JPH0428352B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (a) 産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための装置に関
するものである。更に詳しくは細胞をサスペンジ
ヨン状態で培養するための装置に関するものであ
る。

細胞培養技術は、例えばウイルス、ワクチン、
インターフエロンの如き抗ウイルス剤或いはホル
モンの如き生物薬品の製造にとつて重要である。
更に近年特定タンパク質などを標的とするモノク
ローナル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマ
によるハイブリドーマの培着によるものであり、
その技術の解決は工業的に重要なテーマである。

(b) 従来技術 従来、細胞培養は一般にシヤーレ試験管、培養
びんなどを用いて実験室的規模で行なわれてい
る。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置とし
て、いくつかの提案がなされている。これらの提
案は、大きく分けて付着培養（anchorage
dependent culture）と浮遊培養、つまりサスペ
ンジヨン培養（suspension culture）との２つの
方式に分類されるが、これらの方式は培養される
細胞の特性によつていずれかに決められる。

このうちサスペンジヨン培養に関して下記の提
案がなされている。例えばマグネテイツクスター
ラーもしくは機械的に駆動されるシヤフト上の羽
根車によつて、スピナーフラスコの中に調整され
た攪拌機能を設けた培養方法が提案されている
（米国特許第2958517号および同第3649465号明細
書参照）。

特開昭57−65180号公報には、回転可能なシヤ
フト上に支持される少なくとも１枚の比較的大表
面積の屈撓性シートを攪拌機とし、該攪拌機を回
転させて該シートを波立たせ、それによつてヒト
の２倍体細胞のような或る種の虚弱細胞に対し所
望の穏やかな攪拌を作り出すサスペンジヨン培養
装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、
細胞が一定量の栄養分の中で培養されるため細胞
の生長増殖は比較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジヨン培養において、細胞の生
長増殖が比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細
胞を大量に且つ高密度で培養するために、一般に
新しい培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物
質を含んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら
培養する方式すなわち通常パーヒユージヨン方式
と言われる方式が提案されている（Annual
Reports Of Fermentation Processes，Vo1.6参
照）。

この方式を用いて培養するに当つて重要なことの
１つは、サスペンジヨン液中の生細胞と前記古い
培養液とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽
外へ取り出し、培養槽内の細胞の生育環境を最適
条件下に維持することである。サスペンジヨン液
から生細胞と古い培養液とを分離するために種々
のフイルターやまた種々の形式が提案されている
が、フイルターの目塞りや、装置の構造の煩雑性
などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足
すべきものとは言い難い。

特開昭59−82083号公報および特開昭60−9482
号公報には、培養装置内に細胞沈殿管を兼ねた培
養上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該
導管から培地を添加し同時に上記排出管から培養
上清を排出しつつ培養を行うようにした浮遊細胞
の高濃度培養装置が提案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし
数10ミクロンと小さくしかもその比重は培地の比
重と大きな差がないため、浮遊細胞と培地とを重
力によつて分離する上記の如き装置では、細胞沈
降を有利に達成するために沈降面積を大きくする
必要があるが上記２件の特開昭に開示された装置
では沈降面積をあまり大きくとることはできな
い。

(c) 発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペン
ジヨン培養液から生細胞と培養液とを分離するこ
とが可能な装置を提供することにある。

本発明の他の目的は、フイルターなどを使用し
なくとも生細胞と古い培養液とを分離することが
可能な装置および方法、従つてフイルターの目塞
りなどによる問題の発生を解消した装置を提供す
ることにある。

本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に
達成するための沈降面積を非常に大きくとること
のできる工業的に有利なサスペンジヨン培養のた
めの装置を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、サスペンジヨン培養
においてしばしば問題となる死細胞およびその破
壊片を培養槽外へ容易に除去可能な装置を提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ同密
度の培養に適したパーヒユージヨン方式による工
業的装置を提供することにある。

更に他の目的および利点は、以下の説明から明
らかとなるであろう。

(d) 発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した
本発明の目的および効果は、 細胞培養ユニツトが、細胞のサスペンジヨン培
養ゾーン、および細胞のセトリングゾーン、該セ
トリングゾーン上部からの培養液排出口とを有
し、且つ該サスペンジヨン培養ゾーンと該セトリ
ングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾ
ーン下方部位を通じて連絡するように仕切りによ
つて仕切られており、そして該セトリングゾーン
は、該細胞培養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成
され、セトリングゾーン内槽内壁に沿つて槽内壁
と仕切板との間に邪魔板が設置され、しかもその
邪魔板は、それによつて区切られた領域の培養液
がセトリングゾーンの上部で流れを形成しないよ
うに設置されていることによつて特徴づけられる
細胞培養ユニツトの少なくとも１つを含む細胞培
養装置であつて、該培養装置の任意のサスペンジ
ヨン培養ゾーンには培養液供給口が設けられてい
る灌流培養のための細胞培養装置によつて達成さ
れる。

かかる本発明の培養装置では、培養ユニツトに
設置されたセトリングゾーンにおいて、生細胞は
重力方向の下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊
片などはセトリングゾーンの上部に分離されるこ
とになるのでセトリングゾーンの上部に設けられ
た培養液の排出口から生細胞を実質的に含まない
培養液を排出することができる。また本発明の装
置は培養ユニツトを１個でもよいが２個以上任意
に重ねて構成すると、培養の実質容積に対し、比
較的大きいセトリングゾーンの容積を設置するこ
とが容易であり、また必要により培養ユニツトを
増減して培養規模を変化させることができる。

さらに本発明は、目塞りの原因となるフイルタ
ーを使用することなく、簡単な方式によつて生細
胞と培養液を効率よく分離することを可能とする
ので、細胞の大量且つ同密度培養に有利に適用す
ることができる。

本発明の培養装置における培養ユニツトは、細
胞をサスペンドさせて実質的な細胞培養を実施す
る区域と規定できる細胞のサスペンジヨン培養ゾ
ーンおよび細胞を重力によつて培養液から分離す
る区域と規定できる細胞のセトリングゾーンを有
している。細胞のサスペンジヨン培養ゾーンと細
胞のセトリングゾーンとは、細胞培養槽内におい
て該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡す
るように仕切りによつて仕切られている。このよ
うな構造を有するため、細胞のセトリングゾーン
において、沈降しそして培養液から分離された細
胞は該セトリングゾーンの下方部位を通じて細胞
のサスペンジヨン培養ゾーンに再び導入され、そ
の区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリン
グゾーンは、該培養装置の外側壁と上記仕切りの
間に形成されている。このような構造によつて、
培養装置内でセトリングゾーンの有効なセトリン
グ容積を比較的大きくとることのできる利点があ
る。

本発明の装置は、培養ユニツトのセトリングゾ
ーンにおいて細胞と分離された古い培養液を排出
するための培養液排出口および培養装置へ新しい
培養液を供給するための培養液供給口を上記培養
装置の任意の個所に１個所以上有している。かか
る供給口は装置内の上部に設けることが望まし
い。

本発明の培養ユニツトにおいて、該セトリング
ゾーンは、好ましくは、該サスペンジヨン培養ゾ
ーンの周囲に該サスペンジヨン培養ゾーンを取囲
むように装置側壁と該仕切りとの間に形成されて
いる。この好ましい態様において、例えば該サス
ペンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンは円
筒状仕切りによつて仕切られている。この場合、
さらに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒
状仕切りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に
位置している。

さらに、本発明における培養ユニツト内のセト
リングゾーンは内槽内壁に沿つて槽側壁と仕切板
との間に邪魔板が設置され、しかもその邪魔板
は、それによつて区切られた領域の培養液がセト
リングゾーン上部で流れを形成しないように設置
されている。すなわち、具体的には例えば図−１
から理解できるように、邪魔板８（３個設けられ
ている）は、セトリングゾーン７（槽側壁５と仕
切板６との間に設置されている）に設置され、そ
の上部では邪魔板によつて区切られた領域（図−
１の場合は７の領域）の培養液が互いに流れを形
成しないように間〓を有しないで区切られてい
る。

このようにセトリングゾーンにおける邪魔板
は、その目的を構成するために、その上部に少な
くとも設置されていればよく、その長さは仕切板
との関係から（上部から見て）それと同じか或い
は短いことが好ましい。また邪魔板は平板である
ことが望ましいが、前記培養液の流れを形成しな
いという目的を達成する限り、連通孔を有してい
ても差し支えない。

さらに邪魔板は１つである必要はない。それ以
上あつてもよいが一般には１〜３個が有利であ
る。

セトリングゾーン内における邪魔板が設置され
ていないか或いは設置されていたとしても、その
上部に間〓がある場合にはセトリングゾーン上部
で培養液の流れが形成されることがしばしば起
り、そのために本来の目的であるセトリングゾー
ン内部での細胞と培養液との重力による分離が効
果的に行われず、細胞を含まない培養液の排出が
スムースに実施し難くなる。

これに対し本発明によれば、セトリングゾーン
内部の殊に上部において邪魔板により培養液の流
れが形成されないために、細胞の重力沈降が効果
的に行われ、細胞を含まない培養液の排出が有利
に行うことが可能となる。

本発明の細胞培養装置はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或い
は細胞を微少担体（マイクロキヤリアー）に担持
して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細
胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊
に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培養する
方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞例えばハイブリドーマであつてもよ
い。殊に本発明の培養装置は、動物細胞の培養に
適している。

本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養装
置中においては、培養しようとする細胞が培養液
中に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的
に水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミ
ン類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質な
どの通常細胞培養に使用される添加成分が加えら
れている。また培養液には血清を加えることもで
きるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液
として使用することもできる。

本発明の培養装置を用いて細胞を灌流培養する
場合には、セトリングゾーンから細胞を実質的に
含まない培養液を抜出しそして培養装置へ新しい
培養液を導入することによつて有利に実施され
る。

その際、各培養ユニツトにおけるセトリングゾ
ーンによつて規定される細胞の有効セトリング面
積［Ｓ（cm²）］と、サスペンジヨン培養ゾーン内の
培養液の堆積［Ｖ（cm³）］との比Ｖ／Ｓが好ましく
は0.1〜500cm、特に好ましくは１〜100cmの範囲
にある。

以下本発明の装置について図面により更に詳細
に説明する。

先ず添付した図１〜図４により本発明を説明す
ると、図１〜図４は何れもそれぞれ本発明の装置
の概略図の一例を示したものである。

図１において、培養ユニツト本体５にはその内
壁の内側に隔壁６によつて仕切られたセトリング
ゾーン７が設けられている。培養ユニツト５には
新しい培養液の供給導管１を通じて培養液の供給
口が備えられ、導管３を通じて酸素または酸素含
有ガスが供給されるようになつており、また排ガ
スの排出導管４が設けられている。さらにセトリ
ングゾーン７は円筒状邪魔板８で仕切られ流れを
生じない構造となつており、さらに各領域の上部
には古い培養液の排出口が設けられ、導管２−１
〜２−４を通じて培養ユニツト外へ培養液を排出
するようになつている。

培養ユニツト５中に攪拌装置９が設置され、そ
れを回転させることによつて細胞がサスペンジヨ
ン状態に維持されている。

本発明の装置でいう培養ユニツトとは図−２に
おいては、培養装置の縦長方向に直角断面を切つ
た時に、培養液の排出口２−１−１から２−２ま
での占める区域を１つの培養ユニツトということ
ができる。図−２においては４つの培養ユニツト
を包含している。

一方図−３において、１〜９は図−２と同じ機
能を持つた手段および装置を意味する。図−２と
異なるのは、培養槽１の中に案内筒１０が設けら
れ、その案内筒１０の下部に酸素または酸素含有
ガスを導管３を介して供給するようになつている
点である。この案内筒１０の下部に酸素または酸
素含有ガスを供給することによつてサスペンジヨ
ン液は案内筒１０の内部を下部から上部へ上昇
し、案内筒１０の外側では逆に上部から下部へと
サスペンジヨン液の移動が起こり、全体としてサ
スペンジヨン液の攪拌が行なわれる。

図−４には、培養槽にフルオロカーボンに溶解
させて酸素を導入する装置の縦断面の概略図が示
されている。図−４の装置は、図−２の装置等に
較べるとフルオロカーボン導入口３から酸素を溶
解されたフルオロカーボンが導入され、下方へ落
下する間に培養液と接触して培養液に酸素を供給
し、その後培養槽の下方に貯まり、フルオロカー
ボン排出口４から排出される。なお図−４におい
て、３および４を除いて１〜９は図−２と同じ手
段および装置を意味している。

上記図−１〜図−４において、いずれも培養装
置の内壁の内側に隔壁６によつて仕切られたセト
リングゾーン７が設けられていて、そのセトリン
グゾーンにはサスペンジヨン液の攪拌効果は実質
的に及ばないようになつている。セトリングゾー
ン７の内部では、細胞が重力方向へ沈降し、細胞
を実質的に含まない生育阻害物質を含む古い培養
液が上部に存在するように設計されている。

セトリングゾーンは、その中における培養液の
線速度が、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽
内のサスペンジヨン液の攪拌が及ばない領域が確
保されていればよく、その形状および構造に限定
を受けない。

図−１〜図−４の装置は、セトリングゾーン７
とサスペンジヨン培養ゾーンとが円筒状隔壁６に
よつて仕切られており、該円筒状隔壁６と対向す
る槽側壁の実施的部分が円筒状であり、そして上
記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁とが実質的に同
心に位置しているものである。

さらにセトリングゾーン中には細胞のサスペン
ジヨン培養ゾーン中に流れが形成しないように、
重力方向に伸びてセトリングゾーンを区切る円筒
状邪魔板８が設けてある。

この装置における各培養ユニツトにおいて、
Ｖ／Ｓ（ここで、Ｖはサスペンジヨン培養ゾーン
内の培養液の体積であり、Ｓは細胞の有効なセト
リング面積である）を算出する基礎となるＳは下
記式で表わされる。

Ｓ＝π／４（D²−d²） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄ
は円筒状隔壁６の直径である。また、Ｖは培養槽
の容積から、培養液の存在しない空間部の体積と
セトリングゾーンの容積とを差し引いた体積と理
解されるべきである。

さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養
素の濃度、pHの値を測定し、それらを或る範囲
に維持する装置が一般に設置されているが、本発
明の細胞培養装置にもこれらの装置が備えられて
もよいことは言うまでもない。しかし添付図面に
はこれらの付属装置は省略されている。

本発明の装置を用いて培養を実施するに当つ
て、新しい培養液は、この中にブドウ糖、蛋白質
の如き栄養源、種々のアミノ酸、無機塩、抗生物
質などの細胞培養に必要な成分を水溶液として含
むものが使用されるが、更に血清を含んでいても
よく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジヨン培養装
置への培養液供給口１から、例えば図−１〜図−
４に示すように培養装置の上部に設けられた培養
液供給口１から供給される。またサスペンジヨン
液中へ直接導管を通じて供給してもよい。

また本発明の装置を用いて培養を実施するに当
つて、新しい培養液の供給と、古い培養液の排出
とは、培養装置中の液面の水準がほぼ一定となる
ように維持することが望ましいが、必ずしもその
必要はない。新しい培養液の供給と古い培養液の
排出とは、それぞれ独立して、連続的に行うこと
もできまた間歇的に行うこともできる。

またサスペンジヨン液中の酸素濃度を一定に維
持するために、酸素を供給する方法としては、図
−１、図−２および図−３の如く、サスペンジヨ
ン液中の酸素または酸素含有ガスを直接供給して
もよく、また他の供給手段によつてもよい。他の
供給手段としては、図−４の如く例えば酸素キヤ
リアーを用いる方法である。酸素キヤリアーとし
ては、水と実質的に混合しないで酸素を溶解し得
る液状の化合物が使用され、その例としては、人
工血液の素材として使用されるような種々のフル
オロカーボンが挙げられる。かようなフルオロカ
ーボンを酸素供給手段として使用する場合には、
酸素を溶解させたフルオロカーボンをサスペンジ
ヨン液中の上部から液滴状または薄膜状で添付す
ればよい。

攪拌方法としては、図−１、図−２の示した攪
拌翼の回転による如き機械的攪拌方法、また図−
３に示した案内筒を用いたドラフト効果による方
法、この他図−４に示した酸素を溶解した酸素キ
ヤリアーを用いることにより酸素供給と攪拌を同
時に行なう方法などが挙げられる。もちろんこれ
ら攪拌手段を２つ以上併用することもできる。

また培養を実施するに当つては、培養槽の有効
培養容積（Ｖ）に対して新しい培養液を供給する
割合（新しい培養液の供給量／Ｖ）は１日当り
0.2〜10、好ましくは0.5〜５の範囲とするのが適
当である。

かくして本発明の装置は、細胞のサスペンジヨ
ン培養において、生細胞を含まない古い培養液を
簡単に分離することができ、また細胞破壊片も古
い培養液と共にサスペンジヨン液から除去でき
る。また本発明の装置は構造が簡単であり、その
操作が煩雑でなく工業的装置として適している。
殊に細胞の大量培養、高密度培養に有利である。

【図面の簡単な説明】

図−１〜図−４は、いずれも本発明の培養装置
の概略図の一例を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 細胞培養ユニツトが、細胞のサスペンジヨン
   培養ゾーン、および細胞のセトリングゾーン、該
   セトリングゾーン上部からの培養液排出口とを有
   し、且つ該サスペンジヨン培養ゾーンと該セトリ
   ングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾ
   ーン下方部位を通じて連絡するように仕切りによ
   つて仕切られており、そして該セトリングゾーン
   は、該細胞培養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成
   され、セトリングゾーン内槽内壁に沿つて槽内壁
   と仕切板との間に邪魔板が設置され、しかもその
   邪魔板は、それによつて区切られた領域の培養液
   がセトリングゾーンの上部で流れを形成しないよ
   うに設置されていることによつて特徴づけられる
   細胞培養ユニツトの少なくとも１つを含む細胞培
   養装置であつて、該培養装置の任意のサスペンジ
   ヨン培養ゾーンには培養液供給口が設けられてい
   る灌流培養のための細胞培養装置。