KR100420784B1 - 고정화된 미생물을 이용한 세포외 분비 유용물질의연속생산을 위한 개량된 고정화세포 분리장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화된 세포의 연속배양시 고정화된 세포의 유출을 방지하는 개량된 고정화세포 분리장치에 관한 것이다. 본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치는 원통형의 분리관, 분리관을 동심원상으로 둘러싸며, 내측 최상단에 배양액유출관을 구비한 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 기울기를 가지는 하단부로 구성된 1차 분리조; 전기 1차 분리조의 하단부와 인접한 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 기울기를 가지는 하단부로 구성된 2차 분리조; 전기 2차 분리조의 하단부에 연하여 전기 2차 분리조의 하단부 최하단과 동일한 내경을 가지는 배양액유입관; 및, 전기 2차 분리조의 상단부, 1차 분리조의 하단부 및 1차 분리조의 상단부에 걸쳐 내측에 구비된 원통형의 공기유출관을 포함한다. 본 발명에 의하면, 고정화세포의 연속배양시 고정화된 미생물의 손실을 현저히 감소시킬 수 있으므로, 고정화된 미생물의 배양에 널리 이용될 수 있을 것이다.

Description

고정화된 미생물을 이용한 세포외 분비 유용물질의 연속생산을 위한 개량된 고정화세포 분리장치{Improved Immobilized-cell Separating Apparatus}

본 발명은 개량된 고정화세포 분리장치에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고정화된 세포의 연속배양시 고정화된 세포를 회수하여 재사용하는 개량된 고정화세포 분리장치에 관한 것이다.

고정화된 세포의 배양은 여러 공정에 응용되고 있다. 특히, 균사 형성 미생물을 고정화시킬 경우, 배양액의 유변학적 특성과 고정화세포의 형태학적 특성으로 인해 배양액의 점도를 상당히 낮출 수 있어, 결과적으로 물질전달 계수가 크게 증대된다. 이러한 고정화 배양의 장점은 회분식 배양에서보다 연속배양에서 두드러지게 나타나는데, 세포 재순환이나 회수공정없이 높은 희석속도(배지공급속도)에서도 높은 균체농도를 유지할 수 있고, 이차대사산물 등 유용물질 생산을 위한 미생물의 배양공정에 적용할 경우, 유용물질의 생산성을 크게 향상시킬 수 있다.

그러나, 고정화된 세포를 연속배양할 경우, 배양기 외부로 유출되는 배양액과 배양기내로 회수해야 할 고정화된 세포를 분리하는 것이 매우 어렵고, 따라서 적정 형태의 배양기 및 고정화세포 분리장치 개발이 생산성 및 조업 안정성을 좌우하게 된다. 특히 배양기내 세포농도가 낮은 조건에서 조업되는 폐수처리 시스템과는 달리 이차대사산물 생산을 위한 미생물 배양공정은 고농도의 세포배양을 필요로 하기 때문에 배양액의 점도 증가에 따른 점도 문제를 해결할 수 있는 효율적인 고정화세포 분리장치가 더욱 요구된다 할 수 있다. 이를 해결하기 위하여, 막이나 필터를 이용하거나 세포 분리장치를 사용하기도 하였으나, 막이나 필터를 이용할 경우, 곰팡이나 스트렙토마이세스 계통의 방선균 같은 균사형성 미생물의 배양시, 이들의 균사가 막이나 필터를 막거나 손상을 주기 때문에 효과적이지 못하여, 세포 분리장치를 이용하는 것이 일반적인 추세이다.

한편, 세포 분리장치를 이용할 경우, 상술한 막이나 필터를 이용한 문제점은 해결할 수 있었으나, 배양액의 점도 및 유속에 크게 영향을 받아 배양이 진행될수록 분리효율이 급격히 감소하는 문제점을 갖고 있었다. 특히, 세포 분리장치를 이용한 세포와 배양액의 분리작업시, 배양액에 유입된 공기에 의하여 세포분리 효율이 저하되므로 이를 해결하려는 노력이 계속되어 왔다. 그 결과, 내부에 분리관과 공기유출관이 구비되어, 배양액과 고정화세포를 효율적으로 분리할 수 있는 고정화세포 분리기(decanter)를 개발하고(참조: 대한민국 특허 제 173086호), 목적하는일차대사산물 또는 이차대사산물 등 유용물질을 세포내에 형성하는 미생물을 고정화시켜 연속배양할 경우에 유용하게 사용될 수 있었다.

그러나, 전기 고정화세포 분리기의 경우 분리기 유입관의 내경이 작아 배양이 진행됨에 따라 고정화된 균체가 분리기 하단부에 축적되었으며 결국 고정화세포 분리기의 입구를 막아 연속배양이 불가능하였다. 이러한 문제점은 유용한 이차대사산물 등을 세포 외부로 분비하는 미생물을 고정화하여 연속배양할 경우에는 더욱 심각해진다. 즉, 내부에 대사산물을 축적하는 미생물을 배양할 때와는 달리, 외부로 대사산물을 분비하는 미생물을 배양할 경우에는, 미생물을 배양하여 담체에 고정화시키는 단계와 고정화된 미생물로부터 대사산물을 생산하는 단계가 분리되는데, 대사산물을 생산하는 단계를 연속배양으로 진행시킬 경우, 미생물의 생장이 거의 이루어지지 않는다. 따라서, 연속배양시 배양액을 따라 고정화된 미생물이 외부로 유출된다면 생산성이 계속 떨어져, 결국 대사산물의 생산이 멈추어지게 된다.

따라서, 대사산물을 세포 외부로 분비시키는 고정화된 미생물의 연속배양에 적용할 수 있도록, 고정화된 미생물의 손실을 최소화할 수 있는 세포 분리장치를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 고정화된 미생물의 손실을 최소화할 수 있는 세포 분리장치를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 내부에 원통형 분리관과 공기유출관이 구비된 원통형의 상부와 하부구조를 가지는 종래의 고정화세포 분리기에서 분리관과 하부구조의 내경을 최적화하여 고정화세포의 세포분리기내 침강을 더욱 원활하도록 개량한 고정화세포 분리장치를 개발하고, 이를 고정화된 미생물의 연속배양에 사용할 경우, 종래보다 효과적으로 고정화세포를 배양액과 분리하여 배양기내에 고농도 세포를 유지시킴으로써 생산성을 극대화함은 물론 안정적인 조업이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 고정화세포의 연속배양시, 고정화된 세포를 배양액으로부터 효과적으로 분리시킬 수 있는 개량된 고정화세포 분리장치를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 개량된 고정화세포 분리장치의 단면도이다.

도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 개량된 고정화세포 분리장치를 사용한 연속배양시, 배양기 내부와 유출된 배양액에 포함된 세포의 농도변화를 나타내는 그래프이다.

도 2b는 본 발명의 일실시예에 따른 개량된 고정화세포 분리장치를 사용한 연속배양시, 배양기와 유출액 중의 고정화 담체의 농도변화를 나타내는 그래프이다.

도 3a는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 고정화세포 분리장치를 사용한 연속배양시, 배양기 내부와 유출된 배양액에 포함된 세포의 농도변화를 나타내는 그래프이다.

도 3b는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 고정화세포 분리장치를 사용한 연속배양시, 고정화담체의 세포담지량과 배양기 내의 고정화 담체의 농도변화를 나타내는 그래프이다.

<도면의 주요 부분에 대한 간단한 부호의 설명>

1: 1차 분리조

2: 2차 분리조

3: 배양액유입관

4: 배양액유출관

5: 분리관

6: 공기유출관

본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치는 원통형의 분리관, 전기 분리관 내경의 1.2 내지 1.4배의 내경을 가지고, 분리관을 동심원상으로 둘러싸며, 내측 최상단에 배양액유출관을 구비한 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 상단부의 측면과 130 내지 170^。의 측면내각기울기를 가지는 하단부로 구성된 1차 분리조; 전기 1차 분리조의 하단부와 연하여 1차 분리조의 상단부 내경의 50 내지 65%의 내경을 가지는 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 상단부의 측면과 130 내지 170^。의 측면내각기울기를 가지는 하단부로 구성된 2차 분리조; 전기 2차 분리조의 하단부에 연하여 전기 2차 분리조의 하단부 최하단과 동일한 내경을 가지고, 2차분리조의 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 갖는 배양액유입관; 및, 전기 2차 분리조의 상단부, 1차 분리조의 하단부 및 1차 분리조의 상단부에 걸쳐 내측에 구비되고, 2차 분리조의 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 갖는 원통형의 공기유출관을 포함한다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여, 본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 개량된 고정화세포 분리장치의 단면도이다. 본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치는 1차 분리조(1), 2차 분리조(2) 및 배양액유입관(3)으로 구성되고, 1차 분리조(1)의 내측 최상단에는 배양액유출관(4)이 구비되고 있으며, 전기 1차 분리조(1)의 내측에는 원통형의 분리관(5)이 구비되어 있고, 전기 2차 분리조(2)의 상단 내지 1차 분리조(1)의 상단에 걸쳐 내측에 원통형의 공기유출관(6)이 구비되어 있다: 이때, 1차 분리조(1)와 2차 분리조(2)는 각각 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 상단부의 측면과 130 내지 170^。의 측면기울기를 갖는 하단부로 구성되고, 1차 분리조(1)의 하단부와 2차 분리조(2)의 상단부가 인접하며, 2차 분리조(2)의 하단부에 2차 분리조 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 가지는 배양액유입관(3)이 연통되어 있다. 또한, 2차 분리조(2)의 상단부의 내경은 1차 분리조(1)의 상단부 내경의 50 내지 65%이고, 분리관(5)은 1차 분리조의 상단부의 내측에 위치하며, 1차 분리조(2)의 상단부 내경의 71 내지 83%의 내경을 가지고, 공기유출관(6)은 2차 분리조(2)의 상단부, 1차 분리조(1)의 하단부 및 1차 분리조(1)의 상단부에 걸쳐 위치하며, 공기유출관(6)의 내경은 2차 분리조(2)의 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 가진다.

이하, 전기 개량된 고정화세포 분리장치의 작용 및 효과를 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치는 고정화된 미생물의 연속배양시 배양액과 고정화된 세포를 중력차에 의하여 분리하는데 사용된다. 일반적으로, 대사산물을 세포 외부로 분비하는 미생물로부터 대사산물을 수득하기 위하여 고정화된 미생물을 연속배양할 경우, 세포의 증식은 거의 수행되지 않고, 대사산물만을 생산하는 배양조건을 사용한다. 이때, 배양액의 유출시 고정화된 미생물까지 동시에 유출된다면, 세포의 증식이 이루어지지 않는 상태에서 미생물의 손실이 발생하므로, 결국에는 배양기내 미생물이 고갈되어 대사산물의 생산이 멈춰지게 된다. 이를 방지하기 위해서는, 고정화된 미생물이 완전히 배제된 배양액만을 유출시켜야만 한다. 본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치는 고정화된 미생물의 연속배양시, 배양기의 배양액을 유출시키는 관에 연결하여 사용하는 것으로서, 먼저, 2차 분리조(2)의 하단부와 연통된 배양액유입관(3)을 통하여 고정화된 미생물과 혼합된 배양액이 유입되고, 유입된 배양액은 공기유출관(6)을 따라 1차 분리조(1)의 상단부까지 유입되는데, 2차 분리조(2)에 비하여 단면적이 급격히 증가된 1차 분리조(1)에서는 유입속도가 현저히 저하되므로, 흡입(suction)에 의한 항력보다 중력에 의한 영향이 우세하여 배양액에 포함된 고정화된 미생물이 배양액으로부터 1차 분리되고, 경우에 따라 배양액에 공기가 혼합될 수도 있다. 이어, 배양액은 1차 분리조(1)에 구비된 분리관(5)을 따라 1차 분리조(1)의 하단부로 하강하면서 배양액과 혼합된 공기를 분리시키고, 분리관(5)의 최하단에서 배양액과 고정화된 미생물이 중력에 의하여 2차 분리된다. 그런 다음, 배양액은 1차 분리조(1)의 벽을 따라 상승하여 배양액유출관(4)을 통하여 외부로 유출되고, 고정화된 미생물은 1차 분리조(1)의 하단부 및 2차 분리조(2)를 거쳐 배양액유입관(3)으로 유입되고, 배양기내로 회수된다. 이 경우, 고정화된 미생물과 배양액이 2단계에 걸쳐 분리되므로, 고정화된 미생물의 손실을 극소화할 수 있어, 고정화된 미생물을 이용한 대사산물의 생산을 최대화할 수 있다.

이때, 배양액유입관(3)에서 배양액의 유입과 고정화세포의 침강이 동시에 이루어지므로, 유입관의 내경이 최적화되지 않을 경우 고정화세포가 배양기내로 되돌아가지 않고 축적되는 문제점이 발생할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여 본 연구진은 안쪽에 설치된 공기유출관의 내경을 0.7배 줄이고, 배양액유입관의 내경을 2배 증가시킴으로써 침강이 더욱 원활하도록 하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고정화세포의 연속배양

스트렙토마이시스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis(KCCM 11390))를 셀라이트 담체(Manville, Co., USA)에 고정화시키고, 연속조업 시 개량된 고정화세포 분리장치를 사용하였다. 세포를 고정화한 후, 농축된 생산배지와 증류수로 부피를 맞추어 최종 담체 농도가 50%(v/v)가 되도록 하였다. 연속배양은 29℃, pH 4.0 내지 7.2, 교반속도 350 내지 430rpm, 그리고 통기속도 2 내지 3 L/min의 조건 하에서 수행하였고, 산소제한이 걸리지 않도록 공기와 함께 순수산소를 공급하였다. 조업부피와 희석속도는 각각 2L와 0.05hr^-1로 조절하였다. 공급되는 배지의 조성은 다음과 같다: 엿당 30g/L, 글리신 10g/L, NaCl 1g/L, CaCl₂0.1g/L, K₂HPO₄1.4g/L, PEG-2000 2g/L, H₂SO₄1ml, 미량원소용액(MgSO₄·7H₂O 28.9g/L, FeSO₄·7H₂O 0.5g/L, ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L, MnSO₄·H₂O 0.1g/L, CuSO₄·5H₂O 0.05g/L, CoCl₂·6H₂O 0.04g/L) 20mL/L. 또한, 2차 분리조의 상단부 내경은 40mm, 1차 분리조의 상단부 내경은 53mm, 공기유출관의 내경은 20mm, 분리관의 내경은 46mm, 배양액유입관의 내경은 18mm인 고정화세포 분리장치를 사용하여 고정화된 세포와 배양액을 분리시켰다.

초기 배양시 중성조건에서 배양을 시작하였고, 세포생장이 활발한 시점에서 pH를 산성조건으로 급격히 강하하였다. 이러한 산성조건 하에서 48시간 동안 유지시킨 후, pH를 다시 중성조건으로 상승시켜 발효 종료 시점까지 이 조건을 유지하였다. 이와 같이 세포에 pH 충격(shock)을 가함으로써 카수가마이신 생합성을 유도하였다(참조: 도 2a, 도 2b). 도 2a는 연속배양시 배양기 내부와 유출된 배양액에 포함된 세포의 농도변화를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 배양기와 유출액 중의 고정화 담체의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, 배양기내 세포농도는 배양 393시간 후부터 18g/L를 유지하였고, 유출액 중의 세포농도는 4.0 내지 7.0g/L로 유지되었다. 또한, 세포부하량은 90mg-cell/g-celite로 일정하게 유지되었다. 이러한 결과는 배양기내의 셀라이트 담체가 유실됨이 없이 거의 일정하게 유지되었기 때문이다. 도 2b에서 보듯이, 배양기내의 셀라이트 담체 농도는 연속배양 직후 162g/L에서 배양 854시간 후 82% 수준인 136g/L에 달하였다. 이는 약 26g/L의 셀라이트 담체가 유실되었음을 의미한다. 좀 더 정밀히 측정한 결과, 유실된 담체 중 55%가 시료채취에 기인하였고, 나머지 45%는 유출액을 통해 유실되었음이 확인되었는 바, 실제로 유출액을 통해 유실된 담체는 8.1% 밖에 되지 않았으므로 고정화세포 분리장치의 분리효율이 탁월함을 알 수 있었다. 카수가마이신은 560 내지 760mg/L 범위의 농도로 생산되었다.

비교실시예 1: 종래의 고정화세포의 연속배양

2차 분리조의 상단부 내경은 40mm, 1차 분리조의 상단부 내경은 53mm, 공기유출관의 내경은 30mm, 분리관의 내경은 40mm, 배양액유입관의 내경은 10mm인 고정화세포 분리장치를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고정화세포를 연속배양하였다(참조: 도 3a, 도 3b). 도 3a는 연속배양시 배양기 내부와 유출된 배양액에 포함된 세포의 농도변화를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 고정화담체의 세포담지량과 배양기 내의 고정화 담체의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 3a에 보듯이, 배양기내의 세포농도는 배양 448시간 후, 최고 농도인 17.5g/L에 도달하였다. 그러나, 계속적인 셀라이트 담체의 유출은 배양기내의 세포농도 감소를 유발시켰다. 도 3b에서 보듯이, 배양기내 셀라이트 담체 농도는 연속조업 개시 98시간 후부터 감소하기 시작하여 배양 592시간 후에는 84g/L에 도달하였다. 이는 연속조업 개시 직전 담체 농도의 52%에 해당한다. 도 3a에서 보듯이, 유출된 배양액 중의 세포농도는 6g/L를 유지한 후, 셀라이트 담체가 유출됨에 따라 증가하였으므로, 배양 568시간 후 부터는 배양기내 세포농도와 유출액 중 세포농도의 차는 상당히 줄어들었으며, 이는 고정화세포 분리장치의 분리성능이 현저히 저하하였음을 의미한다. 이후, 희석속도를 낮추거나 고정화세포 분리장치를 흔들어 주는 등 인위적으로 세포 분리장치 하단에 축적된 담체를 배양기 내로 되돌리려는 어떠한 시도도 성공하지 못했으며, 결국, 더 이상의 연속조업이 불가능하였다.

또한, 고정화 담체에 대한 세포의 부착성을 나타내는 지표인 세포담지량은 최고 값인 82mg-cells/g-celite에 도달한 후, 담체의 유실에 따라 점차 감소하여 44mg-cells/g-celite에 도달하였다. 이에, 시료를 채취하여 전자현미경 사진을 판독한 결과, 스트렙토마이세스가 셀라이트 담체에 비균일적으로 고정화되었음을 발견하였으며, 이러한 사실은 애큐리(Arcuri)등에 의해 이미 보고된 바 있다. 이러한 현상은 고정화세포 분리장치의 분리능이 감소하여 담체가 유출되는 상황에서 많은 양의 세포가 고정화된 담체가 그렇지 않은 담체에 비해 밀도가 낮고 더 높은 항력(drag force)을 받기 때문에 더욱 쉽게 유실되었을 것으로 추측되는 바, 담체의 유실에 따른 세포부하량의 감소의 직접적인 원인으로 판단된다.

유출액 중의 카수가마이신 농도는 최고 602mg/L까지 도달한 후 점차 감소하여 배양 532시간 후에는 191mg/L에 도달하였다. 계속적인 담체의 유출로 인한 배양기내에 생합성 상태가 좋은 균주의 유실로 결국 약 250mg/L로 감소된 상태에서 유지되었다.

상술한 실시예 1 및 비교실시예 1에서 보듯이, 개량된 고정화세포 분리장치의 분리관, 공기유출관, 2차 분리조의 상단 및 배양액유입관의 내경을 최적화하여, 고정화된 세포를 배양액과 더욱 효과적으로 분리시킬 수 있었으며 이의 결과로 배양기내에 생합성능이 우수한 세포를 일정하게 유지시킴으로써 세포외 분비 대사산물의 안정적인 생산이 가능하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 고정화된 세포의 연속배양시 고정화된 세포의 유출을 방지하는 개량된 고정화세포 분리장치를 제공한다.본 발명의 개량된 고정화세포 분리장치를 이용하면, 고정화된 미생물의 연속배양시 효과적으로 배양액으로부터 미생물이 고정화된 담체를 분리하여 배양기내로 되돌림으로써 배양기내에 고농도 세포를 유지시키므로, 세포외로 분비되는 이차대사산물 등 유용물질 생산의 생산성을 극대화할 수 있을 것이다.

Claims (1)

1. (i) 원통형의 분리관, 전기 분리관 내경의 1.2 내지 1.4배의 내경을 가지고, 분리관을 동심원상으로 둘러싸며, 내측 최상단에 배양액유출관을 구비한 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 상단부의 측면과 130 내지 170^。의 측면내각기울기를 가지는 하단부로 구성된 1차 분리조;

   (ii) 전기 1차 분리조의 하단부와 연하여 1차 분리조의 상단부 내경의 50 내지 65%의 내경을 가지는 원통형의 상단부 및 전기 상단부와 연하여 상단부의 측면과 130 내지 170^。의 측면내각기울기를 가지는 하단부로 구성된 2차 분리조;

   (iii) 전기 2차 분리조의 하단부에 연하여 전기 2차 분리조의 하단부 최하단과 동일한 내경을 가지고, 2차 분리조의 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 갖는 배양액유입관; 및,

   (iv) 전기 2차 분리조의 상단부, 1차 분리조의 하단부 및 1차 분리조의 상단부에 걸쳐 내측에 구비되고, 2차 분리조의 상단부 내경의 45 내지 55%의 내경을 갖는 원통형의 공기유출관을 포함하는 개량된 고정화세포 분리장치.