簡単に行
なうことができる。
本発明による反応の際、酵素活性および酵素の品質保持
は、低下したpH値で、より悪いことが甘受されるが、
（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（4.1.2.10）はPrunus amy
gdalusからそしてオキシニトリラーゼ（4.1.2.11）はSo
rghum bicolorから簡単に入手、購入することができ、
その結果、特に、酵素安定性の低下率はあまり高くない
が（例えば（Ｒ）−オキシニトリラーゼの場合pH3.75、
20℃で１日あたり８％）、増加した量の添加および予備
的な必然的追加は問題なくできる。
は、低下したpH値で、より悪いことが甘受されるが、
（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（4.1.2.10）はPrunus amy
gdalusからそしてオキシニトリラーゼ（4.1.2.11）はSo
rghum bicolorから簡単に入手、購入することができ、
その結果、特に、酵素安定性の低下率はあまり高くない
が（例えば（Ｒ）−オキシニトリラーゼの場合pH3.75、
20℃で１日あたり８％）、増加した量の添加および予備
的な必然的追加は問題なくできる。
本発明により、オキシニトリラーゼに対する基質である
全てのカルボニル化合物（この場合純粋な化合物シアン
ヒドリン形成はpH値を2.8まで低下することにより抑制
され得る）が変換され、（Ｒ）−または（Ｓ）−シアン
ヒドリンが非常に高い光学純度（ee＞99％）で製造され
得る。
全てのカルボニル化合物（この場合純粋な化合物シアン
ヒドリン形成はpH値を2.8まで低下することにより抑制
され得る）が変換され、（Ｒ）−または（Ｓ）−シアン
ヒドリンが非常に高い光学純度（ee＞99％）で製造され
得る。
脂肪族シアンヒドリンの形成に加えて、芳香族アルデヒ
ドの変換、特に、場合により置換されたベンズアルデヒ
ドからの（Ｒ）−または（Ｓ）−マンデル酸ニトリルお
よびその誘導体の製造を特に研究して、その際pH値3.25
で99％ee以上の光学純度が得られた。また、pH値3.75で
光学的合成は抑制され、それ以外同一の条件下で98％ee
以上の光学純度が得られる。
ドの変換、特に、場合により置換されたベンズアルデヒ
ドからの（Ｒ）−または（Ｓ）−マンデル酸ニトリルお
よびその誘導体の製造を特に研究して、その際pH値3.25
で99％ee以上の光学純度が得られた。また、pH値3.75で
光学的合成は抑制され、それ以外同一の条件下で98％ee
以上の光学純度が得られる。
ベンズアルデヒドより低い反応性のカルボニル化合物
は、対応してより高いpH値でエナンチオ選択性の損失な
く変換され得る。このようにフルフラールはそれ以外同
一の条件下で、しかしpH4.0で99％eeの光学純度を有す
るＲ−シアンヒドリンに変換され得る。
は、対応してより高いpH値でエナンチオ選択性の損失な
く変換され得る。このようにフルフラールはそれ以外同
一の条件下で、しかしpH4.0で99％eeの光学純度を有す
るＲ−シアンヒドリンに変換され得る。
反応温度のより広い範囲および／または低下における基
質濃度の変化により、化学的付随反応を阻止することが
付加的に可能であり、その結果可能な最も有利な条件に
対する一定の余地が与えられる。
質濃度の変化により、化学的付随反応を阻止することが
付加的に可能であり、その結果可能な最も有利な条件に
対する一定の余地が与えられる。
本発明により、特に、基質としての脂肪族、芳香族およ
び複素環式アルデヒドまたはケトンを（Ｒ）−オキシニ
トリラーゼの存在下であるいは芳香族またはヘテロ芳香
族アルデヒドまたは同様にケトンを（Ｓ）−オキシニト
リラーゼを用いて変換することができ、光学的に純粋
な、対応するシアンヒドリンの（Ｒ）−または（Ｓ）−
エナンチオマーが形成される。これらのうち特に重要な
ものは、形成されたシアンヒドリンの薬剤学的領域にお
ける使用に関してみれば、芳香族アルデヒドである。
び複素環式アルデヒドまたはケトンを（Ｒ）−オキシニ
トリラーゼの存在下であるいは芳香族またはヘテロ芳香
族アルデヒドまたは同様にケトンを（Ｓ）−オキシニト
リラーゼを用いて変換することができ、光学的に純粋
な、対応するシアンヒドリンの（Ｒ）−または（Ｓ）−
エナンチオマーが形成される。これらのうち特に重要な
ものは、形成されたシアンヒドリンの薬剤学的領域にお
ける使用に関してみれば、芳香族アルデヒドである。
（実施例） 以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
例１〜13に（Ｒ）−エナンチオマーの製造が、例14〜18
に（Ｓ）−エナンチオマーの形成が開示されている。
例１〜13に（Ｒ）−エナンチオマーの製造が、例14〜18
に（Ｓ）−エナンチオマーの形成が開示されている。
例１ ベンズアルデヒド53mg（0.5mmlo）を50mMのシトラート
緩衝液（pH3.25）9.4mlに溶解し20℃にする。ここに
（Ｒ）−オキシニトリラーゼ水溶液125μｌ（約0.25m
g）および4.2MのHCN水溶液475μｌを加える。反応を旋
光測定（λ＝578nm）で追跡する。30〜40分後一定の旋
光度となり、そして反応を終える。その後、反応混合物
を10mlのクロロホルムで４回抽出する。
緩衝液（pH3.25）9.4mlに溶解し20℃にする。ここに
（Ｒ）−オキシニトリラーゼ水溶液125μｌ（約0.25m
g）および4.2MのHCN水溶液475μｌを加える。反応を旋
光測定（λ＝578nm）で追跡する。30〜40分後一定の旋
光度となり、そして反応を終える。その後、反応混合物
を10mlのクロロホルムで４回抽出する。
合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し溶剤を回転蒸
発器除去する。次いで残留物を３回それぞれ10mlのペン
タンで洗浄し生成物を減圧下に乾燥させる。
発器除去する。次いで残留物を３回それぞれ10mlのペン
タンで洗浄し生成物を減圧下に乾燥させる。
化学的収量:61.8mg（理論量の93％） 化学純度：＞99％ee 光学純度の測定は（Ｒ）−マンデル酸ニトリルのN,O−
ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２−アミノ−
１−フェニルエタノール誘導体としてキャピラリーガス
クロマトグラフィでH.Frankら（J.Chromatogr.146，（1
987）,197−206）に従ってキラル分離相に関して行った
（FS−Chirasil−Val,25m★0.32mm）。
ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２−アミノ−
１−フェニルエタノール誘導体としてキャピラリーガス
クロマトグラフィでH.Frankら（J.Chromatogr.146，（1
987）,197−206）に従ってキラル分離相に関して行った
（FS−Chirasil−Val,25m★0.32mm）。
誘導は次のように行う。
１〜2mgのマンデル酸ニトリルを1Mのジボラン溶液250μ
ｌ（テトラヒドロフラン中）でクロロホルム中で室温で
30分間還元する。エタノールを少量適下して過剰のジボ
ランを加水分解し、溶剤を除去した後得られるアミノア
ルコールを直ちに20μｌの無水ペンタフルオロプロピオ
ン酸でメチレンクロニド中で室温で15分間アシル化す
る。次いで過剰の酸無水物を回転蒸発器で除去し、残留
物をメチレンクロリドで再び抽出しガスクロマトグラフ
ィーで分析する。
ｌ（テトラヒドロフラン中）でクロロホルム中で室温で
30分間還元する。エタノールを少量適下して過剰のジボ
ランを加水分解し、溶剤を除去した後得られるアミノア
ルコールを直ちに20μｌの無水ペンタフルオロプロピオ
ン酸でメチレンクロニド中で室温で15分間アシル化す
る。次いで過剰の酸無水物を回転蒸発器で除去し、残留
物をメチレンクロリドで再び抽出しガスクロマトグラフ
ィーで分析する。
例２ 例１と対応してフルフラール48mg（0.5mmol）をpH4.0で
反応させる。約30分後反応を終える。（Ｒ）−シアンヒ
ドリンの単離は例１に記載したように行う。
反応させる。約30分後反応を終える。（Ｒ）−シアンヒ
ドリンの単離は例１に記載したように行う。
化学的収量:55.3mg（理論量の90％） 光学純度:99％ee 光学純度の測定のため、シアンヒドリンを（Ｒ）−α−
メトキシ−α−トリフルオロエチル−フェニル酢酸クロ
リドでD.Elliot,V.M.D.Choi,W.S.Johnson（J.Org.Chem.
48（1983）,2294−2295）に従ってジアステレオマーの
エステルに誘導しジアステレオマー率をキャピラールガ
スクロマトグラフィーで求めた（FS−OV110m★0.32m
m）。
メトキシ−α−トリフルオロエチル−フェニル酢酸クロ
リドでD.Elliot,V.M.D.Choi,W.S.Johnson（J.Org.Chem.
48（1983）,2294−2295）に従ってジアステレオマーの
エステルに誘導しジアステレオマー率をキャピラールガ
スクロマトグラフィーで求めた（FS−OV110m★0.32m
m）。
例３ 例１に対応して、アセトアルデヒド22mg（0.5mmol）をp
H3.25で反応させる。約90分後反応を終える。後処理は
例１と同様に行う。
H3.25で反応させる。約90分後反応を終える。後処理は
例１と同様に行う。
化学的収量:26mg（理論量の73％） 光学純度:76％ee 光学純度の測定はN,O−ビス−ペンタフルオロプロピオ
ニル−１−アミン−２−プロパノールを介して例１に従
って行う。
ニル−１−アミン−２−プロパノールを介して例１に従
って行う。
例４ 例１に対応して３−メチルシクロヘキサノン56mg（0.5m
mol）をpH4.0で反応させる。90分後反応を終える。
mol）をpH4.0で反応させる。90分後反応を終える。
化学的収量:57mg（理論量の83％） 光学純度：測定せず 例５ （Ｒ）−マンデル酸ニトリルの酵素膜反応器（Enzym−M
embran−Reactor:EMR）内での連続的構造 EMR内で当該方法を高められた量を用いて連続的に行
う。EMR（連続作働性撹拌式反応器に相当する）の作業
条件は、生成物の光学純度が損失することなく穏やかな
条件に対応して比較的高いpH値の使用を可能にする。連
続的製造は、限外濾過による生成物の後処理を省くの
で、酵素の経済的利用になる。
embran−Reactor:EMR）内での連続的構造 EMR内で当該方法を高められた量を用いて連続的に行
う。EMR（連続作働性撹拌式反応器に相当する）の作業
条件は、生成物の光学純度が損失することなく穏やかな
条件に対応して比較的高いpH値の使用を可能にする。連
続的製造は、限外濾過による生成物の後処理を省くの
で、酵素の経済的利用になる。
こうして連続的作業法で10mlのEMR内で26時間で7gの光
学的に純粋な（Ｒ）−マンデル酸ニトリル（ee＞99％）
が製造される。
学的に純粋な（Ｒ）−マンデル酸ニトリル（ee＞99％）
が製造される。
作業条件： ベンズアルデヒド： 48 mmol/l HCN: 180 mmol/l シトラート緩衝液： 45 mmol/l pH3.75 滞留時間： 10 分 酵素濃度： 0.38mg/ml 平均変換率： 84 ％ 空時収量 773 g/（ｌ・ｄ） 温度 20℃ 例６ 例１に対応して0.2モル規定のイソブチルアルデヒド溶
液をpH3.6でかつ温度６℃で反応させる。90分後反応を
終える。
液をpH3.6でかつ温度６℃で反応させる。90分後反応を
終える。
化学的収量：理論量の84％ 光学純度:99％ee ［α］20 Ｄ＝＋16.3゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例７ 例１に対応して0.25モル規定のイソバレルアルデヒド溶
液をpH3.7でかつ温度７℃で反応させる。100分後反応を
終える。
液をpH3.7でかつ温度７℃で反応させる。100分後反応を
終える。
化学的収量：理論量の92％ 光学純度:96.8％ee ［α］20 Ｄ＝＋24.20゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例８ 例１に対応して0.25モル規定の３−メチルメルカプトプ
ロピオンアルデヒド溶液をpH3.3でかつ温度５℃で反応
させる。90分後反応を終える。
ロピオンアルデヒド溶液をpH3.3でかつ温度５℃で反応
させる。90分後反応を終える。
化学的収量：理論量の85.5％ 化学純度:97.3％ ▲［α］20 Ｄ▼＝＋40.0゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例９ 例１に対応して0.25モル規定のヒドロ・ケイ皮アルデヒ
ド溶液をpH4.0でかつ温度８℃で反応させる。80分後に
反応を終える。
ド溶液をpH4.0でかつ温度８℃で反応させる。80分後に
反応を終える。
化学的収量：理論量の93.8％ 化学純度:95.1％ee ▲［α］20 Ｄ▼＝−6.2゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例10 例１に対応して0.25モル規定のケイ皮アルデヒド溶液を
pH4.3でかつ温度８℃で反応させる。90分後に反応を終
える。
pH4.3でかつ温度８℃で反応させる。90分後に反応を終
える。
化学的収量：理論量の94％ 光学純度:94.7％ee ▲［α］20 Ｄ▼＝＋23.75゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例11 例１に対応して0.25モル規定のピバリンアルデヒド溶液
をpH3.3でかつ温度６℃で反応させる。90分後に反応を
終える。
をpH3.3でかつ温度６℃で反応させる。90分後に反応を
終える。
化学的収量：理論量の81.4％ 光学純度:85％ee ▲［α］20 Ｄ▼＝＋13.2゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例12 例１に対応して0.2モル規定のブチルアルデヒド溶液をp
H3.5でかつ温度７℃で反応させる。２時間後反応を終え
る。
H3.5でかつ温度７℃で反応させる。２時間後反応を終え
る。
化学的収量：理論量の83％ 光学純度:96.4％ee ▲［α］20 Ｄ▼＝＋13.6゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例13 例１に対応して0.2モル規定のクロトンアルデヒド溶液
をpH3.3でかつ温度５℃で反応させる。２時間後反応を
終える。
をpH3.3でかつ温度５℃で反応させる。２時間後反応を
終える。
化学的収量：理論量の82％ 光学純度:97.5％ee ▲［α］10 Ｄ▼＝＋25.2゜（ｃ＝５（CHCl3中）） 例14 ｐ−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド52mg（0.5mmol）を5
0mMのシトラート緩衝液（pH3.75）9.4mlに溶解し20℃に
する。ここに（Ｓ）−オキシニトリラーゼ溶液500μｌ
および4.2MのHCN水溶液800μｌを加える。
0mMのシトラート緩衝液（pH3.75）9.4mlに溶解し20℃に
する。ここに（Ｓ）−オキシニトリラーゼ溶液500μｌ
および4.2MのHCN水溶液800μｌを加える。
用いたＳ−オキシニトリラーゼ溶液は84U/mlの活性を有
していた。ここで1Uは20℃かつpH3.75で１μmol/minの
ｐ−ヒドロキシマンデル酸ニトリル形成の触媒作用を行
う。
していた。ここで1Uは20℃かつpH3.75で１μmol/minの
ｐ−ヒドロキシマンデル酸ニトリル形成の触媒作用を行
う。
反応を旋光測定（λ＝578nm）により追跡する。15〜30
分後一定の旋光度になり、この反応を終える。その後反
応混合物をジエチルエーテル10mlで４回抽出する。合わ
せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を回転蒸発
器で除去する。次いで残留物を１回に10mlのペンタンを
用いて３回洗浄し、生成物を減圧下に乾燥する。
分後一定の旋光度になり、この反応を終える。その後反
応混合物をジエチルエーテル10mlで４回抽出する。合わ
せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を回転蒸発
器で除去する。次いで残留物を１回に10mlのペンタンを
用いて３回洗浄し、生成物を減圧下に乾燥する。
化学的収量:64.8mg（理論量の87％） 光学純度:99％ee 光学純度の測定はｐ−ヒドロキシ−マンデル酸ニトリル
のN,O−ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２−
アミノ−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−エタノール
誘導体としてキャピラールガスクロマトグラフィーでH.
Frankらに従って行った。誘導は例１に挙げたように同
様に行った。
のN,O−ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２−
アミノ−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−エタノール
誘導体としてキャピラールガスクロマトグラフィーでH.
Frankらに従って行った。誘導は例１に挙げたように同
様に行った。
例15 例14に対応してｍ−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド61mg
（0.5mmol）をpH3.25で4.2MのHCN水溶液450μｌと反応
させる。30〜40分後反応を終える。（Ｓ）−３−ヒドロ
キシマンデル酸ニトリルの単離を例14に記載されたよう
に行う。
（0.5mmol）をpH3.25で4.2MのHCN水溶液450μｌと反応
させる。30〜40分後反応を終える。（Ｓ）−３−ヒドロ
キシマンデル酸ニトリルの単離を例14に記載されたよう
に行う。
化学的収量:67mg（理論量の90％） 光学純度:98％ee 光学純度の測定は例１に従ってN,O−ビス−ペンタフル
オロプロピオニル−２−アミノ−１−（ｍ−ヒドロキシ
フェニル）−エタノールを介して行った。
オロプロピオニル−２−アミノ−１−（ｍ−ヒドロキシ
フェニル）−エタノールを介して行った。
例16 例14に対応してｍ−メチル−ベンズアルデヒド60mg（0.
5mmol）と4.2MのHCN水溶液475μｌおよびオキシニロリ
ラーゼ溶液500μｌとをpH3.25で反応させる。約45分
後、反応を終える。後処理を例１と同様に行い、（Ｓ）
−３−メチルマンデル酸ニトリルを得た。
5mmol）と4.2MのHCN水溶液475μｌおよびオキシニロリ
ラーゼ溶液500μｌとをpH3.25で反応させる。約45分
後、反応を終える。後処理を例１と同様に行い、（Ｓ）
−３−メチルマンデル酸ニトリルを得た。
化学的収量:59mg（理論量の80％） 光学純度:96％ee 光学純度の測定は例１に従って対応するアミノアルコー
ルのN,O−ビス−ペンタフルオロプロピオニルエステル
アミドを介して行った。
ルのN,O−ビス−ペンタフルオロプロピオニルエステル
アミドを介して行った。
例17 例14に対応してベンズアルデヒド52mg（0.5mmol）と4.2
MのHCN水溶液475μｌおよびＳ−オキシニトリラーゼ溶
液1500μｌとをpH3.25で反応させる。約45分後反応を終
える。後処理は例１と同様に行った。
MのHCN水溶液475μｌおよびＳ−オキシニトリラーゼ溶
液1500μｌとをpH3.25で反応させる。約45分後反応を終
える。後処理は例１と同様に行った。
化学的収量:48mg（理論量の80％） 光学純度:96％ee 光学純度の測定は例１に従ってN,O−ビス−ペンタフル
オロプロピオニルエステルアミドを介して行った。
オロプロピオニルエステルアミドを介して行った。
例18 撹拌式反応器内での固定（Ｓ）−オキシニトリラーゼを
用いた（Ｓ）−ｐ−ヒドロキシマンデル酸ニトリルの連
続的製造 より多量の生成物を連続的作業法での形成する場合の反
応原理の転用を、Eupergit Ｃ（Ｒhm,Darmstadt）の
固定（Ｓ）−オキシニトリラーゼを用いて行った。
用いた（Ｓ）−ｐ−ヒドロキシマンデル酸ニトリルの連
続的製造 より多量の生成物を連続的作業法での形成する場合の反
応原理の転用を、Eupergit Ｃ（Ｒhm,Darmstadt）の
固定（Ｓ）−オキシニトリラーゼを用いて行った。
連続的作業法で10mlの反応器中で72時間にわたって空時
収量57.9g/（ｌ・ｄ）で（Ｓ）−ｐ−ヒドロキシマンデ
ル酸ニトリルを製造した。
収量57.9g/（ｌ・ｄ）で（Ｓ）−ｐ−ヒドロキシマンデ
ル酸ニトリルを製造した。
特有の反応データ： ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド： 21mmol/l HCN: 400mmol/l Na−シトラート： 45mmol/l pH3.75 滞留時間： 3960秒 触媒濃度： 0.15g/ml 操作時間： 72 ｈ 酵素不活性化： ３ ％/d 反応率： 85 ％ エナンチオマー過剰： ＞ 98 ％ 温度： 20℃
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウド・クラグル ドイツ連邦共和国、ユーリッヒ、ロベル ト‐コッホ‐ストラーセ、５ (72)発明者 マリア・レギナ・クラ ドイツ連邦共和国、ハムバッハ‐ニーデル ツイール、ゼルゲンブッシュ、12 (72)発明者 クリスチアン・ウアントライ ドイツ連邦共和国、ユーリッヒ、ウオルフ スホーフエネル・ストラーセ、139 (72)発明者 キュリアコス・マクリアレアス ドイツ連邦共和国、フライゲリヒト １、 ハナウエル・ストラーセ、36アー (72)発明者 カールハインツ・ドラウツ ドイツ連邦共和国、フライゲリヒト、ツー ル・マリーンルーエ、13 (56)参考文献 特開 平２−713（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．, （1966）Ｐ．4299
Claims (5)
- 【請求項１】光学活性なシアンヒドリンを、オキソ化合
物とシアン化水素酸とをオキシニトリラーゼの存在下に
酵素的に反応させることにより製造する方法において、
脂肪族、芳香族またはヘテロ芳香族のアルデヒドまたは
ケトンから誘導された（Ｒ）−シアンヒドリンまたは
（Ｓ）−シアンヒドリンを、対応するオキソ化合物とシ
アン化水素酸とを純粋な水性環境中で（Ｒ）−オキシニ
トリラーゼ（4.1.2.10）またはオキシニトリラーゼ（4.
1.2.11）の存在下に、化学的競合反応とラセミ化が酵素
的合成に比べて無視できるような酸性条件下でかつ−５
〜＋50℃の温度で反応させることにより製造することを
特徴とする方法。 - 【請求項２】反応がpH4.5以下で行なわれる、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】反応が連続的に行なわれる、請求項１また
は２記載の方法。 - 【請求項４】反応が、再利用酵素用保存手段を備えた連
続作動性撹拌式反応器中で行なわれる、請求項３記載の
方法。 - 【請求項５】反応が芳香族アルデヒドを用いて行なわれ
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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| DE3802624 | 1988-01-29 | ||
| DE3802624.4 | 1988-01-29 | ||
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| DE3823864.0 | 1988-07-14 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| EP (1) | EP0326063B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0753116B2 (ja) |
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| DE (2) | DE3823864A1 (ja) |
| DK (1) | DK38789A (ja) |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP2295592A1 (en) | 2000-06-02 | 2011-03-16 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | An enzyme reaction method and a method for enzymatically producing an optically active cyanohydrin |
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| DE3917374A1 (de) * | 1988-07-14 | 1990-12-06 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von s-cyanhydrinen |
| DK0446826T3 (da) * | 1990-03-16 | 1996-02-12 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af optisk aktive cyanhydriner |
| DE4102327C1 (en) * | 1991-01-26 | 1992-06-04 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De | (R)-keto:cyanohydrin prepn. - by reacting ketone with prussic acid in organic solvent in presence of (R)-oxy:nitrilase; used in prepn. of alpha-hydroxy-alpha-(m)ethyl carboxylic acid |
| JP2676568B2 (ja) * | 1991-06-26 | 1997-11-17 | 日東化学工業株式会社 | Ｒ（−）−マンデル酸およびその誘導体の製造法 |
| DE4126580A1 (de) * | 1991-08-12 | 1993-02-18 | Degussa | D-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutansaeurenitril, seine herstellung und verwendung |
| AT396252B (de) * | 1991-10-31 | 1993-07-26 | Chemie Linz Gmbh | Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven herstellung optisch aktiver cyanhydrine |
| DE4139083A1 (de) * | 1991-11-28 | 1993-06-03 | Chemie Linz Deutschland | Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven herstellung optisch aktiver cyanhydrine |
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| AT400035B (de) * | 1993-06-01 | 1995-09-25 | Chemie Linz Gmbh | Enzymatisches verfahren zur herstellung aliphatischer s-cyanhydrine |
| DE4322064A1 (de) * | 1993-07-02 | 1995-01-12 | Chemie Linz Deutschland | Enzymatisches Verfahren zur Herstellung aliphatischer S-Cyanhydrine |
| DE19529116A1 (de) * | 1995-08-08 | 1997-03-06 | Chemie Linz Deutschland Gmbh I | (S)-Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis |
| DE19703314A1 (de) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen |
| US7256027B1 (en) | 1999-06-15 | 2007-08-14 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
| AT408231B (de) * | 1999-12-15 | 2001-09-25 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven cyanhydrinen unter verwendung von r-oxynitrilase |
| ATE423209T1 (de) | 2001-01-16 | 2009-03-15 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Gene, enthaltend eine für hydroxynitrillyase codierende dna-sequenz, rekombinante proteine mit hydroxynitrillyase-aktivität und deren verwendung |
| AT411065B (de) * | 2001-12-27 | 2003-09-25 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Verfahren zur herstellung von heterocyclischen (r)- und (s)-cyanhydrinen |
| AT411064B (de) * | 2001-12-27 | 2003-09-25 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Verfahren zur herstellung von enantiomerenangereicherten cyanhydrinen unter verwendung von acetalen oder ketalen als substrate |
| CN101611141B (zh) | 2006-12-14 | 2014-05-07 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | R-hnl随机变体及其用于制备光学纯的空间位阻氰醇的用途 |
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-
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- 1989-01-23 ES ES89101127T patent/ES2064371T3/es not_active Expired - Lifetime
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（１９６６）Ｐ．４２９９ |
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