JPH02276591A - Ａｎｐのｃ端側を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星ｌ上立五月至１ 本発明はＡＮＰを認識するモノクローナル抗体および該
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関し、
さらに詳しくは、α−ＡＮＰ（７）Ｃ端側の配列、即ち
、α−ＡＮＰ［１７−２８１断片に含まれる部分を認識
す、るモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマに関する。さらに本発明は、
ＡＮＰ（７）Ｃ端側を認識するモノクローナル抗体と、
ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識する抗体で、ＡＮＰをサンド
イッチすることを特徴とする。ＡＮＰのエンザイムイム
ノアッセイ（以下、ＥＩＡと略記）およびラジオイムノ
アッセイ（以下、ＲＩＡと略記）に関する。

鼠未ゑ韮１ 心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ａｔｒｉａｌｎａ
ｔｒｉｕｒａｔｉｃ　ｐｏｌｙｐａｐｔｉｄａ、　ＡＮ
Ｐ）は、心房筋細胞により産生され顆粒中に含まれる、
強い利尿作用およびナトリウム***作用を有するポリペ
プチドである。このようなポリペプチドはヒトのみなら
ずラットにおいても見出されており、それぞれｈＡＮＰ
Ｓ　ｒＡＮＰと呼ばれる。ｈＡＮＰおよびｒＡＮＰはさ
らにα、β、７の３つのタイプに分類される。α−ｈＡ
ＮＰは２８アミノ酸残基かもなり、Ｎ端から７番目（７
）Ｃｙｓ［７コと２３番目（７）Ｃｙｓ［２３］がジス
ルフィド結合しており、その間の配列がリング状構造を
なしている（　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　（以下
ＢＢＲＣと略記とする）１１８．１３１−１３９．１９
８４）（第７図参照）、ａ−ｈＡＮＰではＮ端から１２
番目の残基がＭｅｔであるのに対し、α−ｒＡＮＰでは
Ｉｌｅである点でのみ異なっている（ＢＢＲＣ１１７，
８３９−８６５，１９８３）、β−ｈＡＮＰは、α−ｈ
ＡＮＰの逆平行二量体である（特開昭６Ｏ−１８４０９
８）、　７．−　ｈ　Ａ　Ｎ　Ｐは１２６アミノ酸残基
りなり、その０ｗ４の９９〜１２６アミノ酸がα−ｈＡ
ＮＰに相当する。

ＡＮＰの測定法としては既に抗血清を用いたラジオイム
ノアッセイが確立されている（Ｓｃｉｅｎｃ＠２２８、
３２３−３２５．１９８５　：　Ｎａｔｕｒｅ　３１ム
２６４−２６６．１９８５：　ＢＢＲＣ史、　８１５−
８２１．１９８４　：　ＢＢＲＣ出、６６３−６６８．
１９８４　：　ＢＢＲＣ１２５，３１５−３２３，１９
ｇ４）、　このうち、抗血清ＣＲ−３はＡＮＰ（７）Ｃ
末端断片［１７−２８］を認識することが知られている
。

また、最近ＡＮＰに対して、様々な特異性を有するモノ
クローナル抗体が報告されてきている（Ｌｉｆａ　Ｓｃ
ｉ、　３８．１９９１−１９９７．１９８６　ｉ　Ｍｏ
１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２４、１２７−１３２．１９８７　；　Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ　１２１．８４３−８５２、１９１１７　
：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１２．４３３−４４０．１９
８７）−特に、ＡＮＰ（７）Ｎ端部を認識するモノクロ
ーナル抗体としては、［７−１６］を認識するＫＹ、Ａ
ＮＰ−１（特開昭６４−６１５００）が知られており、
さらに、このＫＹ−ＡＮＰ−１とＣ端側を認識する抗血
清を用いたα−ＡＮＰの免疫測定法も既に確立きれてい
る（特開昭６４−６１５００）。

しかし、ＡＮＰ（７）Ｃ端側を認識するモノクローナル
抗体は全く得られていなかった。

が　　しようとする 従来のＡＮＰのイムノアッセイにおいては、試料からＡ
ＮＰを抽出する必要があり、抽出の必要かない高感度の
アッセイを可能にする親和性の高いモノクローナル抗体
が待望されていた。また、上記のＫＹ−ＡＮＰ−１はα
−ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識するので、Ｃ端側を認識す
るモノクローナル抗体が得られれば、Ｎ端側を認識する
モノクローナル抗体とＣ端側を認識するモノクローナル
抗体によるサンドイッチイムノアッセイが可能になる。

また、Ｃ端側断片を特異的に認識する抗体としては、抗
血清ＣＲ−３が知られているが、該抗体はポリクローナ
ル抗体であり、そのため安定な供給ができない、均一な
特異性が得られない等の点でモノクローナル抗体より劣
る。

従って、以上の理由によりＡＮＰ（７）Ｃ端側断片を特
異的に認識する親和性の高いモノクローナル抗体が待望
きれていた。

課　を　　するための　段 本発明者らはＡＮＰ（７）Ｃ端側断片を特異的に認識す
る親和性の高いモノクローナル抗体を創製すべく鋭意研
究を行なった結果、ＡＮＰ（７）Ｃ端側を認識するモノ
クローナル抗体を得、それを利用するＡＮＰの高感度測
定法を完成するに至った。

（υ　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製 α−ｈＡＮＰは２８アミノ酸残基かもなるポリペプチド
であり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起する
能力（免疫原性）が低い、そのため、抗原として用いる
ためには牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結
合させる。得られた複合体は、フロイントの完全アジュ
バント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫
に用いる。

免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下
または静脈に数回繰り返し接種することにより行なう一
０最終免疫後３日ないし５日後に肺臓を取り出し、抗体
産生細胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と
融合させてハイブリドーマを得るための親細胞として、
ヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）あるいはチミジンキナー
ゼ欠損（ＴＫ−）の様な適切なマーカーを持つミエロー
マ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させて
ハイブリドーマを作製する。

ハイプリドーマ作製における培地として、イーグルＭＥ
Ｍ、ダルベツフ変法培地、ＲＰＭＩ−１６４０などの通
常良く使用されているものに、適宜的１０〜３０％の牛
胎児血清（ＦＣ５％ｆｅｔａｌｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）
を加えて用いる。

まず、親細胞であるミエローマと肺細胞を約１：５の割
合で用意する。融合剤としてはポリエチレングリフール
（ＰＥＧ）を５０％濃度で用いるのが融合率が高いとさ
′れている。融合株はＨＡＴ選択法により選択する。生
じるハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い
、膜螢光抗体法、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎ
ｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ　）、
免疫組織染色法など既知の方法により行ない、目的の免
疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローン
を選択する。ハイブリドーマの単一性を吟味するため、
９６大のマイクロウェルにフィーダーレイヤー（ｆｅｅ
ｄｅｒ　１ａｙｅｒ　）として正常な肺細胞を蒔いた上
にハイブリドーマを１穴に１個より多くならないように
蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリーニン
グを行なう、このサブクローニングを繰り返すことによ
り、単一性のハイブリドーマを得る。

（２Ｄ　　モノクローナル抗体の産生 法に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　）または動物体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で培
養する。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系で培養する場合、培地は
先に述べた通常培地にＦｅ２を添加したものでよく、こ
の培地で３から５日培養の後、培養上清からモノクロー
ナル抗体を得゛る。　ｉｎ　ｖｉｖｏ系の培養では、ハ
イブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７ないし１４
日後に腹水を採取し、これよりモノクローナル抗体を得
るａ　ｉｎ　ＶＩＶＯ系での培養の場合、ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ系での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取
得しうるので好ましい。

こうして得られた培養上清または腹水からのモノクロー
ナル抗体の精製は、硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカ
ラム等の既知の方法を適宜組み合わせて、例えば後記実
施例に記載したようにして行なうことが出来る。

本発明で得られたモノクローナル抗体ＡＮＩ　１１およ
びＡＮ１１７は、後記実施例に示される通り、α−ＡＮ
Ｐおよびβ−ＡＮＰを認識する。そのエピトープはα−
ＡＮＰ（７）Ｃ＃ｌｌ！側、詳細にはＡＩａ［１７］か
らＴ　ｙ　ｒ　［２８］に含まれる部分を認識している
ものと考えられる。また、このＡＩａ［Ｌ７］からＴ　
ｙ　ｒ　［２８］に含まれる部分は、７−ＡＮＰにも共
通な部分であるので、本発明の抗体は当然７−ＡＮＰも
認識する。従って、本発明の抗体はα、βおよび７の全
てのタイプのＡＮＰを認識する。

本発明の抗体は、後記表１に示すとおり、α−ｈＡＮＰ
［７−２７１、 α−ｈＡＮＰ［１７−２２］、 α−ｈＡＮＰ［１７−２０］、 α−ｈＡＮＰ［２１−２６］二量体、 ａ−ｒＡＮＰ［７−２３］ に殆ど反応性を示さない、即ち、 α−ＡＮＰ［２Ｂ］、 α−ＡＮＰ［２３−２８］、 α−ＡＮＰ［２１−２８］、 α−ＡＮＰ［２７−２８コ、 α−ＡＮＰ［２４−２８］ の欠除により反応性が無くなったものと考えられる。従
って、本発明の抗体はこれらの断片に含まれる部分を認
識しているものと推定される。従って、α−ＡＮＰ［１
７−２８］を免疫原として用いたことを考慮すれば、本
発明の抗体は、α−ＡＮＰ［ｎ−２８１ （但し、ｎは１７〜２８の整数を示す、）に含まれる部
分を認識していると言える。ｎとしては、上記から明ら
かな様に、１７．２１．２３．２４．２７．２８が例示
される。

本明細書において、例えばα−ｈＡＮＰ［１７−２８］
とは、α−ｈＡＮＰの１７番目のＡｌａから２８番目の
Ｔｙｒまでの断片を意味する。

また、本抗体はα−ＡＮＰに対して高い親和性（ＡＮｌ
ｌｌが１．７Ｘ１０’Ｍ−’、ＡＮ１１７が２．３Ｘ　
１　Ｇ’Ｍ−’）を示した。第１図に示すα−ＡＮＰの
標準曲線から、９０％阻害濃度（ＩＣ。

）はＡ　Ｎ　１１　ｔ　ｈ’　６．２ｎｇ／ｍｌ、ＡＮ
１１７が４゜４　ｎｇ／ｍｌであった。

本発明のモノクローナル抗体ＡＮＩ　１１およびＡＮ１
１７を産生するハイブリドーマＡＮＩ　１１およびＡＮ
１１７は１９８８年１２月２０日から日本国茨城系つく
ば南東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に、それぞれ
受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２１９７およびＦＥＲＭ　ＢＰ
−２１９８としてブタベスト条約に基づき寄託されてい
る。

（３）抗体と担体との結合 抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ポ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができる
。これらの担体に、α−ｈＡＮＰ（７）Ｎ端側またはＣ
端側を認識する抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸
バッファー中、ｐＨ６〜１０、好ましくは中性付近で室
温下・に−夜装置することにより行なう、抗体を吸着し
た担体は、アジ化ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷
所に保存する。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体について
、同様の処理で担体に結合せしめることができる。

（４）酵素標識抗体の調製 Ｆａｂ’ｌｔυｂ化且梨 ＩｇＧ画分をペプシンで消化してＦ（ａｂ’　Ｌ断片と
し、更にこれを２−メルカプトエチルアミンで還元すれ
ば、目的のＦａｂ　’が得られる。　ＩｇＧからＦａｂ
　’の調製については、ジャーナル・才プ・イムノアッ
セイ［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　］、４．２０９
〜３２７（１９８３）に詳細な説明があり、本発明にお
いても、同様の手法を利用することができる。

罠生立夏皇崖１ 抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明にお
いては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましく用
いられる。また、架橋剤としては、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マ
レイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシン
イミドエステル、４，４°−ジチオジピリジン、その他
公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素
および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じ
て、既知の方法に従って行なえばよい、また、抗゛体と
しては、場合によっては、そのフラグメント、例えばＦ
ａｂ　°、Ｆａｂ％Ｆ（ａｂ’）＊を用い石０本発明に
おいては、架橋、剤として４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステルを用
いるのが好ましい、また、ポリクローナル抗体、モノク
ロ−ナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識抗
体を得ることができる。

このようにして得られる酵素標識抗体は、好ましくは、
アフィニティ・クロマトグラフィーにより精製すれば、
更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素
標識抗体は、安定剤としてチメロサールなどを加えて、
あるいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。

（５）放射性同位元素！ｌＡ識抗体の調製クロラミンＴ
法など公知の方法に従って　１１１１などにより、抗体
を標識する。

（６）ＡＮＰの測定 上記で調製された免疫学的測定試薬を用いてＡＮＰを測
定する際の抗体の組合わせとしては、ＡＮＰ（７）Ｎ端
側を認識する抗体を固定化した場合にはＣ端側を認識す
る抗体を標識抗体とし、Ｃ端側を認識する抗体を固定化
した場合にはＮ端側を認識する抗体を標識抗体とすれば
よい、一般には、固定化には比較的大量の抗体が必要で
あるため安定的に大量の抗体が得られるモノクローナル
抗体（例えば、本発明のＡＮ１１１およびＡＮ１１７）
が固定化に適しているが、抗血清から得られるポリクロ
ーナル抗体も不都合なく使用できる。標識する抗体は、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも
よく、固定化した抗体が認識するのとは異なる部位を認
識するものであればよい。

例えば、固定化抗体として本発明のＡＮＩ　１１または
ＡＮ１１７を用いた場合には標識抗体としてＫＹ−ＡＮ
Ｐ−１が適用でき、またこの逆の組合わせでもよい、当
然、α−ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識する抗血清も本発明
に適用できる。

上記の様に本発明の抗体とＫＹ−ＡＮＰ−Ｉを徂み合わ
せれば、実施例に示すとおり、α−ＡＮＰおよびβ−Ａ
ＮＰを測定することができる。従って、本発明の抗体は
ＫＹ−ＡＮＰ−１とのサンドイッチ免疫測定法に適した
モノクローナル抗体である。また、ＡＮＰ（７）Ｎ端側
を認識する抗体として、７−ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識
する抗体を用いれば、７−ＡＮＰを特異的に測定するこ
とも可能である。

（以下余白） 実施例１ （１）免疫用フンシュゲートの作製 ウシチログロブリン水溶液（６４，４ｍｇ／２．４ｍ１
）とｆｆ−ｈＡＮＰ［１７−２８］水溶液（１１，８ｍ
ｇ／ｌ、７ｍ１）を混和し、さらに１−エチル−３（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶
液（１３６ｍｇ／　３．４ｍ１）を加えた後、０℃で２
時間攪拌して反応させた０反応液を蒸留水に対して４℃
で２日間透析し、遠心で沈殿を除いた後、凍結乾燥した
０以上の方法でα−ｈＡＮＰ［１７−２８］−ウシチロ
グロブリンコンジュゲート３９．７ｍｇを得た。結合比
はウシチーグロブ９２１分子当りα−ｈＡＮＦ’［１７
−２８］２９分子であった。

（２）免疫 実施例１（１）に記載したα−ｈＡＮＰ［１７−２８］
−ウシチログロブリンコンジュゲートの生理食塩水懸濁
液（フンシュゲート濃度１．８２ｍｇ／　ｍｌ　）とフ
ロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液
として、これをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス（雌、８週令
）の背部皮下に０　、１　ｍｌずつ３適間隔で４回注射
した。マウス１匹１回当りのコンジュゲート投与量は９
１μｇ１ハブテンのα−ｈＡＮＰ［１７−２８］として
（７）投与１は５μｇである。諮らに、第４回免疫の３
週間後に、ブースター免疫としてα−ｂＡＮｐ［１７−
２８コ一ウシチログロプリンフンジユゲート１８１μｇ
（ハブテン量１０μｇ）を懸濁した生理食塩水０、１　
ｍｌを２日連続して腹腔内に投与した。

（３）細胞融合 ブースター免疫から３日後にマウスの肺臓を摘出し、そ
の細胞を０．１７Ｍ塩化アンモニウム溶演中に水冷下５
分装置いて赤血球を破壊した。残った細胞をＲＰＭＩ−
１６４０培地に懸濁して細胞融合に用いる牌リンパ球と
した０次に同じくＲＰＭＩ−１８４０培地に懸濁した８
−アザグアニンｉｔ　性ミニａ　−ｖ細ａ（ＮＳ−１）
２．４Ｘ１０’個と牌リンパ球１．２Ｘ１Ｇ”個を混合
して、遠心後、上清を除去した。細胞沈殿物にＲＰＭＩ
−１６４０培地に溶かした５０％ポリエチレングリフー
ル（分子量４０００．メルク社）０．８ａｌを１分間か
けてピペットの先で攪拌しながら加え、きらに１．５分
間攪拌した。その後、２ａｌのＲＰＭＩ−１６４０を２
分間かけて次に２ａｌを１分間かけて攪拌しながら加え
た。さらに１８ｍ１のＲＰＭＩ−１６４０を穏やかに攪
拌しながら徐々に滴加した。遠心後、上清を除去し沈殿
した細胞をＨＡＴ培地（ＩＸｌｏ”Ｍヒボキサンチン、
４×１０−７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチ
ミジンを含む２０％ＦＣ３−ＲＰＭ１１６４Ｑ培地）１
００ｍｌに懸濁し、９６ウエル細胞培養プレート（コー
スタ−社）１０枚の各ウェルに０　、１　ｍｌずつ分注
した。開胸培養プレートには前もって栄養細胞としてマ
ウス肺臓細胞のＨＡＴ培地懸濁液を５×１０４個１０．
１ｍｌ／ウェルずつ入れておいた。

以後、２〜３日に１度ずつＨＡＴ培地を半量ずつ新しい
ものと入れ替えた。約１０日後にはハイブリドーマの増
殖が認められた。バイブｌドーマが増殖してきたウェル
は全部で９５１ウエル（９９％）であった。

（４）ハイブリドーマの選択 ハイプリドーマの増殖してきたウェルについて培養上清
を用いて、抗α−ｈＡＮＰ抗体産生の有無をラジオイム
ノアッセイで検定した。チューブ内で培養上清５０７１
！、２％ウシガンマグロブリンを含むアッセイ用緩衝液
（実施例５に記載）１００μ！およびアッセイ用緩衝液
で希釈したｌ＊ｓＩ標識ａ−ｈＡＮＰ（約３００００　
ｃｐｍ／ｍｌ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ａｌ
を混合し、室温で２時間インキュベートした０次に、２
５％ポリエチレングリフール６０００水溶液２５０μ！
を加えて直ちに攪拌し、遠心（３ＱＱＱｒｐｍ、２０分
）後、上清を除去して沈殿の放射能をガンマカウンター
（アロ力ＡＲＣ−６００型）で測定した。１０００Ｑ”
５以上の放射能を与えるものを抗体陽性とした。

全部で９ウエルが抗体陽性として選択された。

（５）モノクローン化 実施例１（４）によって、選択きれたハイプリドーマを
直ちに限界希釈法でクローニングした。

９６ウエル細胞培養プレートにハイブリドーマを１個／
２００１ｔ１／ウエルの濃度で培養し、ノ１イブリドー
マが増殖してきたウェルの培養上清について実施例１（
４）のラジオイムノアッセイを行ない、抗体陽性のウェ
ルのハイプリドーマを培養拡大した。このクローニング
操作を２〜３回繰り返し、後記のサンドイッチイムノア
ッセイに適した抗α−ｈＡＮＰ抗体産生ハイプリドーマ
細胞株ＡＮＩ　１１およびＡＮ１１７を確立した。

（６）腹水抗体液の作製 確立したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、抗体
濃度の高い腹水を作製した。マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ雌、
１０日前にブリスタン０　、５　ｍｌを腹腔内投与）に
ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁したハイプリドーマ約ｌＸ１
０’個を腹腔内に投与した。１〜３週目に適宜腹水を採
取し、細胞を遠心分離した後、上清にアジ化ナトリウム
０．１％を加えて凍結保存した。この方法でハイブリド
ーマＡＮＩ　１１およびＡＮ１１７の産生するモノクロ
−ナル抗体を高濃度に含む腹水ＡＮＩ　１１ＡおよびＡ
ＮＩ　１７Ａを得た。

（７）モノクローナル抗体の精製 アフィゲルプロティンＡ　ＭＡＰＳ−１キツト（バイオ
ラッド社）を用いて、腹水ＡＮＩ　１１ＡおよびＡＮＩ
　１７Ａより抗体を精製した。ゲル１．２ｍｌを用いて
、腹水それぞれ１ｍｌをキットの操作手順に従って精製
したところ、ＡＮＩ　１１Ａから４．３ｍｇ％ＡＮＩ　
１７Ａから２　、５　ｍｇの抗体を得ることができた。

抗体の純度の確認には、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動を用いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエ
タノールで還元した後、１２．５％ポリアクリルアミド
ゲルで泳動を行なった。その結果、分子量的５２．００
０前後にＨ鎖、約２８．０００前後にＬ鎖の２つのバン
ドが認められた。

実施例２ モノクローナル　　のクラス・サブクラスの定 ハイプリドーマが産生ずる免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定はマウスイムノグロブリン各クラス・サ
ブクラスに特異的な抗体（５ｅｒｏｔａＣ社、マウスモ
ノクローナル抗体タイピング用キット）を用いて、免疫
拡散法によって行なった。

その結果、腹水ＡＮＩ　１１Ａ％ＡＮＩ　１７Ａとも抗
ＩｇＧ、抗体との間にのみ沈降線が認められ、両抗体と
もＩｇＧ、に属することがわかった。

実施例３ モノクローナル　　の　和　　　合　　　の主 実施例５に準じて、α−ｈＡＮＰの標準曲線作成の操作
を行ない、α−ｈＡＮＰ各濃度についてスキャッチ〜−
ド法に基づいて縦軸に沈殿の放射能／上清の放射能、横
軸に抗体に結合したα−ｈＡＮＰの濃度をプロットし、
得られた直線の傾きから、抗体の結合定数を測定した。

その結果、ＡＮｌｌｌが１．７Ｘ１０”Ｍ”、ＡＮ１１
７が２゜３　Ｘ　１０”Ｍ−１ト求メラレタ。

実施例４ モノクローナル　　の 実施例５のα−ｈＡＮＰのラジオイムノアッセイにおけ
る試料として、α−ｈＡＮＰ関連ペプチドおよびペプチ
ドフラグメントを用いて、抗体との交差性を求めた。そ
の結果を表１に示す、この結果からＡＮＩ　１１、ＡＮ
１１７ともにα−ｈＡＮＰ（７）Ｃ末端部を認識するこ
とがわかった。

表１゜ ＡＮＰ関連ポリペプチドの交差反応性 実施例５ モノクローナル　　を　いたラジオイムノアラ立ヱ ［試薬］ 二二！王月皇亘差 １１中にエチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩０．
３７２　ｇ、シスチン・２塩酸塩０．０６３ｇ１ε−ア
ミノカプロン酸０．２６２　ｇ、アジ化ナトリウム０．
１ｇおよびウシ血清アルブミン１ｇを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液　ｐＨ７，０１水員皇麓 ＡＮ１１１Ａ（アッセイ用緩衝液で１１万倍希釈したも
の）またはＡＮＩ　１７Ａ（アッセイ用緩衝液で６．２
万倍希釈したもの） α−ｈＡＮＰ準 アッセイ用緩衝液にα−ｈＡＮＰを３．１３〜１００　
ｎｇ／ｍｌの範囲で２倍きざみの濃度で含むもの ”’Ｉ　　　　ａ−ｈＡＮＰ Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のものを約０．１ｌｔＣ１／ＩＩ
＋１になるようにアッセイ用緩衝液で希釈したもの１％
ウシガンマグロブリン アッセイ用緩衝液に溶解したもの ３７．５％ポリエチレングリフール ポリエチレングリコール６０００をウシ血清アルブミン
を除いたアッセイ用＃Ｉｋ、衝液に溶解したもの ［方法］ チューブにα−ｈＡＮＰ標準液または試料１００μ２を
とり、１１１１標識α−ｈＡＮＰ　１０　Ｇμ！、腹水
希釈液１００μ！および１％ウシガンマグロブリン２０
０μｋを加えて混和した後、４℃で１晩インキユベート
した０次いで、４℃に冷却した３７，５％ポリエチレン
グリフール２５０μ！を加え、直ちに１５秒間攪拌した
後４℃で３００　Ｏｒｐｍ、　２０分間遠心した。上清
を除去した後、沈殿の放射能をガンマカウンター（アロ
カＡＲＣ−６００型）で測定し−た。

［標準曲線］ ラジオイムノアッセイの標準曲線を第１図に示す、感度
（９０％阻害濃度）はＡＮＩ　１１が６゜２　ｎｇ／ｍ
ｌ、ＡＮ１１７が４　、４　ｎｇ／ｍｌであった。

実施例６ α−ｈＡＮＰのサンドイッチラジオイムノアッセイ 同相抗体には、前記のハイブリドーマクローンＡＮＩ　
１１あるいは−ＡＮ１１７が産生する抗α−ＡＮＰ−［
１７−２８］モノクロ一ナル抗体（以後、’ＡＮ１１１
あるいはＡＮ１１７Ｊと略す）をポリスチレンビーズに
固相化したものを、また標識抗体には、ハイブリドーマ
クローンＫＹ−ＡＮＰ−１（特開昭６４−６１５００　
、　ＥＣＡＣＣ８７０８２００１）が産生する抗α−ｈ
ＡＮＰ［１−２８］モノクロ一ナル抗体（以後、’ＫＹ
−ＡＮＰ−１．と略す、）を″“！で標識したものをそ
れぞれ用いて、α−ｈＡＮＰのサンドイッチラジオイム
ノアッセイを確立した。

１、腹水の精製 ＡＮＩ　１１、ＡＮ１１７およびＫＹ−ＡＮＰ−■から
得た腹水をＡｆｆｉ−ｇｐ、Ｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　
ＭＡＰＳ−ｎ　（バイオラッド社製）により精製した。

すなわち、腹水１ｍｌに結合緩衝液１ｍｌを加え、これ
をあ　らかじめ結合緩衝液で平衡化したＡｆｆｉ−ｇｅ
ｌＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラム（０，７Ｘ２ｃｍ）に加え
、結合緩衝液３（１ｍｌで洗浄した０次いで、溶出緩衝
液１０ｍ１で展開して溶出液１ｍｌ毎に分取し、吸光度
（２８Ｇｎｏ＋）が０．１以上の画分を蒸留水に対して
透析してＩｇＧ画分を得た。

２、固相化抗体の作製 上記１で得たＡＮｌｌｌＡあるいはＡＮ１１７ＡのＩｇ
Ｇ画分（１００μｓ／ｍｌ）を含む０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）にポリスチレンビーズ（イチコ社製
、直径３．２ｍｍ）を浸漬し、４℃で２０時間静置シタ
、次イテ、ＲＩ　ＡＪｌｌｌ）衝液［０，１％牛血清ア
ルブミン（ｃｒｙｓｔａｌ、　Ｓｉｇｍａ社製、以後、
’　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｊと略す、）、１ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム（以後、′″ＥＤＴＡＪと略す、
）、０　、２　ｍＭシスチンおよび０．１％アジ化ナト
リウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７゜０］で十
分に洗浄したのち、同緩衝液中に４°Ｃで保存した。

３．１″８Ｉ標識抗体の作製 上記１で得たＫＹ−ＡＮＰ−ＩのＩＫＧ画分１０μｇに
０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、５＞５０μｍとＮａ’
　”　Ｉ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）０．５ｍＣ１を加
え混和した後、０．２％クロラミンＴ溶液１０μｍを加
え、３０秒間攪拌した６次いで、１％メタ重亜硫酸ナト
リウム溶液１０μｍを加え混和後、１０％ヨウ化カリウ
ムおよび１％ＢＳＡ溶液をそれぞれ１０μｍずつ加え、
これをゲル濾過［５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ｐＨｇ
ｒｍａｃｉａ社製、Ｆｉｎｅ）　：　０　、９　Ｘ　２
５ｃｍ。

０　、１　Ｍ　ＩＪ　’ｙ酸緩衝液、ｐＨ７，４コして
ｌ″ａ！標識抗体３９０μＣｉを得た。

４、測定法 ａ、２段階法 上記２の固相化抗体ビーズ１個をポリスチレシチューブ
にとり、これに標準α−ｈＡＮＰ溶液（１０〜２０００
　ｐｇ／ｍｌ）あるいはヒト血漿試料５０μｍおよびＲ
ＩＡ用緩衝液１００μｍを加えて、４℃で２４時間イン
キュベーションした。上清を吸引除去し、洗浄液（０，
１％Ｔｗｅｅｎ　８０および０．９％塩化ナトリウムを
含む０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）１ｍｌで３
回洗浄したのち、目８１標識抗体溶液（１，２Ｘ　１０
’ｄｐｍ／ｍｌ）　１５０μｍを加えて、４℃で２４時
間インキュベーションした。上清を吸引除去し、洗浄液
１ｍｌで３回洗浄したのち、同相に結合した１１！標識
抗体の放射能をガンマカウンターで計測した。

ｂ、１段階法 上記２の固相化抗体ビーズＩＭＩをポリスデレンテユー
プにとり、これに標準α−ｈＡＮＰ溶液（１０〜２００
０ｐｇ／ｍｌ）あるいはヒト血漿試料５０μｍおよび１
ｔＪｌｌ識抗体溶液（１，８Ｘ　１０’ｄｐｍ／ａ＋１
）　１００μｍを加え、４℃で２４時間インキュベーシ
ョンした。上清を吸引除去し、洗浄液１ｍｌで３回洗浄
して固相に結合した１ｔｌＩ標識抗体の放射能をガンマ
カウンターで計測した。

標準曲線は標準α−ｈＡＮＰの濃度を横軸に、計測した
放射能を縦軸にプロットして作成し、血漿ＡＮＰｇ度は
血漿試料の放射能を標準曲線に対応させて求めた。

なお、以下の結果は特記しないかぎり、固相抗体にＡＮ
Ｉ　１１を用いて１段階法により測定したものである。

５、標準曲線 上記の１定法４−ａおよび−ｂの標準曲線は、それぞれ
第２図に示すとおりであった。最小検出感度は、ともに
０　、５　ｐｇ／１ｕｂｅテあツタ。

６、交差反応性 ＡＮＰ関連化合物の交差反応性は第３図および表２に示
すとおりで、Ｃ端部が欠落したもの（α−ｈＡＮＰ［７
−２７］）やα−ｒＡＮＰはほとんど交差しなかった。

７、ヒト血漿の希釈曲線 惟康成人２例の血漿にα−ｈＡＮＰを添加した試料の希
釈曲線は、標準曲線と良い平行性を示しく第４図）、血
漿量と測定値の間の関係は原点に収束する直線性を示し
た（第５図）。

８、血漿α−ｈＡＮＰの回収試験 健康成人２例の血漿に添加したα−ｈＡＮＰの平均回収
率は、表３に示すように１０７．５±７．６％であった
。

９、血漿α−ｈＡＮＰ濃度 健康成人５例の血漿中濃度を測定したところ、表４に示
すように平均９．６±６　、５　ｐｇ／ｍｌであつた。

表２．ＡＮＰ関連ペプチドの交差反応 表４，２段階法によるサンドイッチラジオイムノアッセ
イによる健康成人の血漿α−ｈＡＮＰ濃度 実施例７ α−ｂＡＮＰのサンドイッチェンザイムイムノアッセイ 固相抗体は、前記■のラジオイムノアッセイと同じもの
を、また標識抗体には、ＫＹ−ＡＮＰ−１をマレイミド
法（Ｅ、　　Ｉｓｈｉｋａｗａ　ａｔ　ａｔ、　；Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４．２０９−３２７（１９
８３））によりペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来、Ｓ
ｉｇｍａ社製、以後。

１（ＲＰと略す、）で標識したものをそれぞれ用いて、
α−ｈＡＮＰのサンドイツチェンザイムイムノアッセイ
を確立した。

１、ＨＲＰ標識抗体の作製 ａ　、　ＫＹ−ＡＮＰ−ＩＦａｂ’の作製前記Ｉ−１で
得たＫＹ−ＡＮＰ−Ｉの１３０画分５ｍｇを０．１Ｍ塩
化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸暖衝漬（ｐ）１４．２　
）に、ペプシン（ブタ胃粘膜由来、Ｓｉｇｍａ社製）０
．２ｍｇを加えて溶かし、３７℃で１６時間インキユベ
ーシッンした。２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
ｐＨを７に１ｌｔＬ、たのも、ゲル濾過［カラム：　ｔ
ｌｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４　（ＬＫＢ社製）１．
５Ｍ４５ｃｍ、展開液；　５　ｍＷ　ＥＤＴＡ含有０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　］　Ｉ、てＦ（ａｂ
’）ｓ画分を分取した。

次いで、Ｆ（ａｂ’）ｓ画分をＣａｎｔｒｉｃｏｎ　３
０（Ａａ＋１ｃｏｎ社製）で濃縮しく　２　ｍｇｌｏ、
　４（１１１）、これに０．１Ｍ２−メルカプトエチル
アミン溶液０．０５ｍ１を加えて、３７℃で１．５時間
インキュベーションした０反応液をゲル濾過［カラム：
　５ｅｐｈａｄａｘ　Ｇ−２５（ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）０．９Ｍ４５ｃｍ、展開液；５吐ＥＤＴＡ含有０．
１Ｆｉリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　］　ｔ、て過剰の
試薬を除去したのち、分取したＦａｂ’画分をＣｅｎｔ
ｒｉｃｏｃｚ　３Ｇで濃縮した。

ｂ、マレイミド化ＨＲＰの作製 ＨＲＰ　２　ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）０．３ｍｌに４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステルのジメチル
ホルムアミド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）　３０μｍを加え
、ａｏ”ｃで１時間攪拌した。これを遠心（２０ＱＱＸ
ｇ、５１１１ｉｎ）シ、上清を上記１−　ａ　（５ｅｐ
ｈａｄａＸＧ−２５）と同じ手順でゲル濾過して過剰の
試薬を除去したのち、マレイミド化ＨＲＰ画分をＣｅｎ
ｔｒｉｃｏｎ３０で濃縮した（　１．８ｍｇ１５００μ
ｍ）。

ｃ　、　ＫＹ−ＡＮＰ　−ＩＦａｂ’のｔ（ＲＰＩＩ識
上記１−ａのＫＹ−ＡＮＰ−ＩＦａｂ’溶液（４ｍｇ／
ｍｌ）　５００μｍに、上記１−ｂのマレイミド化■Ｐ
溶液（３，６岨／ｍｌ）　５００μｍを加え混和後、４
℃で２０時間インキュベーションした０次いで０、ＩＭ
　Ｎ−エチルマレイミド溶液０．１ｍＭを加えて、３０
℃で１時間インキュベーションしたのち、上記１−　ａ
　（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４　）と同じ手順で
ゲル濾過してＨＲＰ標識抗体を得た。

２、測定法 ａ、エンザイムイムノアッセイ（２段階法）前記１−２
の固相化抗体ビーズ１個をポリスチレンチューブにとり
、これに標準α−ｈＡＮＰ溶液（６−２０００ｐｇ／ｍ
ｌ）あるいはヒト血漿試料０．０５ｎ＋１およびＥＩＡ
用緩衝液（０，１％ＢＳＡ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０
　、２　ｍＭシスチン、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび
１００ＯＫＩυ／ｍｌアプロデニン（Ｓｉｇｍａ社製）
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）　１００
μｍを加えて４℃で２４時間インキュベーションした。

上清を吸引除去し、洗浄液（０，１Ｍ塩化ナトリウムを
含む１０−リン融緩衝液、ｐＨ７，０）　２ｍＭで２回
洗浄したのち、ＨＲＰ標識抗体溶液（０，３３μｇ／ｍ
ｌ）　１５０　ａｌを加え、４℃で２４４時間インキュ
ベーションた。上清を吸引除去し、洗浄液２ｍｌで２回
洗浄したのち、下記すの手順に従うて固相に結合したＨ
ＲＰｍ識抗体の酵素活性を測定した。

ｂ、酵素活性の測定 固相抗体ビーズを別のポリスチレンチューブに移り、、
０．６％３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）１００μｍ、次いでｏ、ｏｉｓ％過酸化水
素水５０μｍを加え、３０℃で１時間インキュベーショ
ンした。０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０，３）　２
　、５　ｍｌを加えて反応を停止し、螢光強度（励起波
長：　３２０　ｎｍ、螢光波長；４０５ｎｍ）を測定し
た。螢光強度は、キニーネの５０ｏＭ硫酸溶液（０，２
μｓ／ｍｌ　）の螢光強度を１００としたときの相対螢
光強度で表わした。

標準曲線は、標準α−ｈＡＮＰ溶液の濃度を横軸に、螢
光強度を縦軸にプロットして作成した。

３、標準曲線 固相抗体にＡＮｌｌｌおよびＡＮ１１７を用いたときの
標準曲線は第６１！ｌに示すとおりで、最小検出感度は
、ともに０　、１　ｐｇ／１ｕｂｅであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＮＩ　１１およびＡＮ１１７を用いたα−ｈ
ＡＮＰの標準曲線を示す、第２図は１段階および２段階
サンドイッチラジオイムノアッセイにおけるα−ｈＡＮ
Ｐの標準曲線を示す、第３図はＡＮＰ関連ペプチドの交
差反応性を示す、第４図はα−ｂＡＮＰの標準曲線と血
漿希釈曲線を示す、第５図は血漿の希釈試験の結果を示
す、第６図はサンドイッテエンザイムイムノアッセイ（
２段階法）におけるα−ｈＡＮＰの標準曲線を示す、第
７＠はα−ｈＡＮＰの構造を示す。 第　　１ 図

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＡＮＰ（７）Ｃ端側を認識するモノクローナル抗
   体。
2. （２）該ＡＮＰがα−ＡＮＰまたはβ−ＡＮＰである請
   求項１記載のモノクローナル抗体。
3. （３）α−ＡＮＰ［ｎ〜２８］断片（ただし、ｎは１７
   〜２８の整数を示す。）に含まれる部分を認識する請求
   項１記載のモノクローナル抗体。
4. （４）上記ｎが、１７、２１、２３、２４、２７または
   ２８である請求項３に記載のモノクローナル抗体。
5. （５）マウスハイブリドーマＡＮ１１１（ＦＥＲＭ　Ｂ
   Ｐ−２１９７）により産生されるモノクローナル抗体Ａ
   Ｎ１１１である請求項１〜４のいずれかに記載のモノク
   ローナル抗体。
6. （６）マウスハイブリドーマＡＮ１１７（ＦＥＲＭ　Ｂ
   Ｐ−２１９８）により産生されるモノクローナル抗体Ａ
   Ｎ１１７である請求項１〜４のいずれかに記載のモノク
   ローナル抗体。
7. （７）固相に固定化した抗体である請求項１〜６のいず
   れかに記載のモノクローナル抗体。
8. （８）該固相がポリスチレンビーズである請求項７記載
   のモノクローナル抗体。
9. （９）請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマ。
10. （１０）ハイブリドーマＡＮ１１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
    ２１９７）である請求項９記載のハイブリドーマ。
11. （１１）ハイブリドーマＡＮ１１７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
    ２１９８）である請求項９記載のハイブリドーマ。
12. （１２）請求項１〜８のいずれかに記載のＡＮＰのＣ端
    側を認識するモノクローナル抗体とＡＮＰのＮ端側を認
    識する抗体でＡＮＰをサンドイッチすることを特徴とす
    るＡＮＰの免疫測定法。
13. （１３）該ＡＮＰ（７）Ｃ端側を認識するモノクローナ
    ル抗体を固相化抗体とし、該ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識
    する抗体を酵素または放射性同位元素標識抗体として用
    いることを特徴とする請求項１２に記載の測定法。
14. （１４）該ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識する抗体がモノク
    ローナル抗体であることを特徴とする請求項１２または
    １３に記載の測定法。
15. （１５）該ＡＮＰ（７）Ｎ端側を認識する抗体がＫＹ−
    ＡＮＰ−Ｉであることを特徴とする請求項１４に記載の
    測定法。