JPH0375825B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、低密度リポ蛋白質(LDL)を測定
する方法及びその試薬に関する。 LDL−フラクシヨン(低密度リポ蛋白質、β
−リポ蛋白質フラクシヨンとも称される)の測定
は、脂質代謝障害の細分化された診断にとつて極
めて重要になつている。 コレステリン過剰症及びトリグリセリド過剰症
は、動脈硬化及び心臓硬塞の発症に好適である。
従つて、血清中のコレステリン及びトリグリセリ
ドの測定は、臨床化学的な通常の実験室で最も
屡々実施されている試薬である。 脂肪物質代謝の多くの実験で、個々の冠状疾患
はトリグリセリド−及びコレステリン値の変化を
測定するだけでなく、原則的病理変化をリポプロ
テイン標本で検査する際に、良好に確認できると
いう結論に達している(Mu¨nch.med.Wschr.121、
(1979年)1639頁参照)。 公知の血漿リポ蛋白質は、蛋白質(アポリポ蛋
白質)、隣脂質、コレステリン及びトリグリセリ
ドを種々の多量で含有している。これらは、その
特性(種々異なる密度)に基づき、分析的超遠心
で、かつその移動速度のちがいに基づきゲル電気
泳動において4種の異なる群に分けることができ
る: キロミクロン プレ−β−リポ蛋白質=VLDL(超低密度リポ蛋
白質) β−リポ蛋白質=LDL(低密度リポ蛋白質) α−リポ蛋白質=HDL(高密度リポ蛋白質)。 リポ蛋白質の機能の研究で、リポ蛋白質内の
LDLが、血液中でのその増加時に冠心臓疾患に
関する危険性を増大する決定的なアテローム原成
分であることが判明した。この状態の早期認識及
び処置は極めて重要である。従つて、血清及び血
漿中のLDL−濃度の定量的測定の実際的方法に
関する要求が存在する。 従来、LDL−コレステリン値の測定のために
主として3つの方法が使用されていたが、これら
は欠点を有する: 1 超遠心 この方法は、通常の実験室には好適ではな
い。それというのも、このためには特別な設備
装置が必要であり、極めて注意深い作業技術の
実施を必要とし、1回の超遠心で非常に長い時
間(数日間の遠心)が必要であるからである。 従つて、この分析法は、従来は、研究医学の
実験室でのみ保留されていた。 2 ポリアニオン沈澱及び濁り単位のコレステリ
ン値への換算によるリポ蛋白質帯の引続く可視
化を伴う電気泳動分離 しかしながら、この方法は、時間がかかり、
特有の電気泳動装置並びに評価用の濃度計を必
要とする(Lab.Med.1、(1977年)145頁参照)。 3 フリーデワルド式(Friedewald−Formel)
によるLDL−コレステリン値の測定(Clin.
Chem.18巻(1972年)499頁) フリーデワルド式によるLDL−コレステリ
ン値の計算のためには、次の3因子の測定が必
要である:試料のコレステリン、HDL−コレ
ステリン及びトリグリセリド値。従つて、この
方法は充分に実質的ではない。更に、この近似
式は、キロミクロン不含の試料及び400mg/dl
より小さいトリグリセリド値を有する試料のみ
にあてはまる。 4 沈澱反応 LDLをレクチンを用いて沈澱させる方法は、
西ドイツ特許出願公開第2857710号明細書に記
載されている。しかしながら、この方法では、
LDL−コレステリンに関する値を沈澱の再溶
解の後にはじめて、もしくは、沈澱の前と後で
のコレステリン値の差により測定できるにすぎ
ない。このことは著しい欠点である。 沈澱の上澄み中にLDLが残留するリポ蛋白
質の沈澱法は西ドイツ特許第2600664号明細書
に記載されている。しかしながら、この方法
は、日常の測定として使用するためには充分に
実質的ではない。それというのもリポ蛋白質の
沈澱のためには2つの操作工程が必要であるか
らである(2種の異なる試薬−ポリエチレン及
びカチオン交換体−の添加とその中間にあるイ
ンキユベーシヨン相とが連結される)。 従つて、LDL−リポ蛋白質の測定の高い実
現性及び高い確実性を有する簡単な方法及び試
薬に関する要求が存在する。 この課題は、本発明により、体液中の低密度
リポ蛋白質(LDL)の測定法により解決され、
この方法は、被検試料に高密度リポ蛋白質
(HDL)−抗体を添加し、生じる不溶分を分離
し、上澄み中でLDL又はその成分を測定する
ことよりなる。 本発明は、HDL−抗体を用いて、全体的に
LDL−測定を妨害するリポ蛋白質フラクシヨン
がHDLそのものと共に、殊にVLDL及びキロミ
クロンが沈澱されるが、LDLそのものの沈澱は
認められないことの確認に基づく。このことは、
殊にHDLもLDL、VLDL及びキロミクロンも、
非常に種々異なる濃度ではあるが同じアポリポ蛋
白質を含有する蛋白質分を有することから意想外
のことである。従つて、HDLに対する抗体が、
LDLに影響を及ぼすことなしにHDLのみならず
VLDL及びキロミクロンをも定量的に沈澱させる
ことは予想外のことであつた。 VLDL及びキロミクロンの沈澱は、これらの物
質に対する付加的に公知の沈澱剤を使用する方法
で促進することができる。 試薬の上澄み中に残つているLDL−フラクシ
ヨンはこのために慣用の方法で測定することがで
きる。その中に含有して結合されているコレステ
リンの測定は、このために公知の方法の使用下に
行うのが有利である。例えばアルコール性苛性カ
リを用いる鹸化及びリーベルマン−ブルヒヤルド
(Liebermann−Burchard)による化学的測定に
より実施することができる。しかしながら、コレ
ステリンオキシダーゼ及びコレステリンエステル
を分解する酵素又は酵素系例えばコレステリンエ
ステラーゼの使用下に酵素的に測定を実施するの
が有利である。後者方法の使用の際には、消費さ
れた酸素、生じたコレステノン又は最も有利には
生じたH2O2を当業者にとつて公知の方法で測定
することができる。結合したコレステリンの測定
は、当業者にとつて公知であるので、本発明の関
係でこれに関して記述する必要はない。しかしな
がら、本発明方法の範囲内で、VLDL−及びキロ
ミクロン−フラクシヨンの除去によつて、呈色反
応でのコレステノン又はH2O2の光学的測定を害
する濁りの出現は阻止されることに注目すべきで
ある。従つて、この方法は、比色コレステリン測
定法と組合せると特別に好適である。 しかしながら、LDL−フラクシヨン中に含有
されるコレステリンもしくは他のLDL−成分例
えばアポリポ蛋白質B、燐脂質及びトリグリセリ
ドの代わりに、LDL−フラクシヨンそのものを
測定することも可能であり、その際、同様に公知
方法を使用することができる。例えば、比濁計測
定又は西ドイツ特許出願公開第3007764号明細書
に記載の混濁計測定が挙げられる。 HDL−抗体は、本発明の範囲内で、HDL−抗
血清の形で、脱リポイドHDL−抗血清として又
は精製されたHDL−抗体フラクシヨンの形で使
用される。HDL−抗体フラグメント例えばFab、
Fab2及びFab′−フラグメントを使用することも
できる。同様に、このHDLのアポリポ蛋白質A、
C及び/又はEに対する抗体又はそれらのフラグ
メントを使用することもできる。最後に、モノク
ローナルHDL−抗体も使用できる。 本発明により使用される抗体の製造は、免疫原
としての純粋なHDL又は前記アポリポ蛋白質の
使用下に行う。抗体取得のために、通例使用され
ている動物を利用することができる。ヒツジ及び
ウサギが有利である。抗体取得のために、前記の
動物もしくは匹敵する生物以外に細胞培養物も使
用できる。 HDL−抗体の添加時に生じる免疫凝集物の分
離は、同様に常法で行うことができる。可溶性
HDL−抗体を使用する場合は、分離を遠心分離
により行うのが有利である。担体結合された
HDL−抗体を使用する際に、免疫凝集物は液相
の簡単な分離により、コンパクトな固相例えば抗
体で被覆された固体から分離することができる。
免疫原としてのアポリポ蛋白質を用いて得られた
抗体を使用する場合は、免疫原として使用された
アポリポ蛋白質がリポイド被覆を有するようなも
のを使用するのが有利である。このことは、例え
ば、慣用の脱リポイド及び引続くアポリポ蛋白質
の分画の後に、選択されたアポリポ蛋白質A−、
C−及び/又はE−フラクシヨンを再リポイド化
することにより達成できる。しかしながら、免疫
原として精製された完全なHDL−フラクシヨン
を使用するのが有利である。この精製は、超遠心
分離での単離により行うのが有利である。付加的
に、場合によつては、例えば担体結合されたコン
カバリンA(ConcavalinA)上で、親和性クロマ
トグラフイ又は電気泳動法で更に精製することが
できる。これらの方法は、当業者にとつて公知で
あり、ここでは詳述する必要はない。 本発明のもう1つの目的物は、HDL−抗体を
含有することを特徴とする、体液のLDL−フラ
クシヨンの測定するための試薬である。有利な1
実施形では、本発明の試薬は前記のHDL−抗体
もしくはこの方法の説明時に詳述した前記のフラ
グメント又は抗体もしくはHDL−成分のフラグ
メントと共に、なお、コレステリン測定用の試薬
を含有する。 前記種類の有利な試薬は、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステルを分離する酵素又
は酵素系、H2O2を測定する系及び界面活性剤を
含有する。 前記試薬の特に有利な1実施形によれば、これ
は、主としてHDL−抗体、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、3,4−ジクロルフエノール、フエノー
ル、4−アミノフエナゾン、非イオン性界面活性
剤、アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤(PH
7〜8.5)より成る。 本発明による試薬は、測定溶液に対して10-7〜
10-3モル/(もしくは固体Kg)の濃度範囲で抗
体を含有するのが有利である。この抗体は、固体
形で有利に凍結乾燥されていてよいか、又は溶液
の形で存在していてよい。溶剤としては、水、生
理食塩水、血清媒体、緩衝剤例えば0.01〜0.5m
トリス緩衝液(PH7〜8.5)又は0.005〜0.1m燐酸
塩緩衝液(PH6.5〜8.5)が、場合によつては生理
学的食塩溶液の程度の食塩を添加して、使用され
る。抗体を担体結合形で使用する場合は、好適な
担体物質の例は、多糖類例えばセルロース、デキ
ストラン、デンプン及びそれらの誘導体、珪酸
塩、ポリアミド、コラーゲン、ラテツクス、酸化
アルミニウム、牛血清アルブミン及び類似の担体
物質である。この担体は、試験容器例えばプラス
チツク試薬容器の表面に結合して存在してもよ
い。 この試薬は、更に、VLDL及びキロミクロンに
対する公知の沈澱剤を含有していてもよい。 本発明方法の主要な利点は、個々の試薬の添加
の後に、リポ蛋白質群(LDLを除いて)を試料
から除くことができる、診断学上重要なLDL−
含分又はLDL−フラクシヨンのコレステリン含
分を、引続き、更に試料前処理をすることなしに
直接測定することができることにある。更に、試
料中の濁りの原因となつているトリグリセリドの
多いリポ蛋白質群を除き、引続くLDL−又はコ
レステリン測定のために澄明な試料を供給できる
ことが有利である。 次の例は、本発明を有利な実施形につき説明し
ている。 例 1 (A) 精製HDLの製造 超遠心機中でのVLDL及びLDLの分離の後
に、狭く分けられたHDL−フラクシヨン
(d.1.080〜1.210)を超遠心機中で単離させる
[例えば、V.P.スキプスキ(Skipski)による
ブラツド・リポイド・アンド・リポプロテイン
ズ:クオンテイテーシヨン・コンポジシヨン・
アンド・メタボリズム(Blood Lipids and
Lipoproteins:Qnantitation、Composition
and Methabolism、Nelson、Wiley、New
York1972年発行:471〜583頁)のリポイド・
コンポジシヨン・オブ・リポプロテインス・イ
ン・ノルマル・アンド・デイジーズド・ステー
ツ(Lipid Compositin of Lipoproteins in
normal and diseased states)参照]。フラク
シヨンを引続きなお2回、密度1.080及び1.210
で沈澱もしくは浮選させる。 このHDL−フラクシヨンを担体結合された
コンカナバリンA(Concanavalin A);(1974
年)Feds Lett.91、174〜198頁参照)上で、親
和性クロマトグラフイにより、又はR.W.マー
レイ(Mahley)、K.S.ホルコム(Holcombe)
(1977年)のJ.Lipid.Res.18、314〜324頁による
ゲオン−ペビコン−ブロツク−電気泳動
(Geon−Pevicon−Block−Elektrophorese)
を用いて、電気泳動により精製する。 (B) 抗血清の製造 動物:ヒツジ又はウサギ Aで得た免疫原の使用下に、次の免疫化方式
を使用する:
する方法及びその試薬に関する。 LDL−フラクシヨン(低密度リポ蛋白質、β
−リポ蛋白質フラクシヨンとも称される)の測定
は、脂質代謝障害の細分化された診断にとつて極
めて重要になつている。 コレステリン過剰症及びトリグリセリド過剰症
は、動脈硬化及び心臓硬塞の発症に好適である。
従つて、血清中のコレステリン及びトリグリセリ
ドの測定は、臨床化学的な通常の実験室で最も
屡々実施されている試薬である。 脂肪物質代謝の多くの実験で、個々の冠状疾患
はトリグリセリド−及びコレステリン値の変化を
測定するだけでなく、原則的病理変化をリポプロ
テイン標本で検査する際に、良好に確認できると
いう結論に達している(Mu¨nch.med.Wschr.121、
(1979年)1639頁参照)。 公知の血漿リポ蛋白質は、蛋白質(アポリポ蛋
白質)、隣脂質、コレステリン及びトリグリセリ
ドを種々の多量で含有している。これらは、その
特性(種々異なる密度)に基づき、分析的超遠心
で、かつその移動速度のちがいに基づきゲル電気
泳動において4種の異なる群に分けることができ
る: キロミクロン プレ−β−リポ蛋白質=VLDL(超低密度リポ蛋
白質) β−リポ蛋白質=LDL(低密度リポ蛋白質) α−リポ蛋白質=HDL(高密度リポ蛋白質)。 リポ蛋白質の機能の研究で、リポ蛋白質内の
LDLが、血液中でのその増加時に冠心臓疾患に
関する危険性を増大する決定的なアテローム原成
分であることが判明した。この状態の早期認識及
び処置は極めて重要である。従つて、血清及び血
漿中のLDL−濃度の定量的測定の実際的方法に
関する要求が存在する。 従来、LDL−コレステリン値の測定のために
主として3つの方法が使用されていたが、これら
は欠点を有する: 1 超遠心 この方法は、通常の実験室には好適ではな
い。それというのも、このためには特別な設備
装置が必要であり、極めて注意深い作業技術の
実施を必要とし、1回の超遠心で非常に長い時
間(数日間の遠心)が必要であるからである。 従つて、この分析法は、従来は、研究医学の
実験室でのみ保留されていた。 2 ポリアニオン沈澱及び濁り単位のコレステリ
ン値への換算によるリポ蛋白質帯の引続く可視
化を伴う電気泳動分離 しかしながら、この方法は、時間がかかり、
特有の電気泳動装置並びに評価用の濃度計を必
要とする(Lab.Med.1、(1977年)145頁参照)。 3 フリーデワルド式(Friedewald−Formel)
によるLDL−コレステリン値の測定(Clin.
Chem.18巻(1972年)499頁) フリーデワルド式によるLDL−コレステリ
ン値の計算のためには、次の3因子の測定が必
要である:試料のコレステリン、HDL−コレ
ステリン及びトリグリセリド値。従つて、この
方法は充分に実質的ではない。更に、この近似
式は、キロミクロン不含の試料及び400mg/dl
より小さいトリグリセリド値を有する試料のみ
にあてはまる。 4 沈澱反応 LDLをレクチンを用いて沈澱させる方法は、
西ドイツ特許出願公開第2857710号明細書に記
載されている。しかしながら、この方法では、
LDL−コレステリンに関する値を沈澱の再溶
解の後にはじめて、もしくは、沈澱の前と後で
のコレステリン値の差により測定できるにすぎ
ない。このことは著しい欠点である。 沈澱の上澄み中にLDLが残留するリポ蛋白
質の沈澱法は西ドイツ特許第2600664号明細書
に記載されている。しかしながら、この方法
は、日常の測定として使用するためには充分に
実質的ではない。それというのもリポ蛋白質の
沈澱のためには2つの操作工程が必要であるか
らである(2種の異なる試薬−ポリエチレン及
びカチオン交換体−の添加とその中間にあるイ
ンキユベーシヨン相とが連結される)。 従つて、LDL−リポ蛋白質の測定の高い実
現性及び高い確実性を有する簡単な方法及び試
薬に関する要求が存在する。 この課題は、本発明により、体液中の低密度
リポ蛋白質(LDL)の測定法により解決され、
この方法は、被検試料に高密度リポ蛋白質
(HDL)−抗体を添加し、生じる不溶分を分離
し、上澄み中でLDL又はその成分を測定する
ことよりなる。 本発明は、HDL−抗体を用いて、全体的に
LDL−測定を妨害するリポ蛋白質フラクシヨン
がHDLそのものと共に、殊にVLDL及びキロミ
クロンが沈澱されるが、LDLそのものの沈澱は
認められないことの確認に基づく。このことは、
殊にHDLもLDL、VLDL及びキロミクロンも、
非常に種々異なる濃度ではあるが同じアポリポ蛋
白質を含有する蛋白質分を有することから意想外
のことである。従つて、HDLに対する抗体が、
LDLに影響を及ぼすことなしにHDLのみならず
VLDL及びキロミクロンをも定量的に沈澱させる
ことは予想外のことであつた。 VLDL及びキロミクロンの沈澱は、これらの物
質に対する付加的に公知の沈澱剤を使用する方法
で促進することができる。 試薬の上澄み中に残つているLDL−フラクシ
ヨンはこのために慣用の方法で測定することがで
きる。その中に含有して結合されているコレステ
リンの測定は、このために公知の方法の使用下に
行うのが有利である。例えばアルコール性苛性カ
リを用いる鹸化及びリーベルマン−ブルヒヤルド
(Liebermann−Burchard)による化学的測定に
より実施することができる。しかしながら、コレ
ステリンオキシダーゼ及びコレステリンエステル
を分解する酵素又は酵素系例えばコレステリンエ
ステラーゼの使用下に酵素的に測定を実施するの
が有利である。後者方法の使用の際には、消費さ
れた酸素、生じたコレステノン又は最も有利には
生じたH2O2を当業者にとつて公知の方法で測定
することができる。結合したコレステリンの測定
は、当業者にとつて公知であるので、本発明の関
係でこれに関して記述する必要はない。しかしな
がら、本発明方法の範囲内で、VLDL−及びキロ
ミクロン−フラクシヨンの除去によつて、呈色反
応でのコレステノン又はH2O2の光学的測定を害
する濁りの出現は阻止されることに注目すべきで
ある。従つて、この方法は、比色コレステリン測
定法と組合せると特別に好適である。 しかしながら、LDL−フラクシヨン中に含有
されるコレステリンもしくは他のLDL−成分例
えばアポリポ蛋白質B、燐脂質及びトリグリセリ
ドの代わりに、LDL−フラクシヨンそのものを
測定することも可能であり、その際、同様に公知
方法を使用することができる。例えば、比濁計測
定又は西ドイツ特許出願公開第3007764号明細書
に記載の混濁計測定が挙げられる。 HDL−抗体は、本発明の範囲内で、HDL−抗
血清の形で、脱リポイドHDL−抗血清として又
は精製されたHDL−抗体フラクシヨンの形で使
用される。HDL−抗体フラグメント例えばFab、
Fab2及びFab′−フラグメントを使用することも
できる。同様に、このHDLのアポリポ蛋白質A、
C及び/又はEに対する抗体又はそれらのフラグ
メントを使用することもできる。最後に、モノク
ローナルHDL−抗体も使用できる。 本発明により使用される抗体の製造は、免疫原
としての純粋なHDL又は前記アポリポ蛋白質の
使用下に行う。抗体取得のために、通例使用され
ている動物を利用することができる。ヒツジ及び
ウサギが有利である。抗体取得のために、前記の
動物もしくは匹敵する生物以外に細胞培養物も使
用できる。 HDL−抗体の添加時に生じる免疫凝集物の分
離は、同様に常法で行うことができる。可溶性
HDL−抗体を使用する場合は、分離を遠心分離
により行うのが有利である。担体結合された
HDL−抗体を使用する際に、免疫凝集物は液相
の簡単な分離により、コンパクトな固相例えば抗
体で被覆された固体から分離することができる。
免疫原としてのアポリポ蛋白質を用いて得られた
抗体を使用する場合は、免疫原として使用された
アポリポ蛋白質がリポイド被覆を有するようなも
のを使用するのが有利である。このことは、例え
ば、慣用の脱リポイド及び引続くアポリポ蛋白質
の分画の後に、選択されたアポリポ蛋白質A−、
C−及び/又はE−フラクシヨンを再リポイド化
することにより達成できる。しかしながら、免疫
原として精製された完全なHDL−フラクシヨン
を使用するのが有利である。この精製は、超遠心
分離での単離により行うのが有利である。付加的
に、場合によつては、例えば担体結合されたコン
カバリンA(ConcavalinA)上で、親和性クロマ
トグラフイ又は電気泳動法で更に精製することが
できる。これらの方法は、当業者にとつて公知で
あり、ここでは詳述する必要はない。 本発明のもう1つの目的物は、HDL−抗体を
含有することを特徴とする、体液のLDL−フラ
クシヨンの測定するための試薬である。有利な1
実施形では、本発明の試薬は前記のHDL−抗体
もしくはこの方法の説明時に詳述した前記のフラ
グメント又は抗体もしくはHDL−成分のフラグ
メントと共に、なお、コレステリン測定用の試薬
を含有する。 前記種類の有利な試薬は、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステルを分離する酵素又
は酵素系、H2O2を測定する系及び界面活性剤を
含有する。 前記試薬の特に有利な1実施形によれば、これ
は、主としてHDL−抗体、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、3,4−ジクロルフエノール、フエノー
ル、4−アミノフエナゾン、非イオン性界面活性
剤、アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤(PH
7〜8.5)より成る。 本発明による試薬は、測定溶液に対して10-7〜
10-3モル/(もしくは固体Kg)の濃度範囲で抗
体を含有するのが有利である。この抗体は、固体
形で有利に凍結乾燥されていてよいか、又は溶液
の形で存在していてよい。溶剤としては、水、生
理食塩水、血清媒体、緩衝剤例えば0.01〜0.5m
トリス緩衝液(PH7〜8.5)又は0.005〜0.1m燐酸
塩緩衝液(PH6.5〜8.5)が、場合によつては生理
学的食塩溶液の程度の食塩を添加して、使用され
る。抗体を担体結合形で使用する場合は、好適な
担体物質の例は、多糖類例えばセルロース、デキ
ストラン、デンプン及びそれらの誘導体、珪酸
塩、ポリアミド、コラーゲン、ラテツクス、酸化
アルミニウム、牛血清アルブミン及び類似の担体
物質である。この担体は、試験容器例えばプラス
チツク試薬容器の表面に結合して存在してもよ
い。 この試薬は、更に、VLDL及びキロミクロンに
対する公知の沈澱剤を含有していてもよい。 本発明方法の主要な利点は、個々の試薬の添加
の後に、リポ蛋白質群(LDLを除いて)を試料
から除くことができる、診断学上重要なLDL−
含分又はLDL−フラクシヨンのコレステリン含
分を、引続き、更に試料前処理をすることなしに
直接測定することができることにある。更に、試
料中の濁りの原因となつているトリグリセリドの
多いリポ蛋白質群を除き、引続くLDL−又はコ
レステリン測定のために澄明な試料を供給できる
ことが有利である。 次の例は、本発明を有利な実施形につき説明し
ている。 例 1 (A) 精製HDLの製造 超遠心機中でのVLDL及びLDLの分離の後
に、狭く分けられたHDL−フラクシヨン
(d.1.080〜1.210)を超遠心機中で単離させる
[例えば、V.P.スキプスキ(Skipski)による
ブラツド・リポイド・アンド・リポプロテイン
ズ:クオンテイテーシヨン・コンポジシヨン・
アンド・メタボリズム(Blood Lipids and
Lipoproteins:Qnantitation、Composition
and Methabolism、Nelson、Wiley、New
York1972年発行:471〜583頁)のリポイド・
コンポジシヨン・オブ・リポプロテインス・イ
ン・ノルマル・アンド・デイジーズド・ステー
ツ(Lipid Compositin of Lipoproteins in
normal and diseased states)参照]。フラク
シヨンを引続きなお2回、密度1.080及び1.210
で沈澱もしくは浮選させる。 このHDL−フラクシヨンを担体結合された
コンカナバリンA(Concanavalin A);(1974
年)Feds Lett.91、174〜198頁参照)上で、親
和性クロマトグラフイにより、又はR.W.マー
レイ(Mahley)、K.S.ホルコム(Holcombe)
(1977年)のJ.Lipid.Res.18、314〜324頁による
ゲオン−ペビコン−ブロツク−電気泳動
(Geon−Pevicon−Block−Elektrophorese)
を用いて、電気泳動により精製する。 (B) 抗血清の製造 動物:ヒツジ又はウサギ Aで得た免疫原の使用下に、次の免疫化方式
を使用する:
【表】
(C) 血清50μをBで製造した抗血清150μと混
合する。室温で30分温置の後に、生じた沈澱を
遠心分離する(10000gで2分間)。 澄明な沈澱上澄み50μにトリス緩衝液0.1モ
ル/(PH7.7)、アスパラギン酸マグネシウム
0.05モル/、4−アミノフエナゾン1mモ
ル/、フエノール6mモル/、3,4−ジ
クロルフエノール4mモル/、脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル0.3%、コレステリ
ンスエテラーゼ400U/、コレステリンオキ
シダーゼ250U/及びペルオキシダーゼ
200U/を含有する試薬2mを加える。 室温で20分の温置の後に、試料の吸光度を試
薬空値に対して測定する(試薬空値は抗血清
50μを含有し、抗血清のコレステリン含分を
考慮されている)。 ΔE=ΔE試料−ΔE試料空値 LDL=コレステリン(mg/dl)=1.385×ΔE
合する。室温で30分温置の後に、生じた沈澱を
遠心分離する(10000gで2分間)。 澄明な沈澱上澄み50μにトリス緩衝液0.1モ
ル/(PH7.7)、アスパラギン酸マグネシウム
0.05モル/、4−アミノフエナゾン1mモ
ル/、フエノール6mモル/、3,4−ジ
クロルフエノール4mモル/、脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル0.3%、コレステリ
ンスエテラーゼ400U/、コレステリンオキ
シダーゼ250U/及びペルオキシダーゼ
200U/を含有する試薬2mを加える。 室温で20分の温置の後に、試料の吸光度を試
薬空値に対して測定する(試薬空値は抗血清
50μを含有し、抗血清のコレステリン含分を
考慮されている)。 ΔE=ΔE試料−ΔE試料空値 LDL=コレステリン(mg/dl)=1.385×ΔE
【表】
マニユアル・オブ・ラボラトリイ・オペレーシ
ヨンズ、リポイドリサーチ・クリニツクス・プロ
グラム、リポイド・アンド・リポプロテイン・ア
ナリシス(Manual of Laboratory Operations.
Lipid Research Clinics Program.Lipid and
Lipoprotain Analysis;DHEW Publication
No.65〜628)。 例 2 VLDL、HDL、LDLもしくはキロミクロン各
50μの溶液を、免疫原としてのHDLを用いて得
たウサギ−抗血清150μと混合した。遠心後に、
例1の記載と同様に、コレステリン含分を上澄み
中で測定した。
ヨンズ、リポイドリサーチ・クリニツクス・プロ
グラム、リポイド・アンド・リポプロテイン・ア
ナリシス(Manual of Laboratory Operations.
Lipid Research Clinics Program.Lipid and
Lipoprotain Analysis;DHEW Publication
No.65〜628)。 例 2 VLDL、HDL、LDLもしくはキロミクロン各
50μの溶液を、免疫原としてのHDLを用いて得
たウサギ−抗血清150μと混合した。遠心後に、
例1の記載と同様に、コレステリン含分を上澄み
中で測定した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 体液中の低密度リポ蛋白質(LDL)を測定
するために、被検試料に高密度リポ蛋白質
(HDL)−抗体を添加し、生じる不溶分を分離し、
上澄み中でLDL又はその成分であるコレステリ
ン、アポリポ蛋白質B、燐脂質又はトリグリセリ
ドを測定することを特徴とする、体液中の低密度
リポ蛋白質を測定する方法。 2 LDL−成分としてコレステリンを測定する、
特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 抗体を、HDL−抗血清の形で、脱リポイド
HDL−抗血清の形で、又は精製された抗体フラ
クシヨンとして添加する、特許請求の範囲第1項
又は第2項記載の方法。 4 HDL−抗体のフラグメントを添加する、特
許請求の範囲第1項から第3項までのいずれか1
項記載の方法。 5 精製されたHDL又は場合により再リポイド
化されたアポリポ蛋白質A、C及び/又はEを免
疫原として用いて得られる抗体を使用する、特許
請求の範囲第3項又は第4項記載の方法。 6 ヒツジ又はウサギの抗体を使用する、特許請
求の範囲第1項から第5項までのいずれか1項記
載の方法。 7 HDL−抗体を含有することを特徴とする体
液中のLDL−フラクシヨンを測定するための試
薬。 8 コレステリン測定試薬を含有する、特許請求
の範囲第7項記載の試薬。 9 コレステリン測定用試薬はコレステリンオキ
シダーゼ、コレステリンエステル分解酵素又は酵
素系、H2O2測定用系及び界面活性剤を含有する、
特許請求の範囲第8項記載の試薬。 10 主としてHDL−抗体、コレステリンオキ
シダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキ
シダーゼ、3,4−ジクロルフエノール、フエノ
ール、4−アミノフエナゾン、非イオン性界面活
性剤、アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤
(PH7〜8.5)よりなる、特許請求の範囲第9項記
載の試薬。 11 HDL−抗体を担体結合された形で含有す
る、特許請求の範囲第8項から第10項までのい
ずれか1項記載の試薬。
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