HU190836B - Process for reagent for determining low density lipoproteines - Google Patents

Process for reagent for determining low density lipoproteines Download PDF

Info

Publication number
HU190836B
HU190836B HU831403A HU140383A HU190836B HU 190836 B HU190836 B HU 190836B HU 831403 A HU831403 A HU 831403A HU 140383 A HU140383 A HU 140383A HU 190836 B HU190836 B HU 190836B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hdl
reagent
cholesterol
ldl
antibodies
Prior art date
Application number
HU831403A
Other languages
English (en)
Inventor
Joachim Ziegenhorn
Sigbert Schiefer
Brigitte Draeger
Original Assignee
Boehringer,Mannheim Gmbh,De
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer,Mannheim Gmbh,De filed Critical Boehringer,Mannheim Gmbh,De
Publication of HU190836B publication Critical patent/HU190836B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Semiconductor Lasers (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására.
Az LDL-frakció (Low Density Lipoprotein) amelyet β-lipoproteinfrakciónak is neveznek meghatározása lipoid-anyagcserezavar differenciált diagnózisa szempontjából kiemelkedő jelentőségre tett szert.
Hiperkoleszterinémia és hipertrigliceridémia elősegítik az érelmeszesedés és a szívinfarktus létrejöttét. A koleszterin és trigliceridek szérumban való meghatározása ezért a legfontosabb elvégzendő vizsgálatok közé tartozik a klinikai-kémiai rutinlaboratóriumban.
A zsíranyagcserére vonatkozó számos vizsgálat arra a következtetésre jutott, hogy az egyedi koszorúér-elmeszesedés veszélye jobban felismerhető, ha nemcsak a triglicerid- és koleszterin-tükörben beálló változásokat határozzuk meg, hanem a lipoprotein mintában alapul vehető patológiás elváltozásokat is kiderítjük [Münch. med. Wschr. 121, 1639 (1979)].
Az ismert plazmalipoproteinek különböző részarányban tartalmaznak proteint (apolipoproteinek), foszfolipideket, koleszterint és triglícerideket. Az analitikai ultracentrifugában való viselkedésük (eltérő sűrűség) és a gélelektroforézisben tapasztalható eltérő vándorlási sebességük alapján négy különböző osztályba sorolhatók:
chylomikronok pre-P-lipoproteinek = VLDL (very low density lipoprotein) β-lipoproteinek = LDL (low density lipoprotein) α-lipoproteinek = HDL (high density lipoprotein).
A lipoproteinek funkciójának vizsgálata azt eredményezte, hogy az LDL a lipoproteineken belül a döntő érelmeszesedést előidéző komponenst jelenti, amelynek a vérben való felszaporodásakor fokozott veszély áll fenn koszorúér szívbetegségre. Ennek az állapotnak a korai felismerése és elhárítása nagyjelentőségű. Ezért igény van egy gyakorlatilag jól alkalmazható eljárásra a LDL-koncentráció szérumban és plazmában való kvantitatív meghatározására.
Eddig az LDL-koleszterinérték meghatározására lényegében három módszert használtak, amelyeknek azonban hátrányaik vannak :
1. Ultracentrifugálás.
Ez az eljárás rutinlaboratórium részére nem megfelelő, mivel ehhez speciális készülék-ellátottság szükséges, és a kivitelezés rendkívül gondos munkamódszert és az ultracentrifugán nagyon nagy időráfordítást (többszöri centrifugálás) igényel. Ezért ezt az analíziseljárást eddig csak a kutatóorvosi laboratórium részére tartják fenn.
2. Elektroforetikus elválasztás a lipoproteinsávok ezt követően polianionos lecsapással való láthatóvá tételével, és a zavarosodási egységek átszámítása koleszterin-értékekre.
Ez az eljárás szintén időigényes és saját elektroforézis-készüléket igényel, valamint denzitométert a kiértékelésre. [Láb. Med. 1, 145 (1977)].
3. A LDL-koleszterin-érték meghatározása a Friedewald-képlettel [Clin. Chem. 18, 499 (1972)].
Az LDL-koleszterin-értékeknek a Friedewaldképlet szerinti kiszámításához 3 paraméter meghatározása szükséges: a minta koleszterin-, HDLkoleszterin- és triglicerid-értéke. A módszer ezért nem kielégítően gyakorlatias. Azonkívül ez a közelítő képlet csak chylomikronmentes mintákra és 400 mg/dl alatti triglicerid-értékű mintákra érvényes.
4. Kicsapási reakciók.
Olyan eljárást, amelyben az LDL-t valamilyen lektin segítségével csapnak le, a 28 57 710 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban írnak le. Az LDL-koleszterin-érték azonban ennél a módszernél is csak a csapadék újrafeloldása után, illetve a koleszterin-értékek lecsapás előtti és utáni különbségképzésével állapítható meg. Ez jelentős hátrányt jelent.
A lipoproteinek lecsapására szolgáló olyan módszer, amelynél az LDL a csapadék felülúszójában marad, a 26 00 664 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban van leírva. A módszer azonban rutinmeghatározásként való alkalmazásra nem kielégítően gyakorlatias, mivel a lipoproteinek kicsapására 2 munkamenet szükséges (két különböző ágens - polietilén-imin és egy kationcseréld hozzáadása, összekapcsolva egy közbülső inkubációs fázissal).
Ezért igény van az LDL-lipoproteinek meghatározásához egy gyakorlatilag jól alkalmazható és nagy meghatározási pontosságú egyszerű eljárásra és reagensre.
Ezt a feladatot a találmány szerint a low density lipoproteinek (LDL) testfolyadékokban való meghatározására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy a vizsgálandó mintához high density lipoprotein (HDL)-antitesteket adunk, a keletkező csapadékot elválasztjuk, és a felülúszóban az LDL-t vagy komponenseinek egyikét meghatározzuk.
A találmány azon a meglepő megállapításon alapul, hogy HDL-antitestekkel valamennyi, az LDLmeghatározást zavaró lipoprotein-frakció, a HDL mellett különösen a VLDL és a chylomikronok is, lecsapható, az LDL-t magát viszont a csapadék nem köti meg. Ez különösen azért meglepő, mert mind a HDL, mind az LDL, VLDL és a chylomikronok egy olyan proteinrészlettel rendelkeznek, amely azonos apoliproteineket tartalmaz, ha nagyon eltérő koncentrációban is. Ezért nem volt előrelátható, hogy a HDL-antitestek nemcsak a HDL-t, hanem a VLDL-t és a chylomikronokat is kvantitatíve lecsapják anélkül, hogy emellett az LDL-t befolyásolnák.
A VLDL és chylomikronok lecsapása meggyorsítható, amennyiben ezekhez az anyagokhoz pótlólag ismert lecsapószereket alkalmazunk. [Okabe,
X. Int. Congr. of Clin. Chem., Mexico, (1978)].
A reagens felülúszójában maradó LDL-frakció utána az erre szokásos módszerekkel meghatározható [pl. Siedel, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 19 (1981) 836]. A benne levő kötött koleszterin meghatározása előnyösen az erre ismert módszerek alkalmazásával történik. így a meghatározás például alkoholos kálium-hidroxid oldattal való elszáppanosítással, és Liebermann-Burchard-féle kémiai
190 836 meghatározással végezhető. Előnyösen végezhető azonban egy enzimatikus meghatározás is koleszterin-oxidáz és egy koleszterin-észtereket hasító enzim vagy enzimrendszer, különösen koleszterinészteráz alkalmazásával. Az utóbbi módszer alkalmazásakor az elhasznált oxigén, a képződött kolesztenon, vagy legelőnyösebben a keletkezett hidrogénperoxid mérhet a szakember számára ezen a területen ismert módszerekkel. [Trinder, Ann. Clin. Biochem. 6 (1969) 24; Töschlau, Z. Kiin. Chem. Kiin. Biochem. 12 (1974) 403]. Megjegyzendő azonban, hogy a találmány szerinti eljárás keretében a VLDL- és chylomikron-frakciók eltávolításával zavarosodás fellépését gátoljuk meg, amely kolesztenon vagy hidrogén-peroxid színreakciók keretében való optikai mérését zavarhatják. Az eljárás ezért különleges mértékben összefügg egy kalorimetrjás koleszterin meghatározási módszerrel.
Az is lehetséges azonban, hogy az LDL-frakcióban levő koleszterin, illetve más LDL-komponensek, így apoliprotein B, foszfolipidek és trigliceridok helyett magát az LDL-frakciót határozzuk meg, amire szintén önmagukban ismert módszerek használhatók. Példaként a nefelometriás meghatározás vagy a 30 07 764 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban leírt turbidimetriás meghatározás említhető. A foszfolipidek foszfolipázzal, kolinoxidázzal, peroxidázzal és ezt követő - fentiekben említett - H2O2-meghatározással határozhatók meg, a trigliceridek észterázzal, glicerin-foszfatoxidázzal, glicerikonázzal és peroxidázzal, valamint ugyancsak ezt követő H2O2 meghatározással mérhetők.
A HDL-antitesteket a találmány keretében vagy valamilyen HDL-antiszérum formájában, mint zsírmentesitett HDL-antiszérumot vagy tisztított HDL-antitestfrakció formájában használjuk. Lehetséges áz is, hogy a HDL A, C vagy/és E apolipoproteinjei vagy ezek fragmensei elleni antitesteket alkalmazzunk. Végül monoklonális HDL-antitestek is alkalmazhatók.
A találmány szerint alkalmazott antitestek előállítása tiszta HDL vagy az említett apoliproteinek immunogénként való alkalmazásával történik. Az antitest-kinyerésre a szokásosan használt állatfajok vehetők igénybe. Előnyös a birka és a nyúl. Az antitest-kinyerésre azonban a már említett állatokon, illetve összehasonlítható élőlényeken kívül sejttenyészetek is használhatók.
A HDL-antitestek hozzáadásakor keletkező immun aggregátumok elválasztása szintén szokásos módszerekkel történhet. Amennyiben oldható HDL-antitesteket alkalmazunk, úgy az elválasztás célszerűen centrifugálással történik. Immunogénként előnyösen tisztított teljes HDL-frakciót használunk. A tisztítás célszerűen önmagában ismert módon az ultracentrifugában való elkülönítéssel történik. Kiegészítésként adott esetben további tisztítás végezhető például immobilizált konkanavalin A-n az affinitás-kromatográfia módszerei szerint vagy elektroforézissel. [FEBS Lett. 91 (1974) 174-198 és J. Lipid. Rés. 18 (1977) 314-324],
A találmány tárgyát képezi továbbá LDL-frakció testfolyadékokból való meghatározására szolgáló reagens is, amelyre az jellemző, hogy HDLantitesteket tartalmaz. Egy előnyös kiviteli formában a találmány szerinti reagens a már említett HDL-antitestek, illetve az előbb a találmány magyarázatánál közelebbről leírt fragmensek vagy antitestek, illetve HDL-komponensek fragmensei mellett még egy koleszterin meghatározására szolgáló reagenst is tartalmaz.
Egy előbb említett fajtájú előnyös reagens koleszterinoxidázt, koleszterinésztert hasító enzimet vagy enzimrendszert, hidrogén-peroxid meghatározására szolgáló rendszert és egy felületaktív anyagot tartalmaz.
Az előbb említett reagens egy különösen előnyös kiviteli alakja szerint ez lényegében HDL-antitestekből, koleszterinoxidázból, koleszterinészterázból, peroxidázból, 3,4-diklór-fenolból, fenolból,
4-amino-fenazonból, [2,3-dimetil-4-(dimetilamino)-l-fenil-3-pirazolin-5-on] egy nem ionos detergensből, magnézium-aszpartátból és 7-8,5 pHjú pufferből áll.
A találmány szerinti reagens az antitestet célszerűen 10“7-10-3 mól/liter (illetve kg szilárd anyag) koncentrációtartományban tartalmazza a meghatározó oldatra vonatkoztatva. Az antitest szilárd formában, előnyösen liofilizálva, vagy oldat formájában fordul elő. Oldószerként víz, fiziológiás konyhasóoldat, szérum, pufferok, így például 0,01-0,5 mólos (7-8,5 pH-jú) trisz-puffer, vagy 0,005-0,1 mólos (6,5-8,5 pH-jú) foszfátpuffer, adott esetben fiziológiás konyhasóoldatok nagyságrendjébe eső konyhasóadalékkal alkalmazhatók. Amennyiben az antitestet immobilizált formában alkalmazzuk, úgy alkalmas hordozóanyagokra példaként poliszacharidok, így cellulóz, dex trán, keményítő és ezek származékai, szilikátok, poliamidok, kollagén, latex, aluminium-oxid, marhaszérumalbumin és hasonló hordozóanyagok említhetők. Az antitest lehet a vizsgálati edények, például műanyag reagens-üvegek felületére is felkötve.
A reagens ezenkívül VLDL és chylomikronok lecsapódására alkalmas ismert szereket is tartalmazhat [pl. J. Lipid. Rés. 11 (1970) 583 és Clin. Chem. 23 (1977) 882],
A találmány szerinti eljárás jelentős előnye abban van, hogy egyetlen reagens hozzáadása után a lipoproteinek - LDL kivételével - a mintából eltávolithatók, és a diagnosztikailag lényeges LDLtartalom vagy az LDL-frakció koleszterintartalma végül további kezelés nélkül közvetlen méréshez hozzáférhető. Előnyös továbbá, hogy a mintában zavarosodásokat okozó trigliceridben gazdag lipoproteineket eltávolítjuk úgy, hogy a végső LDLvagy koleszterin-meghatározáshoz tiszta minta áll rendelkezésre.
A következő példák egy előnyös kiviteli alak segítségével szemléltetik a találmányt.
1. példa
A) Tisztított HDL előállítása.
VLDL és LDL ultracentrifugában való leválasztása után egy szűk HDL-frakciót (d = 1,080-1,210) különítünk el az ultracentrifugában, ahogy V. P. Skipski leírja. [Lipid composi-3190 836 tion of lipoproteins in normál and diseased States; Blood Lipids and Lipoproteins; Quantitation, Composition and Metabolism. Kiadó: Nelson, Wiley, New York, 1972, 471-583. old.]. A frakciót végül még két sűrűségnél, 1,080-nál és 1,210-nél 5 ülepítjük, illetve Dotáljuk.
A HDL-frakciót immobilizált konkanavalin A-n affinitás-kromatográfiásan [FEBS Lett. 91, 174-198 (1974)] vagy R. W. Mahley és K. S. Holcombe |J. Lipid. Rés. 18, 314-324 (1977)] szerint 10 Geon-Pevicon blokkelektroforézissel elektroforétikusan tisztítjuk.
B) Az antiszérum előállítása.
Állatfaj: birka vagy nyúl.
Az A) pont szerint kapott immunogén alkalma- 15 zásával a következő immunizálási vázlatot használjuk :
Nap Alkalmazás I m m unogén-mennyiség 20
0 intradermálisan 1 mg protein (HDL) emulgeálva
7 intramuszkulárisan Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva 25
14 bőr alá Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva
30 intramuszkulárisan Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva 30
60 bőr alá Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva 35
minden további 30 nap bőr alá Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva Freund adjuvánsban 40
Az első próbavéreztetést 45 nap múlva végezzük.
nap elteltével újból vért veszünk és az ebből nyert szérumot HDL-antitestre vizsgáljuk turbidimetriásan, HDL-lel, mint antigénnel. Azokat a szé- 45 rumokat, amelyek elegendő HDL-antitestet tartalmaznak, összegyűjtjük. Ezt a „szérum-poolt” közvetlenül alkalmazzuk HDL-antiszérumként vagy D. M. Weir, Immunochemistry Vol. 1., Kap. 6. Blackwell Scient. Publ. 173 szerint tisztított anti- 50 test-frakcióvá tisztítjuk és az 5. példa szerint felhasználjuk.
C) 50 μΐ szérumot elegyítünk 150 μΐ B) pont szerint előállított antiszérummal. Szobahőmérsékleten 30 percig tartó inkubálás után a keletkezett g5 csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 g-nál).
μΙ tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml reagenssel elegyítünk, amely 0,1 mól/liter trisz-puffert (pH = 7,7), 0,05 mól/liter magnézium-aszpartátot, mmól/liter 47amino-fenazont [2,3-dimetil-4(dimetil-amino)-l-fenil-3-pirazolin-5-on], 6 mmól/ liter fenolt, 4 mmól/liter 3,4-diklór-fenolt, 0,3% zsiralkohol-poliglikol-étert, 400 E/liter koleszterinészterázt, 250 E/liter koleszterinoxidázt és 200 E/liter peroxidázt tartalmaz.
Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után 546 nm-nél mérjük a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben (a reagens-vakérték 50 μΐ antiszérumot tartalmaz, és az antiszérum koleszterin-tartalmát veszi figyelembe).
ΔΕ ÁEm,nl4 óEreagerí_vaj[^rt^|t
LDL-koleszterin (mg/dl) = 1,385 x ΔΕ
Szé- Ki nézés rum Koleszterin Trigliccri- dek LDL-koleszterin
NIH- eljárás· immunológiai lecsapás
1 zavaros 353 mg/dl 503 mg/dl 234 mg/dl 238 mg/dl
2 tiszta 638 mg/dl 591 mg/dl 510 mg/dl 495 mg/dl
3 tiszta 350 mg/dl 153 mg/dl 237 mg/dl 231 mg/dl
4 zavaros 195 mg/dl 575 mg/dl 102 mg/dl 95 mg/dl
5 chylo- mik- ronokat tartal- maz 231 mg/dl 379 mg/dl 149 mg/dl 130 mg/dl
•Referenciamódszerként az NIH-eljárás szolgál. (VLDL és chylomikronok ultracentrifugában való leválasztása után LDL-t csapunk le. A lecsapás előtti és utáni koleszterinérték különbségéből kapjuk az LDL-koleszterinértéket.)
Manual of Laboratory Operations, Lipid Research Clinics Program, Lipid and Lipoprotein Analysis, DHEW Publication No. 65-628.
2. példa
50-50 μΙ VLDL, HDL, LDL, illetve chylomikron oldatot elegyítünk 150 μΐ nyúl-antiszérummal, amelyet immunogénként HDL-t alkalmazva állítottunk elő. Centrifugálás után a koleszterin-tartalmat az 1. példában leírtak szerint határozzuk meg a felülúszóban.
Minta A minta koleszterin-tartalma lecsapás előtt lecsapás után
Chylomik- 61,4 mg/dl 2,6 mg/dl
ronok
VLDL 23,2 mg/dl 2,8 mg/dl
LDL 177,0 mg/dl 165,0 mg/dl
HDL 50,9 mg/dl 0,0 mg/dl
3. példa
Módszer LDL-foszfolipidek meghatározására . 50 μΐ szérumot 150 μΐ, az 1 példa B) pontja szerint előállított antiszérummal elegyítünk. Szobahőmérsékletű 30 perces inkubálás után a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 gnál).
μΙ tiszta csapadék feletti felülúszót 3 ml olyan reagenssel elegyítünk, amely 50 mmól liter triszpufTert (pH = 8,0), 20 mmól/liter fenolt, X mmól/ liter 4-amino-fenazont, 1000 E/liter foszl'olipidáz D-t. 1400 E/liter kolinoxidázt és 800 E/liter peroxidázt tartalmaz.
Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után
190 836 a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben méljük (a reagens-vakérték 50 μΐ antiszérumot tartalmaz, amely 3 +1 arányban fiziológiás nátrium-kloridoldattal hígított és figyelembe veszi az antiszérum foszfolipid-tartalmát a csapadék feletti felülúszóban). 5 * * * *
A kiértékelést kolin-klorid-sztandardon keresztül végezzük (54,1 mg/100 ml, ez megfelel 300 mg foszfolipid/100 ml mennyiségnek), amit; ugyanúgy, mint a szérumot, 1 + 3 arányban elegyítünk az antiszérummal. 10
ΔΕ^ ÁE^t* ÁE^genB-vakérték
ΔΕ2 ÁEJztandanj AErelgcn)kvakérljk
AF
LDL-foszfolipid (mg/100 ml) = 300 * ==1
ΔΕ2 15
4. példa
Módszer LDL-trigliceridek meghatározására 2θ μΐ szérumot 150 μΐ az 1. példa B) pontja szerint előállított antiszérummal elegyítünk. Szobahőmérsékleten 30 percig tartó inkubálás után a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 g-nál).
μΐ tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml olyan 25 reagenssel elegyítünk, amely 0,15 mól/liter triszpuffert (pH = 7,6), 17,5 mmól/liter magnézium-szulfátot, 10 mmól/liter EDTA-dinátrium-sót, 3,5 mmól/ liter 4-klór-fenolt, 0,15% nátrium kolátot, 6 mmól kálium-[hexaciano-ferrát(II)]-ot, 0,12% detergenst,
0,5 mmól/liter ATP-t, 0,35 mmól/liter 4-amino-fenazont, 3000 E/liter észterázt, 2500 E/liter glicerin-foszfatooxidázt, 200 E/liter glicerokinázt és 150 E/liter peroxidázt tartalmaz.
’C-on 10 percig tartó inkubálás után méljük a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben (a d reagens vakérték 50 μΐ antiszérumot tartalmaz, amely 3 + 1 arányban fiziológiás nátrium-klorid-oldattal hígított és figyelembe veszi az antiszérum trigliceridtartalmát). A kiértékelést glicerin-sztandardon keresztül végezzük, amely 200 mg/dl triglicerid-tarta- 0 lomnak felel meg és amely, ugyanúgy mint a szérum, + 3 arányban antiszérummal van elegyítve.
ΔΕι = ÁEminU — AEreageni.vakirték
ΔΕ2 ÁEKrtanjarj ÁEreagena.VB|£4rt4|£ 45
LDL-triglicerid (mg/100 ml) = 200 χ
5. példa 50
50-50 μΐ VLDL-t, HDL-t, LDL-t, illetve chylomikronokat tartalmazó oldatot különböző mennyiségű tisztított HDL-antitesttel (nyúl eredetű) elegyítünk.
Centrifugálás után a felülúszóban az 1. példában meg- 55 adottak szerint meghatározzuk a koleszterin-tartalmat.
A minta koleszterin-tartalma mg/dl
Reagens
lecsapás előtt lecsapás után
a) HDL-antitest-koncentráció 10-3 mól/liter
Chylomikronok 61,4 2,4
VLDL 23,2 2,8
LDL 177,0 165,0
HDL 50,9 0,0
b) HDL-antitest-koncentráció
10~5 mól/liter
Chylomikronok 61,1 2,5
VLDL 23,0 2,9
LDL 177,5 166,0
HDL 51,2 0,0
c) HCL-antitest-koncentráció
10-7 mól/liter
Chylomikronok 61,6 2,7
VLDL 23,6 2,6
LDL 177,1 167,0
HDL 50,5 0,0
6. példa
a) immobilizált antitest előállítása ml, emberi HDL elleni birka-antiszérumból származó IgG-frakciót (protein-tartalom összesen 280 mg/15 mmól/liter - 50 mmól/liter nátrium-kloridot tartalmazó - kálium-foszfát-pufferben „Affinitatsadsorbens, Glutardialdehyd-aktiviert” (Boehringer Mannheim, Kát. sz.: 665 526) adszorbensen megkötünk, a gyártó útmutatásai szerint. Ily módon 1 g adszorbensen 10-15 mg IgG-t immobilizálunk. A megkötési kapacitás LDL-re körülbelül 20 mg/ adszorbens g.
b) LDL-teszt immobilizált antitesttel μΐ szérumot 250 μΐ fiziológiás konyhasóoldattal hígítunk és összekeverünk az immobilizált antitest nedves pasztájának 300 μΐ mennyiségével, majd 60 percig rázzuk < 25 ’C-on. Ezt követően 2 percig centrifugáljuk 10 000 g-nál.
μΐ tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml olyan reagenssel elegyítünk, amely 0,1 mól/liter trisz-puffert (pH = 7,7), 0,05 mól/liter magnézium-aszpartátot, 1 mmól/liter 4-amino-fenazont, 6 mmól/liter fenolt, 4 mmól/liter 3,4-diklór-fenolt, 0,3% zsíralkohol-poliglikol-étert, 400 E/liter peroxidázt tartalmaz. .
Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után méljük a minta extinkcióját 546 nm-nél, reagensvakértékkel szemben (a reagens-vakérték 50 μΐ antiszérumot tartalmaz és figyelembe veszi az antiszérum koleszterin-tartalmát).
A kiértékelést olyan extinkciós érték alapján végezzük, amit azonosan kezelt szabad koleszterin-sztandarddal kaptunk, az alábbi képlet alapján:
CminU — AF CKtaixiard “•-'sztandard
A NIH-eljárással végzett összehasonlítás jó egyezést adott:
190 836
Szérum LDL-koleszterin mg/dl
NIH-eljárás* immobilizált antitesttel végzett 5 vizsgálat
1 93 90
2 228 230
3 111 115 10
4 173 164
5 240 244
6 129 135
v. ö. 1. példával 15

Claims (10)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás low density lipoproteinek (LDL) testfo- 20 lyadékokban való meghatározására, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó mintához high density Úpoprotein (HDL)-antitesteket adunk, a keletkező csapadékot elválasztjuk, és a felülúszóból az LDL-t vagy komponenseinek egyikét meghatározzuk. 25
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy LDL-komponensként koleszterint határozunk meg.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestet HDL-antiszérum, zsírmen- 30 tesített HDL-antiszérum formájában vagy tisztított antitestfrakcióként adunk a mintához.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan antitesteket használunk, amelyeket tisztított HDL-el, mint immunogénnel nyertünk.
  5. 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy juh vagy nyúl eredetű antitesteket használunk.
  6. 6. Reagens az LDL-frakció testfolyadékokban való meghatározására, azzal jellemezve, hogy HDL-antitesteket tartalmaz ΚΓ’-ΙΟ-3 mól/Úter koncentrációban.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy koleszterin meghatározására szolgáló reagenst is tartalmaz.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy a koleszterin meghatározására szolgáló reagens koleszterinoxidázt, koleszterinésztert hasító enzimet vagy enzimrendszert, hidrogén-peroxid meghatározására szolgáló rendszert és felületaktív anyagot tartalmaz.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy
  10. 10^-10-3 mól/liter HDL-antitestből,
    0,1-10 E/ml koleszterinészterázból,
    0,05-10 E/ml koleszterinoxidázból,
    0,05-20 E/ml peroxidázból,
    0,2-30 mmól/Úter fenolból,
    1-10 mmól/liter 3,4-diklór-fenolból,
    0,2-2 mmól/liter 4-amino-fenazonból,
    0,02-2% nemionos detergensből,
    10-200 mmól/liter magnézium-aszpartátból és
    10-200 mnlól/liter 7-8,5 pH-jú pufferből áU.
    10. A 7-9. igénypontok valamelyike szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy a HDL-antitesteket immobilizált formában tartalmazza.
HU831403A 1982-04-23 1983-04-22 Process for reagent for determining low density lipoproteines HU190836B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19823215310 DE3215310A1 (de) 1982-04-23 1982-04-23 Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU190836B true HU190836B (en) 1986-11-28

Family

ID=6161825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU831403A HU190836B (en) 1982-04-23 1983-04-22 Process for reagent for determining low density lipoproteines

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5407836A (hu)
EP (1) EP0092801B1 (hu)
JP (1) JPS58191967A (hu)
AT (1) ATE17404T1 (hu)
AU (1) AU539195B2 (hu)
CA (1) CA1211707A (hu)
DE (2) DE3215310A1 (hu)
DK (1) DK159840C (hu)
ES (1) ES8402426A1 (hu)
FI (1) FI77538C (hu)
HU (1) HU190836B (hu)
IE (1) IE54314B1 (hu)
NO (1) NO162094C (hu)
SU (1) SU1296019A3 (hu)
ZA (1) ZA832842B (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3319066A1 (de) * 1983-05-26 1984-11-29 Claus-Christian Dr.Rer.Nat. Dr.Med. 6901 Wilhelmsfeld Heuck Verfahren und reagenz zum direkten nachweis eines analyts nach spezifischer entfernung von colloidpartikeln in waessrigen loesungen biologischer herkunft
DE3338836A1 (de) * 1983-10-26 1985-05-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung
JPH02242158A (ja) * 1989-03-15 1990-09-26 Nippon Shoji Kk ヒトアポリポ蛋白ｃ―３の測定法
USRE39915E1 (en) 1989-09-01 2007-11-06 Roche Diagnostics Gmbh Method for the determination of HDL cholesterol by means of a rapid diagnostic agent with an integrated fractionating step
DE3929032C2 (de) * 1989-09-01 1998-09-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bestimmung von HDL-Cholesterin mittels eines Schnelldiagnostikums mit integriertem Fraktionierschritt
US5213965A (en) * 1990-07-16 1993-05-25 Cholestech Corporation Solid-phase precipitation assay device
US5213964A (en) * 1990-07-16 1993-05-25 Cholestech Corporation High-density lipoprotein solid-base precipitation assay method
US5034332A (en) * 1990-08-06 1991-07-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Assay for high density lipoprotein cholesterol
BR9201168A (pt) * 1992-04-02 1994-04-12 Zerbini E J Fundacao Microemulsoes usadas como velculo para carregar quimioterapicos as celulas neoplasicas
ES2165947T3 (es) 1995-07-21 2002-04-01 Wako Pure Chem Ind Ltd Metodo para medir la cantidad de un constituyente contenido en una lipoproteina especifica.
JP3441993B2 (ja) 1999-01-27 2003-09-02 松下電器産業株式会社 コレステロールセンサ
EP1150118B1 (en) * 1999-11-22 2005-02-09 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Cholesterol sensor and method for determining cholesterol
US6898728B2 (en) * 2001-09-25 2005-05-24 Sun Microsystems, Inc. System domain targeted, configurable interconnection
WO2003056163A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Polymer Technology Systems, Inc. Test strip and method for determining hdl cholesterol concentration from whole blood of plasma
ES2252358T3 (es) * 2002-04-09 2006-05-16 Cholestech Corporation Metodo y dispositivo de ensayo para la cuantificacion del colesterol asociado a lipoproteinas de alta densidad.
US7772007B2 (en) * 2004-04-02 2010-08-10 Cholestech Corporation Assay device for direct measurement of LDL cholesterol
US7491542B2 (en) * 2004-07-12 2009-02-17 Kim Scheuringer Test device for determining the concentration of LDL-cholesterol in a sample
US7824879B2 (en) 2007-01-09 2010-11-02 Cholestech Corporation Device and method for measuring LDL-associated cholesterol
US20120039984A1 (en) * 2008-07-03 2012-02-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycopeptide and uses thereof
KR102381248B1 (ko) * 2011-11-11 2022-04-01 엑시스-시일드 에이에스 혈액 샘플 분석 방법
RU2501013C1 (ru) * 2012-07-26 2013-12-10 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека
RU2497116C1 (ru) * 2012-08-10 2013-10-27 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения атерогенности крови человека

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4039285A (en) * 1975-10-10 1977-08-02 Ortho Diagnostics, Inc. Single sample method for determination of lipoprotein concentrations in blood
DE2600664C3 (de) * 1976-01-09 1980-10-23 Claus-Christian Dr.Rer.Nat. Dr.Med. 6901 Wilhelmsfeld Heuck Verfahren zur direkten Bestimmung des ß -Cholesteringehaltes im Blutserum
DE2612725C3 (de) * 1976-03-25 1979-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin
US4184921A (en) * 1976-03-25 1980-01-22 Boehringer Mannheim Gmbh Process and reagent for determining cholesterol
NL7701800A (nl) * 1977-02-18 1978-08-22 Akzo Nv Testkit en methode voor de bepaling van lp-x.
US4190628A (en) * 1977-11-21 1980-02-26 Trustees Of Boston University Kit for determining the level of LDL cholesterol in body fluids
FR2455743A1 (fr) * 1979-05-02 1980-11-28 Goella Laboratoires Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques
DE3009037A1 (de) * 1980-03-08 1981-09-24 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur direkten bestimmung des lipidgehaltes der (beta) -lipoproteine des blutes
DE3117455A1 (de) * 1981-05-02 1982-11-25 Boehringer Mannheim Gmbh Reagens zur praezipitation apo-b-haltiger lipoproteine, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von hdl-cholesterin
DE3208253A1 (de) * 1982-03-08 1983-09-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur spezifischen bestimmung des cholesterins der ldl-fraktion im serum

Also Published As

Publication number Publication date
DK159840C (da) 1991-04-29
FI77538C (fi) 1989-03-10
IE54314B1 (en) 1989-08-16
DK175383A (da) 1983-10-24
NO162094C (no) 1989-11-01
NO162094B (no) 1989-07-24
NO831428L (no) 1983-10-24
FI831359A0 (fi) 1983-04-21
ES521757A0 (es) 1984-02-01
ES8402426A1 (es) 1984-02-01
DK159840B (da) 1990-12-10
EP0092801B1 (de) 1986-01-08
DE3361763D1 (en) 1986-02-20
SU1296019A3 (ru) 1987-03-07
ATE17404T1 (de) 1986-01-15
AU539195B2 (en) 1984-09-13
EP0092801A1 (de) 1983-11-02
JPH0375825B2 (hu) 1991-12-03
ZA832842B (en) 1984-01-25
US5407836A (en) 1995-04-18
FI831359L (fi) 1983-10-24
US5532172A (en) 1996-07-02
IE830823L (en) 1983-10-23
FI77538B (fi) 1988-11-30
CA1211707A (en) 1986-09-23
DK175383D0 (da) 1983-04-21
AU1343783A (en) 1983-10-27
JPS58191967A (ja) 1983-11-09
DE3215310A1 (de) 1983-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU190836B (en) Process for reagent for determining low density lipoproteines
US4746605A (en) Process and a reagent for the determination of low density lipoproteins (LDL)
US5736406A (en) Method of determining the amount of cholesterol in a high-density lipoprotein
CA2260689C (en) Method for quantifying cholesterol in low density lipoprotein
Hurst et al. Optimized assay for serum angiotensin-converting enzyme activity.
AU719144B2 (en) Method for quantitatively determining LDL cholesterols
KR101394802B1 (ko) 소립자 저비중 리포 단백의 정량 시약
US4851335A (en) Process and reagent for the specific determination of HDL cholesterol in serum or plasma
JP2010172346A (ja) コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
WO2004048605A1 (ja) 特定リポ蛋白中の脂質測定法
JPH1038888A (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
JPWO2004055204A1 (ja) 低密度リポ蛋白中コレステロールのマルチ定量法
EP1164376B1 (en) Method for quantitating cholesterol
JP4542234B2 (ja) コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
JP4059586B2 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
JP4519239B2 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
JP2001095600A (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
Schriewer et al. Determination of HOL Phosphatidyl Choline by an Enzymatic Method
JP2600065C (hu)
MXPA01009548A (en) Method for quantitating cholesterol

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee