KR910007609B1 - 미립담체에 의한 b형 간염 표면항원의 연속적인 대량 배양방법 - Google Patents

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Description

미립담체에 의한 B형 간염 표면항원의 연속적인 대량 배양방법

제1도는 외경이 23mm인 주침전관을 주심으로 외경이 5mm인 보조관이 3개가 붙어있는 침전관의 모형을 나타낸 것이다.

제2도는 침전관을 사용한 연속 배양장치의 도면이다.

제3도와 제4도는 침전관을 사용한 연속배양시 배양일별 및 배양기관 누적일별에 따른 대사물질들과 B형 간염 표면항원의 생성량 변화에 대한 상관관계를 나타내 주는 그림이다.

제5도는 스크린이 사용된 세포배양 기둥관과 조절배양기에 의한 연속 배양장치를 나타내 주는 도면이다.

제6도와 제7도는 스크린을 사용한 연속배양시 배양일별 및 배양기관 누적일별에 따른 대사물질들과 B형 간염 표면항원의 생성량 변화에 대한 상관관계를 나타내 주는 그림이다.

제8도와 제9도는 미립담체에 B형 간염 표면항원 생산 세포주가 자라는 모습을 기간별로 나타내 주고 있는 그림이다.

본 발명은 변형된 동물세포를 미립담체에 부착하여 침전관 또는 스크린을 사용하여 B형 간염 표면항원을 연속적으로 대량 배양하는 방법에 관한 것이다.

최근에 동물세포 배양기술은 배양생산물의 수요가 급증함에 따라 급속히 발전되어 왔으며, 배양산물로는 인터페론, TPA, 각종 호르몬, 백신, 단일크론 항체 등을 들 수 있는데, 배양방법은 생산물의 종류보다 세포의 성장형태에 의해 선택된다. 동물세포는 그 성장형태에 따라 섬유아세포 등과 같이 임의의 기질 표면에 붙어야만 성장과 증식을 할 수 있는 부착성(anchorage-dependent)세포와 B-세포 하이브리도마 등과 같이 배지속에서 분산된 형태로 성장, 증식하는 부유성(anchorage-independent)세포로 구별할 수 있다. 모든 단일크론 항체의 생산과 호르몬의 일부는 부유성 세포를 배양하여 얻고 있으며, 백신과 대부분의 호르몬등은 부착성 세포를 배양하여 생산하고 있다.

백신류를 생산하기 위해서는 부착성 세포가 표면에 부착하여 증식하기 때문에 초기배양장치는 Roller bottle 이나 Roux bottle을 사용하였다. 그러나, 상기의 배양방법은 대량생산을 위해 확대(scale-up)시킬 수 없으며, 또한 세포농도를 극대화 하기 위해 배양용기내의 배양조건을 임의로 조절할 수 없는 단점을 지니고 있다. 따라서, 현재는 대량배양을 수행할 수 있도록 세포 배양방법 및 장치가 많이 개발되어 있는데, 중공섬유(hollow fiber), 미세캡슐화(microencapsulation), 세포침전장치(cell settler), 미립담체(microcarrier)등을 들 수가 있다.

중공섬유(hollow fiber)에 의한 방법은 병원에서 사용하고 있는 혈액 투석기와 유사한 형태로 실관을 통하여 영양분을 공급하고 세포 대사물질을 배출하는 형태의 배양방법이다. 중공섬유를 이용할 때 섬유자체가 세포가 붙어 자랄 수 있는 담체(matrix)로도 작용하여 세포의 종류에 관계없이 배양할 수 있다는 장점을 지니고 있다.

또한, 세포생산물의 높은 생산성과 교반을 해주지 않음으로써 동물세포에 기계적 손상을 주지 않음으로 인한 반응기의 안정성 때문에 산업적으로 널리 이용되고 있다.(참조; Knaxek, R.A. et al., Science178, 65, 1972)

그러나 세포가 자라는 극미세공간(extra capillary space)에서의 영양분 이동의 균등한 분배문제, 적절한 배양 환경조건의 조절문제, 기공장해(pore plugging)문제, 배양기가 상당히 비싸다는 점 등 해결해야 할 많은 문제점들이 남아 있다.

미세캡슐화(microencapsulation)에 의한 방법은 F.Lim 등(Lim.F., Biometrical Application of microencapsulation, CRC press, 1984, pp. 137-154)에 의해 동물세포 배양에 응용되었으며, 이 방법은 적절한 크기의 고분자 막에 집어 넣음으로써 교반에 대한 세포의 안정성, 중공섬유에 의한 방법과 유사한 세포생산물의 분리, 정제의 용이성 등이 있다. 그러나 주로 하이브리도마 세포의 배양에 이용되며, 주된 문제점은 세포가 자라는 부분내에 pH, 용존산소, 기질의 농도 등을 측정, 제어할 수 없다는 것과 기질의 공급이 주로 확산에 의하므로 확산속도에 의해 세포증식이 제한된다는 단점을 지니고 있다.

세포침전장치(cell settler)를 사용하는 방법은 주로 하이브리도마 세포의 배양에 사용하는 것으로 세포의 비중이 배지의 비중보다 커서 침전관을 이용할 때 세포는 배양기 밑으로 가라 앉아 분산 배양되고, 배지만을 침전관 위로 빠져 나가게 하는 방법이다. 이는 특별한 배양장치를 요하지 않기 때문에 비교적 저렴할 뿐만 아니라 배양기관도 반영구적이라 할 수 있다. 그러나, 배지의 유출속도를 어느 한계 이상 높히면 세포가 딸려 올라가는 현상이 일어남으로 확대생산성의 문제점으로 지적되고 있다.

미립담체(microcarrier)를 이용한 방법은 반 베젤(Van wezel, A.L., Nature,216, 64, 1967)에 의해 개발된 것인데, 처음에는 고체성 미립담체(solid microcarrier)형태의 이온교환겔인 디이에이-세파덱스(DEAE-sephadex)A-50을 세포가 붙어서 자랄 수 있도록 하였다.

그후, 여러 가지 담체의 개발과 더불어 부착성 세포의 대량 배양을 위해 사용되어 왔고(Levine, D, W., et al., Biotechnol. Bioeng.,21, 821, 1979), 최근에는 대공성 미립담체(microporous microcarrier)가 개발되어 부유성 세포의 경우에도 적용시킬 수 있는 것으로 발표되었지만, 산업적으로는 주로 부착성 세포에 쓰이고 있다.

미립담체를 사용하는 경우는 비교적 배양방법이 손쉬우며, 비용도 저렴하고, 또한 단위 부피당 상당히 큰 표면적을 제공하기 때문에 유리한 점이 많다.

그러나, 배양초기에 세포의 접종량이 많고 세포가 담체의 표면에만 부착되어 있기 때문에 높은 세포농도를 얻기가 어렵다. 그리고 세포 반응기에서 배양 담체간의 충돌 및 담체 주변에 생기는 소용돌이(eddy) 또는 전단응력 등의 수력학적인 영향(hydrodynamiceffect) 때문에 어느정도 이상의 교반에서는 세포가 죽어 가는 현상이 일어난다.

본 발명에서는 미립담체에 B형 감염 표면항원을 생산할 수 있도록 적절히 유전자 조작에 의해 변형된 쥐의 섬유아세포를 부착하여 배양하도록 고안하였다. 상기에 언급한 미립담체로는 디이에이-세파로스(DEAE-sepharose), 큐에이세파로스(QAE-sepharose), 시토덱스(Cytodex) 3등을 적용하였으며, 특히 대량배양으로는 QAE-sepharose를 미립담체로 사용하는 것이 바람직하였고, 배양장치는 세포 침전장치 방법을 더욱 개발하여 특수한 침전관을 고안하여 배양체의 침전효율을 높여 유출속도의 극대를 이루어 고농도 배양을 할 수 있었으며, 또한 세포배양기둥관을 사용한 방법으로 흐름유동을 이용하여 수력학적(교반)인 영향을 최소화하고, 조절배양관을 분리하여 적절한 환경조건 조절기능을 만들 수 있었으며, 이 배양의 문제점인 스크린의 장해(plugging)현상을 없애는 분리관 기능을 첨가하였다.

이 두 방법을 병용하여 배양초기에는 침전관을 사용하여 미립담체 위에 세포의 고른성장을 유도하고, 세포 성장기 후반부터 미립담체의 비중이 커진 후 흐름유동(fluid dynamics)을 적용시켜 세포농도를 극대화 함으로써 반영구적 고농도 연속배양이 가능하게 되었다.

[실시예 1]

미립담체 선별 및 배양배지 최적조건 실험

본 발명에 사용된 세포주는 B형 간염 표면항원(HBsAg)을 생성분비하는 HV1-4 세포로서 부착성 섬유 아세포이다. 이 HV1-4 세포주를 부착시키기 위해 미립담체로서 DEAE-sepharose와 QAE-sepharose를 사용하였으며, 배양기로는 1.5L 스피너 플라스크(spinnerflask)를 사용하여 최종 부피가 500ml가 되도록 하였다. 세포수확방법은 기존의 알려진 방법에 따라 수행하였다. 즉, B형 간염표면항원 생산 세포주가 중간대수 증식기에 도달하였을 때(1-2×10⁶cells/ml) 배양용기내의 배양배지를 완전히 제거시킨 후 무기질 배지(mineral broth(MB)) 또는 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺가 배제된 인산완충용액(Ca⁺⁺, Mg⁺⁺free PBS)으로 2회에 걸쳐 세척하고, 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 배양용기에 1ml 첨가한 다음, CO₂배양기에서 1-2분 동안 방치하여 세포들이 배양용기로부터 분리되도록 유도하고, 이때 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM배지 4ml를 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 세포용액을 수확하였다.

본 발명에 사용된 미립담체를 각각 1.5g씩 꺼내어 무기질 배지 또는 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺가 배제된 인산완충용액으로 함수시킨 후, 70% 에탄올을 사용하거나 또는 121℃에서 15분간 살균기로 멸균시키고 10% 우태아혈청이 첨가된 배양배지에 옮겨 넣은 다음, 같은 배지로 3회 이상 세척하여 적당한 pH 및 온도를 유지하였다.

이때 상기에서 수확한 세포용액에서 1×10⁸세포를 미립담체와 섞은 다음 1.5L 스피너 플라스크에 넣은 후 최종 부피가 500ml가 되도록 맞추어 주었다. 배양초기에는 HV1-4 세포를 미립담체에 효과적으로 부착시키기 위해 10-20rpm이 속도로 1분간 교반하고 50분간 정지시키는 방식으로 3회에 걸쳐 수행한 다음 20rpm으로 배양을 시작하였다.

성장기(growth phase)에서는 20-30rpm의 속도를 유지해 주면서 2일 간격으로 배양배지를 완전히 교체 하였으며, 15-20일간의 성장기가 끝나고 수확기(production phase)에는 30-60rpm의 속도를 유지하면서 3일 간격으로 배양배지를 완전히 교체해 주었다.

본 발명에 사용된 배양배지 조성은 90% DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 40μMCdCl₂로 되어 있으며, 각각의 배양시 세포농도의 측정(참조: Sanford K.K. et al., J.NAT. Cancer Inst.11,773, 1951), 각 대사산물-포도당(참조 : Raanbo E, et al., Scand Lab Invest.12,402, 1960), 젖산(참조 : Henry RJ., Clinical Chemistry-Principle and Tachnics. Harper Row, New York 664-666, 1968), 암모니아(참조 : Okuda, H. et al., Exptl. Med12,11, 1965)의 측정은 공시의 방법을 사용하였으며, 세포 생성물인 B형 간염 표면항원 측정은 EIA(Enzyme-immuno assay)방법을 사용하였다.

표 1에서 장기간 배양(long-term culture)에 있어 DEAE-sepharose 보다는 QAE-sepharose를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

미립담체로서 QAE-sepharose를 사용할 때 B형 간염 표면항원 생성량은 6mg HBsAg/L/3day의 수준을 2개월 이상 유지하였으며, 시료를 채취하여 현미경 관찰을 하였을 때 세포가 미립담체에서 이탈되는 현상도 관찰되지 않는 것으로 보아 매우 우수하다는 것을 할 수 있었다.(제8도, 제9도)

[표 1]

* 배지조성 : DMEM(90%)+NBCS(10%)+CdCl₂(100uM)

* 세포의 수 : 1×10⁸세포/500ML 성장배지/1.5g M.C.

* 교반속도 : 30-60RPM

표 2에서는 QAE-sepharose를 사용하여 배양할 때 혈청변화, 포도당(glucose) 농도변화, 금속이온 효과, 혈청고갈(serum-shock)등의 시험을 통해서 최적의 배지조건을 만들어 주었다.

혈청의 경우 NBCS 보다는 FBS의 경우가 B형 간염 표면항원 생산성을 보였으며, 탄소원인 포도당의 경우 고농도로 첨가된 DMEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 금속이온의 Cd⁺⁺에서 Sn⁺⁺치환 또는 Sn⁺⁺의 첨가 유무에 따른 B형 간염 표면항원의 생성량에는 커다란 변화가 없었으며, 혈청이 고갈되었을 때 배양생성물의 정제는 용이하나, 생성량이 40% 정도 감소하는 경향을 보여 주었다.

따라서, 최적의 배양배지 조성은 90% DMEM(4.5g/L포도당), 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 40μM CdCl₂로 만들어지는 것이 좋은 것으로 나타났다.

[표 2]

* 미립담체 : QAE-SEPHAROSE(23ML, 1.5g M.C.)

* 세포의 수 : 0.8-1.0×10⁸세포/500ML 성장배지

* 교반속도 : 30-60RPM

[실시예 2]

침전관에 의한 입자 분리능력시험

상기의 배치 배양방법은 오염 가능성이 클 뿐만 아니라, 배양 배지내로 영양분의 원활한 공급 및 대사산물의 신속한 제거를 할 수가 없는 단점을 지니고 있다. 또한 배양 배지내의 용존산소, 이산화탄소, pH 등의 조절이 용이하지 못하기 때문에 충분한 양의 B형간염 표면항원을 생성하기에는 적합하지 못한 배양장치이다.

이러한 단점을 보완하기 위해 반연속 또는 연속세포배양 장치인 침전관을 제작하였다.(제1도)

상기의 침전관을 가지고 직경과 비중이 다양한 입자들을 선별하여 각각에 대한 분리능력을 시험해 보았다.

그 결과는 표 3에서 보여주고 있다.

미생물을 제외하고는 동물세포, 미립담체, 엘지네이트(Alginate)비드 등은 모두 좋은 분리능력을 나타내었으며, 입자와 배양액의 경계면이 선명하게 분리되어 나타남을 확인하였다.

따라서, 입자들의 비중이 1.03 이상되며 직경이 30㎛ 이상되는 입자들은 본 침전관에서 효과적으로 적용되어질 수 있음을 알 수 있었다.

[표 3]

[실시예 3]

침전관에 의한 배양방법

상기의 침전관을 가지고 1.5L 스피너 플라스크에 장치한 다음 미립담체로서 QAE-sepharose를 사용하여 연속 배앙을 실시하였다.

연속 배양장치는 제2도에 상세히 나타나 있다. 이때 사용된 세포주, 배양배지, 초기배양 방법은 실시예 1과 같은 방법으로 수행하였으며, 사용한 미립담체 양은 1L 배양액당 100ml을 사용하여 배양하였고, 여기에 탄산가스, 산소, 공기 그리고 질소를 사용한 조절기능을 갖추어 제2도와 같은 시스템으로 배양하였다. 이때 주입되는 가스는 배양체에 기계적인 손상을 주지 않기 위해 배양배지의 표면을 통해서 들어가도록 조절하였으며 임펠러의 속도는 30-60rpm을 유지하였다.

제2도의 배양장치로 대사물질의 소모 및 생성 그리고 간염 표면항원의 생성에 관한 결과는 제3도, 제4도에 나타나 있다.

간염 표면항원의 생성량은 포도당의 소모 및 생성 젖산의 생성 사이에 밀접한 상관관계를 찾아볼 수 있었다.

또한 배지의 교체 속도 그리고 영양원의 고갈(nutrient shock)에도 영향을 받은 것을 알 수 있었다.

또한 이 배양장치로 하루에 1.5-3L의 배지를 교체하였고, 성장기(growth phase)는 약 15일 소요되었으며, 그 이후에는 수확기로서 거의 일정한 세포대사 물질의 생성분비와 간염 표면항원 농도를 나타내었다. 특히 간염 표면항원 농도는 3mg/L/day 정도의 수준을 보여주었고, 세포침전관의 분리효과는 1.5L 스피너 플라스크에서 하루에 약 7L정도로 배양배지의 4-5부피까지 교체가 가능하였고, 0.2-0.5vvm량의 4가지 가스를 사용하여 조절기능도 좋아서 이 배양장치로 2개월 이상의 연속배양이 가능하였다.

[실시예 4]

스크린을 사용한 연속배양

실시예 3에서의 침전관을 사용한 연속배양은 양호한 결과를 얻었으나, 배양배지의 표면으로 가스의 주입을 조절하는 배양장치로는 대량 배양을 위해서는 적절하지 못하며 또한 임펠러의 속도가 올라감에 따라 고농도의 세포수를 유지하기에 어려움이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 세포배양 기둥관을 사용하여 배양배지의 흐름 유동(fluid dynamics)과 배양 용기내 임펠러의 회전유동을 병행 실시함으로써 가능하였다. 조절 배양기(Celligen control reactor)로부터 우리가 원하는 상태로 적절히 조절된 배양배지를 배양 기둥관 밑으로 흘러 보냄으로써 흐름 유동을 유발시키고 동시에 임펠러 속도를 낮출 수 있어 세포의 기계적 손상을 줄일 수 있게 되었다.

제5도의 배양장치에서 4번 펌프에 의해 조절배양기로 들어온 배지는 배양기 안에서 원하는 상태로 조절되어 2번 펌프에 의해 분리관(Decanting column)을 통해 세포배양 기둥관 하부로 들어간다. 이때 5번 펌프에 의해 수확되어진 배양배지 양만큼 새로운 배양배지는 액면조절기(level controller)에 의해 조절배양기로 계속해서 들어가게 된다.

세포배양 기둥관 하부로 돌아온 배양배지는 기둥관 위로 향하면서 흐름유동을 유발시키고 상부의 스크린을 통하여 조절 배양기로 되돌아가게 된다. 이때 임펠러의 회전속도는 10-20rpm으로 하고, 배양배지의 흐름은 하루에 60-300L의 속도로 하여 배양체의 부유를 유도하였고, 배양기둥 전체길이의 3/4을 넘지 않도록 하였다. 장기간 배양시 배양체 및 기타물질에 의해 상부의 스크린이 막혀 흐름저항을 생기게 하므로 상부 스크린 아래 구멍으로 배양배지를 빨아내어 배지의 흐름방향을 반대로 바꾸어 스크린의 부착물질을 제거하고 이때 역회전에 의해 빨려나온 약간의 배양체는 분리관에 모여 세포 기둥관 하부로 다시 들어가게 하였다.

실험 방법은 제5도의 배양장치에 나타나 있는 세포 배양 기둥관에 상기에 언급한 실시예 1과 같은 방법으로 QAE-sepharose를 전처리하여 1L 배양배지당 100ml의 미립담체를 넣고, 세포농도는 미립담체 1ml당 1×10⁶세포를 넣었으며, 초기배양방법도 상기와 같은 방법으로 하였다. 그후 조절 배양기에서 서서히 배양배지를 세포 배양배지관으로 불어 넣으면서(60-300L/day) 임펠러 속도를 10-20rpm으로 유지하면서 미립담체를 부유케 하였으며, 배양기간과 넣어주는 배양액의 부피에 따라서 임펠러 속도를 줄이는 대신 배지의 유입속도를 크게 하였다. 이때 배양체의 높이는 세퐁 배양 기둥관의 3/4을 넘지 않도록 유지하였으며, 배양기간이 길어짐에 따라 배양체의 비중이 커지게 되면 이에 상응하여 배지의 유입속도를 크게 해 주었다.

이 배양장치에서 용존산소 및 pH 조절은 4가스(공기, 산소, 이산화탄소, 질소)를 사용하여, 실시하였고, 가스의 유속은 0.2-2vvm으로 조정하였다.

성장기는 10-15일 정도이었고, 그후 조절능력이 켜서 계속적인 조절이 가능하여서 4mg/L/day 수준의 B형 간염 표면항원을 생산할 수 있어서 실시예 3보다 33% 수율 향상을 나타내었다.(제5도, 제6도)

또한 실시예 3에서 보다 임펠러에 의한 손상을 줄여 줌으로써 세포의 성장속도를 빠르게 유도하였으며, 세포성장이 끝난 후에도 고농도의 B형 간염 표면항원을 생성할 수 있도록 세포를 보다더 안정하게 유지시킬 수 있었다.

Claims (17)

1. 미립담체를 사용하여 동물세포를 배양함에 있어서, 침전관 또는 스크린이 장치된 배양기에서 동물세포를 연속적으로 대량 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 미립담체가 디이에이 세파로스(DEAE-Sepharose), 큐에어 세파로스(QAE-Sepharose), 시토덱스(Cytodex), 큐 세파로스(Q-Sepharose), 플라스틱, 젤라틴 또는 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 담체의 농도를 최종 배양액 부피의 5-20%로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 동물세포가 부착성 또는 비부착성 동물세포인 방법.
5. 제4항에 있어서, 동물세포주가 B형 간염표면항원을 생산하기 위해 적절히 유전자 조작되어 변형된 쥐의 섬유아세포임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 동물세포의 연속배양을 위해 제1도에 나타나 있는 침전관 및 변형한 형태로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 침전관의 장치는 유리, 스테인레스 스틸, 플라스틱 실리콘관을 사용하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 침전관에 부착된 보조관의 수는 2-5개이며, 각 보조관이 주침전관에 연결위치, 길이 및 직경을 달리하여 사용하는 방법.
9. 제6항에 있어서, 침전관의 사용할 수 있는 미립담체의 크기는 비중이 1.03 이상이며, 직경이 30㎛ 이상으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 스크린을 이용한 동물세포 배양시 제5도에 나타나 있는 배양장치의 사용 그리고 이들 조절, 작동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 스크린이 장치된 배양 반응기에서 순화배지의 양을 1일 동안에 반응기 체적의 10-300배로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 세포 배양기둥관이 원통형, 사각기둥 또는 이의 변형 형태로 사용하는 방법.
13. 제10항에 있어서, 세포배양 반응기의 스크린 밑에 역순화용관을 설치하여 분리관과 연계장치한 경우와 첵 밸브를 사용하여 배양체를 회수하는 방법.
14. 제10항에 있어서, 세포배양 반응기내의 교반속도를 10-20rpm으로 낮추어 배양하는 것을 특징으로 하거나, 순환배지의 속도를 올림으로서 임펠러를 사용하지 않는 방법.
15. 제10항에 있어서, 미립담체가 들어있는 세포배양 반응기와 배양배지의 조절을 위한 조절 배양관이 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 동물세포 연속 배양시에 성장기에는 침전관을 사용하고, 수확기에는 스크린을 사용하여 배양하는 혼합배양장치를 사용하는 방법.
17. 제1항에 있어서, B형 간염 표면항원을 4mg/L/day 이상의 수준으로 2개월 이상 연속적으로 수확할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.

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