JPH01304881A - ウロキナーゼ前駆体の製造方法 - Google Patents
ウロキナーゼ前駆体の製造方法Info
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- JPH01304881A JPH01304881A JP13528288A JP13528288A JPH01304881A JP H01304881 A JPH01304881 A JP H01304881A JP 13528288 A JP13528288 A JP 13528288A JP 13528288 A JP13528288 A JP 13528288A JP H01304881 A JPH01304881 A JP H01304881A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔利用分野〕
本発明はウロキナーゼ前駆体(以下、単に前駆体と省略
)の製造方法に関する。詳細には、抗体アフィニティー
クロマトグラフィー処理により得られた前駆体含有画分
中に混在する抗体を含む夾雑蓋白を除去することを目的
とする前駆体の製造方法に関する。
)の製造方法に関する。詳細には、抗体アフィニティー
クロマトグラフィー処理により得られた前駆体含有画分
中に混在する抗体を含む夾雑蓋白を除去することを目的
とする前駆体の製造方法に関する。
〔従来技術]
前駆体は生体内に存在する線維素溶解酵素の一種であり
、その詳細は特開昭60−62981号公報に記載され
ている。前駆体はそのままでは不活性であるが、プラス
ミン処理することにより酵素活性を発現する、いわゆる
チモゲンであり、ヒト腎細胞の無血清培地中にて生成で
きる。
、その詳細は特開昭60−62981号公報に記載され
ている。前駆体はそのままでは不活性であるが、プラス
ミン処理することにより酵素活性を発現する、いわゆる
チモゲンであり、ヒト腎細胞の無血清培地中にて生成で
きる。
前駆体は、アミノ酸411個からなる1本の鎖状構造を
有する分子量的50000〜55000の蛋白である。
有する分子量的50000〜55000の蛋白である。
前駆体は上記の如く酵素活性を示さないが、プラスミン
処理により発現するブラスミノーゲンアクチベータ活性
は、抗ウロキナーゼ抗体により完全に阻害される。前駆
体はフィブリンに対して特異的な親和性を有し、また血
栓を構成する線維であるフィブリンを選択的に分解する
など、従来のウロキナーゼとは異なる血栓溶解特性を有
する。
処理により発現するブラスミノーゲンアクチベータ活性
は、抗ウロキナーゼ抗体により完全に阻害される。前駆
体はフィブリンに対して特異的な親和性を有し、また血
栓を構成する線維であるフィブリンを選択的に分解する
など、従来のウロキナーゼとは異なる血栓溶解特性を有
する。
ウロキナーゼとは異なる優れた特性を存する前駆体は線
維素溶解酵素として臨床上の幅広い利用が期待される。
維素溶解酵素として臨床上の幅広い利用が期待される。
前駆体の精製方法としては、CM−セファデックス処理
、抗前駆体抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
ー処理(特開昭6O−62981)、抗UK抗体による
アフィニティークロマトグラフィー処理、ConA−セ
ファロース処理(特開昭61−177987公報)等が
知られている。特に抗体アフィニティークロマトグラフ
ィー処理による方法は高純度の前駆体を得るために有用
な手段である。
、抗前駆体抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
ー処理(特開昭6O−62981)、抗UK抗体による
アフィニティークロマトグラフィー処理、ConA−セ
ファロース処理(特開昭61−177987公報)等が
知られている。特に抗体アフィニティークロマトグラフ
ィー処理による方法は高純度の前駆体を得るために有用
な手段である。
このアフィニティークロマトグラフィーを利用すれば、
目的物質を簡単に効率よく純化することがtきるが、一
方、このアフィニティークロマトグラフィーで使用する
抗体としては、人以外の動物に免疫して得られた抗体(
IgG)、すなわち異種タンパクの場合が多く、また、
このアフィニティークロマトグラフィーのクロマト条件
においては、一般的にpHの変動が大きいなど過激な条
件で使用する場合もあるため、不溶性担体にリガンドと
して固定化した抗体、すなわち異種タンパクが多少なり
とも脱離してくるという問題点がある。
目的物質を簡単に効率よく純化することがtきるが、一
方、このアフィニティークロマトグラフィーで使用する
抗体としては、人以外の動物に免疫して得られた抗体(
IgG)、すなわち異種タンパクの場合が多く、また、
このアフィニティークロマトグラフィーのクロマト条件
においては、一般的にpHの変動が大きいなど過激な条
件で使用する場合もあるため、不溶性担体にリガンドと
して固定化した抗体、すなわち異種タンパクが多少なり
とも脱離してくるという問題点がある。
゛そこで、本発明者らは、上記の事情に鑑み、各種検討
を重ねた結果、前駆体含有画分を、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸から選
ばれる化合物を水不溶性担体に結合させた固定化担体を
用いて処理し、その非吸着画分を回収することにより、
抗体成分等を含む夾雑蒼白を除去できることを見出し、
本発明を完成した。
を重ねた結果、前駆体含有画分を、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸から選
ばれる化合物を水不溶性担体に結合させた固定化担体を
用いて処理し、その非吸着画分を回収することにより、
抗体成分等を含む夾雑蒼白を除去できることを見出し、
本発明を完成した。
即ち、本発明はウロキナーゼ前駆体含有水溶液を、アミ
ノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジン、塩基性
アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に結合させ
た固定化担体を用いて処理し、その非吸着画分を回収す
ることを特徴とするウロキナーゼ前駆体の製造方法であ
る。
ノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジン、塩基性
アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に結合させ
た固定化担体を用いて処理し、その非吸着画分を回収す
ることを特徴とするウロキナーゼ前駆体の製造方法であ
る。
本発明で使用される前駆体は、そのままではほとんど線
溶活性を有しないが、プラスミン等の酵素処理により、
二本鎖ウロキナーゼに変換されて線溶活性を示すもので
ある。また、フィブリン存在下でも若干の線溶活性を示
すものである。
溶活性を有しないが、プラスミン等の酵素処理により、
二本鎖ウロキナーゼに変換されて線溶活性を示すもので
ある。また、フィブリン存在下でも若干の線溶活性を示
すものである。
本発明で使用される前駆体のまず第1の代表例は、分子
量5oooo〜5500Gで、−末鎖のペプチド結合構
造を有するものである。
量5oooo〜5500Gで、−末鎖のペプチド結合構
造を有するものである。
このような前駆体としては、たとえば構成アミノ酸41
1個(アミノ酸配列は後記実施例・実験例における前駆
体の調製の項参照)のものが挙げられる(特開昭60−
62981号公報参照)。
1個(アミノ酸配列は後記実施例・実験例における前駆
体の調製の項参照)のものが挙げられる(特開昭60−
62981号公報参照)。
上記前駆体の由来には特に制限はなく、たとえば、細胞
培養法、遺伝子工学法などにより調製されたものが例示
される。細胞培養法は特開昭60−62981号公報等
に、遺伝子工学法は特開昭60−180591号公報等
に開示されている。
培養法、遺伝子工学法などにより調製されたものが例示
される。細胞培養法は特開昭60−62981号公報等
に、遺伝子工学法は特開昭60−180591号公報等
に開示されている。
本発明でいう前駆体は上記のものに限定されず、その誘
導体をも包含する概念である。かかる誘導体としては前
駆体のエビダーマルグロースファクタードメインの全領
域もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはそ
の一部を他のアミノ酸残基で置換されている蛋白質分子
、前駆体のフィンガードメインの全領域もしくはその一
部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他のアミ
ノ酸残基で置換されている蓋白質分子等が挙げられる。
導体をも包含する概念である。かかる誘導体としては前
駆体のエビダーマルグロースファクタードメインの全領
域もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはそ
の一部を他のアミノ酸残基で置換されている蛋白質分子
、前駆体のフィンガードメインの全領域もしくはその一
部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他のアミ
ノ酸残基で置換されている蓋白質分子等が挙げられる。
従って、特に言及しない限り、本願明細書において前駆
体とは前駆体自体および上記のごとき前駆体誘導体をも
意味するものである。
体とは前駆体自体および上記のごとき前駆体誘導体をも
意味するものである。
この前駆体誘導体は、通常分子量4万〜5万程度で前駆
体自体と同様に一本鎖のペプチド結合構造を有する。ま
た、その線溶活性の発現様式も上記前駆体自体と同じで
ある。
体自体と同様に一本鎖のペプチド結合構造を有する。ま
た、その線溶活性の発現様式も上記前駆体自体と同じで
ある。
この誘導体は、たとえば遺伝子工学的な手法により調製
される。
される。
前駆体の比活性としては、合成基質法で測定した場合に
そのままでは活性を示さず、フィブリン存在下で100
〜100OUK単位/■程度、プラスミン処理時に8万
〜20万UK単位/■程度が例示される。
そのままでは活性を示さず、フィブリン存在下で100
〜100OUK単位/■程度、プラスミン処理時に8万
〜20万UK単位/■程度が例示される。
本発明の出発原料は、抗体アフィニティークロマトグラ
フィー処理を行って得られた前駆体含有画分(水溶液)
が好適に用いられる。具体的には、夾雑蛋白として、抗
UK抗体、抗前駆体抗体、抗IgG抗体などの抗体成分
を混在している前駆体含有画分(水溶液)が好適に用い
られる。
フィー処理を行って得られた前駆体含有画分(水溶液)
が好適に用いられる。具体的には、夾雑蛋白として、抗
UK抗体、抗前駆体抗体、抗IgG抗体などの抗体成分
を混在している前駆体含有画分(水溶液)が好適に用い
られる。
本発明で用いられる固定化担体はアミノベンズアミジン
、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸を
水不溶性担体に共有結合させたものである。
、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸を
水不溶性担体に共有結合させたものである。
本発明で使用される塩基性アミノ酸としては、たとえば
アルギニン、リジン等が例示される。
アルギニン、リジン等が例示される。
水不溶性担体としては、自体既知のものを使用すればよ
く、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体などが好適に使
用される。
く、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体などが好適に使
用される。
固定化は公知の方法に準じて行えばよい。たとえば、特
公昭57−13266号公報にその開示がある。また、
共有結合のために架橋剤および縮合剤を用いることも可
能である。−例を挙げると、シアン化ブロムで活性化し
たアガロースをε−アミノカプロン酸(架橋剤)と結合
させた後、l−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロ
ピル)−カルボジイミド(ta合剤)の存在下、アミノ
ベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンまたは塩基
性アミノ酸と結合させて、固定化担体を得る。
公昭57−13266号公報にその開示がある。また、
共有結合のために架橋剤および縮合剤を用いることも可
能である。−例を挙げると、シアン化ブロムで活性化し
たアガロースをε−アミノカプロン酸(架橋剤)と結合
させた後、l−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロ
ピル)−カルボジイミド(ta合剤)の存在下、アミノ
ベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンまたは塩基
性アミノ酸と結合させて、固定化担体を得る。
かかるものの市販品としては、たとえばベンズアミジン
−セファロース6B(登録商標、ファルマシア社?りな
どがあげられる。
−セファロース6B(登録商標、ファルマシア社?りな
どがあげられる。
本発明の処理方法としてはカラム法、バッチ法のどちら
を用いてもよい。
を用いてもよい。
バッチ法の場合、pH5〜9、イオン強度0.1〜IM
程度の緩衝液〔たとえば、0.1〜IM塩化ナトリウム
含有0.01〜0.2Mリン酸緩衝液(pi(6〜7)
等]に溶解した前駆体(蛍白濃度としては0.5〜10
%であることが好ましい)を同じ緩衝液で平衡化した固
定化担体と接触させる。その条件としては、固定化担体
1dに対して溶液1〜100戚と混合させ、4±2°C
で30分〜2時間であることが好ましい。その後、遠心
分離して上清のみを採取する。
程度の緩衝液〔たとえば、0.1〜IM塩化ナトリウム
含有0.01〜0.2Mリン酸緩衝液(pi(6〜7)
等]に溶解した前駆体(蛍白濃度としては0.5〜10
%であることが好ましい)を同じ緩衝液で平衡化した固
定化担体と接触させる。その条件としては、固定化担体
1dに対して溶液1〜100戚と混合させ、4±2°C
で30分〜2時間であることが好ましい。その後、遠心
分離して上清のみを採取する。
カラム法の場合は、pH5〜9の緩衝液(前記と同様)
に溶解した前駆体(蛍白濃度としては0.5〜10%で
あることが好ましい)を同じ緩衝液で平衡化した固定化
担体(カラム)において展開させ、非吸着の透過画分を
回収する。
に溶解した前駆体(蛍白濃度としては0.5〜10%で
あることが好ましい)を同じ緩衝液で平衡化した固定化
担体(カラム)において展開させ、非吸着の透過画分を
回収する。
こうして得られた前駆体は、必要に応じて、さらに精製
された後、公知の方法により製剤化される。
された後、公知の方法により製剤化される。
本発明の方法によれば、簡便な処理工程で前駆体を製造
することができ、しかも大規模処理にも適するので工業
的製法として橋めて有用である。
することができ、しかも大規模処理にも適するので工業
的製法として橋めて有用である。
また、混在する抗体成分あるいはUK等の夾雑蛋白が除
去できるので、得られた前駆体は純度がさらに向上して
おり、安全性にも優れた製剤を提供することができる。
去できるので、得られた前駆体は純度がさらに向上して
おり、安全性にも優れた製剤を提供することができる。
本発明をより詳細に説明するために、実施例および実験
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
実施例1
培養人腎細胞を011%ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に3日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をpH5,5
に調整した後、CM−5ephadex C−50ば接
触した。0.16 Mリン酸緩衝液(pH5,5)でカ
ラムを洗浄した後、0.16 Mリン酸緩衝液(pH8
,5)で吸着していた前駆体を溶出した。
培養液に3日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をpH5,5
に調整した後、CM−5ephadex C−50ば接
触した。0.16 Mリン酸緩衝液(pH5,5)でカ
ラムを洗浄した後、0.16 Mリン酸緩衝液(pH8
,5)で吸着していた前駆体を溶出した。
一方、前駆体で予め免疫したウマから得られた抗血清を
精製して抗前駆体抗体を回収した。このウマ由来抗前駆
体抗体をBrCN活性化アガロース(セファロース4B
、ファルマシア社製)に固定化した。
精製して抗前駆体抗体を回収した。このウマ由来抗前駆
体抗体をBrCN活性化アガロース(セファロース4B
、ファルマシア社製)に固定化した。
この抗体カラムを0.5M塩化ナトリウム含有0.1M
リン酸緩衝液(pH6,5)で平衡化し、これに前記の
前駆体を含有する溶出液を接触した。0.5M塩化ナト
リウム含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6,5)でカラ
ムを洗浄した後、吸着していた前駆体を0.5M塩化ナ
トリうム含有0.2Mグリシンー塩酸水溶液(pH2,
5)で?8出させた。
リン酸緩衝液(pH6,5)で平衡化し、これに前記の
前駆体を含有する溶出液を接触した。0.5M塩化ナト
リウム含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6,5)でカラ
ムを洗浄した後、吸着していた前駆体を0.5M塩化ナ
トリうム含有0.2Mグリシンー塩酸水溶液(pH2,
5)で?8出させた。
溶出液を0.5M塩化ナトリウム含有0.1 Mリン酸
緩衝液(p)16.5 )によりi4縮・透析した。
緩衝液(p)16.5 )によりi4縮・透析した。
ウサギ由来抗つマIgG抗体(ウマIgGをつサギに免
疫して得られた抗血清を精製したもの)を固定化したア
ガロース(セファロース4B・ファルマシア社製)を上
記緩衝液で平衡化しておき・この前駆体含有画分を接触
させ、非吸着画分を回収した。
疫して得られた抗血清を精製したもの)を固定化したア
ガロース(セファロース4B・ファルマシア社製)を上
記緩衝液で平衡化しておき・この前駆体含有画分を接触
させ、非吸着画分を回収した。
さらに、この両分を、上記緩衝液で平衡化したパラアミ
ノベンズアミジン−アガロース(ベンザミジン−セファ
ロース6B、ファルマシア社製)に接触させ、その非吸
着画分を回収した。
ノベンズアミジン−アガロース(ベンザミジン−セファ
ロース6B、ファルマシア社製)に接触させ、その非吸
着画分を回収した。
当該画分を除菌濾過した後、凍結乾燥した。
得られた前駆体の性状は以下の通り。
分子量は、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
(還元下)で約54000であり、単一バンドを示した
。アミノ酸は配列を第1表に示す。
(還元下)で約54000であり、単一バンドを示した
。アミノ酸は配列を第1表に示す。
比活性はプラスミン未処理時で100UK単位/mg蛋
白、プラスミン処理時で14万tJ K単位/mg蛋白
であった(活性は合成基質法により測定した)。
白、プラスミン処理時で14万tJ K単位/mg蛋白
であった(活性は合成基質法により測定した)。
夾雑蛋白としては、ウマ抗体、ウサギ抗体とも検出限界
以下であった。
以下であった。
実験例1
本発明の方法により、主にウサギ抗体の除去効果につい
て検討した。測定はRPHA法によった。
て検討した。測定はRPHA法によった。
結果を第2表に示す。
以上の表のごとく、ベンザミジン処理を組込むことで異
種タンパクを効率良く除去できることが判明した。数値
的にはN11llでは88.1%以上の除去率、Nα2
では87.2%以上の除去率となったが、これはRPH
A法の検出限界での数値であり、実際にはほぼlOO%
除去できているものと考えられる。
種タンパクを効率良く除去できることが判明した。数値
的にはN11llでは88.1%以上の除去率、Nα2
では87.2%以上の除去率となったが、これはRPH
A法の検出限界での数値であり、実際にはほぼlOO%
除去できているものと考えられる。
特許出願人 株式会社 ミドリ十字
Claims (2)
- (1)ウロキナーゼ前駆体含有水溶液を、アミノベンズ
アミジン、アミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸
から選ばれる化合物を水不溶性担体に結合させた固定化
担体を用いて処理し、その非吸着画分を回収することを
特徴とするウロキナーゼ前駆体の製造方法。 - (2)ウロキナーゼ前駆体含有水溶液が抗体アフィニテ
ィークロマトグラフィー処理により得られる請求項(1
)の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63135282A JP2714817B2 (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63135282A JP2714817B2 (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01304881A true JPH01304881A (ja) | 1989-12-08 |
JP2714817B2 JP2714817B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=15148059
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63135282A Expired - Fee Related JP2714817B2 (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2714817B2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6062981A (ja) * | 1983-09-13 | 1985-04-11 | Green Cross Corp:The | 線維素溶解酵素 |
-
1988
- 1988-05-31 JP JP63135282A patent/JP2714817B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6062981A (ja) * | 1983-09-13 | 1985-04-11 | Green Cross Corp:The | 線維素溶解酵素 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2714817B2 (ja) | 1998-02-16 |
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