JPH0398572A - 細胞培養装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）　　産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための装置および方法に
関するものである。更に詳しくは細胞をサスペンジョン
状態で培養するための装置および方法に関するものであ
る。

細胞培養技術は、例えばウィルス．ワクチン，インター
フェロンの如き抗ウィルス剤或いはホルモンの如き生物
薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナ
ル抗体の生産は抗体産生ｍ胞とミエローマによるパイプ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

（ｂ＋　　従来技術 従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管，培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

方近年細胞の培養方法及びそのための装置として、いく
つか提案がなされている。これらの提案は、大きく分け
て付着培養（　ａｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
　ｃｕｌｔｕｒｅ　）と浮遊培養、つまりサンスベンジ
ョン培＊　（ｓｕｓｐｎｅｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）
との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培養さ
れる細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネテイツクスクーラーもしくは機
械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スビナ
ーフラスコの中に調整された攪拌機能を設けた培養方法
が提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号お
よび同第３，６４９，４６５号明細書参照〉。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シ一トを攪拌機とし、該攪拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のような或
る種の虚弱細胞に対し所望の隠かな攪拌を作り出すサン
ベンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、ｍｕが一
定量の栄養分の中で培養されるためｉ胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を大量に且つ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽
中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養する方式すなわち通称バーヒュ
ーション方式と言われる方式が提案されている（　Ａ　
ｎｎｕａＲ　ｅｐｏｒｔｓ　ｏｒ　Ｆ　ｉａｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ　Ｐ　ｒｏｃｅｓｓｅｓ，　ｖｏｌ．６参照）
。この方式を用いて培養するに当って重要なことの１つ
は、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを
効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培
養槽内の細胞の成育環境を最適条件下に維持することで
ある。サスペンジョン液から生ａｌｌ胞と古い培養液と
を分離するために種々のフィルターやまた種々の形式が
提案されているが、フィルターの目塞りや、装置の構造
の煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいずれも満
足すべきものとは言い難い。

特開昭５９−８２０８３号公報および特開昭６０−９４
８２号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培養
上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管から
培地を添加し同時に上記排出管から培養土清を排出しつ
つ培養を行うようにした浮遊ｌｌｌ胞の高濃度培養装置
が提案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ミ
クロンと小さくしかもその比重は培養の比重と大きな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要があるが上記２件の特開昭に
開示された装置では沈降面積をあまり大きくとることは
できない。

（Ｃ）　　発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペンジョン培
養液から生細胞と培養液とを分離することが可能な装置
および方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、フィルターなどを使用しなくとも
生細胞と古い培養液とを分離することが可能な装置およ
び方法、従ってフィルターの目塞りなどによる問題の発
生を解消した装置および方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に達成する
ための沈降面積を非常に大きくとることのできる工業的
に有利なサスペンジョン培養のための装置および方法を
提供することにある。

本発明の更に他の目的は、サスペンジョン培養において
しばしば問題となる死細胞およびその破壊片を培養槽外
へ容易に除去可能な装置および方法を提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ高密度の培養
に適したパーヒュージョン方式による工業的装置および
方法を提供することにある。

更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかとな
るであろう。

《ｄ＋　　発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した本発明の
目的および利点は、細胞培養槽が、細胞のサスペンジョ
ン培養ゾーン，細胞のセトリングゾーン，該セトリング
ゾーンからの培養液排出口および該サスペンジョン培養
ゾーンへの培養液供給口とを有し、該サスペンジョン培
養ゾーンと該セトリングゾーンとは該細胞培養槽内で該
セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡するように円
筒状仕切りによって仕切られており、そして該セトリン
グゾーンは該細胞培養槽の槽側壁と該円筒状仕切りの間
に形成され、該円筒状仕切りと対向する槽側壁の実質的
部分が円筒状であり、上記円筒状仕切りと上記円筒状槽
側壁とが実質的に同心に位置しており、該セトリングゾ
ーン内に少なくとも１つの円筒状のじゃま板を有し、該
円筒状じ１）ま板が、上記円筒状槽側壁及び上記円筒状
仕切りと実質的に同心に位置していることを特徴とする
サスペンジョン培養のための細胞培養槽から構或される
灌流培養のための細胞培養装置及び該装置を用いて灌流
培養する方法によって達或される。

かかる本発明によれば、培薔槽中に設置されたセトリン
グゾーンにおいて、生細胞は重力方向の下部へ沈降し、
古い培養液や細胞破壊片などはセトリングゾーンの上部
へ分離されることになるので、セトリングゾーンの上部
に設けられた培養液の排出口から生細胞を実質的に含ま
ない培養液を排出することができる。従って本発明は、
目塞りの原因となるフィルターを使用することなく、簡
単な方式によって生細胞と培養液を効率よく分離するこ
とを可能とするので、細胞の大量且つ高密度培養に適用
することができる。

本発明の培養装置は、細胞をサスペンドさせて実質的な
細胞培養を実施する区域と規定できる細胞のサスペンジ
ョン培養ゾーンおよび細胞を重力によって培養液から分
離する区域と規定できる細胞のセトリングゾーンを有し
ている。細胞のサスペンジョン培養ゾーンと細胞のセト
リングゾーンとは、ａｍ培養槽内において該セトリング
ゾーンの下方部位を通じて連絡するように円筒状仕切り
によって仕切られている。このような構造を有するため
、ＩＲ胞のセトリングゾーンにおいて、沈降しそして培
養液から分離された細胞は該セトリングゾーンの下方部
位を通じて細胞のサスペンジョン培養ゾーンに再び導入
され、その区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリングゾーン
は、該培養槽の円筒状槽側壁と上記円筒状仕切りの間に
形成されている。このような構造によって、培養槽内で
セトリングゾーンの有効なセトリング面積を非常に大き
くすることのできる利点がある。

本発明の装置は、セトリングゾーンにおいて細胞と分離
された古い培養液を排出するための培養液排出口および
培養ゾーンへ新しい培養液を供給するための培養液供給
口を上記培養槽に有している。

また、本発明の装置は、セトリングゾーンにおける細胞
のセトリングを助長するため、細胞のサスペンジョン培
養ゾーン中に形成される培養液の流動の影響を可及的に
小さくする目的で、重力方向に伸びてセトリングゾーン
を仕切る円筒状のじゃま板を少なくとも１つ設けている
。該円筒状じゃま板によって分けられるセトリングゾー
ンは、上部で連絡しているか、もしくは該じゃま板によ
って完全に分けられているか、どちらの形態を取っても
良い。

本発明の装置の培養槽は、細胞のサスペンジョン培養ゾ
ーン中の培養液を強制的に流動させるための手段を備え
ることができる。そのような手段は、例えば培養液中に
細胞を強制的にサスペンドさせるための機械的攪拌手段
であることができる。

また、培養槽に、酸素含有ガス導入口、または酸素含有
ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を設け、該導入口から
導入された酸素含有ガスが上昇する際の攪拌効果により
培養液中に細胞を強制的にサスペンドさせることもでき
る。

本発明の細胞培養装置はサスペンジョン型の細胞培養に
適用されるが、サスペンジョン型とは、水性媒体中で細
胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞を微小担体（マ
イクロキャリアー）に担持して浮遊しながら、またマイ
ク口カプセル中で細胞が生育されるような種々の浮遊培
養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培
養する方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞は、植物
細胞，動物細胞，微生物細胞などであってもよく、また
人為的或いは遺伝子操作により変性された細胞例えばハ
イブリドーマであってもよい。殊に本発明の培養ｉ置は
、動物細胞の培養に適している。

本発明におけるサスペンジョン型の細胞培養槽中におい
ては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態
で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体に
、種々の無機塩，ビタミン類，捕酵素．ブドウ糖，アミ
ノ酸．抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加成
分が加えられている。また培養液には血清を加えること
もできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することも出来る。

本発明の培養装置を用いて細胞を灌流培養する本発明方
法は、セトリングゾーンから細胞を実質的に含まない培
養液を抜出しそしてサスペンジョン培養ゾーンへ新しい
培養液を導入することによって有利に実施される。

その際、セトリングゾーンによって規定される細胞の有
効セトリング面梢［Ｓ（ｃａｔ）］と、サスペンジョン
培養ゾーン内の培養液の体積［■（ｄ〉］との比Ｖ／Ｓ
が好ましくはＯ，ｔ　〜５００ｃｍ、特に好ましくは１
〜１００αの範囲にある。

以下本発明の装置および方法について更に詳細に説明す
る。

先ず添付した図１および図２により本発明を説明すると
、図１および図２は、それぞれ本発明の装置の概略図の
一例を示したものである。

図１において培養槽本体１にはその内壁の内側に隔壁２
によって仕切られたセトリングゾーン６が設けられてい
る。セトリングゾーン６内にはじゃま板８が入れられて
おり、セトリングゾーン６における攪拌，対流の影響を
抑えている。又、じゃま板８の上部ではセトリングゾー
ン６が連絡している。培養４１１には新しい培養液の供
給導管３を通じて培養液の供給口が備えられ、導管５を
通じて酸素またはＭ素含有ガスが供給ざれるようになっ
ており、また排ガスの排出導管９が設けられている。さ
らにセトリングゾーン６の上部には古い培養液の排出口
が設けられ、導管４を通じて培養槽外へ培養液を排出す
るようになっている。

図１は培養槽１中に攪拌装置７が設置され、それを回転
させることによって、細胞がサスペンジョン状態に維持
されている。

一方図２において、１〜６は図１と同じＩａ能を待った
手段および装置を意味する。図１と異なるのは、じゃま
板８′が８と異なりセトリングゾーンを完全に分けてい
る点である。このためセトリングゾーンは６と１１とな
り、培養液の排出も排出口を４と１０とが必要となる。

上記図１および図２において、いずれも培養槽の内壁の
内側に隔壁２によって仕切られたセトリングゾーン６及
び１１が設けられていて、そのセトリングゾーンにはサ
スペンジョン液の攪拌効果は実質的に及ばないようにな
っている。セトリングゾーン６及び１１の内部では、細
胞が重力方向へ沈降し、細胞を実質的に含まない生育阻
害物質を含む古い培養液が上部に存在するように設計さ
れている。

又、図１および図２中ではセトリングゾーン内のじゃま
板は１枚であるが、数が多くても良い。

図１および図２に示すように槽の高さを口，槽の直径を
Ｄとしたとき、Ｈ／Ｄが０．５〜１０、好ましくは１〜
５の範囲となるような槽が、本発明の培養槽として好ま
しく使用される。また槽の全体の形状としては一般に細
胞のサスペンジョン型培養に使用されるものであれば種
々のものが用いられる。

セトリングゾーンは、その中にじゃま板を少なくとも１
つは含みその中における培養液の線速度が、細胞の沈降
速度よりも遅く且つ培養槽内のサスペンジョン液の攪拌
が及ばない領域が確保されていればよい。

図１および図２の装置は、セトリングゾーン６および１
１とサスペンジョン培養ゾーンとが円筒状隔壁２によっ
て仕切られており、該円筒状隔壁２と対向する槽側壁の
実質的部分とセトリングゾーン内のじゃま板が円筒状で
あり、そして上記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁、及び
セトリングゾーン内仕切り板が実質的に同心に位置して
いるものである。

この装置において、Ｖ／Ｓ　（ここで、■はサスペンジ
ョン培養ゾーン内の培養液の体積であり、Ｓは細胞の有
効なセトリング面積である）を算出する基礎となるＳは
下記式で表わされる。

Ｓ＝π／４　（Ｄ２−　ｄ２　） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄは円筒状
側壁２の直径である。また、■は培養槽の容積から、培
養液の存在しない空間部の体積とセトリングゾーンの容
積とを差し引いた体積と理解されるべきである。

又、培養装置には、酸素，二酸化炭素や栄養素の濃度．
ｐ目の値を測定し、それらを或る範囲に維持する装置が
一般に設置されているが、本発明の細胞培養槽にもこれ
らの装置が備えられてもよいことは言うまでもない。し
かし添付図面にはこれらの付属装慟は省略されている。

本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液は、こ
の中にブドウ糖．蛋白質の如き栄養源、種々のアミノ酸
，無機塩，抗生物質などの細胞培養に必要な成分を水溶
液として含むものが使用されるが、さらに血清を含んで
いてもよく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジョン培養ゾーンへの
培養液供給口から、例えば図１および図２に示すように
培養槽の上部に設けられた培養液供給口から供給される
。またサスペンジョン液中へ直接導管を通じて供給して
もよい。

また本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液の
供給と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準
がほぼ一定となるように維持することが望ましいが、必
ずしもその必要はない。新しい培養液の供給と古い培養
液の排出とは、それぞれ独立して、連続的に行なうこと
もできまた間歇的に行なうこともできる。

本発明の培養方法において、サスペンジョン液中の酸素
濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法とし
ては、前述の如く、サスペンジョン液中の酸素または酸
素含有ガスを直接供給してもよく、また他の供給手段に
よってもよい。他の供給手段としては、例えば酸素キャ
リアーを用いる方法である。酸素キャリアーとしては、
水と実質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合
物が使用され、その例としては、人工血液の素材として
使用されるような種々のフルオロカーボンが挙げられる
。かようなフルオロカーボンを酸素供給手段として使用
する場合には、酸素を溶解させたフルオロカーボンをサ
スペンジョン液中の上部から液滴状または薄膜状で添加
すればよい。

また培養は、培ｉｔ槽の有効培養容積（Ｖ）に対して新
しい培養液を供給する割合（新しい培養液の供給ｆｆｉ
／Ｖ）は１日当り０．２〜１０、好ましくは０．５〜５
の範囲とするのが適当である。

かくして本発明によれば、細胞のサスペンジョン培養に
おいて、生Ｗ８胞を含まない古い培養液を簡単に分離す
ることができ、また細胞破壊片も古い培養液と共にサス
ペンジョン液から除去できる。

また本発明の装置は構造が簡単であり、その操作が煩雑
でなく工業的装置として適している。殊にＩＩＩ胞の大
量培養，高密度培養に有利である。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例１ （１）培養装置 添付図３に示す培養システムを使用した。培養槽は図３
に示されるように外壁の内側に設けられた隔壁２によっ
て仕切られたセトリングゾーン６か設けられ、その中に
じゃま板８−１．８−２．８−３があり、セトリングゾ
ーン６を４つに分けている。それらの上部には培養液の
排出のための導管４−１．４−２．４−３．４−４を有
しており、攪拌装置７が設置されている。正味培養槽容
積は４０１，Ｖは２０！ｌであった。

｛２｝培養液 Ｒ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培地，ハム・Ｆ１２培地および
ダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合したも
のにさらにアミノ酸，グルコース等を添加したもの（以
下ｅＲ　Ｄ　Ｆと称する〉を基本培地として用いた。こ
れに増殖因子としてインスリン，トランスフエリン，エ
タノールアミン，亜セレン酸を添加したものを培養に用
いた。これらの増殖因子の添加邑は、インスリン９μ９
／ｒｄ．　トランスフエリン１０μｇ／ｄ，エタノール
アミン１０μＭ，亜セレン酸２Ｘ１０−８Ｍであった。

（３）　　培養方法 細胞はマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株を親株とするマ
ウス×ヒトハイブリドーマ０２３株用いた。

この細胞は［Ｇ産生株である。

あらかじめオートクレープ滅菌した前記培養槽に培地を
入れ、これに細胞を４．７ｘｌ０５ｃｅｌｌｓ　／一と
なるように播種した。培養槽では炭酸ガス５％を含む酸
素ガスが、溶存酸素３　ｐｐｎ＋となるように吹込みノ
ズル５を通して自動的にコントロールされて送入された
。培養液と接触したのちガスはノズル９から系外へ取出
された。培養槽中の培養液は３７℃に保持された。培養
槽中にはＦＣ式の攪拌機が取付けられており、攪拌速度
は２０ｒｐｍであった。

播種後２日間は回分培養を行い、この後パーヒュージョ
ンを開始した。すなわち、新培地をノズル３から送入し
、培養槽１の液面が一定になるように細胞を分離された
培養液を導管４を経由して系外へ取出した。

バーヒュージョンのＲ度として正味培養容積の１日当り
の置換率を実験結果に併記する。

（４）培養結果 かくして２４日間培養を行った結果を表に示す。

【図面の簡単な説明】

図１〜３は、それぞれ本発明の培養装置の概略図を示し
たものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞培養槽が、細胞のサスペンジョン培養ゾーン
   、細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーンからの
   培養液排出口および該サスペンジョン培養ゾーンへの培
   養液供給口とを有し、該サスペンジョン培養ゾーンと該
   セトリングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾ
   ーンの下方部位を通じて連絡するように円筒状仕切りに
   よつて仕切られており、そして該セトリングゾーンは該
   細胞培養槽の槽側壁と該円筒状仕切りの間に形成され、
   該円筒状仕切りと対向する槽側壁の実質的部分が円筒状
   であり、上記円筒状仕切りと上記円筒状槽側壁とが実質
   的に同心に位置しており、該セトリングゾーン内に少な
   くとも１つの円筒状のじゃま板を有し、該円筒状じゃま
   板が、上記円筒状槽側壁及び上記円筒状仕切りと実質的
   に同心に位置していることを特徴とするサスペンジョン
   培養のための細胞培養槽から構成される灌流培養のため
   の細胞培養装置。
2. （２）請求項１記載の細胞培養装置によつて細胞を灌流
   培養する方法。