JP5167146B2 - プレトロンビン−1の活性化方法 - Google Patents
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Description
凝固カスケードの終わりから二番目の工程は、活性酵素トロンビンへの酵素前駆体プロトロンビンのXa因子複合体触媒変換である。プロトロンビンは、肝臓において合成される、一本鎖の、ビタミンK依存性糖タンパク質である。それはglaドメイン、2つのクリングル領域、A鎖、およびセリンプロテアーゼドメイン(B鎖)を含む。トロンビンへの変換には、プロトロンビンが2箇所で切断され、glaドメインおよびクリングル領域が取り除かれ、そしてA鎖とB鎖との間で切断されて、「α-トロンビン」と呼ばれる活性プロテアーゼが生成されることが必要とされる。
本発明はプレトロンビン-1をトロンビンに変換する方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程を含む:(a)pH 6.4〜8.0、30 mM〜110 mM NaClの水溶液中に0.1 mg/mL〜10 mg/mLの濃度でプレトロンビン-1を提供する工程、(b)固相支持体上に固定化されたオスキュタリン-C(oscutarin-C)を提供する工程、ならびに(c)固相支持体1 mL当たり500 mg〜4000 mgのプレトロンビン-1、およびプレトロンビン-1とオスキュタリン-Cとの間の1.8分以上3.5分以下の接触時間が提供されるように、固定化されたオスキュタリン-Cに水溶液を適用し、それによりプレトロンビン-1が切断されてトロンビンを生成し、トロンビン含有溶液が得られる工程。本発明の1つの態様では、プレトロンビン-1の水溶液は、pH=7.4である。本発明の別の態様では、プレトロンビン-1はヒトのプレトロンビン-1である。本発明の更なる態様では、オスキュタリン-Cは、支持体1 mL当たりのオスキュタリン-Cが0.1〜20 mgである濃度で固相支持体上に固定される。関連する態様では、オスキュタリン-Cは、支持体1 mL当たりのオスキュタリン-Cが0.1〜5.0 mgである濃度で固相支持体上に固定される。本発明の別の態様では、固相支持体は架橋アガロースマトリックスを含む。更なる態様では、プレトロンビン-1の水溶液中のNaCl濃度は70 mMである。他の態様では、本発明の方法は、17℃〜45℃の温度、20℃〜37℃の温度、20℃〜30℃の温度、または25℃の温度で行われる。
実施例1
組換え型のプレトロンビン-1を、米国特許第5,527,692号において開示されたTHR101発現ベクターで形質転換したCHO DG44細胞において産生した。細胞をバイオリアクタ中で環流モードで培養した。条件培養培地を採取し、段階的な一連のデプスフィルター、ならびに最終的に0.2μm PES(ポリエーテルスルフォン)二重膜フィルタを通して限外ろ過/ダイアフィルトレーションにより浄化した。浄化した培地を10倍に濃縮するため、30 kDa公称分子量限界ポリエーテルスルホン膜(30 kDa nominal molecular weight limit polyethersulfone membranes)(PELLICON BIOMAX; Millipore Corp、ビレリカ、マサチューセッツ州)で構成される、接線流動限外ろ過装置(tangential flow ultrafiltration system)を使用した。濃縮培地をその後、9.0 g/L プレトロンビン-1の濃度へと、平衡バッファー(20 mM Tris、120 mM NaCl、pH9.1±0.1)の6倍のダイアフィルトレーション容量で、連続してダイアフィルトレーションした。
組換え型PT-1のトロンビンへの変換における、pHの影響を研究した。実験は本質的には実施例1において記載したように、6.8から8.0までの活性化反応のpHで、PT-1 対 固定されたオスキュタリンCの比2000:1、および2.5分の接触時間を用いて実施した。このpH範囲では、PT-1のトロンビンへの最も大きな変換が、pH7.4で報告された。pH6.8では、PT-1のトロンビンへの反応はそれほど効率的ではなく、低いトロンビン収量をもたらした。pH8.0では、PT-1がPT-2に変換されるために、再び低いトロンビン収量をもたらす傾向があった。図3〜5を参照。
PT-1の活性化を、本質的には実施例1で記載したように、pH7.4で多様なNaCl濃度を用いて行った。NaCl濃度の増加は、図6(300 mM NaCl; 29.4 mS/cm)、図7(120 mM NaCl; 14.3 mS/cm)、および図8(70 mM NaCl; 8.7 mS/cm)に示すように、活性化反応を阻害することが判明した。しかしながら、溶液中のPT-1の安定性を維持するために、多少のNaClが反応バッファー中に含まれている必要があった。一連の実験から、70 mM NaClが、PT-1の安定性および活性化効率の適切な組合せをもたらしたことが決定した。
活性化因子カラムにおけるPT-1の滞留時間の活性化への影響を、本質的には実施例1に記載されるような活性化条件で、流速を変えることによって研究した。PT-1の1.0-mLボーラス量を、スケールダウンしたPTAカラムに注入した。画分を回収し、可溶性ベンズアミジンを含む溶液中で急冷し、PT-1、PT-2、およびトロンビン濃度について、逆相HPLCによって分析した。より短い接触時間(より高い流速)は、PT-1のトロンビンへの、より不十分な変換をもたらした。これらの研究もまた、PT-1活性化が初期の変換測定値と比べて、変換過程の終わりでわずかに低下したことを示した。このデータのグラフを図1に示す。
PT-1とPT-2活性化における、プロセスパラメーターの影響を研究した。PT-1およびPT-2各20 mLを、20 mM Tris、120 mM NaCl中に、pH7.4、2〜8℃で17.5時間透析した。透析したタンパク質をその後、同じバッファーにおいて1 mg/mLに希釈した。タンパク質溶液を、等モルインジェクションで0.2〜0.5 mL/分の流速で、活性化因子カラムへ適用した。図2に示されるように、PT-1のトロンビンへの変換率は、PT-2の変換率より大きかった。また、図2に示されるように、PT-1に対する接触時間の関数としての変換下降率はPT-2より少なく、PT-2変換が活性化因子上の接触時間により、影響をより受けることを示している。
Claims (19)
- 以下の工程を含む、プレトロンビン-1をトロンビンに変換する方法:
pH 6.4〜8.0、30 mM〜110 mM NaClの水溶液中に0.1 mg/mL〜10 mg/mLの濃度でプレトロンビン-1を提供する工程;
固相支持体上に固定化されたオスキュタリン-C(oscutarin-C)を提供する工程;ならびに
固相支持体1 mL当たり500 mg〜4000 mgのプレトロンビン-1、およびプレトロンビン-1とオスキュタリン-Cとの間の1.8分以上3.5分以下の接触時間が提供されるように、固定化されたオスキュタリン-Cに前記水溶液を適用し、それによりプレトロンビン-1が切断されてトロンビンを生成し、トロンビン含有溶液が得られる工程。 - さらに以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
イオン交換クロマトグラフィー媒質およびアフィニティークロマトグラフィー媒質からなる群より選択される捕捉媒質(capture medium)にトロンビン含有溶液を適用し、それによりトロンビンが該捕捉媒質に結合する工程;
結合トロンビンを洗浄する工程;および
前記捕捉媒質から結合トロンビンを回収する工程。 - 前記捕捉媒質がアフィニティークロマトグラフィー媒質である、請求項2に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィー媒質が固相支持体上に固定化されたPABAを含む、請求項3に記載の方法。
- プレトロンビン-1の水溶液がpH=7.4である、請求項2に記載の方法。
- プレトロンビン-1がヒトプレトロンビン-1である、請求項2に記載の方法。
- オスキュタリン-Cが架橋アガロースマトリックス上に固定化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記マトリックス上のオスキュタリン-Cの濃度が1.0 mg/mLである、請求項7に記載の方法。
- プレトロンビン-1の水溶液がpH=7.4である、請求項1に記載の方法。
- プレトロンビン-1がヒトプレトロンビン-1である、請求項1に記載の方法。
- 17℃〜45℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 20℃〜37℃の温度で行われる、請求項11に記載の方法。
- 20℃〜30℃の温度で行われる、請求項11に記載の方法。
- 25℃の温度で行われる、請求項11に記載の方法。
- オスキュタリン-Cが、支持体1 mL当たりオスキュタリン-C 0.1〜20 mgである濃度で固相支持体上に固定されている、請求項1に記載の方法。
- 濃度が、支持体1 mL当たりオスキュタリン-C 0.1〜5.0 mgである、請求項15に記載の方法。
- プレトロンビン-1水溶液中のNaCl濃度が70 mMである、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む、プレトロンビン-1をトロンビンへ変換する方法:
pH=6.8〜8.0、30 mM〜110 mM NaClの水溶液中、1.0 mg/mL〜10 mg/mLの濃度でプレトロンビン-1を提供する工程;
支持体1 mL当たりオスキュタリン-C 0.1 mg〜20 mgの濃度で固相支持体上に固定化されたオスキュタリン-Cを提供する工程;
固相支持体1 mL当たりのプレトロンビン-1が500 mg〜4000 mgであるプレトロンビン-1:オスキュタリン-C比、ならびに20℃〜30℃の温度での、プレトロンビン-1とオスキュタリン-Cとの間の1.8〜3.5分の接触時間を提供するように、プレトロンビン-1を固定化されたオスキュタリン-Cに適用し、それによりプレトロンビン-1が切断されてトロンビンを生成し、トロンビン含有溶液が得られる工程;
トロンビン含有溶液を固定化されたPABAに適用し、それによりトロンビンがPABAに結合する工程;
不純物を取り除くために結合トロンビンを洗浄する工程;ならびに
固定化されたPABAから結合トロンビンを回収する工程。 - 回収する工程が、結合トロンビンを溶出するのに十分な濃度のNaClおよびイソプロパノールによって、固定化されたPABAを洗浄することを含む、請求項18に記載の方法。
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