DE19724239A1

DE19724239A1 - Dysprothrombinämie

Info

Publication number: DE19724239A1
Application number: DE1997124239
Authority: DE
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Kerckhoff-Klinik 61231 Bad Nauheim De GmbH
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 1998-12-10
Also published as: EP0990157A1; WO1998057178A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Thrombophilie bei Patienten sowie einen Testkit, enthaltend die für die Durchführung des Verfahrens benötigten Substanzen.

In einem Kollektiv von Patienten mit klinisch vermuteter angeborener Thromboseneigung (Thrombophilie) können heute bei etwa 50% der Patienten Störungen des Hämostasesystems als molekulare Ursache der Thrombophilie identifiziert werden. Die Mehrzahl dieser molekularen Defekte betrifft das Protein-C-System, das durch Bindung der Serinprotease Thrombin an den endothelialen Kofaktor Thrombomodulin (TM) initiiert wird. Durch Bildung eines Komplexes aus Thrombin und Thrombomodulin wird nämlich Protein C aktiviert, welches dann antikoagulatorisch wirkt.

Thrombomodulin ist in dieser Reaktion nicht nur ein Cofaktor, der die Substratumsetzung steigert, sondern verändert auch die Substratspezifität des Thrombins in dem Sinne, daß Thrombin seine prokoagulatorischen Eigenschaften verliert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Möglichkeit bereitzustellen, bei Patienten eine Vorhersage zu treffen, ob ein erhöhtes Thromboserisiko besteht. Hierbei wurde im Rahmen der Erfindung festgestellt, daß es Thrombinmutanten gibt, die eine normale prokoagulatorische (gerinnungsför dernde), aber eine eingeschränkte oder fehlende antikoagulatorische Aktivität aufweisen. Durch Untersuchungen mit in-vitro generierten Mutanten wurde nämlich herausgefunden, daß die molekularen Regionen des Thrombinmoleküls, die zur Bindung an TM notwendig sind, nur partiell identisch sind mit den Regionen, welche die Fibrinogeninteraktion vermit teln. Zum Nachweis dieser postulierten Mutanten wurde daher ein Testverfahren entwickelt, das spezifisch die antikoagulatorische Aktivität von Thrombin bestimmt.

Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe daher durch ein Verfahren zum Nachweis einer Thrombophilie bei Patienten, bei welchen die antikoagulato rische Aktivität von Thrombin in Blut oder Blutplasma bestimmt wird.

Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die Erkenntnis, daß nicht die Gesamtkonzentration von Thrombin für das Vorliegen einer Thrombophilie maßgebend ist, sondern vielmehr die pro- und antikoagulatorischen Aktivitäten des Thrombins zu betrachten sind, da Defekte bei der antikoagu latorischen Aktivität allein bei ansonsten unveränderter prokoagulatorischer Aktivität Ursache einer Thrombophilie sein können.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher in zwei getrennten Testansätzen zum einen die Gesamtkonzentration an Thrombin und zum zweiten die Konzentration an antikoagulatorisch aktivem Thrombin bestimmt.

Bevorzugt wird hierzu die Gesamtkonzentration von Thrombin im Blutplasma bestimmt, nachdem die Thrombinbildung initiiert worden ist. Es ist zwar auch denkbar, in die Bestimmung von Gesamt-Thrombin Prothrombin mit einzubeziehen, vorteilhaft ist es aber, vor der Bestimmung der Konzentration die Thrombinbildung zu veranlassen und dann die Konzentration zu messen.

Hierzu wird vorteilhaft dem aus Patientenblut gewonnenen Plasma Calcium, Phospholipide und Tissue factor (TF) zugesetzt. Als Phospholipide werden solche verwendet, die gerinnungsaktiv sind. Derartige Phospholipide sind dem Fachmann bekannt.

Um einen ungünstigen Einfluß anderer im Plasma vorhandener Substanzen, wie zum Beispiel Antithrombin oder Alpha-2-Makroglobulin, auszuschließen bzw. so gering zu halten, daß er die Bestimmung nicht mehr behindert, wird vorzugsweise vor der Initiierung der Thrombinbildung das Plasma im Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 500 verdünnt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die antikoagulatorische Aktivität über die Aktivierung von Protein C untersucht. Hierzu wird neben der Bestimmung der Gesamtkonzentration von Thrombin im Plasma die Konzentration von antikoagulatorisch aktivem Thrombin festgestellt, indem man dem vorzugsweise verdünnten Plasma Thrombomo dulin und Protein C zufügt. Nachfolgend wird die Menge an gebildetem aktiviertem Protein C bestimmt und hierüber auf die Konzentration von antikoagulatorisch aktivem Thrombin geschlossen.

Bei den Konzentrationsbestimmungen gemäß der vorliegenden Erfindung, also für Thrombin und aktiviertes Protein C, wird vorzugsweise die Hydrolyse spezifischer chromogener Substrate als Indikator verwendet. Entsprechende chromogene Substrate sind dem Fachmann bekannt und allgemein erhältlich.

Wiederum bevorzugt ist es, im erfindungsgemäßen Verfahren rekombinant hergestellte Substanzen wie Tissue factor, Thrombomodulin oder/und Protein C einzusetzen.

Obwohl für das Verfahren an sich nichts gegen die Verwendung von auf konventionellem Weg hergestellter Substanzen spricht, haben rekombinant hergestellte Zusätze möglicherweise den Vorteil größerer Reinheit, leichterer Erhältlichkeit und damit eines geringeren Preises etc.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform wird die antikoagulatorische Aktivität von Thrombin über die Fähigkeit zur Komplex bildung mit Thrombomodulin bestimmt. Auch in einer gestörten Bindungs aktivität von Thrombin mit Thrombomodulin kann eine Ursache für verminderte antikoagulatorische Aktivität liegen. Die Komplexbildungsfähig keit wird vorzugsweise ebenfalls nach Initiierung der Bildung von Thrombin im Plasma und Bestimmung der Gesamtkonzentration an Thrombin bestimmt.

Hierzu wird vorzugsweise wiederum durch Zugabe von Tissue factor initiiert und danach, nach Bestimmung von Gesamt-Thrombin, Thrombomodulin zugegeben. Der gebildete Komplex kann dann nach an sich bekannten Methoden nachgewiesen werden.

Auch gemäß diesem Verfahren kann vorteilhaft rekombinantes Thrombomo dulin eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt ist es, das Plasma in Kontakt zu bringen mit Festpha sen-gebundenem Thrombomodulin. Danach kann besonders einfach das Plasma abgetrennt werden und der Komplex besonders bevorzugt mittels eines Sandwich-ELISA nachgewiesen werden.

In diesem Fall wird vorzugsweise ein Anti-Thrombin-Antikörper als Nachweisantikörpereingesetzt. Dieser Antikörper kann beispielsweise selbst eine Markierung tragen, ggf. auch eine indirekte Markierung, wie Konjuga tion mit einem Enzym, dessen Anwesenheit wiederum über ein chromoge nes Substrat nachgewiesen wird. Es ist anderseits aber auch möglich und bevorzugt, an den vorhandenen Komplex aus Thrombomodulin, Thrombin und Anti-Thrombin-Antikörper einen weiteren Antikörper binden zu lassen, der gegen den Anti-Thrombin-Antikörper gerichtet ist. Derartige Anti- Antikörper sind dem Fachmann geläufig. Ein solcher Antikörper würde dann eine Markierung tragen, wobei alle hierfür dem Fachmann bekannten Markierungen geeignet sind.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zum Nachweis einer Thrombophilie sowohl die antikoagulatorische Aktivität von Thrombin über die Aktivierung von Protein C als auch über die Bindefähigkeit von Thrombin mit Thrombomodulin immunologisch festge stellt. Durch eine derartige Kombination kann eine besonders relevante Aussage über das Vorliegen einer Thrombophilie bei Patienten getroffen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Ein derartiger Testkit umfaßt alle wesentlichen, für die Durchführung des oder der Verfahren nötigen Substanzen. Derartige Testkits können gegebenenfalls auch noch Pufferlösungen und andere Substanzen enthalten.

Ein erfindungsgemäßer Testkit zur Bestimmung der antikoagulatorischen Aktivität von Thrombin in Patientenblut oder -plasma enthält:

a) Tissue factor, Calcium (vorzugsweise in Form eines Calciumsalzes) und gerinnungsaktive Phospholipide zur Initiierung der Thrombinbildung und
b) Protein C und Thrombomodulin oder/und
c) festphasengebundenes Thrombomodulin;

sowie gegebenenfalls geeignete Nachweissubstanzen für Thrombin oder/und aktiviertes Protein C oder/und einen gebildeten Thrombin-Thrombomodulin- Komplex.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit zum Nachweis von Thrombin oder/und aktiviertem Protein C ein chromogenes Substrat.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit zum Nachweis eines gebildeten Thrombin-Thrombomodulin-Komplexes einen Anti-Thrombin-Antikörper.

Es ist hierbei möglich, daß ein markierter Anti-Thrombin-Antikörper enthalten ist oder aber, bevorzugterweise, daß ein weitere Antikörper vorhanden ist, der gegen den Anti-Thrombin-Antikörper gerichtet ist und selbst eine nachweisbare Markierung trägt.

Des weiteren ist es bevorzugt, daß die Substanzen Tissue factor oder/und Protein C oder/und Thrombomodulin in rekombinanter Form vorhanden sind.

Als Antikörper werden besonders bevorzugt monoklonale Antikörper verwendet.

Die folgenden Beispiele und Figuren sollen die Erfindung weiter erläutern:

Fig. 1 zeigt hierbei eine klare Korrelation zwischen der Menge an gebildetem Thrombin und der Menge an gebildetem aktiviertem Protein C bei gesunden Personen nach Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmung über Aktivierung von Protein C.

Fig. 2 zeigt die Korrelation zwischen gemessenem aktiviertem Protein C und erwartetem aktiviertem Protein C in einem Patientenkollektiv mit vermuteter Thrombophilie.

Beispiel 1

In einem amidolytischen Testverfahren wird in zwei getrennten Testan sätzen sowohl die Thrombinkonzentration als auch die Konzentration an antikoagulatorisch aktivem Thrombin gemessen. Das eingesetzte Plasma wird 1 : 200 vorverdünnt.

Durch Mischen mit einem rekombinanten und käuflichen Tissue factor in Anwesenheit von Calcium und Phospholipiden wird die Thrombinbildung initiiert. In einem Testansatz ist rekombinantes Thrombomodulin (rTM) und rekombinantes Protein C (rPC) enthalten. Dabei sind die Konzentrationen so gewählt, daß die Menge an gebildetem aktiviertem Protein C (APC) mit der Menge an funktionell aktivem Thrombin korreliert. Das gebildete APC wird durch Hydrolyse des chromogenen Substrats S2366 (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden, Art.-Nr. 41222) gemessen, während in dem Kontroll ansatz die Menge an Thrombin durch Hydrolyse des Thrombinsubstrats S2238 (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden, Art.-Nr. 41202) ermittelt wird. Die Pipettierschemata beider Ansätze sind im folgenden dargestellt:

An einem Kollektiv von 50 gesunden Blutspendern konnte gezeigt werden, daß eine klare Korrelation zwischen der Menge an gebildetem Thrombin und der Menge an APC besteht (Fig. 1). Dementsprechend konnte aufgrund der gemessenen Thrombinkonzentration die Menge an erwartetem gebildetem APC extrapoliert werden. Mit dieser Methode wurden in einem Kollektiv von 57 Patienten mit klinisch vermuteter Thrombophilie bei 9 Patienten eine statistisch signifikante Abweichung zwischen der Menge an erwartetem APC und der tatsächlich gebildeten APC-Menge gemessen (Fig. 2).

Mit hoher Wahrscheinlichkeit besteht ein kausaler Zusammenhang zwischen der erniedrigt gemessenen antikoagulatorischen Aktivität des Patienten- Thrombins und der klinisch bestehenden Thromboseneigung. Ein mögliches Erklärungsmodel für die verminderte antikoagulatorische Aktivität des Thrombins ist das Vorliegen einer Mutation in der Thrombomodulinbindungs sequenz oder das Vorhandensein eines anderen Störfaktors.

Beispiel 2

Das entwickelte Verfahren stellt einen kombinierten funktionellen immunolo gischen Assay dar. Rekombinantes Thrombomodulin (rTM) wird auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach Zugabe von verdünntem Plasma wird die Thrombinbildung durch Zugabe von Tissue factor (rTF) initiiert und anschließend die Menge an gebundenem Thrombin mit einem polyklonalen Anti-Thrombin-Antikörper (Alexis Corporation, San Diego, CA, USA, Bestell- Nr. 60 760-1) bestimmt. Der Assayvorgang im Einzelnen:

Beschichtung der Mikrotiterplatten:
100 µg rTM pro Vertiefung

Bildung von Thrombin:
50 µl Plasma (1 : 500/1 : 1000)
+ 25 µl rTF (Innovin 1 : 2)
+ 15 µl Calciumchlorid (25 mM)
+ 10 µl Phospholipide (2,5 µg/m)

Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur

Bestimmung von Thrombin:
Kaninchen-Anti-Thrombin (100 ng/ml)
Schwein-Anti-Kaninchen IgG, Peroxidase-konjugiert.

In einem Konzentrationsbereich zwischen 0,04 und 2,5 U/ml Thrombin kann die Bindung von Thrombin spezifisch gemessen werden. Die Koeffizienten der Inter- und Intraassayvarianz lagen in allen Konzentrationsbereichen < 12 und < 10%. An dem oben erwähnten Patientenkollektiv (Beispiel 1) wurde bei allen auffälligen Patienten eine verminderte TM-Bindung ermittelt (6 außerhalb des x-2s Bereiches und 3 grenzwertig erniedrigt).

Diese Daten untermauern die Hypothese, daß eine verminderte antikoagula torische Aktivität von Thrombin durch eine eingeschränkte Bindung von Thrombin an Thrombomodulin bedingt sein kann.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Thrombophilie bei Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man die antikoagulatorische Aktivität von Thrombin im Blut oder Blutplasma bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei getrennten Testansätzen zum einen die Gesamtkonzen tration an Thrombin und zum zweiten die Konzentration von antiko agulatorisch aktivem Thrombin bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtkonzentration von Thrombin im Blutplasma bestimmt wird, nachdem die Thrombinbildung initiiert worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Thrombinbildung durch Zugabe von Calcium, Phospholi piden und Tissue factor zum Blutplasma initiiert.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Blutplasma vor der Initiierung der Thrombinbildung im Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 500 verdünnt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung der Konzentration von antikoagulatorisch aktivem Thrombin dem Blutplasma Thrombomodulin und Protein C zufügt und nachfolgend die Menge an gebildetem aktiviertem Protein C feststellt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man die Konzentration an Thrombin oder/und aktiviertem Protein C über Hydrolyse chromogener Substrate bestimmt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man rekombinanten Tissue factor, rekombinantes Thrombomodu lin oder/und rekombinantes Protein C verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindefähigkeit des in Patientenblut oder -plasma vorhandenen oder nach Initiierung dort gebildeten Thrombins an Thrombomodulin bestimmt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man im Plasma die Thrombinbildung durch Zugabe von Tissue factor initiiert, anschließend Thrombomodulin zugibt und die Bindung an Thrombomodulin durch einen Sandwich-ELISA bestimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man rekombinantes Thrombomodulin verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasma mit Festphasen-gebundenem Thrombomodulin in Kontakt bringt und nach Entfernung des Plasmas gebundenes Thrombin mittels eines Anti-Thrombin-Antikörpers nachweist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis ein weiterer, markierter und gegen den Anti- Thrombin-Antikörper gerichteter Antikörper verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die antikoagulatorische Aktivität mittels eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 2 bis 9 oder/und gemäß den Ansprüchen 9 bis 13 bestimmt.

15. Kit zur Bestimmung der antikoagulatorischen Aktivität von Thrombin in Patientenblut oder -plasma, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) Tissue factor, Calcium und Phospholipide zur Initiierung der Thrombinbildung und
b) Protein C und Thrombomodulin oder/und
c) festphasengebundenes Thrombomodulin;

sowie jeweils geeignete Nachweissubstanzen für Thrombin oder/und aktiviertes Protein C oder/und einen gebildeten Thrombin-Thrombo modulin-Komplex.

16. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er zum Nachweis von Thrombin ein chromogenes Substrat enthält.

17. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er zum Nachweis von aktiviertem Protein C ein chromogenes Substrat enthält.

18. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er zum Nachweis des gebildeten Thrombin-Thrombomodulin- Komplexes einen Anti-Thrombin-Antikörper enthält.

19. Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-Thrombin-Antikörper markiert ist.

20. Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein markierter gegen den Anti-Thrombin-Antikörper gerichteter Antikörper enthalten ist.