JPS63123379A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ω　産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための方法に関するもの
である。更に詳しくは細胞をサスペンジョン状態で培養
するための方法に関するものである。

細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナ
ル抗体の産生は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

山）　従来技術 従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案がなされている。これらの提案は、大きく分
けて付着培Ｎ　（ａｎｃｈｏｒａａｅ　ｄｅｐｅｎｄ−
ｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　）と浮遊培養、つまりナスペ
ンション培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ
）との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培養
される細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネティックスタラ−もしくは機械
的に駆動されるシレフト上の羽根車によって、スピナー
フラスコの中に調整された撹拌機能を設けた培養方法が
提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号およ
び同第３，６４９，４６５号明ｌｌＩ書参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シートを撹拌機とし、該撹拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによ゛つてヒトの２倍体細胞のような
成る種の虚弱細胞に対し所望の穏かな撹拌を作り出すサ
スペンジョン培養装置が提案されいる。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定足の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長が比較
的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を大口に且つ高密
度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽中へ
供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養槽外
へ排出しながら培養する方式すなわち通称バーヒユージ
ョン方式と言われる方式が提案されている（Ａｎｎｕａ
ｌ　ＲｅｐｏｒｔｓＯｒ　ｌ”ｅｒｍｅｎｔｅＮｏｎ　
Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、　ｖｏｌ、５参照）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは
、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効
率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養
槽内の細胞の成育環境を最適条件下に維持することであ
る。サスペンジョン液から生細胞と古い培養液とを分離
するために種々のフィルターやまた種々の形式が提案さ
れているが、フィルターの口塞りや、装置の構造の煩雑
性などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足すべ
きものとは言い難い。

特開昭５６−８２０８３号公報および特開昭６０−９４
８２号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培養
上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管から
培地を添加し同時に上記排出管から培養上清を排出しつ
つ培養を行うようにした浮遊細胞の高濃度培養が提案さ
れている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ミ
クロンと小さくしかもその比重は培地の比重と大ぎな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要があるが上記２件の特開昭に
開示された装置では沈降面積をあまり大きくとることは
できない。

そこで、本発明者の一部は、簡単な構造でサスペンジョ
ン培養液から生細胞と培養液とを分離することが可能で
あり、フィルターを使用した場合に生起するフィルター
の口塞りなどの問題の発生を解消した生細胞と培養液の
分離するための装置および方法について研究を進めた結
果、「細胞培養槽が、細胞のサスペンジョン培養ゾーン
、細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーンからの
培養液排出口および該サスペンジョン培養ゾーンへの培
養液供給口とを有し、該サスペンジョン培養ゾーンと該
セトリングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾ
ーンの下方部位を通じて連絡するように仕切りによって
仕切られており、そして該セトリングゾーンは該細胞培
養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成されていることを特
徴とするサスペンジョン培養のための細胞培養槽から構
成される潅流培養のための細胞培養装置。」および「こ
の細胞培養装置によって細胞をＷｌ流培養する方法であ
って、セトリングゾーンから細胞を実質的に含まない培
養液を抜出し、そしてサスペンジョン培養ゾーンへ新し
い培養液を導入することを特徴とする細胞培養方法。」
を見出し、先に提案したく特願昭６１−８８３９号明細
書参照；昭和６１年１月２１日付出願）。

本発明者は、前記提案装置およびその装置を用いて、細
胞培養を行ったところ、成る程度の規模では特に支障な
く効率的に細胞と培養液を分離できるが、規模が大きく
なると、それに従ってサンペンション培養ゾーンの体積
に対するセトリングゾーンの体積の割合を大きくする必
要が生じ、そのためサスペンジョン培養ゾーンにおける
回転による撹拌力がセトリング培養ゾーンに及ぶことが
避けられず、サスペンジョンゾーン内での細胞の重力沈
降がスムースに行なわれないことが、度々認められた。

このサスペンジョン培養ゾーンでの撹拌は、該培養ゾー
ンとセトリングゾーンとを仕切っている仕切りを出来る
限り下方へ長くしても、規模が大きくなるにつれて、前
記撹拌も強くならざるを得ず、その撹拌力の影響はセト
リングゾーンへ及ぶことは避けられなくなる。

そこで本発明者は、前記した如き細胞のサスペンジョン
培養ゾーンと細胞のセトリングゾーンを設えた細胞培養
槽を用いて、細胞を培養する方法における問題点、特に
規模を大きくした時に生じる問題点を解消すべく、さら
に研究を進めたところ培養槽内の底部に水よりも密度が
大きい特定の液状媒体の層を形成させ、その液状媒体層
を撹拌させながら培養すると培養規模が大きくなり、セ
トリングゾーンを大きくしてもセトリングゾーンでの細
胞のｍカ沈降は乱されることなく効果的に起り、培養液
が細胞と分離されて培養槽外へ容易に取出すことができ
ることがわかった。

（Ｃ）　　発明の構成 本発明は、かかる知見に基いて到達されたものであって
、細胞培養槽が、細胞のサスペンジョン培養ゾーン、細
胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーンからの培養
液排出口および該ナスペンション培養ゾーンへの培養液
供給口とを有し、該サスペンジョン培養ゾーンと該セト
リングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾーン
の下方部位を通じて連絡するように仕切りによって仕切
られており、そして該セトリングゾーンは該細胞培養槽
の槽側壁と該仕切りの間に形成されている細胞培養槽を
用いて細胞を培養する方法であって、該培養槽の底部に
下記性質 （イ）水と実質的に混和せず （ロ）水より密度が大きく且つ （１０動物細胞の生育を実質的に阻害しないを有する液
状媒体の層を形成させ、その液状媒体層を撹拌させなが
ら培養することを特徴とする細胞培養方法である。

かかる本発明方法に従えば、培養槽の底部に前記液状媒
体層を存在せしめ、この液状媒体層を撹拌することによ
って、その液状媒体層の表面、つまり培養ゾーンとの接
触面において上下方向への波立現象を起させ、この現象
によって培養ゾーンでの細胞の分散が助けられるがセト
リングゾーンでの細胞沈降は妨げられない。

従って、本発明によれば、大規模の培養槽であっても培
養槽中に設置させたセトリングゾーンにおいて、生細胞
は重力方向の下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片な
どはセトリングゾーンの上部へ分離されることになるの
で、セトリングゾーンの上部に設けられた培養液の排出
口から生細胞を実質的に含まない培養液を排出すること
ができる。従って本発明は、口塞りの原因となるフィル
ターを使用することなく、簡単な方式によって生細胞と
培養液を効率よく分離することを可能とするので、細胞
の大量且つ高密度培養に適用することができる。

本発明の培養槽は、細胞をサスペンドさせて実質的な細
胞培養を実施する区域と規定できる細胞サスペンジョン
培養ゾーンおよび細胞を重力によって培養液から分離す
る区域と規定できる細胞のセトリングゾーンを有してい
る。細胞のサスペンジョン培養ゾーンと細胞のセトリン
グゾーンとは、細胞培養槽内において該セトリングゾー
ンの下方部位を通じて連絡するように仕切りによって仕
切られている。このような構造を有するため、ｉｌ胞の
セトリングゾーンにおいて、沈降しそして培養液から分
離された細胞は該セトリングゾーンの下方部位を通じて
細胞のサスペンジョン培養ゾーンに再び導入され、その
区域で再び培養される。

本発明の培養槽内の該セトリングゾーンは、該培養槽の
槽側壁と上記仕切りの間に形成されている。このような
構造によって、培養槽内でセトリングゾーンの有効なセ
トリング面積を非常に太きくとることのできる利点があ
る。

本発明の培養槽は、セトリングゾーンにおいて細胞と分
離された古い培養液を排出するための培養液排出口およ
ぞ培養ゾーンへ新しい培養液を供給するための培養液供
給口を有している。

本発明の培養槽において、該セトリングゾーンは、好ま
しくは、該サスペンジョン培養ゾーンの周囲に該サスペ
ンジョン培養ゾーンを取囲むように槽側壁と該仕切りと
の間に形成されている。この好ましい態様において、例
えば該サスペンジョン培養ゾーンと該セトリングゾーン
は円筒状仕切りによって仕切られている。この場合、さ
らに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する槽側壁の実
質的部分が円筒状であり、そして上記円筒状仕切りと上
記円筒状槽側壁とが実質的に同心に位置している。

また、本発明の培養槽は、セトリングゾーンにおける細
胞のセトリングを助長するため、セトリングゾーン内に
細胞のセトリングを助長する手段を有することができる
。その様な手段は、細胞が沈降する重力方向の距離を短
くするような手段であり、例えば重力方向を遮ぎる方向
にラドリングゾーン内に設けられた沈降板であることが
できる。

さらに、セトリングゾーン中には、細胞のサスペンジョ
ン培養ゾーン中に形成される培養液の流動の影響を可及
的に小さくする目的で、重力方向に伸びてセトリングゾ
ーンを仕切るじゃま仮を設けることもできる。重力方向
に角度を有してセトリングゾーン内に設けられたじゃま
板は沈降板としての機能を発揮することは容易に理解さ
れよう。

また、培養槽に、酸素含有ガス導入口、または酸素含有
ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を設け、該導入口から
導入された酸素含有ガスが上背する際の撹拌効果により
培養液中に細胞を強制的にサスペンドさせることもでき
る。

本発明の細胞培養槽はサスペンジョン型の細胞培養に適
用されるが、サスペンジョン型とは、水性媒体中で細胞
それ自体が浮遊しながら、或いは細胞を微小担体くマイ
クロキャリアー）に担持して浮遊しながら、またマイク
ロカプセル中で１ｌｌｌ胞が生育されるような種々の浮
遊培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させなが
ら培養する方式に有利に用いられる。

本発明の方法において培養される細胞は、動物細胞、微
生物細胞などであってもよく、また人為的或いは遺伝子
操作により変性された細胞例えばハイブリドーマであっ
てもよい。殊に本発明の方法は、動物細胞の培養に適し
ている。

本発明にお（プるサスペンジョン型の細胞培養槽中にお
いては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状
態で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体
に、種々の無償塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ等、ア
ミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加
成分が加えられている。また培養液には血清を加えるこ
ともできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液
として使用することも出来る。

本発明の培養槽を用いて細胞を潅流培養する本発明方法
は、セトリングゾーンから細胞を実質的に含まない培養
液を抜出しそしてサスペンジョン培養ゾーンへ新しい培
養液を導入することによって有利に実施される。

その際、セトリングゾーンによって規定される細胞の有
効セトリング面積［５（ｃｎ）］と、サスペンジョン培
養ゾーン内の培養液の体積［Ｖ　（Ｃｒｔ）　］との比
Ｖ／Ｓが好ましくは０．１〜５００ｃＩＲ１特に好まし
くは１〜１００の範囲にある。

本発明方法に用いられる培養槽の底部には、前記、液状
媒体層が形成され、培養液と界面を形成している。この
液状媒体層の厚さは、特に制限を受けないが、液状媒体
層の上層面（培養液との接触面）が、培養ゾーン（おけ
る培養液がセトリングゾーンへ移動を妨げないように、
培養ゾーンとセトリングゾーンとの間に形成された仕切
りの下端よりも、下方に位置する程度にすべきである。

液状媒体層の厚さは培養槽の大きさ、槽の形状、撹拌の
強さなどにより適宜決定される。

また本発明方法は液状媒体層を撹拌し、その表面（培養
液との接触面）に波立を起させて、部分的に表面の上下
運動を起させることが望ましい。

そのために液状媒体層中で回転翼を回転させると共に、
液状媒体が回転円周に沿って回転するのを阻止するよう
なるじゃま板を設けておくのが好ましい。このじゃま板
は、培養層の液状媒体層が形成された底部の槽壁内に数
個所設置することができる。また液状媒体層中の数個所
において回転翼を設けて撹拌することもでき、その場合
槽の円周に沿って液状媒体が回転することがないので特
にじゃま板を設ける必要もないことがある。

本発明において使用される“液状媒″としては下記性質 （イ）水と実質的に混和せず （０１水より密度が大きく且つ （ハ）　動物細胞の生育を実質的に阻害しないを有する
ものである。

かかる液状媒体としては、例えばパーフルオロカーボン
が好適に使用される。

かかるフルオロカーボンとしては、常温で液体であるも
のが有利であり、市販されているものが広く利用できる
。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料として使用されてい
るフルオロカーボン、人工血液として使用されている種
々のフルオロカーボンが使用できる。その具体例として
は、例えば炭素数８以上のパーフルオロアルカン類、パ
ーフルオロシクロアルカン類（例えば、パーフルオロデ
カリン、パーフルオロメチルデカリン、炭素数３〜５の
アルキル置換基を有するパーフルオロアルキルシクロヘ
キサン）、炭素数５〜７のアルキル置換基を有するパー
フルオロアルキルテトラヒドロフラン類、炭素数４〜６
のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキルテトラ
ヒドロビラン類。

パーフルオロアダマンタン類（例えばパーフルオロアダ
マンタン、パーフルオロメチルアダマンタン、パーフル
オロジメチルアダマンタン、パーフルオロジメチルエチ
ルアダマンタン、パーフルオロジエチルアダマンタンな
ど）が挙げられる。前記フルオロカーボンは、種々の基
、例えば第３級アミノ基を含有したものであってもよい
。

以下本発明において使用される培養槽について、添付図
面を用いて説明する。図面は培養槽の概略図を示したも
のである。

図面において培養槽本体１にはその内壁の内側に隔壁２
によって仕切られたセトリングゾーン６が設けられてい
る。溶媒Ｐａ１には新しい培養液の供給導管３を通じて
培養液の供給口が備えられ、導管５を通じて酸素または
酸素含有ガスが供給されるようになっており、酸素濃度
検知センサー７が設けられ、また排ガスの排出導管が設
けられているがこれは図面では省略されいる。ざらにセ
トリングゾーン６の上部には古い培養液の排出口が設け
られ、導管４を通じて培ＰＬＷＪ外へ培養液を排出する
ようになっている。また培養槽底部にはじゃま板９が設
置されている。

図面の培養槽１の底部には液状媒体が導入されており、
液状媒体層１０が形成されている。図面における点線は
液状媒体層と培養液との界面を意味する。

培養層内の液状ばたい層中に撹拌翼８が設けられ、また
前述したようにじゃま板９も設けられている。

かくして液状媒体層１０を撹拌翼８により撹拌すると液
状媒体は撹拌されるが、撹拌翼の回転方向の回転がじゃ
ま板９により阻止され、液状媒体層の表面が渡島現象を
起し、部分的に上下にゆれるようになる。液状媒体層の
表面の渡島によって培養ゾーン中の細胞はサスペンジョ
ン状態に維持される。一方セトリンゾーンは液密になっ
ており、細胞の沈降はスムースに行なわれ、セトリング
ゾーンの上部に設けられた排出口より導管４を通じて細
胞を含まない古い培養液が取り出される。

図面に示すように槽の高さをＨ１槽の直径をＤとしたと
き、Ｈ／Ｄが０．５〜１０、好ましくは１〜５の範囲と
なるような槽が、本発明の培養槽として好ましく使用さ
れる。また槽の全体の形状としては一般に細胞のサスペ
ンジョン型培養に使用されるものであれば種々のものが
用いられる。

セトリングゾーンは、その中における培養液の線速度が
、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽内のサスペンジ
ョン液の撹拌が及ばない領域が確保されていればよく、
その形状および構造に限定を受けない。

図面の培養槽は、セトリングゾーン６とサスペンジョン
培養ゾーンとが円筒状隔壁によって仕切られており、該
円筒状隔壁と対向する槽側壁の実質的部分が円筒状であ
り、そして上記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁とが実質
的に同心に位置しているものである。

この培養槽において、Ｖ／Ｓ　（ここで、■はサスペン
ジョン培養ゾーン内の培養液の体積であり、Ｓは細胞の
有効なセトリング面積である）を算出する基礎となるＳ
は下記式で表わされる。

Ｓ＝π／４　（Ｄ２−ｄ　２　） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄは円筒状
隔壁直径である。また、■は培養槽の容積から、培養液
の存在しない空間部の体積とセトリングゾーンの容積と
を差し引いた体積と理解されるべきである。

さらに培養槽には、二酸化炭素や栄養素の濃度、ｐＨの
値を測定し、それらを成る範囲に維持する装置が一般に
設置されているが、本発明の細胞培養槽にこれらの装置
が備えられてもよいことは言うまでもない。しかし添付
図面にはこれらの付属装置は省略されている。

本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液は、こ
の中にブドウ糖、蛋白質の如き栄養源、種々のアミノ酸
、無機塩、抗生物質などの細胞培養に必要な成分を水溶
液とし含むものが使用されるが、さらに血清を含んでい
てもよく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジョン培養ゾーンへの
培養液供給口から、例えば図面に示すように培養槽の上
部に設けられた培養液供給口から供給される。またサス
ペンジョン液中へ直接導管を通じて供給してもよい。

また本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液の
供給と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準
がほぼ一定となるように維持することが望ましいが、必
ずしもその必要はない。新しい培養液の供給と古い培養
液の排出とは、それぞれ独立して、連続的に行なうこと
もできまた間歇的に行なうこともできる。

本発明の培養方法において、サスペンジョン液中の酸素
濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法とし
ては、前述の如く、サスペンジョン液中の酸素または酸
素含有ガスを直接供給することができる。

また培養は、培ａ槽の有効培養容積（Ｖ）に対して新し
い培養液を供給する割合〈新しい培養液の供給ｍ／■）
は１日当り０．２〜１０、好ましくは０．５〜５の範囲
とするのが適当である。

かくして本発明によれば、細胞のサスペンジョン培養に
おいて、生細胞を含まない古い培養液を筒中に分離する
ことができ、また細胞破壊片も古い培養液と共にサスペ
ンジョン液から除去できる。

また本発明の装置は構造が簡単であり、その操作が煩雑
でなく工業的装置として適している。殊に細胞の大口培
養、高密度培養に有利である。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例 （１）培養槽の形状 添加図面に示したような容積的１０１の容器を培養槽と
して用いた。この容器は図面に示したように撹拌の力が
およばないセトリングゾーンがもうけられている。この
容器下部には撹拌翼８とジャマ板９を全没させるように
約１．２交のフルオロカーボンが入れられており、この
フルオロカーボンを撹拌するような構造をしている。

図面の培養槽におけるＨ：Ｄの比は約１＝１である。

（２）培養液の組成 培養液はタルベツコ変法イーグル培地とＲＰ〜Ｉ　Ｉ　
１６４０培地とハムＦ１２培地を１：２：１の割合で混
ぜたものに、種々のアミノ酸、グルコース、ピルビン酸
ナトリウム、チミジン、塩化コリン、イノミトール等を
加えたものを基礎培地として、これにインシュリン、ト
ランスフェリン、エタノールアミン、セレナイト及びＦ
ｅ２を加えたものを用いた。

（３）培養方法 添付図面で示した培養槽に約８磨の培養液を入れ、撹拌
Ｗを約２０ｒＤｍで回転させて培養した。

この時、細胞は約４すの懸濁液として容器中に存在する
。細胞はマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を親株とするマ
ウス−マウスハイブリドーマを用いた。この細胞は免疫
グロブリン（ＩｇＧ＞産生型の株である。培養槽中己は
、５％ＣＯ２含空気と０２ガスを供給され培養中ｐＨ＝
　６．５〜７．０．溶存酸素３〜４　ｐｐｍにゆるよう
に調節された。培養液の入れ換えは培養を始めた日に開
始し、２１　／ｄａｙ　〜８　（１／ｄｅＶの流速で行
った。培養槽は、３７℃に保たれるような条件とした。

（４）培養結果 培養結果は第１表の通りであった。

表１　培養結果 比較例１ （１）　　培養槽の形状 培養槽としては前記実施例と同じ添付図面と同様の容器
を使用した。ただし、撹拌はフルオロカーボンを用いず
直接撹拌翼によって行った。

その他の培養条件は、前記実施例と同様であった。

［２）　　＠養結果 フルオロカーボンを用いない方法では撹拌の調整が非常
に困難であることが判明した。撹拌を約２０ｒｐｎ＋で
行なうと細胞がうまくセトリングせず、培養上清と細胞
の分離が不可能であった。

撹拌速度を１２ｒｐｍまで下げる、細胞が懸濁せず、培
養槽下部に沈澱してしまい、生存させることができなか
った。結果を表２に示す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明の培養方法を実施するために適した
培養槽の概略図を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞培養槽が、細胞のサスペンジョン培養ゾーン、
   細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーンからの培
   養排出口および該サスペンジョン培養ゾーンへの培養液
   供給口とを有し、該サスペンジョン培養ゾーンと該セト
   リングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリングゾーン
   の下方部位を通じて連絡するように仕切りによつて仕切
   られており、そして該セドリングゾーンは該細胞培養槽
   の槽側壁と該仕切りの間に形成されている細胞培養槽を
   用いて細胞を培養する方法であって、該培養槽の底部に
   下記性質 （イ）水と実質的に混和せず （ロ）水より密度が大きく且つ （ハ）動物細胞の生育を実質的に阻害しないを有する液
   状媒体の層を形成させ、その液状媒体層を撹拌させなが
   ら培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。