JPS6336774A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための装置に関するもの
である。更に詳しくは細胞をサスペンジョン状態で培養
するための装置に関するものである。

細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナ
ル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

（ｂ）従来技術 従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案がなされている。これらの提案は、大きく分
けて付着培Ｍ（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　ｄ（？ｐｅｎ−ｄ
ｅｎｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）と）１遊１８養、つまりサス
ペンジョン培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒ
ｅ）との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培
養される細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうらサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネテイツクスターラーもしくは機
械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピ犬
−フラスコの中に調整された攪拌機能を設けた培養方法
が提案されている（米国特許第２，９５８．５１７　＠
および同第３．６４９．４６５号明細再参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少なくとも１枚の比較的大表面積の屈
撓性シートを攪拌機とし、該１責拌機を回転させて該シ
ートを波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のよう
な成る種の虚弱細胞に対し所望の穏やかな攪拌を作り出
すサスペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のりスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防き゛、細胞を大量に且
つ高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養
槽中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培
養槽外へ排出しながら培養する方式すなわら通常パーヒ
ユージョン方式と言われる方式が提案されている（Ａｎ
ｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒ−ｔｓ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、　ｖｏｌ、６参照）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことの且つは
、１ノスペンシヨン液中の生細胞と前記古い培養液とを
効率よく分離し、古い培養液を１８養槽外へ取り出し、
培養槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持すること
である。サスペンジョン液から生細胞と古い培養液とを
分離するために種々のフィルターやまた種々の形式が提
案されているが、フィルターの口塞りや、装置の構造の
煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足
すべきものとは言い難い。

特開昭５９−８２０８３号公報および特開昭６０−９４
８２　＠公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培
養上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管か
ら培地を添加し同時に上記排出管から培養上清を排出し
つつ培養を行うようにした浮遊細胞の高濃度培養装置が
提案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ミ
クロンと小さくしかもその比重は培地の比重と大ぎな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要がめるが上記２件の特開昭に
開示された装置では沈降面積をあまり大きくとることは
できない。

（Ｃ）発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペンジョン培
養液から生細胞と培養液とを分離することが可能な装置
を提供することにある。

本発明の他の目的は、フィルターなどを使用しなくとも
生細胞と古い培養液とを分離することが可能な装置およ
び方法、従ってフィルターの口塞りなどによる問題の発
生を解消した装置を提供することにある。

本発明のざらに他の目的は、細胞沈降を有利に達成する
ための沈降面積を非常に大きくとることのできる工業的
に有利な４ノスペンシヨン培養のための装置を提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、４ノスペンシヨン培養におい
てしばしば問題となる死細胞およびその破壊片を培養槽
外へ容易に除去可能な装置を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ同密度の培養
に適したパーヒユージョン方式による工業的装置を提供
することにある。

更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかとな
るであろう。

（ｄ）発明の構成および効果 すなわら、本発明者の研究によれば、前記した本発明の
目的および効果は、 細胞培養ユニットが、細胞のりスペンジョン培養ゾーン
、および細胞のセトリングゾーン、該しトリングゾーン
上部からの培養液排出［１とを有し、且つ該サスペンジ
ョン培養ゾーンと該セトリングゾーンとは該細胞培養槽
内で該セトリングゾーン下方部位を通じて連絡するよう
に仕切りによって仕切られており、そして該セトリング
ゾーンは、該細胞培養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成
され、セトリングゾーン内槽内壁に沿って槽内壁と仕切
板との間に邪魔板が設置され、しかもぞの邪魔板は、そ
れによって区切られた領域の培養液がセトリングゾーン
の上部で流れを形成しないように設置されていることに
よって特徴づけられる細胞培養ユニットの少なくとも且
つを含む細胞培養装置であって、該培養装置の任意のＶ
スペンジョン培養ゾーンには培養液供給口が設けられて
いる潅流培養のための細胞培養槽内によって達成される
。

かかる本発明の培養装置では、培養ユニットに設置され
たセトリングゾーンにおいて、生細胞は重力方向の下部
へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片などはセトリングゾ
ーンの上部に分離されることになるのでセトリングゾー
ンの上部に設けられた培養液の排出Ｌ１から生細胞を実
質的に含まない培養液を排出Ｊることができる。また本
発明の装置は培養ユニットを１個でもよいが２個以上任
意に重ねて描成すると、培養の実質容積に対し、比較的
大きいセトリングゾーンの容積を投首することが容易で
あり、また必要によりｔＪｌ’を養ユニットを増減して
培養規模を変化させることができる。

ざらに本発明は、１塞りの原因となるフィルターを使用
することなく、簡単な方式によって生細胞と培養液を効
率よく分離することを可能とするので、細胞の大開且つ
同密度培養に右利に適用することができる。

本発明の培養装置における培養ユニットは、細胞をリス
ベンドさせて実質的な細胞■８養を実施する区域と規定
できる細胞のりスペンジョン培養ゾーンおよび細胞を車
力によって培養液から分離する区域と規定できる細胞の
セトリングゾーンを有している。細胞のりスペンジョン
培養ゾーンと細胞のセトリングゾーンとは、細胞培養槽
内において該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡
するように仕切りによって仕切られている。このような
構造を有するため、細胞のセトリングゾーンにおいて、
沈降しそして培養液から分離された細胞は該セトリング
ゾーンの下方部位を通じて細胞のりスペンジョン培養ゾ
ーンに再び導入され、その区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリングゾーン
は、該培養装置の外側壁と上記仕切りの間に形成されて
いる。このような構造によって、培養装置内でセトリン
グゾーンの有効なセトリング容積を比較的大きくとるこ
とのできる利点がある。

本発明の装置は、培養ユニットのセトリングゾーンにお
いて細胞と分離された古い培養液を排出するための培養
液排出口および培養装置へ新しい培養液を供給するため
の培養液供給口を上記培養装置の任意の個所に１個所以
上有している。かかる供給口は装置内の上部に設けるこ
とが望ましい。

本発明の培養ユニットにおいて、該セトリングゾーンは
、好ましくは、該サスペンジョン培養ゾーンの周囲に該
サスペンジョン培養ゾーンを取囲むように装置側壁と該
仕切りとの間に形成されている。この好ましい態様にお
いて、例えば該サスペンジョン培養ゾーンと該セトリン
グゾーンは円筒状仕切りによって仕切られている。この
場合、ざらに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒状仕切
りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に位置している
。

さらに、本発明における培養ユニット内のセトリングゾ
ーンは内槽内壁に沿って槽側壁と仕切板との間に邪魔板
が設置され、しかもその邪魔板は、それによって区切ら
れた領域の培養液がセトリングゾーン上部で流れを形成
しないように設置されている。ずなわら、具体的には例
えば図−１から理解できるように、邪魔板８（３個設け
られている）は、セトリングゾーン７（槽側壁５と仕切
板６との間に設置され−（いる）に設置され、ぞの上部
では邪魔板によって区切られた領域（図−１の場合は７
の領域）の培養液がないに流れを形成しないように間隙
を有しないで区切られている。

このようにセトリングゾーンにおける邪魔板は、その目
的を構成するために、その上部に少なくとも設置されて
いればよく、その長さは仕切板との関係から（上部から
見て）それと同じか或いは短いことが好ましい。また邪
魔板は平板であることが望ましいが、前記培養液の流れ
を形成しないという目的を達成する限り、連通孔を有し
ていても差し支えない。

ざらに邪魔板は且つである必要はない。それ以上あって
もよいが一般には１〜３個が有利である。

セトリングゾーン内における邪魔板が設置されていない
か或いは設置されていたとしても、その上部に間隙があ
る場合にはセトリングゾーン上部で培養液の流れが形成
されることがしばしば起り、そのために本来の目的であ
るセトリングゾーン内部での細胞と培養液との重力によ
る分離が効果的に行われず、細胞を含まない培養液の排
出がスムースに実施し難くなる。

これに対し本発明によれば、セトリングゾーン内部の殊
に上部において邪魔板により培養液の流れが形成されな
いために、細胞の重力沈降が効果的に行われ、細胞を含
まない培養液の排出が有利に行うことが可能となる。

本発明の細胞培養装置はりスペンジョン型の細胞培養に
適用されるが、″サスペンジョン型とは、水性媒体中で
細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞を微少担体（
マイクロキレリアー）に担持しで浮遊しながら、またマ
イクロカプセル中で細胞が生育されるような種々の浮遊
培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊さＵながら
培養する方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞は、植物
細胞、動物細胞、微生物細胞などであってもよく、また
人為的或いは遺伝子操作により変性された細胞例えばハ
イブリドーマであってもよい。殊に本発明の培養装置は
、動物細胞の培養に適している。

本発明におけるサスペンジョン型の細胞培養装置中にお
いては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状
態で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体
に、種々の照Ｉａ塩、ビタミン類、捕酵素、ブドウ糖、
アミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添
加成分が加えられている。また培養液には血清を加える
こともできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養
液として使用することもできる。

本発明の培養装置を用いて細胞を潅流培養する場合には
、セトリングゾーンから細胞を実質的に含まない培養液
を扱出しそして培養装置へ新しい培養液を導入すること
によって有利に実施される。

その際、各培養ユニットにおけるセトリングゾーンによ
って規定される細胞の有効レトリング面積［Ｓ　（ｃｍ
２）　］と、サスペンジョン培養ゾーン内の培養液の堆
積［ｖ（ＣＩｌ１３）］トノ比■／Ｓカ好ましくは０１
１〜５００ｃｍ　、特に好ましくは１〜１００ｃｍの範
囲にある。

以下本発明の装置について図面により更に詳細に説明す
る。

先ず添付した図１〜図４により本発明を説明すると、図
１〜図４は何れもそれぞれ本発明の装置の概略図の一例
を示した：ｂのである。

図１．において、培養ユニット本体５にはでの内壁の内
側に隔壁６によって仕切られたセトリングゾーン７が設
けられている。培養ユニット５には新しい培養液の供給
導管１を通じて培養液の供給口が備えられ、導管３を通
じて酸素または酸素含有ガスが供給されるようになって
おり、また排ガスの排出導管４が設けられている。ざら
にセトリングゾーン７は円筒状邪魔板８で仕切られ流れ
を生じない構造となっており、さらに各領域の上部には
古い培養液の排出口が設けられ、導管２−１〜２−４を
通じて培養ユニット外へ培養液を排出するようになって
いる。

培養ユニット５中に攪拌装置９が設置され、それを回転
させることによって細胞がサスペンジョン状態に維持さ
れている。

本発明の装置でいう培養ユニットとは図−２においては
、培養装置の縦長方向に直角断面を切った時に、培養液
の排出口２−１−１から２−２までの占める区域を且つ
の培養ユニットということができる。図−２においては
４つの培養ユニットを包含している。

一方図−３において、１〜９は図−２と同じは能を持っ
た手段および装置を意味する。図−２と異なるのは、培
養槽１の中に案内筒１０が設けられ、その案内筒１０の
Ｆ部に酸素または酸素含有ガスを導管３を介して供給す
るようになっている点である。この案内筒１０の下部に
酸素または酸素含有ガスを供給することによってサスペ
ンション液は案内筒１０の内部を下部から上部へ上昇し
、案内筒１０の外側では逆に上部から下部へとサスペン
ション液の移動が起り、全体としてサスペンジョン液の
攪拌が行なわれる。

図−４には、培養槽にフルオロカーボンに溶解させて酸
素を導入する装置の縦断面の概略図が示されている。図
−４の装置は、図−２の装置等に較べるとフルオロカー
ボン導入口３から酸素を溶解されたフルオロカーボンが
導入され、下方へ落下する間に培養液と接触して培養液
に酸素を供給し、その後培養槽のＦ方に貯まり、フルオ
ロカーボン排出口４から排出される。なお図−４におい
て、３および４を除いて１〜９は図−２と同じ手段およ
び装置を意味している。

上記図−１〜図−４において、いずれも培養装置の内壁
の内側に隔壁６によって仕切られたセトリングゾーン７
　／ＪＥ　Ｆ、Ｑ　ＧＪられていて、そのセトリングゾ
ーンには４ノスペンジヨン液の攪拌効果は実質的に及ば
ないようになっている。セトリングゾーン７の内部では
、細胞が重力方向へ沈降し、細胞を実質的に含まない生
育阻害物質を含む古い培養液が上部に存在するように設
置１されている。

セトリングゾーンは、その中における培養液の線速度が
、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽内の゛サスペン
ジョン液の攪拌が及ばない領域が確保されていればよく
、その形状および構造に限定を受けない。

図−１〜図−４の装置は、セトリングゾーン７とサスペ
ンジョン培養ゾーンとが円筒状隔壁６によって仕切られ
ており、該円筒状隔壁６と対向する槽側壁の実施的部分
が円筒状であり、そして上記円筒状隔壁と上記円筒状槽
側壁とが実質的に同心に位置しているものである。

ざらにセトリングゾーン中には細胞のサスペンジョン培
養ゾーン中に流れが形成しないように、重力方向に伸び
てセトリングゾーンを区切る円筒状邪魔板８力見２けで
ある。

この装置における各培養ユニットにおいて、■／Ｓ　（
ここで、■はりスペンジョン培養ゾーン内の培養液の体
積であり、Ｓは細胞の有効なセトリング面積である）を
算出する基礎となるＳは下記式で表わされる。

π Ｓ＝　−（Ｄ２−ｄ２　） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄは円筒状
隔壁６の直径である。また、■は培養槽の容積から、培
養液の存在しない空間部の体積とセトリングゾーンの容
積とを差し引いた体積と理解されるべきでおる。

さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養素の′ａ
度、ｐｌ＋の伯を測定し、それらを成る範囲に維持覆る
装置が一般に設置されているが、本発明の細胞Ｊ＆ｒＪ
菰置に装これらの装置が備えられてもよいことばｇうよ
でもない。しかし添付図面にはこれらの付属装置は省略
されている。

本発明の装置を用いて培養を実施するに当って、新しい
培養液は、この中にブドウ糖、蛋白質の如き栄養源、種
々のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培養に必要
な成分を水溶液として含むものが使用されるが、更に血
清を含んでいてもよく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、１ノスペンシヨン培養装置への
培養液供給口１から、例えば図−１〜図＝４に示すよう
に培養装置の、Ｌ部に設けられた培養液供給口１から供
給される。またサスペンション液中へ直接導管を通じて
供給してもよい。

また本発明の装置を用いて培養を実施するに当って、新
しい培養液の供給と、古い培養液の排出とは、培養装置
中の液面の水準がほぼ一定となるように維持することが
望ましいが、必ずしもその必要はない。新しい培養液の
供給と古い培養液の排出とは、それぞれ独立して、連続
的に行うこともできまた間歇的に行うこともできる。

また］ノスベンジョン液中の酸素濃度を一定に維持する
ために、酸素を供給する方法としては、図＝１１図−２
および図−３の如く、サスペンジョン液中の酸素または
酸素含有ガスを直接供給してもよく、また他の供給手段
によってもよい。他の供給手段としては、図−４の如く
例えば酸素↓【／リアーを用いる方法である。酸素キャ
リアーとしては、水と実質的に混合しないで酸素を溶解
し１７る液状の化合物が使用され、その例としては、人
″工血液の素材として使用されるような種々のフルオロ
カーボンが挙げられる。かようなフル７１［コカーボン
を酸素供給手段として使用する場合には、酸素を溶解さ
けたフルオロカーボンをサスペンジョン液中の上部から
液滴状または薄膜状で添加すればよい。

攪拌方法としては、図−１２図−２の示した滑拌翼の回
転による如き機械的攪拌方法、また図−３に示した案内
筒を用いたドラフト効果による方法、この地図−４に示
した酸素を溶解した酸素キ【・リアーを用いることによ
り酸素供給と攪拌を同時に行なう方法などが挙げられる
。もらろんこれら攪拌手段を２つ以上併用することもで
きる。

また培養を実施するに当っては、培養槽の有効培養容積
（Ｖ）に対して新しい培養液を供給する割合（新しい培
養液の供給量／Ｖ）は１日当り０．２〜１０、好ましく
は０．５〜５の範囲とするのが適当である。

かくして本発明の装置は、細胞のりスペンジョン培養に
おいて、生細胞を含まない古い培養液を簡単に分離する
ことができ、また細胞破壊片も古い培養液と共に１ノス
ペンシヨン液から除去できる。

また本発明の装置は構造が簡単であり、その操作が煩雑
でなく工業的装置として適している。殊に細胞の大量培
養、高密度培養に有利でおる。

【図面の簡単な説明】

図−１〜図−４は、いずれも本発明の培養装置の概略図
の一例を示したものである。 ］＼ ソ 図−１ 図−２ Ｉ￥Ｉ−３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 細胞培養ユニットが、細胞のサスペンジョン培養ゾーン
   、および細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーン
   上部からの培養液排出口とを有し、且つ該サスペンジョ
   ン培養ゾーンと該セトリングゾーンとは該細胞培養槽内
   で該セトリングゾーン下方部位を通じて連絡するように
   仕切りによって仕切られており、そして該セトリングゾ
   ーンは、該細胞培養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成さ
   れ、セトリングゾーン内槽内壁に沿って槽内壁と仕切板
   との間に邪魔板が設置され、しかもその邪魔板は、それ
   によって区切られた領域の培養液がセトリングゾーンの
   上部で流れを形成しないように設置されていることによ
   って特徴づけられる細胞培養ユニットの少なくとも１つ
   を含む細胞培養装置であって、該培養装置の任意のサス
   ペンジョン培養ゾーンには培養液供給口が設けられてい
   る潅流培養のための細胞培養装置。