KR960009014B1

KR960009014B1 - Anp의 c-말단을 인식하는 단클론성 항체

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Publication number: KR960009014B1
Application number: KR1019900005504A
Authority: KR
Inventors: 아쯔시 미사끼; 아끼라 야마우찌; 마사오 고노; 겐이찌 이가노; 겐 이노우에
Original assignee: 시오노기세이야꾸 가부시끼가이샤; 요시또시 가즈오
Priority date: 1989-04-19
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1996-07-10
Also published as: EP0393640B1; DE69021921D1; EP0393640A1; DE69021921T2; GR3017268T3; JPH02276591A; KR900016464A; CA2012740A1; CA2012740C; ES2078918T3; ATE127158T1; DK0393640T3; JPH0667319B2

Abstract

내용없음.

Description

ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체

제1도는 AN111 및 AN117을 사용한 α-hANP의 표준 곡선을 나타낸다.

제2도는 1단계 및 2단계의 샌드위치 방사선 면역검정(radioimmunoassays)의 표준 곡선을 나타낸다.

제3도는 ANP-연관 펩티드의 교차 반응식을 나타낸다.

제4도는 α-hANP의 표준 곡선 및 혈장 희석 곡선을 나타낸다.

제5도는 혈장의 희석 시험의 결과를 설명한다.

제6도는 샌드위치 효소 면역검정(2단계)에서의 α-hANP의 표준 곡선을 나타낸다.

제7도는 α-hANP의 구조를 나타낸다.

본 발명은 ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체, 상기 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 및 ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체 및 ANP의 N-말단을 인식하는 항체로 ANP를 샌드위치시킴을 특징으로 하는 ANP의 효소 면역검정(이하 EIA로 약칭함) 및 방사선 면역검정(이하 RIA로 약칭함)에 관한 것이다.

심방성 나트륨 이뇨 폴리펩티드(atrial natriuretic polypeptide, ANP)는 심방성 근세포에 의해 생성되는 과립중에 함유되어 있으며 강한 이뇨작용 및 나트륨 배설작용을 갖는다.

이와 같은 폴리펩티드는 사람 뿐만 아니라 쥐에게서 발견되고 각각 hANP 및 rANP로 명명된다. 또한, hANP 및 rANP를 각각 3개의 군 즉, α-, β- 및 γ-타입으로 분류할 수 있다. α-hANP는 28개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 그의 Cys[1] 및 Cys[23](N-말단으로부터 각각 7번째 및 23번째의 시스테인 잔기)는 디설파이드 결합을 형성하고 그들 사이의 서열은 고리구조를 형성한다[Biochem. Biophys. Res. Commun. (이하 BBRC로 약칭함) 118, 131∼139, 1984](제7도 참조).

α-hANP의 N-말단으로부터 12번째 잔기는 Met는 반면, α-rANP의 N-말단으로부터 12번째 아미노산 잔기는 Ile이다(BBRC 117, 839∼865, 1983). β-hANP는 α-hANP 역평행 이량체이다(일본국 특개소 60-184098).

γ-hANP는 126개의 아미노산 잔기로 이루어지고 그의 C-말단의 66∼126 아미노산 서열은 α-hANP에 상응한다.

ANP의 검정으로 항혈청을 사용하는 방사성 면역검정은 이미 확립되어 있다(Science 228, 323∼325, 1985 ; Nature 314, 264∼266, 1985 ; BBRC 124, 815∼821, 1984 ; BBRC 124, 663∼668, 1984 ; BBRC 125, 315∼323, 1984).

공지된 항혈청중, 항혈청 CR-3이 ANP의 C-말단 단편[17-28]을 인식한다고 공지되어 있다. 또한, 최근 ANP에 대해 상이한 종류의 특이성을 갖는 단클론성 항체가 보고되어 있다(Life Sci. 38, 1991∼1997, 1986 ; Mo1. Immunol. 24, 127∼132, 1987 ; Endocrinology 121, 843∼852, 1987 ; Hybridoma 6, 433∼440, 1987). 특히, ANP의 N-말단을 인식하는 단클론성 항체로 ANP의 N-말단 부위[7-16]을 인식하는 KY-ANP-I가 공지되어 있다(일본국 특개소 64-61500). 더욱이, KY-ANP-I 및 C-말단을 인식하는 항혈청을 사용하는 α-ANP의 면역검정이 이미 확립되어 있다(일본국 특개소 64-61500). 그러나, ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체는 아직 수득되지 않았다.

통상적인 ANP의 면역검정에서는 시험 시료로부터 ANP를 추출하는 것이 필요하므로, 추출없이 고감도 분석을 할 수 있고 고도의 친화성을 갖는 단클론성 항체가 요망되고 있다. 상술된 KY-ANP-I가 ANP의 N-말단 부위를 인식하는 것으로 알려져 있으므로, α-ANP의 C-말단 부위를 인식하는 단클론성 항체를 이용할 경우 α-ANP의 N- 및 C-말단을 각각 인식하는 두가지 타입의 단클론성 항체를 사용하는 샌드위치 면역검정이 가능하게 된다.

항 혈청 CR-3은 C-말단쪽을 특이하게 인식하는 것으로 이미 공지되어 있다. 그러나, 상기 항 혈청은 다클론성이므로 안정한 공급, 균일한 특이성 등의 측면에서 단클론성 항체 항체보다 불량하다.

본 발명은 α-ANP의 C-말단의 서열을 인식하는 단클론성 항체 즉, α-ANP[17-28]의 단편에 함유된 부분 및 상기 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공한다. 또한, 본 발명은 ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체와 ANP의 N-말단을 인식하는 항체를 사용하여 ANP를 샌드위치시킴을 특징으로 하는 ANP의 효소 면역검정(EIA) 및 방사선 면역검정(RIA)에 관한 것이다.

ANP의 C-말단을 특이하게 인식하고 그에 대한 고도의 친화성을 갖는 상기 클론성 항체는 ANP의 샌드위치 면역검정에 유용하다.

본 발명자들은 ANP의 C-말단을 특이하게 인식하는 고친화성의 단클론성 항체를 개발하기 위해 열심히 연구하였다.

그 결과, ANP의 C-말단을 인식하는 항체를 수득하고 그것을 사용하는 ANP의 고감도 검정을 확립하는데 성공하였다.

(1) 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마의 제조

α-hANP는 28개의 아미노산 잔기로 이루어지고 그의 저분자량 때문에 저항원성을 나타낸다. 따라서, 이것은 항원으로 사용되는 소혈청 알부민, 소 티로글로블린등과 결한다. 수득한 복합체를 생쥐 면역에 절절한 보조액에 유탁시킨다.

상기 유탁액을 생쥐 면역을 위해 생쥐에게 수주 간격으로 복강, 피하 또는 정맥내로 반복하여 접종시킨다. 최종 면역후 3∼5일에 비장을 취하여 항체 생성 세포로 사용한다.

히포잔틴-구아닌-포스포리보실 전이 효소 결손(HGPRT-), 티미딘키나제 결손(TK-) 등과 같은 적당한 마커를 갖는 골수품 세포를 항체 생성 세포와 융합하는 친(親)세포로 사용하여 하이브리도마를 제조한다.

항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 제조한다.

하이브리도마를 제조하기 위한 배지에는 이글스 MEM, 달벡코 변형 배지, RPMI-1640, 및 통상적으로 사용되는 것이 포함되며, 필요하다면, 약 10∼30% 소 태아 혈청(FCS)을 가하여 사용한다.

친세포로 골수종 세포 및 비장세포를 약 1 : 5의 비로 제조한다. 효과적인 융합을 위해 융합제로 폴리에틸렌 글리콜을 50% 농도로 사용한다. 수득한 세포를 HAT법에 의해 선택한다. 이렇게 수득된 하이브리도마의 스크리닝을 막형광 항체법, ELISA법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 면역 화학기술 또는 기타 통상적인 검정에 따라 수행하여 목적 면역 글로블린을 생산하는 클론을 선택한다. 하이브리도마의 단일성을 확인하기 위해서 하이브리도마를 96-웰 마이크로 플레이트에 피더층(feeder layer)으로 정상 비장세포를 웰당 1 미만의 농도로 사용하여 배양한다. 클론이 형성될때 상술된 바와 동일한 스크리닝을 다시 수행한다. 이 서브클로닝 방법을 반복하여 단일성 하이브리도마를 수득한다.

(2) 단클론성 항체의 생산

본 발명의 단클론성 항체를 생산하기 위해서 상기에서 수득된 하이브리도마를 용기내(in vitro) 또는동물체내(in vivo)에서 배양한다. 용기내 배양의 경우 하이브리도마를 상술된 FCS를 첨가한 통상의 배지에서 3∼5일간 배양하여 상층액으로부터 단클론성 항체를 회수한다. 동출체내 배양의 경우 하이브리도마를 포유류의 복강에 접종하고, 7∼14일 후에 복수를 수거하여 그로부터 단클론성 항체를 회수한다. 동물체내 배양의 경우 용기내 배양의 경우보다 휠씬 다량인 단클론성 항체가 효율적으로 수득되므로 동물체내 배양이 바람직하다.

이렇게 상층액 또는 복수로부터 수득된 단클론성 항체를 설페이트-분획화, DEAE-세파로즈 컬럼 크로마토그래피, 기타 공지된 방법 또는 그의 조합, 예를 들어 하기 실시예에 기재되는 방법에 의해 정제할 수 있다.

하기 실시예로부터 본 발명의 단클론성 항체 AN111 및 AN117는 각각 α-ANP 및 β-ANP를 인식한다는 것이 명백해진다. 특히 항원 결정부위(epitope)는 α-ANP의 C-말단쪽, 특히 Ala(17)와 Tyr(28)사이의 부분인 것으로 보여진다. Ala(17)∼Tyr(28)의 부분은 γ-ANP와 공통이므로 본 발명의 단클론성 항체는 당연히 γ-ANP를 인식해야 한다. 결론적으로, 본 발명의 단클론성 항체는 ANP의 모든 타입 즉, α-, β- 및 γ-ANPs를 인식한다.

본 발명의 단클론성 항체는 제1도에서 보는 바와 같이 하기에 기재한 것과 거의 반응하지 않는다.

α-hANP[7-27],

α-hANP[17-22],

α-hANP[17-20],

α-hANP[21-26], 이량체, 및

α-rANP[7-23].

반응성이 없는 것은 하기에 기재된 것이 부족한 탓으로 생각된다.

α-ANP[28]

α-ANP[23-28],

α-ANP[21-28],

α-ANP[27-28], 및

α-ANP[24-28].

따라서, 본 발명의 단클론성 항체는 상기 단편에 함유된 부분을 인식하는 것으로 추정된다. 이러한 사실로 α-ANP(17-28)은 면역원으로 사용되는 것으로 사려되고, 본 발명의 단클론성 항체는 하기 단편에 함유된 부분을 인식하는 것으로 결론지어진다 :

α-ANP[n-28]

(이때, n은 17∼28의 정수이다).

정수 n은 바람직하게는 17, 21, 23, 24, 27 또는 28이다.

본 명세서에서 예를 들어 α-hANP 17-18은 α-hANP의 17번째 Ala∼28번째 Tyr의 단편을 의미한다.

본 발명의 단클론성 항체는 α-ANP와 고도의 친화성을 나타내고 AN111 및 AN117은 각각 1.7×10⁹M^-1및 2.3×10⁹M^-1의 친화 상수를 나타낸다. 제1도의 α-ANP의 표준 곡선으로부터 계산된 AN111 및 AN117의 90% 저해 농도(IC₉₀)는 각각 6.2ng/ml 및 4.4ng/ml이다.

본 발명의 단클론성 항체 AN111 및 AN117을 생성하는 하이브리도마 AN111 및 AN117는 부다페스트 조약에 의거하여 1988년 12월 20일 이후 일본국 이바라끼껭 쓰꾸바시 하가시 1쪼메 1방 3고(우편번호 305)에 소재한 통상 산업성 공업기술원 미생물 연구소(FRI)에 수탁번호 FERM BP-2197 및 FERM BP-2198로 기탁되어 있다.

(3) 고체상의 항체의 고정화

항체가 고정화된 고체상으로 유리 또는 합성 수지의 입상물(bead), 구상물(ball) 및 튜브 및 플레이트와 같은 항원-항체 반응용 통상적인 담체를 사용할 수 있다. 이 담체상에 α-hANP의 N-말단 또는 C-말단쪽을 인식하는 항체를 pH 6~10, 바람직하게는 중성부근의 인산 완충액에 실온으로 밤새 방치함으로써 고정화한다. 항체를 흡착시킨 담체를 아디즈 나트륨과 같은 방부제의 존재하에 냉소에 보관한다.

임의의 단클론성 및 다클론성 항체를 상술된 방법에 의해 담체상에 고정화할 수 있다.

(4) 효소-표식 항체(Enzyme-Conjugated Antibody)의 제조

Fab' 단편의 제조

IgG의 펩신-소화에 의해 수득된 F(ab')₂단편을 2-메르캅토 에탄올로 환원시켜 목적 Fab' 단편을 제조한다.

IgG로부터의 Fab' 단편의 제조는 J. Immunoassay, 4, 209~327(1983)에 기재되어 있고 이것은 본 발명에 사용가능하다.

[항체의 효소 표식]

항체에 표식되는 효소로 알칼리석 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 글루코스-옥시다제가 바람직하고 특히, 서양 와사비 퍼옥시다제가 더욱 바람직하다. 가교제로 N,N'-O-페닐렌 디말레이미드, N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, N-숙신이미딜 6-말레이미도헥산-1-카르복실레이트, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 및 기타 공지된 가교제가 사용가능하다. 이 가교제와 효소 및 항체와의 반응을 각 가교제의 성질에 따른 공지된 방법으로 수행한다. 이 반응에서 항체 자체 및 Fab', Fab, F(ab')₂와 같은 그의 단편은 사용가능하다. 본 발명에서 가교제로 N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도에틸)시클로헥산-1-카르복실레이트가 가장 바람직하다. 효소-표식 항체를 임의의 단클론성 및 다클론성 항체로부터 상기 방법에 의해 제조할 수 있다. 이렇게 수득된 효소-표식 항체를 바람직하게는 친화성 크로마토그래피로 정제하고 다시 감도가 더 높은 면역검정계를 행할 수 있다. 경제된 효소-표식 항체를 동결건조시킨 후 또는 티멜로살과 같은 안정화제 존재하에 암소에 보관한다.

(5) 방사성 동위원소-표지 항체(Radioisotope-labelled Antibody)의 제조

¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소를 사용하여 클로르아민 T법과 같은 공지된 방법에 따라 항체를 표지한다.

(6) ANP의 검정

상기에서 제조된 면역검정용 시약을 사용하는 ANP 검정을 할 때 항체의 조합은 다음과 같다. ANP의 N-말단을 인식하는 항체가 고정화되는 곳에서 C-말단을 인식하는 항체는 표지된다. 반대로, C-말단을 인식하는 항체가 고정화되는 곳에서 N-말단을 인식하는 항체는 표지된다. 일반적으로, 고정화에 비교적 많은 양의 항체가 필요하기 때문에 다량이 안정하게 생성되는 단클론성 항체(예, 본 발명의 AN111 및 AN117)가 고정화에 적합하다.

물론, 항 혈청으로부터 수득된 단클론성 항체를 어려움 없이 고정화에 사용할 수 있다. 만일 표지되는 항체가 고정화된 항체에 의해 인식되는 것과 다른 부분을 인식하면 그것은 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 예를 들어 본 발명의 AN111 또는 AN117를 고정화할 때 KY-ANP-I를 표지된 항체로 사용할 수 있고 그의 역조합 또한 사용가능하다. 물론, α-ANP의 N-말단쪽을 인식하는 항 혈청도 또한 본 발명의 검정에 사용할 수 있다.

본 발명의 항체를 상술된 KY-ANP-I와 조합시킴으로써 α-ANP 및 β-ANP의 검정을 실시예에 기재된 것과 같이 실행한다. 즉, 본 발명의 항체는 KY-AND-I를 사용하는 샌드위치 면역검정에 적합하다. 또한, 만약 γ-ANP의 N-말단쪽을 인식하는 항체가 ANP의 N-말단쪽을 인식하는 항체로 사용되면, γ-ANP의 특이적 검정이 가능하다.

[실시예 1]

항-α-hANP 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마의 제조 및 항체의 생성

(1) 면역용 콘쥬게이트(conjugate)의 제조

소 티로글로블린(64.4mg/2.4ml)과 α-hANP[17/28](1.8mg/1.7ml)의 혼합물에 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(136mg/3.4ml)의 용액을 가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간동안 교반하면서 반응시킨다.

반응액을 4℃에서 2일간 증류수에 대해 투석시킨다. 원심분리로 침전물을 제거한 후, 수득물을 동결건조하여 39.7mg의 α-hANP[17-28]-소 티로글로불린 콘쥬게이트를 수득한다. 소 티로글로블린 1 분자당 α-hANP[17-28]의 결합비는 29 : 1이다.

(2) 면역

α-hANP[17-28]-소 티로글로블린 콘쥬게이트의 생리 식염수 현탁액(콘쥬게이트의 농도 : 1.82mg/ml)을 상기 혼합액과 동일한 부피의 프륀드 완전 보조액으로 유탁시킨다.

유탁액(0.1ml)을 Balb/c 생쥐(암컷 8주령)의 등에 3주 간격으로 4회 피하 주사한다. 생쥐 1마리당 1회당 콘쥬게이트의 양은 91㎍이고 α-hANP[17-28]의 합텐(hapten)으로 투여량은 5㎍이다. 게다가, 4회 면역한지 3주 후에, α-hANP[17-28]-소 티로블로블린 콘쥬게이트 181㎍(합텐 10㎍)의 생리 식염수 현탁액0.1ml을 증강 면역으로서 2일 연속으로 매일 1회 복강내로 투여한다.

(3) 세포 융합

증강 면역한지 3일후에 생쥐의 비장을 적출시키고 0.17M 염화암모늄에 용해중인 세포를 5분간 방치하여 적혈구를 파괴한다. 남아있는 세포를 RPMI-1640 배지에 현탁시켜서 하기 융합에 사용될 비장 림프구를 수득한다. 그 다음에 RPMI-1640 배지에 현탁시킨 8-아자구아닌 내성근세포(NS-1) 2.4×10⁷개 및 비장 림프구 1.2×10⁸개를 혼합한 후 원심분리한다.

수득된 세포 침전물에 0.8ml의 50% 폴리에틸렌글리콜(분자량 4,000; 메르크사제)을 1분후에 피펫 끝부분으로 교반하면서 가한 혼합물을 1.5분간 교반한다. 혼합물에 2ml의 RPMI-1640 배지를 2분 후 가한 다음 1분 후에 2ml의 RPMI-1640을 가한다. 그후 18ml의 RPMI-1640을 천천히 교반하면서 적가한다. 원심분리한 후 상층액을 제거한 다음에 수득된 세포 침전물을 100ml의 HAT배지((1×10^-4하이포잔틴, 4×10⁷M 아미놉테린 및 1.6×10^-5M 티미딘을 함유한 20% FCS-RPMI-배지)에 현탁시키고, 웰당 0.1ml로 96-웰 마이크로 플레이트(코오스터 사제) 10개의 플레이트에 분주한다. HAT 배지에 현탁시킨 생쥐 비장 세포의 현탁액은 미리 마이크로 플레이트(5×10⁴세포/0.1ml/웰)에 분주되어 있다.

HAT 배지의 1/2 분량을 2~3일에 한번씩 새로운 것으로 바꾸어준다. 약 10일 후에 하이브리도마의 증식이 관찰된다. 하이브리도마가 증식된 웰은 951(99%)이다.

(4) 하이브리도마의 선택

하이브리도마가 증식된 웰의 상층액을 사용하여, 항-α-hANP 항체가 생성되었는지 여부를 방사선 면역 검정에 따라 조사한다. 배양 상층액 50㎕, 검정 완충액(실시예 5에 기재됨)에 용해시킨 2% 소 γ-글로불린 10㎕ 및 상기 검정 완충액으로 희석시킨¹²⁵I-표지 α-hANP(약 30,000cpm/ml, 아메르샴사제)100㎕을 혼합하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양한다. 혼합물에 25% 폴리에틸렌글리콜 6000의 용액 250㎕을 교반하면서 가한다. 원심분리(3,000rpm, 20분) 후, 상층액을 제거하고 수득한 침전물의 방사능을 γ 카운터(아로카 ARC-600형)로 측정한다. 1,000cpm 이상의 방사능을 갖는 9개의 웰을 항체-양성으로 간주하고 선택한다.

(5) 클로닝화

실시에 1(4)에서 선택된 하이브리도마를 즉시 한계 희석법에 의해 클로닝한다. 하이브리도마를 96-웰 마이크로 플레이트내에서 1 세포/200㎕/웰의 농도로 배양한다. 하이브리도마를 증식시킨 상층액을 방사선 면역검정한다. 상체-양성 특징을 갖는 하이브리도마를 배양 확장시킨다. 이 클로닝 조작을 2회 또는 3회 반복한 후, 후술되는 샌드위치 면역검정에 적합한, 항-α-hANP 항체를 생산하는 하이브리도마 AN111 및 AN117을 확립한다.

(6) 복수(ascitic fluid)의 제조

이렇게 확립된 하이브리도마를 생쥐에게 복강내로 이식하고 항체 농도가 높은 복수를 제조한다. RPMI-1640에 현탁시킨 하이브리도마(약 1×10⁷세포)를 생쥐(Balb/c 암컷, 투여 10일전에 0.5ml의 프리스탄(pristan)을 복강내에 투여함)에게 복강내로 투여한다. 투여한지 1~3주후에 복수를 수거한 후, 복수를 원심분리하여 그 안에 있는 세포를 제거한다. 수득한 상층액에 0.1%의 아지드화 나트륨을 가하고 혼합물을 동결 보존시킨다. 하이브리도마 AN111 및 AN117에 의해 생성된 단클론성 항체를 함유하는 AN111A 및 AN117A의 복수를 상기 방법에 의해 각각 수득한다.

(7) 단클론성 항체의 정제

Affigel 단백질 A MAPS-II 키트(바이오래드사제)를 사용하여 항체를 AN111A 및 AN117A의 복수로부터 각각 정제한다. 1.2ml의 겔을 사용하여 각 복수(1ml)를 조작순서에 따라 정제한 후, AN111A로부터 항체 4.3mg, AN117A로부터 항체 2.5mg을 수득한다. 항체의 순도를 결정하기 위해 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동을 수행한다. 2-메르캅토에탄올을 사용하여 항체 분획을 환원시킨 후, 수득물을 12.5% 폴리아크릴아미드겔 전기 영동을 수행한다. 그 결과, 분자량 약 52,000 위치의 H-사슬 및 분자량 약 28,000 위치의 L-사슬 2개의 밴드가 관찰된다.

[실시예 2]

단클론성 항체의 클래스 및 서브클래스의 결정

하이크리도마에 의해 생성되는 면역 글로블린의 클래스 및 서브클래스를 생쥐 면역 글로블린(세로 테크사제, 생쥐 단클론성 항체-형 키트)의 클래스 또는 서브클래스에 대해 특이한 항체를 사용하는 면역 확산법에 의해 결정한다. 그 결과, 복수 AN111A 및 AN117A 두개의 경우 오직 항 IgG₁항체와의 침전선이 관찰된다. 그러므로, 두 항체 모두 IgG₁에 속하는 것이 확인된다.

[실시예 3]

단클론성 항체의 친화성(결합계수)

α-hANP의 표준 곡선을 실시예 5와 동일한 방법으로 작성한다. 스케차드(Scatchard)법을 기준으로, 세로축에는 침전물의 방사능/상층액의 방사능을 가로축에는 항체와 결합된 α-hANP의 농도를 도면으로 나타낸다. 항체의 결합계수를 수득한 곡선의 경사로부터 계산한다. 그 결과, AN111의 결합계수는 1.7×10⁹M^-1이고 AN117의 결합계수는 2.3×10⁹M^-1이다.

[실시예 4]

단클론성 항체의 특이성

실시예 5에 기재되는 α-hANP 방사선 면역검정의 시료로 α-hANP 연관 펩티드 및 펩티드 단편을 사용하여 교차 반응성을 측정한다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 이것은 AN111 및 AN117 모두 α-hANP의 C-말단부를 인식함을 확인시켜준다.

[실시예 5]

단클론성 항체를 사용하는 방사선 면역검정

시약

검정용 완충용액 : 1ℓ중에 0.372g의 에틸렌디아민사초산이나트륨염, 0.063g의 시스틴 이염산염, 0.262g의 ε'-아미노카프론산, 0.1g의 아지드화 나트륨 및 1g의 소 혈청 알부민을 함유하는 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0).

복수 희석액 : 검정 완충용액으로 110,000배 희석된 AN111A 또는 검정 완충용액을 62,000배 희석된 AN117A.

α-hANP 표준액 : 3.13ng/ml~100ng/ml 농도 범위로 연속 2배 희석된 α-hANP.

I-표지 α-hANP : 검정 완충 용액이 사용되어 약 3.7KBg/ml이하로 희석된125I-표지 α-hANP(아메르샴사제).

1% 소 γ-글로블린 : 검정 완충 용액에 용해시킨 것.

37.5% 폴리에틸렌글리콜 : 소 혈청 알부민이 제거된 검정 완충용액에 용해시킨 폴리에틸렌글리콜 6000.

방법

α-hANP 표준액 또는 시료 100ml이 채워진 튜브에 100ml의-I-표지 α-hANP, 100ml의 복수 희석액 및 200ml의 1% 소 γ-글로블린을 가하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 배양한다. 그후 즉시 4℃로 냉각된 250ml의 37.5% 폴리에틸렌글리콜을 거기에 가하고 수득한 혼합물을 15초간 교반한 후 4℃에서 3000rpm으로 20분간 원심분리한다.

상층액을 제거한 후, 침전물을 방사능을 카운터(아로카, ARC-600형)에 의해 측정한다.

표준 곡선

제1도는 방사선 면역검정의 표준 곡선을 나타낸다.

AN111 및 AN117의 강도(90% 저해 농도)는 각각 6.2ng/ml 및 4.4ng/ml이다.

[실시예 6]

α-hANP의 샌드위치 방사선 면역검정

입상물상에 고정화된, 상기 하이브리도마 클론 AN111 또는 AN117에 의해 생성된 항-α-hANP[17-28] 단클론성 항체(이하 AN111 또는 AN117로 약칭함)를 고정화된 항체로 사용한다. 표지 항체로I로 표시된, 하이브리도마 클론 KY-ANP-I-에 의해 생성된 항-α-hANP[1-28] 단클론성 항체(ECACC 87082001, 일본국 특개소 64-61500)(이하 KY-ANP-I로 약칭함)를 사용한다. 상기 항체에 의해 α-hANP의 방사선 면역겸정을 확림한다.

1. 복수의 정제

AN111, AN117 또는 KY-ANP-I의 복수를 Affigel 단백질 A MAPS-II(바이오래드사제)로 정제한다. 간단히 말해서, 1ml의 복수 및 1ml의 결합 완충용액의 혼합물을 동일한 결합 완충용액으로 이미 평형화된 Affigel의 단백질 A컬럼(0.7×2cm) 상에 로딩한다. 컬럼을 30ml의 결합 완충용액으로 세척한 후 100ml의 용리 완충용액으로 전개시켜 용출된 1ml-분획을 수거한다. 280nm에서의 흡광도가 0.1 이상인 분획을 증류수에 대하여 투석하여 IgG 분획을 수득한다.

2. 고정화 항체의 구조

상기 항목 1에서 제조된 AN111A 또는 AN117A의 IgG 분획(100㎍/ml)을 함유하는 0.05M 인산 완충액(pH 7.4)에 폴리스티렌 입상물(이찌코사제, 3.2mm 직경)을 침지시키고 4℃에서 20분간 방치한다. RIA 완충용액[0.1% 소 혈청 알부민(결정, 시그마사제, 이하 BSA로 약칭함), 1mM 에틸렌디아민사초산이나트륨(이하 EDTA로 약칭함), 0.2mM 시스틴 및 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 pH 7.0의 0.1M 인산 완충 용액]으로 입상물을 충분히 세척한 후, 입상물을 4℃에서 동일한 완충용액내에 보존한다.

3.I-표지 항체의 제조

상기 항목 1에서 제조된 KY-AND-I의 IgG 분획 10㎍과 함께 0.5M 인산 완충용액(pH 7.5) 50ml 및 NaI(아메르사제) 0.5mCi을 혼합한다. 혼합물에 0.2% 클로라민 T 용액 10㎍을 가하고 30초간 교반한다. 그것과 1% 이성중 아황산나트륨 10㎍을 혼합한 후, 혼합물에 10% 요오드화 칼륨 10ml 및 1% BSA 용액 10ml을 가한 다음, 겔-여과[Sephadex G-25(미세 파마시아사제) 0.9×25cm, pH 7.4의 0.1M 인산 완충용액]하여I-표지 항체 300μCi를 수득한다.

4. 검정

a. 2단계 검정

상기 항목 2의 고정화-항체 입상물 한개, α-hANP 표준 용액(10~2000pg/ml)또는 사람 혈장 시료 50ml 및 RIA 완충용액 100ml을 튜브에 넣고 혼합하고 4℃에서 24시간 동안 보온한다. 상층액을 흡입 제거한 후, 입상물을 1ml의 세척액(0.1% Tween 80 및 0.9% 염화나트륨을 함유하는 pH 7.0의 0.01M 인산 완충용액)으로 3회 세척한다. 그후, 거기에 150ml의I-표지 항체 용액(1.2×10dpm/ml)을 가하고 4℃에서 24시간 동안 보온한다. 상층액을 흡입제거하고, 입상물을 1ml의 세척액으로 3회 세척한 후, 고체상에 결합된I-표지 항체의 방사능을 카운터로 측정한다.

b. 1단계 검정

상기 항목 2에서 제조된 고정화-항체 입상물 한개를 폴리스티렌 튜브에 넣고, 거기에 α-hANP 표준 용액(10~2,000pg/ml) 또는 사람 혈장 시료 50ml 및I-표지 항체 용액(1.8×10dpm/ml) 100ml을 가하고 4℃에서 24시간 동안 보온한다. 상층액을 흡수하고 입상물을 1ml의 세척액으로 3회 세척한 후, 고체상에 결합된I-표지 항체의 방사능을 카운터로 측정한다.

표준 곡선은 가로축에 α-hANP의 농도를 세로축에 측정된 방사능을 도면으로 나타내어 작성한다. 혈장내의 ANP 농도를 혈장 시료의 방사능을 표준 곡선에 대응시켜서 계산한다.

하기 결과는 달리 정의되어 있지 않으면 고정화 항체로 AN111을 사용하는 1단계 검정에 의해 측정한 것이다.

5. 표준 곡선

상기 검정 4-a 및 4-b의 표준 곡선을 제2도에 나타낸다. 이 검정의 최소 검출 감도는 똑같이 0.5pg/튜브이다.

6. 교차 반응성

ANP-연관 화합물의 교차 반응성을 제3도 및 표 2에 기재한다. α-hANP[7-27] 및 α-rANP와 같은 C-말단 소실 ANP의 교차 반응성은 관찰되지 않는다.

7. 사람 혈장의 희석 곡선

α-hANP를 갖는 정상 성인의 혈장 시료의 2개의 희석 곡선은 표준 곡선에 평행하다(제4도). 혈장량과 ANP의 측정량과의 관계는 원점에 집중되는 직선으로 나타난다(제5도).

8. 혈장내 α-hANP의 회수 시험

두개의 정상 상인의 혈장 시료가 가해진 α-hANP의 평균 화숭율은 표 3에 기재한 바와 같이 107.5±7.6%이다.

9. 혈장내 α-hANP의 농도

정상 성인의 혈장 시료내 α-hANP의 평균 농도는 표 4에서 보는 바와 같이 9.6±6.5pg/ml이다.

[실시예 7]

α-hANP의 샌드위치 효소 면역검정

상기 방사선 면역검정과 동일한 종류의 고정화 항체를 사용한다. 표지 항체로 말리이미드법(E. Ishikawa et al., J. Immunoassay, 4 209~327(1983))에 따라 퍼옥시다제(서양 와사비 유래, 시그마사제, 이하 HRP로 약칭함)로 표식된 KY-ANP-I를 사용한다. 이 항체를 사용함으로써 α-hANP의 샌드위치 효소 면역 검정을 확립한다.

1. HRP-표식 항체의 제조

a. KY-ANP-I Fab'의 제조

상기 제조된 KY-ANP-I의 IgG 분획(5mg)을 0.1M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 초산 완충액(pH 4.2)에 0.2mg의 펩신(돼지위점막유래, 시그마사제)을 가함으로써 용해시키고 37℃에서 16시간동안 보온한다. 수득한 혼합물 pH를 2M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 7로 조절한 후 겔 여과[컬럼 : Ultrogel AcA 44(LKB) 1.5×45cm, 용리액 : 5mM EDTA를 함유하는 0.1M 인산 완충용액(pH 6.0)]로 분획시켜 F(ab')₂분획을 수득한다.

F(ab')₂분획을 Centricon 30(아미콘사제)을 사용하여 2mg/0.4ml 이하로 농축시키고 0.1M 2-메르캅토에틸아민용액 0.05ml을 가한다. 37℃에서 1.5시간동안 보온한 후, 과량의 시약을 제거하기 위해 수득한 혼합물을 겔 여과[컬럼; Sephadex G-25(파마시아사제), 0.9×45cm, 용리액; 5mM EDTA를 함유하는 0.1M 인산 완충용액(pH 6.0)]시킨다. 수득한 Fab' 분획을 Centricon 30으로 농축시킨다.

b. 말레이미드-HRP의 제조

2mg의 HRP를 함유하는 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0) 0.3ml에 10mg/ml의 N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도 메틸)시클로헥사노에이트를 함유하는 디메틸포름이미드 용액 30㎕을 가하고 30℃에서 한시간 동안 교반한다. 원심분리(2000×g,5분)한 후 과량의 시약을 제거하기 위해 항목 I-a(Sephadex G-25 사용)와 동일한 방법으로 상층액을 겔 여과한다. 수득한 말레이미드-HRP 분획을 Centricon 30으로 1.8mg/500㎕로 농축시킨다.

c. KY-ANP-I Fab'을 사용한 HRP의 표식

상기 항목 1-a의 4mg/ml KY-ANP-I Fab' 용액 500㎕과 상기 항목 1-b의 3.6mg/ml 말레이미드-HRP 용액 500㎕과 혼합하고 4℃에서 20시간동안 보온한다. 0.1M N-에틸말레이미드 용액을 가한 후, 30℃에서 1시간 동안 보온하고, 수득한 혼합물을 상기 항목 1-a(Ultrogel AcA 44를 사용)와 동일한 방법으로 겔 여과하여 HRP-표식 항체를 수득한다.

2. 검정

a. 효소 면역검정(2단계)

고정화-항체 입상물 한개를 폴리스티렌 튜브에 넣고, α-hANP 표준 용액(6-2000pg/ml) 또는 사람 혈장 시료 0.05ml 및 EIA 완충용액(pH 7.0의 0.01M 인산 완충용액, 0.1% BSA, 1mM EDTA, 0.2mM 시스틴, 0.3M 염화나트륨 및 1000KIU/ml 아프로티닌(시그마사제)) 100ml을 가한 후, 4℃에서 24시간 동안 보온한다. 상층액을 흡입 제거한 후, 입상물을 세척액(0.1M 염화나트륨을 함유하는 pH 7.0의 10mM 인산 완충용액 2ml)으로 2회 세척하고, 150ml의 HRP-표식 항체 용액 0.33㎍/ml을 가한 후, 4℃에서 24시간 동안 보온한다. 상층액을 흡입제거한 후, 입상물을 2ml의 세척액으로 2회 세척한다. 고체상에 결합된 HRP-표식 항체의 효소 활성을 하기 b의 순서에 따라 측정한다.

b. 효소 활성의 측정

입상물을 또 다른 폴리스티렌 튜브에 넣고 0.6% 3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트(Aldrich 사제)를 함유하는 0.1M 인산 완충용액(pH 8.0) 100ml을 가한 후, 0.015% 과산화수소수 50ml을 가한 다음 30℃에서 1시간 동안 보온한다.

0.1M 글리신 완충용액(pH 10.3) 2.5ml을 가함으로서 반응을 종결시킨다. 형광 강도를 여기 파장 320nm 및 형광 파장 405nm에서 측정한다. 50mM 황산에 용해시킨 0.2㎍/ml 퀴닌의 형광 강도를 100으로 간주한다.

표준 곡선은 가로축으로 α-hANP 표준 용액의 농도를 세로축으로 형광 강도를 도면으로 나타내어 수득한다.

3. 표준 곡선

고정화 항체로 AN111 및 AN117을 사용하는 표준 곡선을 제6도에 나타낸다. 최소 검출 감도는 똑같이 1.0pg/튜브이다.

Claims

다음의 하이브리도마 세포주에서 얻을 수 있는 ANP의 C-말단을 인식하는 단클론성 항체 : (a) 수탁번호 FERM BP-2197인 AN111; 또는 (b) 수탁번호 FERM BP-2198인 AN117.
제1항에 있어서, ANP가 α-ANP 또는 β-ANP인 단클론성 항체.
제1항에 있어서, α-ANP[n-28] 단편(단, n은 17~28의 정수임)을 인식하는 단클론성 항체.
제3항에 있어서, n이 17,21, 23, 24, 27 또는 28인 단클론성 항체.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 고정화된 항체인 단클론성 항체.
제5항에 있어서, 고체상이 폴리스티렌 입상물인 단클론성 항체.
하이브리도마 AN111(FERM BP-2197)
하이브리도마 AN117(FERM BP-2198)
두 종류의 항체 사이에 ANP를 샌드위치 상태로 만드는 것을 포함하는 ANP의 면역검정에 있어서, 두 항체 중의 하나는 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 ANP의 C-말단을 인식하는 상기 단클론성 항체이고, 다른 하나는 ANP의 N-말단을 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 ANP의 면역검정.
제9항에 있어서, ANP의 C-말단을 인식하기 위해 고체상에 고정화된 상기 단클론성 항체와 ANP의 N-말단을 인식하기 위해 효소 또는 방사선 동위원소로 표지화된 상기 기타 항체를 사용함을 특징으로 하는 면역검정.
제9항 또는 제10항에 있어서, ANP의 N-말단을 인식하는 항체가 단클론성 항체인 면역검정.
제11항에 있어서, 단클론성항체가 KY-ANP-I인 면역검정.