JPH0393799A - プロティンｃの活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロテインＣを活性化するための新規な方法に
関する。本発明方法は、プロテインＣをチモーゲン（酵
素前駆体）から活性化プロテインＣに変換するための簡
単かつ有効な手段を提供するものである。プロテインＣ
を活性化するための従来の方法は、プロテインＣの不活
性なチモーゲンを、溶液中の高レベルのトロンビン、ま
たはトロンビンとトロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏ
ｍｏｄｕｌｉｎ）との混合物、または活性化するための
他の高価な酵素により処理することからなっていた。本
発明は、固定化トロンビンを使用してプロテインＣを活
性化することにより、トロンボモジュリンを必要とする
ことなく、固定化トロンビン複合体から除去されて容易
に精製することのできる活性化プロテインＣ分子を得る
ための方法を提供するものである。

血液凝固調節におけるプロテインＣの役割ビタミンＫ依
存性血漿タンパク質であるプロテインＣは、ホメオスタ
シス（恒常性）の制御にとって生理学的に極めて重要な
ものである。プロテインＣは、本明細書では形成期プロ
テインＣと呼ぶ、不活性な分子として合成される。形成
期プロテインＣは、以下でより詳細に説明するように、
複雑なプロセッシングを受けて多くの種々の不活性分子
を生じさせるものである。分泌された、不活性なプロテ
インＣを、本明細書ではチモーゲンプロテインＣと呼ぶ
ことにする。プロテインＣの活性化は、トロンボモジュ
リンートロンビン複合体が関与する反応によって血液中
で起こる。活性化プロテインＣは、そのコ，ファクター
であるプロテインＳと共に、重要な生理学的意義を有す
る抗凝血物質である。活性化プロテインＣは血管内の血
栓形成を予防することができ、また既に存在している血
餅の広がりを抑制することができる。活性型プロテイン
Ｃの作用機序および不活性なチモーゲンが活性プロテア
ーゼに活性化される機序は最近明らかにされた［概説と
しては、ガーディナー（Ｊ．Ｅ．　Ｇａｒｄｉｎｅｒ）
およびグリフィン（Ｊ，　｝Ｉ．　Ｇｒ汀ｆｉｎ）のＰ
ｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，　１３
巻，　２６５−２７８頁，エルマー●ビー６ブラウン（
Ｅｌｍｅｒ　Ｂ．Ｂｒｏｗｎ）ｌ，Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ
　Ｓｔｒａｔｔｏｎ，　　Ｉｎｃ．　，　１９８３を参
照のこと］。

プロテインＣの活性化にはトロンビン、凝固カスケード
における最終セリンプロテアーゼ、およびトロンボモジ
ュリンと呼ばれる内皮細胞膜一関連糖タンパク質が関連
している。トロンボモジュリンは、トロンビンと堅い、
化学量論的な複合体を形成する。トロンボモジュリンは
、トロンビンと複合体化した場合、トロンビンの機能性
を全体として変化させる。トロンビンは通常、フィブリ
ノーゲンを凝固させ（ｃｌｏｔ）、血小板を活性化し、
そして凝固コファクターである第Ｖおよび第■因子をそ
れぞれの活性型であるＶａおよび■ａに変換させる。そ
して最後にトロンビンは、プロテインＣを活性化するが
、それは極めて遅く、非効率的である。これとは対照的
に、トロンボモジュリンと複合体化したトロンビンはフ
ィブリノーゲンを凝固させず、血小板を活性化せず、ま
たは凝固因子である第■因子および第■因子をそれぞれ
活性型の第Ｖａ因子および第■ａ因子に変換させないが
、プロテインＣの非常に有効なアクチベーターになる。

トロンボモジュリンートロンビンによるプロテインＣの
活性化の速度定数は、トロンビン単独の速度定数よりも
１．０００倍高い。

活性化プロテインＣがどのようにして血液凝固を低下調
節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）するのかを理解する
ため、以下に凝血酵素系の簡単な説明を行う。凝血系は
、活性セリンブロテアーゼに至るチモーゲンの連続的な
活性化に関連した連鎖反応と見なされる。この連鎖反応
は、限定タンパク質分解反応を介して血漿フィブリノー
ゲンを不溶性ゲルのフィブリンに変換するトロンビン酵
素を結果として産生させる。凝固カスケードにおける２
つの重要な事象は、凝固因子ＩＸａによる凝固因子Ｘか
らＸａへの変換、および凝固因子Ｘａによるプロトロン
ビンからトロンビンへの変換である。これら両反応は共
に、細胞表面上、最も普通には血小板表面上で起こり、
そして両反応ともコファクター（補助因子）が必要であ
る。系中において主要なコファクターである第Ｖ因子お
よび第■因子は、比較的不活性な前駆体として循環して
いるが、トロンビンの最初の幾つかの分子が形成されれ
ば、トロンビンはループバック（ｌｏｏｐ　ｂａｃｋ）
　Ｌ、限定タンパク質分解を介してそれらコファクター
を活性化する。活性化されたコファクターである第Ｖａ
因子および第■ａ因子はプロトロンビンのトロンビンヘ
の変換、および第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を約５ケ
タの大きさだけそれぞれ促進させる。活性化プロテイン
Ｃは、タンパク質分解的に崩壊するまで、不活性な凝固
因子の第Ｖおよび第■因子の活性型である凝固コファク
ター第Ｖａ因子および第■ａ因子に対して優先的に機能
し、それらを加水分解し、そして不可逆的に破壊する。

対照的に、凝固因子第■および第■因子は、活性化プロ
テインＣに対して非常に僅かしか反応しない物質である
。

活性化プロテインＣに対して重要なコファクターは、も
う１つのビタミンＫ依存性の血漿タンパク質、プロテイ
ンＳである。プロテインＳは、第Ｖａ因子および第■ａ
因子の活性化プロテインＣ介在性加水分解を２５倍実質
的に増大させる。

治療物質としてのプロテインＣ プロテインＣは、価値ある治療物質として認識されてい
る［たとえば、欧州特許公開第０２１５５４８号および
米国特許第４，　７７５，　６２４号を参照のことコ。

活性化プロテインＣは、ヘパリンおよび経口用ヒドロキ
シクマリン型の抗凝血物質などの市販されている抗凝血
物質よりも広い治療指数を有している新規な抗血栓物質
である。凝固因子■の第Ｖａ因子への変換、および第■
因子の第■ａ因子への変換にはトロンビンが必要とされ
、これら２つのコファクターの活性型は活性化プロテイ
ンＣにとって優先的な基質であるので、チモーゲンプロ
テインＣまたは活性化プロテインＣはいずれもトロンビ
ンが生成されるまで機能しない。さらに、チモーゲンプ
ロテインＣが活性化されるには、トロンビンが必要であ
るが、その理由はトロンボモジュリンートロンビン複合
体が無ければ、プロテインＣチモーゲンはその活性型に
変換されないからである。

活性化プロテインＣは、コファクター第Ｖａおよび第■
ａ因子を不活化することによって機能するものであり、
したがって需要性のある抗凝血物質である。トロンビン
は第■および第■囚子をそれらの活性型である第Ｖａお
よび第■ａ因子に変換するのに必要であるので、プロテ
インＣのみがトａンビンが生成された後に抗凝血物質と
して機能する。このような活性化プロテインＣとは対照
的に、従来の抗凝血物質は患者に投与されている限りは
循環している間一定の抗凝血状態を維持するので、それ
により出血という合併症発現の危険性がプロテインＣま
たは活性化プロテインＣ以上に実質的に増大される。し
たがって、活性化プロテインＣは、ヘバリンおよびヒド
ロキシクマリン類に替わる薬物として広範に臨床応用さ
れ得る需要性ある抗凝血物質である。

遺伝的なプロテインＣ欠損症など、ある種の疾患症状で
は、プロテインＣチモーゲンは治療学的に極めて重要で
ある。先天的なホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）の
プロテインＣ欠損症では、罹患個体は、しばしば致死的
な散在性の血管内凝固という病態である、電撃性紫斑病
のため、幼少年期に死亡してしまう。ヘテロ接合性（ｈ
ｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）のプロテインＣ欠損症では、
罹患個体は重篤な再発性血栓塞栓症に見舞われる。血友
病Ｂまたは第ＩＫ因子欠損症を処置するよう設計された
、不純物としてプロテインＣを含有する血漿タンパク質
濃縮物は、ヘテロ接合性プロテインＣ欠損症における血
管内凝血の予防および処置に有用であることが臨床的に
十分確立されている。さらに、散在性の血管内凝血など
の血栓状態、ならびに重い外傷、重い手術および癌など
の、血栓にかかり易くなった疾病状態においては、プロ
テインＣレベルが異常に低いことが知られている。

プロテインＣのチモーゲン型は治療には非常に有用であ
るが、疾患の中には、プロテインＣの活性型を患者に投
与することによって、より効率的に処置することができ
るものがある。たとえば、心筋梗塞または深部静脈血栓
（特に、下肢の手術後に発症したもの）などの疾患にお
いては、患者は、正常レベルのプロテインＣチモーゲン
を有しているが、活性化プロテインＣのレベルは血栓の
生成を予防し、または存在する血栓を除去し得る程には
十分なものでない。活性化プロテインＣを十分な量だけ
生成することができないことは、トロンボモジュリンが
不適当なレベルであることにその原因がある場合がある
が、原因が何であろうとも、これらの疾患を有効に処置
するに必要なのは、活性化プロテインＣの投与であって
、そのチモーゲンの投与ではない。本発明は、トロンビ
ン／トロンボモジュリン複合体ではなく、固定化トロン
ビンを使用し、プロテインＣを活性化するための新規な
方法を提供するものである。

ヒトプロテインＣの合成および活性化 形成期プロテインＣは以下のように模式図的に表すこと
ができる： １　ブレーブ０　４！１４３　　ＬＣ　　ｌｌ＋？ｌＩ
ＩＩＩＩ　　ＫＲ　　ｌ＠ｌＩｐｏＯ　　ＡＰ　　！Ｉ
ｌｌ！１１　　ＡＩＩＣ　　４１１１＜−１１ｃ−＞ プレーブロー形戊期ヒトプロテインＣの１４２のアミノ
酸残基は、プロテインＣの分泌およびγ一カルボキシル
化の指令にとって重要であるシグナルペブチドおよびヒ
トプロテインＣのブローペブチドをコードしている。

ＬＣ−１度翻訳後修飾を受けた形成期プロテインＣの４
３−１９７アミノ酸残基は、２鎖のチモーゲン（以下に
記載するように、ＫＲジペブチドの除去によりｌ鎖のチ
モーゲンから生成される）、およびプロテインＣの活性
型の両方のＬ鎖（ＬＣ）を構成している。

ＫＲ一形成期ヒトプロテインＣの１９８−１９９アミノ
酸残基である。これらの残基は、おそらく２工程反応、
すなわちまず開裂（１９７−１９８または１９９−２０
０残基間のいずれか）され、次いでカルボキシペブチダ
ーゼまたはアミノペブチダーゼ作用を受ける反応によっ
て除去されると考えられ、それにより２鎖のプロテイン
Ｃが生成される。

ＡＰ一形成期プロテインＣの２００−２　１　１アミノ
酸残基は活性型ベプチドを構成しており、それはプロテ
インＣのチモーゲン型から除去されて活性化プロテイン
Ｃが得られる。

ＡＨＣ−翻訳後修飾を１度受けている、形成期プロテイ
ンＣの２　１　２−４　６　１アミノ酸残基は、活性プ
ロテインＣの活性化Ｈ鎖（ＡＨＣ）を構成している。

ＨＣ−アミノ酸残基２００−４６１のＡＰおよびＡＨＣ
を構成している、翻訳後修飾を１度受けたプロテインＣ
チモーゲンの２鎖形態のＨ鎖である。

ヒトプロテインＣチモーゲンは、肝臓で合成され、血中
に存在するセリンブロテアーゼ前駆体である。プロテイ
ンＣは、完全な生物学的活性を発現するために、ビタミ
ンＫを要する翻訳後修飾を必要とする。限定タンパク質
分解によって、１鎖の前駆体から、成熟した２鎖のジス
ルフィド連結したプロテインＣチモーゲンが生成される
。この限定タンパク質分解は、細胞内プロセッシング期
におけるｌ−４２アミノ酸残基から構成されるプレープ
ロペブチドの開裂と除去、および形成期ポリペプチドの
細胞からの分泌、および１９８および１９９アミノ酸残
基の除去を包含していると考えられ、それによりチモー
ゲンに認められる２鎖が形成される。このチモーゲンの
活性セリンプロテアーゼへの活性化はＡＲＧ−ＬＥＵペ
プチド結合（２ｌ１および２１２残基）のタンパク質分
解的開裂を包含する。この後者の開裂により、２鎖チモ
ーゲン分子の比較的大きい（Ｈ）鎖のアミノ末端を構成
するドデカペブチド（２００−２１１残基）が遊離され
る。プロテインＣは有意にグリコシル化されている。す
なわち、その成熟酵素は〜２３％の炭水化物を含有して
いる。プロテインＣはさらに、γ一カルボキシグルタミ
ン酸およびβ−ヒドロキシアスパラギン酸（エリスロー
し−β−ヒドロキシアスパルテート）などの、普通でな
いアミノ酸を多く含有している。γ一カルボキシアスパ
ラギン酸（ｇｌａ）は、補酔素としてビタミンＫを必要
とする肝ミクロゾームのカルボキシラーゼによるγ−グ
ルタミルカルボキシル化によってグルタミン酸残基から
産生される。

ヒトプロテインＣの活性化も、以下に記載するように、
模式図的に表すことができる。当業者であれば、この模
式図で示された工程の順序がインビボの経路を必ずしも
反映していないことは理解されよう。

プレーブトＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−ＡＨＣ 形成期プロテインＣ ＬＣ−ＫＲ−ＡＰ一＾ＨＣ　　１鎖チモーゲンＬＣ Ｓ−Ｓ ２鎖チモーゲン ＡＨＣ−ＡＰ ＬＣ Ｓ−Ｓ　　活性化プロテインＣ Ｉ ＾ＨＣ 本発明は、固定化トロンビンを使用した、プロテインＣ
チモーゲンを活性化するための新規な方法を提供するも
のである。

本明細書に記載している本発明の説明のため、以下に用
語を定義する。

本明細書に記載しているタンパク質またはペプチド中に
おけるアミノ酸残基゛の略語は、以下のものを使用して
いる： ３文字略語　　　アミノ酸残基　　　ｌ文字略語ＰＨＥ
　　　　フエニルアラニン　　　ＦＬＥＵ　　　　ロイ
シン　　　　　　　　ＬｒＬＥ　　　　インロイシン　
　　　　　ｌＭＥＴ　　　　メチオニン　　　　　　Ｍ
ＶＡＬ　　　バリン　　　　　　　Ｖ ＳＥＲ　　　セリン　　　　　　　Ｓ ＰＲＯ　　　　ブロリン　　　　　　　　ＰＴＨＲ　　
　　スレオニン　　　　　　ＴＡＬＡ　　　　アラニン
　　　　　　　ＡＴＹＲ　　　　チロシン　　　　　　
　　ＹＨ■Ｓ　　　ヒスチジン　　　　　　　ＨＧＬＮ
　　　　グルタミン　　　　　　　ＱＡＳＮ　　　　ア
スパラギン　　　　　　ＮＬＹＳ　　　　リジン　　　
　　　　　　ＫＡＳＰ　　　　アスパラギン酸　　　　
ＤＧＬＵ　　　　グルタミン酸　　　　　　ＥＣＹＳ　
　　　システイン　　　　　　　ＣＴＲＰ　　　　トリ
プトファン　　　　　ＷＡＲＧ　　　　アルギニン　　
　　　　ＲＧＬＹ　　　　グリシン　　　　　　　　Ｇ
Ｅｎｈｔたはエンハンサー−ＢＫウイルスのエンハンサ
ー γ一カルボキシル化一グルタミン酸のγ一炭素にカルボ
キシ基を付加する反応。

γ一カルボキシル化夕冫パク質一幾つかのグルタミン酸
残基がγ一カルボキシル化を受けているタンパク質。

形成期タンパク質−ｍＲＮＡ転写物の翻訳の際に生成さ
れるポリペプチドであって、翻訳後修飾を受ける前のも
の。しかし、グルタミン酸残基のγ一カルボキシル化、
およびアスパラギン酸残−基のヒドロキシル化などの翻
訳後修飾は、タンパク質がｍＲＮＡ転写物から完全に翻
訳される前に起こる場合がある。

プロテインＣ活性一タンパク質分解的、アミド分解的、
エステル分解的、および生物学的（抗凝血またはプロフ
ィプリン分解的な）な活性に関与するヒトプロテインＣ
の性質。タンパク質の抗凝血活性の試験方法は当業界周
知であり、グリンネル（Ｇｒｉｎｎｅｌ　Ｉ）らのＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１１８９（１９８７）に
記載されている。

チモーゲン（酵素前駆体）一タンパク質分解酵素の酵素
学的に不活性な前駆体。本明細書で使用しているプロテ
インＣチモーゲンとは、分泌された不活性型の１鎖また
は２鎖いずれかのプロテインＣを意味する。

本発明は、プロテインＣの新規な活性化法であって、 ａ）不活性プロテインＣを固定化トロンビンと接触させ
、そして ｂ）得られた活性化プロテインＣを精製して固定化トａ
冫ビンおよび他の夾Ｍ物を除去することを特徴とする方
法を提供するものである。

不活性なヒトプロテインＣチモーゲンおよび不活性な形
成期ヒトプロテインＣの生産方法はいくつか開示されて
いるが（欧州特許公開第２１５５４８号および米国特許
第４，　７７５，　６２４号を参照のこと）、この開示
事項には、固定化トロンビンを使用するプロテインＣの
活性化法は記載されていない。従来法は、それに代わっ
て、産生されたプロテインＣチモーゲンを、溶液中α−
トロンビン、トリプシン、ラッセルの毒ヘビの毒液（Ｒ
ｕｓｓｅｌｌ’ｓ　ｖｉｐｅｒ　ｖｅｎｏｍ）第Ｘ因子
アクチベーター、またはトロンビンおよびトロンボモジ
ュリンの混合物などの物質で処理することにより、活性
化プロテインＣを得ていた。これらの活性化法はすべて
、活性化ヒトプロテインＣの組換え的生産を非能率的に
し、汚染の危険性をもたらし、そしてなによりも高価で
ある。ある種の活性化反応は、活性型のペプチドのタン
パク質分解的開裂後にタンパク質分解反応が停止するよ
う、慎重にモニターしなければならず、そうしなければ
、産生される活性化プロテインＣは開裂され、不活性型
に変換されてしまう。

さらに、α−トロンビンは溶液中に保持された場合、自
己消化を起こす傾向にあり、したがってα−トロンビン
を継続的に反応混合物に加えることが必須となる。固定
化トロンビンを使用する本発明のプロテインＣの活性化
法は、トロンビンの自己消化の問題が回避され、トロン
ボモジコリンの必要性が排除された発明である。

本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術によって生成される
ヒトプロテインＣチモーゲンの活性化ばかりでなく、血
漿から単離される天然に存在しているヒトプロテインＣ
の活性化にも使用することができる。キシール（Ｋｉｓ
ｉｅｌ，　ｗ．　）［Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ
，６４　：７６１−７６９（１９７９）］は、血漿から
プロテインＣを単離するためのこのような方法を開示し
ている。

さらに、本発明の方法は、バング（Ｂａｎｇ）らの欧州
特許公開第ＥＰ−０−３２３　１４９に記載されている
ようなプロテインＣ誘導体を活性化することにも使用す
ることができる。また、新しいグリコシル化のパターン
を有する組換えヒトプロテインＣ分子も、本発明の新規
な固定化トロンビン法によって活性化することができる
。

一般に、本発明の方法は、トロンビンを樹脂支持体に固
定化することによって実施される。使用するトロンビン
の種類は多くの因子、特に経費および安全性によって左
右される。ヒト、ウマ、マウスまたはラノト由来のトロ
ンビンが市販されているが、ウシトロンビンが、ヒトウ
イルスの混入のおそれが少ないので、一般に好ましい。

α−トロンビン、β−トロンビンおよびδ−トロンビン
などの幾つかの種のトロンビンも入手することができ、
本発明にとって有用であるが、とりわけαトロンビンが
好ましい。

プロテインＣの活性化に使用するトロンビンを固定化す
るには、多くの種々のタイプの固相支持体を使用するこ
とができるが、セファロースおよびアガロースが好まし
い支持体である。架橋剤としてＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）エステルを使用したアガロースアフィ
ニティー支持体が最も好ましいものである。トロンビン
は、ＨＥＰＥＳなどの非アミノ緩衝液中カラムに結合す
るエプシロンアミ／基であるリジン残基を含有している
。ＨＥＰＥＳ緩衝液はｐＨ約７．６に調節し、トロンビ
ンの安定性を維持させ、リジン残基が十分に脱プロトン
化するようにする。上記エステル中に見いだされる炭素
原子が脱プロトン化リジンによって求核攻撃を受け、そ
れによりこのエステルがトロンビン上のりジン残基と置
換することができるのである。この反応は非常に温和で
あり、トロンビンの安定性は維持されたままである。

トロンビンが支持体と結合すれば、生成する固定化トロ
ンビンは適当な緩衝液と平衡化することができ、プロテ
インＣを加えればそれを活性化することができる。固定
化トロンビンはバッチ反応としてプロテインＣと接触さ
せるか、または固定化トロンビンを含有するカラムにプ
ロテインＣを通過させればよい。プロテインＣは１つの
長いカラムを通過させるか、または短いカラムに再循環
させればよく、反応過程における特定の時点で活性を検
定することができる。固定化トロンビンは溶液中トロン
ビン程容易に分解しないので、固定化トロンビン法は、
従来の可溶性トロンビン法よりも効率的である。固定化
トロンビンのカラムは再使用することができ、たいてい
は１５回もの装填が可能である。トロンビン／トロンボ
モジュリン法で使用されるトａンボモジュリンは固定化
される支持体と共有結合されず、活性化プロテインＣの
最終溶出物が汚染され易いので、固定化トロンビン法は
この従来の固定化トロンビン／トロンボモジ一リン法よ
りも効率的である。このような交差汚染は、固定化トロ
ンビンを単独で使用する場合には問題とならない（それ
は１／１００万部以下である）。

活性化プロテインＣの活性は種々の方法によってモニタ
ーすらことができるが、最も普通の方法は第Ｘａ因子の
１工程凝固検定または活性化部分トロンボブラスチン時
間（ＡＰＴＴ）凝固検定［両者とも、グリンネルらのＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１１８９−１１９２（
１９８７）に記載されている］である。活性化方法も１
９８８年ｌＯ月４日発行のバングらの米国特許第４，７
７５，　６２４号に開示されている。

本発明の方法を実施する第１の工程は、ウシα−トロン
ビン約５０ｍｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
６）約２５ｘＱに溶解することである。

次いで、２５ＪｌＱボトル容量のアフィゲル”（Ａｆｆ
ｉｇｅｌ”）　１　０ビーズを非常に冷えた高度に精製
した水約５００ｚｅで洗浄する。ビーズから過剰の水を
排出させた後、得られた湿潤ビーズをトロンビン溶液に
加え、回転装置によって１〜２時間４゜Ｃにおいて穏や
かに混合する。アフィーゲル−１０°Ｍ樹脂における未
反応の部位をブロックするため、１Ｍグリシン（ｐＨ８
．０）ｌ　ＯＯｔｔ（ｌヲ＋（ＤｔＢＫｔに加え、４℃
においてｌ〜１６時間回転させる。

トロンビンービーズ（Ｔ−ビーズ）を２つの５０ｌＱ容
量滅菌ポリスチレン管に分割し、半分の速度またはそれ
以下の速度で３０〜６０秒間遠心する。

その管を水上に置き、Ｔ−ビーズをｌ〜２分間沈殿させ
、次いで上清を取り出し、捨てる。Ｔ−ビーズ約１２．
５１１２は各管中に入れたままにしておく。

２０ｍＭ｝リスーＨＣｌ２（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ
ＮａＣｆｆ洗浄緩衝岐約３５ｚＩ２を各管に加え、次い
でその管を穏やかに反転させてＴ−ビーズのすべてを再
懸濁させる。得られた管を前記と同様に遠心し、次いで
水上にて完全に沈澱させる。上清を取り出し、捨てる。

この洗浄操作をｌＯ〜１５回繰り返し、次いで最後の上
清のアミド分解活性を確認して非結合または浸出トロン
ビンを検出する。

５　０　４　ｎｍにおける光学密度の変化がＯ．　Ｏ　
Ｏ　２／分以下になったら、Ｔ−ビーズを使用のために
準備する。このＯＤが高すぎる場合は、適切なレベルに
なるまで、洗浄操作を繰り返さなければならない。

上清が適切なレベルの純度を示したなら、遠心したＴ−
ビーズ１ｍｌ２当たり２０ＩＩＩＭトリ７！．−ＨＣＱ
ｐＨ７．４、２００ｍＭ　ＮａＣＣ洗浄緩衝液３収を加
えてＴ−ビーズの２５％懸濁液を調製する。

洗浄緩衝液中、４℃において滅菌状態を保持すれば、そ
のＴ−ビーズはより長期間保存することができる。

１．５ｚｆｆポリプロピレン微小遠心管中、３７℃、２
〜３時間、試験的に活性化することによって、得られた
Ｔ−ビーズ懸濁液のプロテインＣ活性化能について試験
する。プロテインＣの機能活性は、グリンネルらのＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１１１３９−１１９２（
１９８７）に記載されている抗凝固活性操作法、および
Ｓ一２２３８アミド分解操作の両者によって検定するこ
とができる。プロテインＣ固定化トロンビンを入れた微
小遠心管を３０〜６０分間隔で回転させ、プロテインＣ
の機能活性をプラトー状態にする。

以下に実施例を記載し、本発明をさらに詳細に説明する
。

実施例１ ウシα−トロンビンの固定化 パイロジェン不含の高度に精製されたウシトロンビン［
メイルス・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒ＋ｅｓ，　Ｉｎｃ．　ｌインディアナ４６５１５
．エルコート，ボックス２０００，ミルトレルｌ１２１
番）、またはＩＣＮファーマシューテイカルズ（ＩＣＮ
　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，　Ｉｎｃ．　，オ
ハイオ４４１２８．クリーブランド，メイルス・ロード
２６２０１番）から人手］ｌボトル（約５０ｍｇ）を５
０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）２５ｘＣに溶
解した。アフィーゲルＴＭ−１ｏビーズ［バイオラド・
ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ），ニューヨーク１１５７１，ロックビル・セン
ター，メイプル・アベニュー２２０番，　Ｐ．　Ｏ．ボ
ックス７０８番］２５ｘ＆ボトルを、１５０ｘｉ２容量
ガラス溶融漏斗（ｇｌａｓｓ　ｆｒｉｔ『ｕｎｎｅｌ）
中において、非常に冷えた高度に精製した水約３００〜
５００ｚｅで洗浄した。水を添加する毎に、ビーズを再
スラリー化し、決して乾燥状態にならないようにした。

得られたビーズは非常に脆弱であり、容易に破壊される
。

トロンビン溶液を、滅菌した５０１ｌＱ容量ボリスチレ
ン遠心管に移し、洗浄したビーズを加えた。

その遠心管に栓を施し、回転混合装置によって４℃で１
〜２時間穏やかにその内容物を混合した。

次いで、ＩＭグリシン溶液（ｐＨ８．０）１００μｇを
加えて、アフイーゲル−１０ＴＭ樹脂における未反応の
部位をブロックした。その遠心管に再び栓をし、４℃に
お１いて１〜１６時間回転させた。次いで、トロンビン
ービーズ（Ｔ−ビーズ）を２つの別々の５０ｊｌ１２容
量ポリスチレン遠心管に分割し、それらを水浴中に入れ
、さらに冷却した。得られた遠心管を、ベンチ・トップ
型臨床遠心器によって半分の速度またはそれ以下の速度
（約１０００−　２　０　０　Ｏ　ｒｐｍ）で６０秒間
遠心した。その遠心管を注意して水浴に移し、さらに１
〜２分間放置することにより沈澱させた。次いで、滅菌
ピペットにより得られた上清を各遠心管から除去し、各
遠心管中Ｔ−ビーズ約１２．５ｚ＋２を残した。

Ｔ−ビーズ洗浄緩衝液（２０ｍＭ　　｝　！Ｊ　ス−Ｈ
Ｃｌ２ｐＨ７．４、２　０　０＋Ｍ　ＮａＣｌ２）約３
５ｘ＆を各遠心管に加え、堅く栓をし、手作業により穏
やかに反転させ、Ｔ−ビーズを再懸濁した。その遠心管
を半分の速度で６０秒間遠心し、次いで水浴中に１〜２
分間置いた後、滅菌ピペットで上清を除去した。この洗
浄操作を約１０〜１５回繰り返し、混入したエンドトキ
シン、グリシンおよびトロンビンを除去した。

次いで、Ｓ−２２３８アミド分解検定法により、得られ
た上清をチェソクした。ヘレナ・ラボラトリーズ（Ｈｅ
ｌｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）Ｓ　−２　２　
３　８基質ｌボトル（２５ｇｇ）を、０．２ｍｘアクロ
ディスク・フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ　ｆｉｌｔｅ
ｒ）を通して滅菌した、２０ｍＭ｝リスーＨＣＩ２，１
　５０ｍＭ　ＮａＣｆ２（ｐＨ７．４）１８１ｔｌ２中
に溶解した。次いで、２０ｍＭ｝リスーＨＣ（　ｐＨ７
．４、１　５０ｍＭ　ＮａＣＩ２，３ｍＭＣ　ａ　Ｃ　
（ｌ　ｔおよび１ｇｇ／Ｒ＆ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）から構成された希釈緩衝液を調製した。浸出トロン
ビンに関してＴ−ビーズをチェックするため、以下のブ
ロトコールを実施した。使い捨て用マイクロキュベット
中、Ｔ−ビーズ上清１００μＱを希釈緩衝液６００μｅ
およびＳ−２２３８基質溶液３００μｅと混合した。得
られたキュベットをバラフィルム（ｐａｒａｆｉｌＩＩ
１）で覆い、次いで反転させて混合した。４０５ｎｍに
おける光学密度を４分間判読した。△Ｏ．　Ｄ．／分が
Ｏ．　Ｏ　Ｏ　２またはそれ以下の場合、Ｔ−ビーズは
十分に清澄化している。△Ｏ．　Ｄ．／分が０．００２
より大きい場合は、Ｔ−ビーズが浸出トロンビンから十
分に分離するまで上記の洗浄プロトコールを繰り返す。

Ｔ−ビーズが清澄化したなら、遠心管の側面にある目盛
りを使用し、Ｔ−ビーズの相対量を測った。次いで、３
容量のＴ−ビーズ洗浄緩衝液を加え、１から４の希釈度
（２５％）に希釈した。Ｔ−ビーズは滅菌状態を保持さ
せれば、４℃において、より艮期間この溶液中に保存で
き、維持させることができる。

そのＴ−ビーズにおけるプロテインＣの活性化能を試験
するため、再懸濁したＴ−ビーズ４００μＱを１．５ｘ
ｆｆポリプロピレン微小遠心管に移し、半分の速度で６
０秒間遠心し、次いで上清を注意して取り除いた。高品
質の非活性組換えヒトプロテインＣ（１ｇｇ／ｗ＆）５
００μＣを、０．２ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）（これは
カルシウムを除去するためのものである）と共にＴ−ビ
ーズに加えた。得られた遠心管に栓をし、穏やかに数回
反転させ、次いで前と同様に遠心した。その上清から１
００μｇを取り出し、Ｔ−ビーズ希釈緩衝液９００μｅ
と混合し、次いでＯ．Ｄ．，．。ｎｍを判読し、その試
料が組換えヒトプトテインＣ（ｒＨＰＣ）中、ｌｊＩｇ
／ｚ（ｌであることを確認した。

その反応遠心管に再度栓をし、３７°Ｃで２〜４時間穏
やかに回転させた。３０分、１時間、２時間、および４
時間経過時点で、その遠心管を遠心し、試料１０μＱを
取り出した。この１０μｅ試料を希釈して終濃度１０μ
ｇｈ（ｌｒＨＰｃとした。

次いで、この希釈試料５０μｅを活性検定希釈緩衝液６
５０μｇおよびＳ−２２３８基質３００μＱに加え、次
いで反転させて穏やかに混合した。

０．Ｄ．＊ｏｓｎｆｆｌを４分間判読した。Ｏ．　Ｄ．
の変化かＯ：】／分よりも大きくなったなら、それはｒ
ＨＰＣが十分活性であることを示唆している。

実施例２ ｒＨＰＣの活性化 バングらの米国特許第４，　７７５，　６２４号、およ
びグＪンネルらのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：ｌ
１８９−１１９４（１９８７）の教示に実質的にしたが
い、組換えＨＰＣを調製した。ファルマシア・ファース
ト・フローＱ　［Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆａｓｔ　Ｐｌ
ｏｗ　Ｑ］（Ｆ　Ｆ　Ｑ）樹脂１００ｏ２を取り扱い説
明書通りに正しく調製した。次いで、このＦＦＱ樹脂を
２０ｍＭ　　トリス、０，１５ＭＮａＣＱ，２ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ，２＋ｎＭベンズアミジン（ｐＨ７．４）を含有
する緩衝溶液で平衡化させた。ＥＤＴＡおよびペンズア
ミジンは、それぞれ最終容ｆｆｉ４ＩＩＩＭおよび５ｍ
Ｍになるように細胞培養上清に加えた。この培養培地を
一次流速２０ｃｘ／時でＦＦＱカラム（３　Ｘ　１　６
ｃｚ）に通した。得られたカラムをまず２０ｍＭ｝リス
、０．１　５Ｍ　ＮａＣｌ２、２ｍＭ　ＥＤＴＡ．２ｍ
Ｍペンズアミジン（ｐＨ７．４）を含有スル溶ｅ．３　
０　０ｍ（１（３　ｈ　ラム容ｆｆｉ）テ、次いで２０
ＩｌｌＭトリス、０．１　５Ｍ　ＮａＣ＆．．１　０ｍ
Ｍ　ＣａＣＱｘおよび２ＩＩＩＭペンズアミジン（ｐＨ
７．４）を含有する溶液３００肩＆（３カラム容量）で
洗浄した。次いで、この２番目の溶出液を従来からの陰
イオン交換法によって濃縮した。

精製したｒＨＰＣ含有溶液を滅菌した０．２μｍアク口
ディスク・フィルターを介して濾過し、ポリプロピレン
容器に導入した。得られるｒＨＰＣの冫農度は、２０ｍ
Ｍ　　トリスｐ　Ｈ　７．　４．、０．１　５ＭＮ　ａ
Ｃ　１２（Ｃ　ａＣ　Ｑ１は不存在）中、１　−　１　
０ｘｇ／ｘ（１である。（プレー活性化緩衝液）。実施
例１により調製したＴ−ビーズをＴ−ビーズ洗浄緩衝液
で洗浄した後、遠心し、上清を捨てた。Ｔ−ビーズ約５
−７ｘＱは、精製ｒＨＰＣを４５村まで活性化するのに
十分である。プレー活性化緩衝液中、ｒＨＰＣをＴ−ビ
ーズに加え、次いでＥＤＴＡを終濃度０．５ｍＭ　まで
加えた。遠心管の栓をし、３７℃で穏やかに回転させた
。試料として一部を定期的に取り出し、実施例ｌに記載
の方法に実質的にしたがい、アミド分解活性を検定した
。この方法で処置したプロテインＣは２時間以内で１０
０％活性化されることが見いたされた。

当業者ならば、本明細書に記載している特定の物質およ
び操作法と等価の多くのものを、僅かに通常の実験を行
うだけで、認知し、確かめることができるであろう。こ
のような等価物は本発明の範囲内に包含されるものであ
り、特許請求の範囲に含まれるものである。

特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）不活性プロテインＣを固定化トロンビンに接触
   させ、そして ｂ）活性化されたプロテインＣを固定化トロンビンおよ
   び他の夾雑物から分離して精製することを特徴とするプ
   ロテインＣの活性化法。 ２、トロンビンが、ウシトロンビン、ウマトロンビン、
   ヒトトロンビン、マウストロンビンおよびラットトロン
   ビンの中から選ばれる請求項１に記載の方法。 ３、トロンビンが、α−トロンビン、β−トロンビンお
   よびγ−トロンビンの中から選ばれる請求項１に記載の
   方法。 ４、トロンビンがアガロースに固定化されている請求項
   １に記載の方法。 ５、トロンビンがセファロースに固定化されている請求
   項１に記載の方法。 ６、プロテインＣが、ウシプロテインＣ、ヒトプロテイ
   ンＣおよびヒトプロテインＣ誘導体の中から選ばれる請
   求項１に記載の方法。 ７、プロテインＣがヒトプロテインＣである請求項６に
   記載の方法。 ８、トロンビンがウシα−トロンビンである請求項２に
   記載の方法。 ９、ウシα−トロンビンがアガロースに固定化されてい
   る請求項８に記載の方法。 １０、プロテインＣがヒトプロテインＣである請求項９
   に記載の方法。