JPH1014592A - ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH1014592A JPH1014592A JP8174675A JP17467596A JPH1014592A JP H1014592 A JPH1014592 A JP H1014592A JP 8174675 A JP8174675 A JP 8174675A JP 17467596 A JP17467596 A JP 17467596A JP H1014592 A JPH1014592 A JP H1014592A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ラットＰＡＩ−１と特異的に結合し、またラ
ットＰＡＩ−１／ＰＡ複合体と特異的に結合する、およ
び／またはラットＰＡＩ−１の活性中和作用を有するモ
ノクローナル抗体、および該抗体を用いたラットＰＡＩ
−１の定量、検出方法を提供する。 【解決手段】 活性化した精製ラットＰＡＩ−１を抗原
として用い、所望のモノクローナル抗体およびこれを産
生するハイブリドーマ細胞株を得る。この抗体を用いて
ラットＰＡＩ−１を定量、検出する。
ットＰＡＩ−１／ＰＡ複合体と特異的に結合する、およ
び／またはラットＰＡＩ−１の活性中和作用を有するモ
ノクローナル抗体、および該抗体を用いたラットＰＡＩ
−１の定量、検出方法を提供する。 【解決手段】 活性化した精製ラットＰＡＩ−１を抗原
として用い、所望のモノクローナル抗体およびこれを産
生するハイブリドーマ細胞株を得る。この抗体を用いて
ラットＰＡＩ−１を定量、検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ラットＰＡＩ−１（タイプ１
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター）に対す
るモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリド
ーマに関する。さらに、該モノクローナル抗体を用いる
ラットＰＡＩ−１の検出または定量方法に関する。
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター）に対す
るモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリド
ーマに関する。さらに、該モノクローナル抗体を用いる
ラットＰＡＩ−１の検出または定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内において線維素溶解（線溶）系
は、血栓の溶解、組織の破壊や修復、細胞の移動などに
重要な役割を果たしており、線溶系は、プラスミノーゲ
ンアクチベーター（ＰＡ）によりプラスミンが生じるこ
とにより活性化される。ＰＡＩ−１は、この線溶系をそ
の開始段階において制御しており、種々の血栓症、糖尿
病、動脈硬化症等の病態の形成、進展に関与していると
考えられている。動物モデルを用いて種々の病態とＰＡ
Ｉ−１の関係を明らかにすることは、ＰＡＩ−１の機能
を調整あるいは阻害する新しい薬物等、血栓症、糖尿
病、動脈硬化症等の治療薬の開発に有用と考えられる。
は、血栓の溶解、組織の破壊や修復、細胞の移動などに
重要な役割を果たしており、線溶系は、プラスミノーゲ
ンアクチベーター（ＰＡ）によりプラスミンが生じるこ
とにより活性化される。ＰＡＩ−１は、この線溶系をそ
の開始段階において制御しており、種々の血栓症、糖尿
病、動脈硬化症等の病態の形成、進展に関与していると
考えられている。動物モデルを用いて種々の病態とＰＡ
Ｉ−１の関係を明らかにすることは、ＰＡＩ−１の機能
を調整あるいは阻害する新しい薬物等、血栓症、糖尿
病、動脈硬化症等の治療薬の開発に有用と考えられる。
【０００３】このようなＰＡＩ−１は、各種動物の細
胞、主に血管内皮細胞で産生され、周辺の組織あるいは
血流中に分泌される一本鎖糖蛋白質である。ＰＡＩ−１
の反応中心であるアルギニンがＰＡのセリンと共有結合
することにより、ＰＡを失活させることが知られてい
る。ＰＡＩ−１は、分子内にシステイン残基を有してい
ないため立体構造が変化しやすく、活性のある構造（活
性型）から活性のない潜在型（不活性型）へと移行しや
すい。また、ＰＡＩ−１は血漿中のビトロネクチンと結
合して存在し（Declerckら、Journal of Biological Ch
emistry、第269巻、15454頁、1988年）、血漿中のビト
ロネクチンと結合することで潜在型への移行が抑制され
ると考えられている。このようにＰＡＩ−１は産生直後
の活性型から潜在型へ、あるいはビトロネクチンとの複
合体形成と、複雑な存在形態をとることが知られてい
る。病態モデルを用いて種々の病態とＰＡＩ−１の関係
を明らかにするためには、ＰＡＩ−１の変化（量的変化
および活性に相関する構造変化）を捉えることが必要で
あるが、上記のようにＰＡＩ−１は複雑な構造変化をす
るため、抗体が均一でなく交差反応物と反応する確率の
高いポリクローナル抗体では、ＰＡＩ−１の変化を正確
に捉えることが困難であった。このような背景から、種
々の病態とＰＡＩ−１の関係を明らかにするために、Ｐ
ＡＩ−１の定量・検出、あるいは活性の中和に用い得る
特異性の高い抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体が望まれ
ていた。
胞、主に血管内皮細胞で産生され、周辺の組織あるいは
血流中に分泌される一本鎖糖蛋白質である。ＰＡＩ−１
の反応中心であるアルギニンがＰＡのセリンと共有結合
することにより、ＰＡを失活させることが知られてい
る。ＰＡＩ−１は、分子内にシステイン残基を有してい
ないため立体構造が変化しやすく、活性のある構造（活
性型）から活性のない潜在型（不活性型）へと移行しや
すい。また、ＰＡＩ−１は血漿中のビトロネクチンと結
合して存在し（Declerckら、Journal of Biological Ch
emistry、第269巻、15454頁、1988年）、血漿中のビト
ロネクチンと結合することで潜在型への移行が抑制され
ると考えられている。このようにＰＡＩ−１は産生直後
の活性型から潜在型へ、あるいはビトロネクチンとの複
合体形成と、複雑な存在形態をとることが知られてい
る。病態モデルを用いて種々の病態とＰＡＩ−１の関係
を明らかにするためには、ＰＡＩ−１の変化（量的変化
および活性に相関する構造変化）を捉えることが必要で
あるが、上記のようにＰＡＩ−１は複雑な構造変化をす
るため、抗体が均一でなく交差反応物と反応する確率の
高いポリクローナル抗体では、ＰＡＩ−１の変化を正確
に捉えることが困難であった。このような背景から、種
々の病態とＰＡＩ−１の関係を明らかにするために、Ｐ
ＡＩ−１の定量・検出、あるいは活性の中和に用い得る
特異性の高い抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体が望まれ
ていた。
【０００４】ＰＡＩ−１は、各種動物の血管内皮細胞の
ほか、血小板、肝細胞等でも産生され、また、種々の細
胞株からの産生も知られており、ヒトまたはウシのＰＡ
Ｉ−１に関して現在まで細胞培養上清からの単離・精製
について多数報告されている。例えば、ウシ内皮細胞か
らの精製〔Journal of Biological Chemistry、第259
巻、14914〜14921頁、1984年、およびBiochemistry、第
27巻、2911〜2918頁、1988年）、ヒトメラノーマ細胞
（ＭＪＺＴ）からの精製〔Journal of BiologicalChemi
stry、第261巻、14474〜14481頁、1986年）、ヒト線維
肉腫細胞（ファイブロザルコーマ）ＨＴ−１０８０から
の精製（Blood、第70巻、1645〜1653頁、1987年）など
が報告されている。
ほか、血小板、肝細胞等でも産生され、また、種々の細
胞株からの産生も知られており、ヒトまたはウシのＰＡ
Ｉ−１に関して現在まで細胞培養上清からの単離・精製
について多数報告されている。例えば、ウシ内皮細胞か
らの精製〔Journal of Biological Chemistry、第259
巻、14914〜14921頁、1984年、およびBiochemistry、第
27巻、2911〜2918頁、1988年）、ヒトメラノーマ細胞
（ＭＪＺＴ）からの精製〔Journal of BiologicalChemi
stry、第261巻、14474〜14481頁、1986年）、ヒト線維
肉腫細胞（ファイブロザルコーマ）ＨＴ−１０８０から
の精製（Blood、第70巻、1645〜1653頁、1987年）など
が報告されている。
【０００５】ラットＰＡＩ−１に関しては、ラットＨＴ
Ｃ細胞の培養上清中に、ヒトあるいはウシの細胞培養上
清と同様に、線溶系を抑制するＰＡＩ−１様物質が存在
することが報告されている〔Proceedings of National
Academy of Scienses USA、第75巻、6130〜6133頁、197
8年、Journal of Biological Chemistry、第257巻、426
0〜4264頁、1982年、Journal of Biological Chemistr
y、第259巻、6847〜6851頁、1984年、Thrombosis and H
aemostasis、第55巻、8〜11頁、1986年、等〕。また、
ヒトＰＡＩ−１遺伝子の配列をもとに、ＨＴＣ細胞から
ラットＰＡＩ−１遺伝子がクローニングされている〔Jo
urnal of Biological Chemistry、第265巻、2078〜2085
頁、1990年〕が、組換えラットＰＡＩ−１を活性な形で
発現させた報告は知らない。また、ラット生体試料ある
いはラット細胞からＰＡＩ−１を、モノクローナル抗体
を作製するのに充分な純度まで精製した報告はない。
Ｃ細胞の培養上清中に、ヒトあるいはウシの細胞培養上
清と同様に、線溶系を抑制するＰＡＩ−１様物質が存在
することが報告されている〔Proceedings of National
Academy of Scienses USA、第75巻、6130〜6133頁、197
8年、Journal of Biological Chemistry、第257巻、426
0〜4264頁、1982年、Journal of Biological Chemistr
y、第259巻、6847〜6851頁、1984年、Thrombosis and H
aemostasis、第55巻、8〜11頁、1986年、等〕。また、
ヒトＰＡＩ−１遺伝子の配列をもとに、ＨＴＣ細胞から
ラットＰＡＩ−１遺伝子がクローニングされている〔Jo
urnal of Biological Chemistry、第265巻、2078〜2085
頁、1990年〕が、組換えラットＰＡＩ−１を活性な形で
発現させた報告は知らない。また、ラット生体試料ある
いはラット細胞からＰＡＩ−１を、モノクローナル抗体
を作製するのに充分な純度まで精製した報告はない。
【０００６】ＰＡＩ−１に対するモノクローナル抗体に
関して、ヒトＰＡＩ−１に対するモノクローナル抗体あ
るいはそれらを利用した定量法が知られており（特開昭
６３−５００５６４、Blood、第71巻、220〜225頁、198
8年、Blood Coagulation andFibrinolysis、第6巻、520
〜526頁、1995年）、定量用キットも市販されている。
しかし、ラットＰＡＩ−１については、ウサギのポリク
ローナル抗体が市販されているのみであり、ラットＰＡ
Ｉ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は知られ
ていない。
関して、ヒトＰＡＩ−１に対するモノクローナル抗体あ
るいはそれらを利用した定量法が知られており（特開昭
６３−５００５６４、Blood、第71巻、220〜225頁、198
8年、Blood Coagulation andFibrinolysis、第6巻、520
〜526頁、1995年）、定量用キットも市販されている。
しかし、ラットＰＡＩ−１については、ウサギのポリク
ローナル抗体が市販されているのみであり、ラットＰＡ
Ｉ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は知られ
ていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】かかる現状にかんが
み、本発明者らはラットＰＡＩ−１と特異的に結合し得
るモノクローナル抗体を得るべく種々研究した結果、ラ
ットＰＡＩ−１で免疫感作した哺乳動物の抗体産生細胞
を用い、細胞融合技法により所望のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを得ることに成功し、本発明
を完成するに至った。しかして本発明の目的は、ラット
ＰＡＩ−１を特異的に認識して結合し得るモノクローナ
ル抗体、ＰＡと複合体を形成したラットＰＡＩ−１を特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体、および
／またはラットＰＡＩ−１の活性を中和するモノクロー
ナル抗体を提供することにある。本発明の他の目的は、
かかる抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを提供することにある。本発明のさら
に他の目的は、かかる抗ラットＰＡＩ−１モノクローナ
ル抗体を用いたラットＰＡＩ−１の優れた定量・検出方
法を提供することにある。
み、本発明者らはラットＰＡＩ−１と特異的に結合し得
るモノクローナル抗体を得るべく種々研究した結果、ラ
ットＰＡＩ−１で免疫感作した哺乳動物の抗体産生細胞
を用い、細胞融合技法により所望のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを得ることに成功し、本発明
を完成するに至った。しかして本発明の目的は、ラット
ＰＡＩ−１を特異的に認識して結合し得るモノクローナ
ル抗体、ＰＡと複合体を形成したラットＰＡＩ−１を特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体、および
／またはラットＰＡＩ−１の活性を中和するモノクロー
ナル抗体を提供することにある。本発明の他の目的は、
かかる抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを提供することにある。本発明のさら
に他の目的は、かかる抗ラットＰＡＩ−１モノクローナ
ル抗体を用いたラットＰＡＩ−１の優れた定量・検出方
法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、活性化
した精製ラットＰＡＩ−１を用いて哺乳動物、例えばマ
ウスを免疫感作させ、その動物の抗体産生細胞を常法に
より哺乳動物の骨髄腫細胞と融合させ、得られるハイブ
リドーマの中からラットＰＡＩ−１に特異的に結合する
抗体、ＰＡ、とくに組織型プラスミノーゲンアクチベー
ター（ｔ−ＰＡ）と複合体を形成したラットＰＡＩ−１
を特異的に認識して結合し得る抗体、および／またはラ
ットＰＡＩ−１の活性を中和する抗体を産生しているも
のを選択し、該選択されたハイブリドーマを常法にした
がってモノクローン化することにより、所望のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができ
る。このようにして得られるハイブリドーマ細胞株を常
法により、例えば免疫に使用した動物の腹腔内に移植し
て抗体濃度の高い腹水を得、それから目的のモノクロー
ナル抗体を得ることができ、また該ハイブリドーマ細胞
株を培地で培養し、その培養液から目的のモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
した精製ラットＰＡＩ−１を用いて哺乳動物、例えばマ
ウスを免疫感作させ、その動物の抗体産生細胞を常法に
より哺乳動物の骨髄腫細胞と融合させ、得られるハイブ
リドーマの中からラットＰＡＩ−１に特異的に結合する
抗体、ＰＡ、とくに組織型プラスミノーゲンアクチベー
ター（ｔ−ＰＡ）と複合体を形成したラットＰＡＩ−１
を特異的に認識して結合し得る抗体、および／またはラ
ットＰＡＩ−１の活性を中和する抗体を産生しているも
のを選択し、該選択されたハイブリドーマを常法にした
がってモノクローン化することにより、所望のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができ
る。このようにして得られるハイブリドーマ細胞株を常
法により、例えば免疫に使用した動物の腹腔内に移植し
て抗体濃度の高い腹水を得、それから目的のモノクロー
ナル抗体を得ることができ、また該ハイブリドーマ細胞
株を培地で培養し、その培養液から目的のモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
【０００９】本発明のモノクローナル抗体は、ラットＰ
ＡＩ−１と特異的に結合し、またラットＰＡＩ−１とｔ
−ＰＡとの複合体も認識し、および／またはラットＰＡ
Ｉ−１に対して活性中和作用を有するなどの優れた性質
を有する。したがって、本発明のモノクローナル抗体
は、検体中あるいは組織中のラットＰＡＩ−１の免疫化
学的検出および定量に用いることができ、また複雑な構
造変化を生じたりｔ−ＰＡと複合体を形成するＰＡＩ−
１の病態モデルにおける動態解析等に用いられる。さら
に、本発明のモノクローナル抗体は、そのＰＡＩ−１の
活性中和作用により、生体内におけるＰＡＩ−１の機能
解明等にも有用である。本発明のモノクローナル抗体に
は、抗原認識部位の異なる複数の抗体が含まれるので、
上記ラットＰＡＩ−１の検出、定量に際して、適当な２
種類のモノクローナル抗体を組み合わせて、感度のよ
い、サンドイッチＥＩＡが実施できる。
ＡＩ−１と特異的に結合し、またラットＰＡＩ−１とｔ
−ＰＡとの複合体も認識し、および／またはラットＰＡ
Ｉ−１に対して活性中和作用を有するなどの優れた性質
を有する。したがって、本発明のモノクローナル抗体
は、検体中あるいは組織中のラットＰＡＩ−１の免疫化
学的検出および定量に用いることができ、また複雑な構
造変化を生じたりｔ−ＰＡと複合体を形成するＰＡＩ−
１の病態モデルにおける動態解析等に用いられる。さら
に、本発明のモノクローナル抗体は、そのＰＡＩ−１の
活性中和作用により、生体内におけるＰＡＩ−１の機能
解明等にも有用である。本発明のモノクローナル抗体に
は、抗原認識部位の異なる複数の抗体が含まれるので、
上記ラットＰＡＩ−１の検出、定量に際して、適当な２
種類のモノクローナル抗体を組み合わせて、感度のよ
い、サンドイッチＥＩＡが実施できる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
例えば、精製したラットＰＡＩ−１を抗原として用い、
これで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の
不死化細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより
産生される。ハイブリドーマの製造に際して哺乳動物の
免疫感作に用いられるラットＰＡＩ−１としては、ラッ
ト血小板、ラット肝細胞、ラット肝癌細胞、ラット内皮
細胞などから精製したＰＡＩ−１もしくはそのペプチド
等が挙げられる。またすでに報告されているラットＰＡ
Ｉ−１遺伝子に基づいて、遺伝子組換え技術により発現
させたラットＰＡＩ−１もしくはそのペプチドも使用で
きる。ただし、そのような遺伝子組換え技術による生成
物では、糖鎖の付加、などの問題があり、またＰＡＩ−
１は生体内で複雑な構造変化をする蛋白質であることか
ら、できるだけ生体由来のものに近いものを使用するこ
とが好ましく、このような観点から、ラット細胞（ラッ
トヘパトーマＨＴＣ細胞など）から精製したものが好ま
しい。好適な例として、例えばデキサメタゾン処理した
ラット肝癌細胞ＨＴＣ細胞の培養液から精製したＰＡＩ
−１を用い得る。精製方法としては、ファストプロテイ
ン液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ；Ｆast protein li
quid chromatography）や高速液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）により精製する方法が挙げられる。例えば
コンカナバリンＡ−セファロース（ＣonＡ-Ｓepharos
e）、ＤＥＡＥ−セファセル（ＤＥＡＥ−Ｓephacel）、
ブルー−セファロース（Ｂlue−Ｓepharose）およびス
ーパーデックス（Ｓuperdex）ＰＧ200等のカラムにより
精製できる。精製過程においてはＰＡＩ活性を指標とし
て活性画分の選択を実施すればよく、ＰＡＩ活性の測定
は、例えば、リバースフィブリンオートグラフィーや合
成基質を用いて実施できる。このようにして得られる精
製ラットＰＡＩ−１は、通常不活性な潜在型として存在
するため、これを活性型に変換し、活性化した精製ラッ
トＰＡＩ−１として哺乳動物の免疫感作に用いるのが好
ましい。活性化手段としては、例えばグアニジン塩酸や
ＳＤＳで処理する方法が挙げられる。
例えば、精製したラットＰＡＩ−１を抗原として用い、
これで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の
不死化細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより
産生される。ハイブリドーマの製造に際して哺乳動物の
免疫感作に用いられるラットＰＡＩ−１としては、ラッ
ト血小板、ラット肝細胞、ラット肝癌細胞、ラット内皮
細胞などから精製したＰＡＩ−１もしくはそのペプチド
等が挙げられる。またすでに報告されているラットＰＡ
Ｉ−１遺伝子に基づいて、遺伝子組換え技術により発現
させたラットＰＡＩ−１もしくはそのペプチドも使用で
きる。ただし、そのような遺伝子組換え技術による生成
物では、糖鎖の付加、などの問題があり、またＰＡＩ−
１は生体内で複雑な構造変化をする蛋白質であることか
ら、できるだけ生体由来のものに近いものを使用するこ
とが好ましく、このような観点から、ラット細胞（ラッ
トヘパトーマＨＴＣ細胞など）から精製したものが好ま
しい。好適な例として、例えばデキサメタゾン処理した
ラット肝癌細胞ＨＴＣ細胞の培養液から精製したＰＡＩ
−１を用い得る。精製方法としては、ファストプロテイ
ン液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ；Ｆast protein li
quid chromatography）や高速液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）により精製する方法が挙げられる。例えば
コンカナバリンＡ−セファロース（ＣonＡ-Ｓepharos
e）、ＤＥＡＥ−セファセル（ＤＥＡＥ−Ｓephacel）、
ブルー−セファロース（Ｂlue−Ｓepharose）およびス
ーパーデックス（Ｓuperdex）ＰＧ200等のカラムにより
精製できる。精製過程においてはＰＡＩ活性を指標とし
て活性画分の選択を実施すればよく、ＰＡＩ活性の測定
は、例えば、リバースフィブリンオートグラフィーや合
成基質を用いて実施できる。このようにして得られる精
製ラットＰＡＩ−１は、通常不活性な潜在型として存在
するため、これを活性型に変換し、活性化した精製ラッ
トＰＡＩ−１として哺乳動物の免疫感作に用いるのが好
ましい。活性化手段としては、例えばグアニジン塩酸や
ＳＤＳで処理する方法が挙げられる。
【００１１】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
作製はケーラーおよびミルシュタインの方法（G. Kohle
r & C. Milstein; Nature; 第256巻、495〜897頁、1975
年）に準じて下記の手順で行う。
作製はケーラーおよびミルシュタインの方法（G. Kohle
r & C. Milstein; Nature; 第256巻、495〜897頁、1975
年）に準じて下記の手順で行う。
【００１２】（ｉ）活性化した精製ラットＰＡＩ−１に
よる哺乳動物の免疫感作 免疫する哺乳動物としてはとくに制限されず、マウス、
ウサギ、モルモット、ヒツジなどが挙げられるが、とく
にマウス（ＢＡＬＢ／c マウスなど）が好適に用いら
れる。免疫方法は常法により行い、例えば生理食塩水に
溶かしたラットＰＡＩ−１をフロイントの完全アジュバ
ントと混合し、乳懸濁液として投与する。ラットＰＡＩ
−１の濃度は適当な量の抗原刺激されたリンパ球が生成
するように選択する。 （ii）抗体産生細胞の採取 免疫感作された哺乳動物の抗体産生細胞、例えば脾細胞
またはリンパ節細胞などを採取し、適当な媒体に懸濁し
て、細胞懸濁液を調製する。
よる哺乳動物の免疫感作 免疫する哺乳動物としてはとくに制限されず、マウス、
ウサギ、モルモット、ヒツジなどが挙げられるが、とく
にマウス（ＢＡＬＢ／c マウスなど）が好適に用いら
れる。免疫方法は常法により行い、例えば生理食塩水に
溶かしたラットＰＡＩ−１をフロイントの完全アジュバ
ントと混合し、乳懸濁液として投与する。ラットＰＡＩ
−１の濃度は適当な量の抗原刺激されたリンパ球が生成
するように選択する。 （ii）抗体産生細胞の採取 免疫感作された哺乳動物の抗体産生細胞、例えば脾細胞
またはリンパ節細胞などを採取し、適当な媒体に懸濁し
て、細胞懸濁液を調製する。
【００１３】（iii）細胞融合 適当な融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）を
使用して、上記懸濁された抗体産生細胞を適当な不死化
細胞、例えば骨髄腫細胞のセルライン（例えばＮＳＩ−
Ａg 4/1、Ｓp２／Ｏ−Ａg１４など）と細胞融合させ
る。この際、骨髄腫細胞当たり約１０の脾細胞またはリ
ンパ節細胞の比率が好ましい。１０6個の脾細胞または
リンパ節細胞のために全容量約１ｍｌの融合媒体が適当
である。使用される骨髄腫セルラインは好ましくはいわ
ゆる“薬剤耐性”型であり、これによって選択培地中で
未融合骨髄腫細胞は死滅し、他方ハイブリドは生存す
る。酵素ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルト
ランスフェラーゼを欠き、そのためＨＡＴ培地（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）中で増殖するこ
とができない８−アザグアニン耐性セルラインが最も頻
繁に使用される。使用される骨髄腫セルラインはまた、
それ自身が抗体または免疫グロブリンのＨ鎖もしくはＬ
鎖を産生しないように“非分泌”型であるのが好まし
い。
使用して、上記懸濁された抗体産生細胞を適当な不死化
細胞、例えば骨髄腫細胞のセルライン（例えばＮＳＩ−
Ａg 4/1、Ｓp２／Ｏ−Ａg１４など）と細胞融合させ
る。この際、骨髄腫細胞当たり約１０の脾細胞またはリ
ンパ節細胞の比率が好ましい。１０6個の脾細胞または
リンパ節細胞のために全容量約１ｍｌの融合媒体が適当
である。使用される骨髄腫セルラインは好ましくはいわ
ゆる“薬剤耐性”型であり、これによって選択培地中で
未融合骨髄腫細胞は死滅し、他方ハイブリドは生存す
る。酵素ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルト
ランスフェラーゼを欠き、そのためＨＡＴ培地（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）中で増殖するこ
とができない８−アザグアニン耐性セルラインが最も頻
繁に使用される。使用される骨髄腫セルラインはまた、
それ自身が抗体または免疫グロブリンのＨ鎖もしくはＬ
鎖を産生しないように“非分泌”型であるのが好まし
い。
【００１４】（iv）融合細胞の単離 融合処理された細胞を、適当に希釈したのち、例えばＨ
ＡＴ培地中で１〜２週間培養することにより、例えば８
−アザグアニンに対する耐性を有する未融合骨髄腫セル
ラインは増殖せず死滅し、また未融合の脾細胞またはリ
ンパ節細胞も限られた数の***サイクルのみを有するた
め、約１〜２週間後に死滅する。一方、融合した細胞は
親骨髄腫細胞からの遺伝的な永久増殖性と親脾細胞また
はリンパ節細胞からの酵素ヒポキサンチン−グアニン・
ホスホリポシルトランスフェラーゼ合成能とを有するた
め、***を続け、選択培地中で生存することができる。 （ｖ）所望の抗体を産生するハイブリドーマの選別およ
びクローニング 上記培養後、その上清について、例えばエンザイムイム
ノアッセイにより抗ラットＰＡＩ−１抗体（ＩgＧ）の
有無を検出して、所望のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを選択する。このように選別されたハイ
ブリドーマを、例えば限界希釈法によってクローニング
することにより、ラットＰＡＩ−１と特異的に結合する
および／またはラットＰＡＩ−１の活性中和作用を有す
るモノクローナル抗体を産生する能力を有する増殖可能
なハイブリドーマ細胞株が得られる。本発明によって得
られるハイブリドーマ細胞株のうち、ラットＰＡＩ−１
およびＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体との高い反応性を示
し、ラットＰＡＩ−１に対する強い活性中和作用を有す
るハイブリドーマＤ１．Ｂ１２−３について工業技術
院、生命工学工業技術研究所に寄託している（受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６５８号）。
ＡＴ培地中で１〜２週間培養することにより、例えば８
−アザグアニンに対する耐性を有する未融合骨髄腫セル
ラインは増殖せず死滅し、また未融合の脾細胞またはリ
ンパ節細胞も限られた数の***サイクルのみを有するた
め、約１〜２週間後に死滅する。一方、融合した細胞は
親骨髄腫細胞からの遺伝的な永久増殖性と親脾細胞また
はリンパ節細胞からの酵素ヒポキサンチン−グアニン・
ホスホリポシルトランスフェラーゼ合成能とを有するた
め、***を続け、選択培地中で生存することができる。 （ｖ）所望の抗体を産生するハイブリドーマの選別およ
びクローニング 上記培養後、その上清について、例えばエンザイムイム
ノアッセイにより抗ラットＰＡＩ−１抗体（ＩgＧ）の
有無を検出して、所望のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを選択する。このように選別されたハイ
ブリドーマを、例えば限界希釈法によってクローニング
することにより、ラットＰＡＩ−１と特異的に結合する
および／またはラットＰＡＩ−１の活性中和作用を有す
るモノクローナル抗体を産生する能力を有する増殖可能
なハイブリドーマ細胞株が得られる。本発明によって得
られるハイブリドーマ細胞株のうち、ラットＰＡＩ−１
およびＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体との高い反応性を示
し、ラットＰＡＩ−１に対する強い活性中和作用を有す
るハイブリドーマＤ１．Ｂ１２−３について工業技術
院、生命工学工業技術研究所に寄託している（受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６５８号）。
【００１５】上記のようにして得られる所望のモノクロ
ーナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞株を、常法
により例えば免疫に使用した動物（例えばＢＡＬＢ／c
マウス）の腹腔内に移植し、一定期間後、所望の抗体
濃度が高くなった腹水を取り出し、それから目的のモノ
クローナル抗体を採取することができる。また、該ハイ
ブリドーマ細胞株を適当な培地、例えば牛胎児血清を添
加したＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地中
で培養し、その培養液から目的のモノクローナル抗体を
採取することもできる。また、いったん所望のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得たら、このハ
イブリドーマからこのモノクローナル抗体をコードする
遺伝子源（cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなど）を得て、これ
を用いて通常の遺伝子組換え技術により、適当な宿主細
胞で目的のモノクローナル抗体あるいはその断片を発
現、産生させることもできる。得られたモノクローナル
抗体の分離、精製は通常の抗体類の精製法にしたがって
行うことができる。例えば腹水を飽和硫酸アンモニムと
混合し遠心分離して得られるペレットをリン酸緩衝生理
食塩水で透析後、アフィニティクロマトグラフィ等に付
す。また培養液の場合は、それを遠心分離して得られる
上清液を限外濾過、ゲルクロマトグラフィ、アフィニテ
ィクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等に
付す。
ーナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞株を、常法
により例えば免疫に使用した動物（例えばＢＡＬＢ／c
マウス）の腹腔内に移植し、一定期間後、所望の抗体
濃度が高くなった腹水を取り出し、それから目的のモノ
クローナル抗体を採取することができる。また、該ハイ
ブリドーマ細胞株を適当な培地、例えば牛胎児血清を添
加したＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地中
で培養し、その培養液から目的のモノクローナル抗体を
採取することもできる。また、いったん所望のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得たら、このハ
イブリドーマからこのモノクローナル抗体をコードする
遺伝子源（cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなど）を得て、これ
を用いて通常の遺伝子組換え技術により、適当な宿主細
胞で目的のモノクローナル抗体あるいはその断片を発
現、産生させることもできる。得られたモノクローナル
抗体の分離、精製は通常の抗体類の精製法にしたがって
行うことができる。例えば腹水を飽和硫酸アンモニムと
混合し遠心分離して得られるペレットをリン酸緩衝生理
食塩水で透析後、アフィニティクロマトグラフィ等に付
す。また培養液の場合は、それを遠心分離して得られる
上清液を限外濾過、ゲルクロマトグラフィ、アフィニテ
ィクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等に
付す。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリン（ＩgＧ）クラスで、サブクラスはＩgＧ2a、Ｉ
gＧ1で、Ｌ鎖はいずれもカッパ鎖である。これらのモノ
クローナル抗体は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）によるテストの結果、いずれもラットＰＡＩ−１
と反応し、これと特異的に結合する性質を有し、またＰ
ＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に対しても特異的に結合する
性質を有する。本発明のモノクローナル抗体は、さら
に、ラットＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和
作用について調べた結果、強い中和作用を有するものが
含まれている。
ロブリン（ＩgＧ）クラスで、サブクラスはＩgＧ2a、Ｉ
gＧ1で、Ｌ鎖はいずれもカッパ鎖である。これらのモノ
クローナル抗体は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）によるテストの結果、いずれもラットＰＡＩ−１
と反応し、これと特異的に結合する性質を有し、またＰ
ＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に対しても特異的に結合する
性質を有する。本発明のモノクローナル抗体は、さら
に、ラットＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和
作用について調べた結果、強い中和作用を有するものが
含まれている。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体を用いれば、
血清等の被験試料中のラットＰＡＩ−１を定量または検
出することができる。本発明によるラットＰＡＩ−１の
定量、検出には、公知のラジオイムノアッセイ、エンザ
イムイムノアッセイ、ケミルミネッセントイムノアッセ
イ、バイオルミネッセントイムノアッセイ、フルオロイ
ムノアッセイ等のいずれの方法も採用され得る。例えば
本発明のモノクローナル抗体と、125Ｉ等の放射性同位
元素やペルオキシダーゼ等の酵素で標識したラットＰＡ
Ｉ−１を用いる競合法、ラットＰＡＩ−１に対する抗原
認識部位が異なる２種類のモノクローナル抗体を用いる
非競合法によるイムノアッセイが挙げられる。標識を、
アクリジニウムエステルやイソルミノール等の化学発光
物質、ルシフェリン等の生物発光物質、フルオレッセイ
ンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いて行うことも
できる。また、例えば本発明のモノクローナル抗体をポ
リスチレンビーズ等の固相に吸着あるいは化学結合させ
て用いる固相法も採用され得る。
血清等の被験試料中のラットＰＡＩ−１を定量または検
出することができる。本発明によるラットＰＡＩ−１の
定量、検出には、公知のラジオイムノアッセイ、エンザ
イムイムノアッセイ、ケミルミネッセントイムノアッセ
イ、バイオルミネッセントイムノアッセイ、フルオロイ
ムノアッセイ等のいずれの方法も採用され得る。例えば
本発明のモノクローナル抗体と、125Ｉ等の放射性同位
元素やペルオキシダーゼ等の酵素で標識したラットＰＡ
Ｉ−１を用いる競合法、ラットＰＡＩ−１に対する抗原
認識部位が異なる２種類のモノクローナル抗体を用いる
非競合法によるイムノアッセイが挙げられる。標識を、
アクリジニウムエステルやイソルミノール等の化学発光
物質、ルシフェリン等の生物発光物質、フルオレッセイ
ンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いて行うことも
できる。また、例えば本発明のモノクローナル抗体をポ
リスチレンビーズ等の固相に吸着あるいは化学結合させ
て用いる固相法も採用され得る。
【００１８】本発明によるラットＰＡＩ−１の定量、検
出方法を、さらに、具体的な工程で示せば、下記のよう
な方法が例示できる。 （Ａ）固相化した本発明のモノクローナル抗体を用いる
方法： （１）ラットＰＡＩ−１と特異的に結合する本発明のモ
ノクローナル抗体（第１抗体）を固相化し、この固相化
したモノクローナル抗体に、被験試料を接触せしめて、
該モノクローナル抗体と被験試料中のラットＰＡＩ−１
を結合させる工程、（２）ラットＰＡＩ−１と特異的に
結合し、第１抗体とは抗原認識部位が異なる本発明のモ
ノクローナル抗体（第２抗体）もしくはラットＰＡＩ−
１に対するポリクローナル抗体（第２'抗体）であっ
て、必要に応じて標識物で標識された第２もしくは第
２'抗体を、（１）で得られた結合物に結合させる工
程、（３）工程（２）で用いる抗体が、標識物で標識さ
れていない場合は、（２）で得られた結合物にさらに、
第２抗体もしくは第２'抗体を認識しかつ標識物で標識
された抗体（第３抗体）（例えばビオチン化抗体）を結
合させる工程、および（４）化学発光基質等を用いて標
識物の活性を測定する工程からなることを特徴とするラ
ットＰＡＩ−１の定量、検出方法。
出方法を、さらに、具体的な工程で示せば、下記のよう
な方法が例示できる。 （Ａ）固相化した本発明のモノクローナル抗体を用いる
方法： （１）ラットＰＡＩ−１と特異的に結合する本発明のモ
ノクローナル抗体（第１抗体）を固相化し、この固相化
したモノクローナル抗体に、被験試料を接触せしめて、
該モノクローナル抗体と被験試料中のラットＰＡＩ−１
を結合させる工程、（２）ラットＰＡＩ−１と特異的に
結合し、第１抗体とは抗原認識部位が異なる本発明のモ
ノクローナル抗体（第２抗体）もしくはラットＰＡＩ−
１に対するポリクローナル抗体（第２'抗体）であっ
て、必要に応じて標識物で標識された第２もしくは第
２'抗体を、（１）で得られた結合物に結合させる工
程、（３）工程（２）で用いる抗体が、標識物で標識さ
れていない場合は、（２）で得られた結合物にさらに、
第２抗体もしくは第２'抗体を認識しかつ標識物で標識
された抗体（第３抗体）（例えばビオチン化抗体）を結
合させる工程、および（４）化学発光基質等を用いて標
識物の活性を測定する工程からなることを特徴とするラ
ットＰＡＩ−１の定量、検出方法。
【００１９】（Ｂ）ＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体を形成
させる方法： （１）ラットＰＡＩ−１と複合体を形成し得るｔ−ＰＡ
を固相化し、この固相化したｔ−ＰＡに、被験試料を接
触せしめて、該ｔ−ＰＡと被験試料中のラットＰＡＩ−
１を結合させる工程、（２）ラットＰＡＩ−１と特異的
に結合し、かつ必要に応じて標識物で標識されたモノク
ローナル抗体を、（１）で得られた結合物に結合させる
工程、（３）工程（２）で用いる抗体が標識物で標識さ
れていない場合は、（２）で得られた結合物にさらに、
（２）で用いる抗体を認識しかつ標識物で標識された抗
体（第２抗体）を結合させる工程、および（４）化学発
光基質等を用いて標識物の活性を測定する工程からなる
ことを特徴とするラットＰＡＩ−１の定量、検出方法。
させる方法： （１）ラットＰＡＩ−１と複合体を形成し得るｔ−ＰＡ
を固相化し、この固相化したｔ−ＰＡに、被験試料を接
触せしめて、該ｔ−ＰＡと被験試料中のラットＰＡＩ−
１を結合させる工程、（２）ラットＰＡＩ−１と特異的
に結合し、かつ必要に応じて標識物で標識されたモノク
ローナル抗体を、（１）で得られた結合物に結合させる
工程、（３）工程（２）で用いる抗体が標識物で標識さ
れていない場合は、（２）で得られた結合物にさらに、
（２）で用いる抗体を認識しかつ標識物で標識された抗
体（第２抗体）を結合させる工程、および（４）化学発
光基質等を用いて標識物の活性を測定する工程からなる
ことを特徴とするラットＰＡＩ−１の定量、検出方法。
【００２０】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ラット
ＰＡＩ−１を特異的に認識しこれと結合し得るので、こ
のモノクローナル抗体を用いることにより、交差反応物
の影響を受けず、検体中あるいは組織中のラットＰＡＩ
−１を免疫化学的定量法、免疫組織化学的検出法により
精度良く定量・検出することができる。また、本発明の
モノクローナル抗体は、ＰＡ、ことにｔ−ＰＡと複合体
を形成したＰＡＩ−１を認識しこれと結合し得るもので
ある。従って、複雑な構造変化と複合体形成をするＰＡ
Ｉ−１の病態モデルにおける動態解析等に有用である。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＰＡＩ−１の活
性中和作用を有するので、生体内におけるＰＡＩ−１の
機能解明等に有用である。
ＰＡＩ−１を特異的に認識しこれと結合し得るので、こ
のモノクローナル抗体を用いることにより、交差反応物
の影響を受けず、検体中あるいは組織中のラットＰＡＩ
−１を免疫化学的定量法、免疫組織化学的検出法により
精度良く定量・検出することができる。また、本発明の
モノクローナル抗体は、ＰＡ、ことにｔ−ＰＡと複合体
を形成したＰＡＩ−１を認識しこれと結合し得るもので
ある。従って、複雑な構造変化と複合体形成をするＰＡ
Ｉ−１の病態モデルにおける動態解析等に有用である。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＰＡＩ−１の活
性中和作用を有するので、生体内におけるＰＡＩ−１の
機能解明等に有用である。
【００２１】
実施例１ 抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体の作
製 （１）ラットヘパトーマＨＴＣ細胞培養上清からのラッ
トＰＡＩ−１の精製 ラット肝癌細胞株ＨＴＣの培養上清中に、ヒトあるいは
ウシの細胞培養上清と同様に、線溶系を抑制する物質が
存在することが報告されているので、ラットＨＴＣ細胞
培養上清からラットＰＡＩ−１を精製した。精製方法
は、ウシおよびヒトの細胞培養上清からのＰＡＩ−１精
製方法〔Journal of Biological Chemistry、第259巻、
14914〜14921頁、1984年、Biochemistry、第27巻、2911
〜2918頁、1988年、Journal of Biological Chemistr
y、第261巻、14474〜14481頁、1986年、Blood、第70
巻、1645〜1653頁、1987年〕に準じて以下のようにして
実施した。
製 （１）ラットヘパトーマＨＴＣ細胞培養上清からのラッ
トＰＡＩ−１の精製 ラット肝癌細胞株ＨＴＣの培養上清中に、ヒトあるいは
ウシの細胞培養上清と同様に、線溶系を抑制する物質が
存在することが報告されているので、ラットＨＴＣ細胞
培養上清からラットＰＡＩ−１を精製した。精製方法
は、ウシおよびヒトの細胞培養上清からのＰＡＩ−１精
製方法〔Journal of Biological Chemistry、第259巻、
14914〜14921頁、1984年、Biochemistry、第27巻、2911
〜2918頁、1988年、Journal of Biological Chemistr
y、第261巻、14474〜14481頁、1986年、Blood、第70
巻、1645〜1653頁、1987年〕に準じて以下のようにして
実施した。
【００２２】＜ＨＴＣ細胞株の培養＞ラット肝癌細胞株
ＨＴＣ（Ｍorris Ｈepatoma 7288Ｃ）［Proceedings
of National Academy of Sciences USA、第75巻、6130
〜6133頁、1978年］は大日本製薬より購入したものを用
いた。培養は、１０％新生仔牛血清および１％非必須ア
ミノ酸含有ＭＥＭ増殖用培地を用い、３７℃、５％ＣＯ
2インキュベータ中にて実施した。ＨＴＣ細胞株を３×
１０6cells／フラスコになるように２２５ｃｍ2培養フ
ラスコに接種後、これを培養し、コンフルエントになっ
た培養４日目に培地を除去して、細胞を３０ｍｌのＰＢ
Ｓで洗浄した。この細胞に無血清培地４０ｍｌを添加
し、さらにデキサメタゾン１０-7Ｍ（最終濃度）を加え
た。これをさらに２４時間培養して得られた培養液を４
℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、培養上清を、使
用時まで−８０℃で保存した。同様の培養を適宜行なっ
て、合計２.７Ｌの培養上清を得た。
ＨＴＣ（Ｍorris Ｈepatoma 7288Ｃ）［Proceedings
of National Academy of Sciences USA、第75巻、6130
〜6133頁、1978年］は大日本製薬より購入したものを用
いた。培養は、１０％新生仔牛血清および１％非必須ア
ミノ酸含有ＭＥＭ増殖用培地を用い、３７℃、５％ＣＯ
2インキュベータ中にて実施した。ＨＴＣ細胞株を３×
１０6cells／フラスコになるように２２５ｃｍ2培養フ
ラスコに接種後、これを培養し、コンフルエントになっ
た培養４日目に培地を除去して、細胞を３０ｍｌのＰＢ
Ｓで洗浄した。この細胞に無血清培地４０ｍｌを添加
し、さらにデキサメタゾン１０-7Ｍ（最終濃度）を加え
た。これをさらに２４時間培養して得られた培養液を４
℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、培養上清を、使
用時まで−８０℃で保存した。同様の培養を適宜行なっ
て、合計２.７Ｌの培養上清を得た。
【００２３】＜ＰＡＩ−１の精製＞得られた培養上清
２.７Ｌを、メンブレンフィルター（フィルター孔径０.
２μｍ以下）でろ過した後、ペンシル型モジュール（旭
化成社製）を用いて約１４０ｍｌまで限外濃縮した。得
られた濃縮培養上清を、ＦＰＬＣにより分画した。ＦＰ
ＬＣのカラム操作は４℃で行い、溶出液は２８０ｎｍで
検出した。カラム操作は、以下のように実施した。ま
ず、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で平衡化し
たＣonＡ−セファロースカラム（１.６×２０ｃｍ、容
量４０ｍｌ）（Ｐharmacia社製）に、濃縮培養上清を添
加した。続いてカラムを、４０ｍｌの０.０５Ｍ トリ
ス−ＨＣl含有 ０.１Ｍ ＮaＣl（pＨ７.４）、次いで
４０ｍｌの０.０５Ｍ トリス−ＨＣl含有１Ｍ ＮaＣl
（pＨ７.４）で洗浄した後、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl
含有０.５Ｍ ＮaＣl、０.５Ｍ α−メチル−Ｄ−マン
ノシッド（pＨ７.４）を用いて溶出を行ない、溶出液を
５ｍｌずつ分画・採取した。各分画の一部をとり、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）に付した後、このゲルについて、後記参考例記載の
方法によりリバースフィブリンオートグラフィー（ＲＦ
Ａ；reverse fibrin autography）を行ない各分画中の
ＰＡＩ−１活性を検出した。活性が認められた画分を集
め、４Ｌの水で２回透析後、１／１０容の０.１Ｍトリ
ス−ＨＣl 含有０.１Ｍ ＮaＣl（pＨ８.４）を添加し
た。次いでこれを、０.０１Ｍ トリス−ＨＣl含有
０.０１Ｍ ＮaＣl、（pＨ８.４）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファセルカラム（１.６×１.５ｃｍ、容量３ｍ
ｌ）（Ｐharmacia社製）に、流速９ｍｌ／ｈで添加し
た。同緩衝液３０ｍｌで洗浄した後、０.０１Ｍ トリ
ス−ＨＣl（pＨ８.４）を用いＮaＣlの濃度段階法で溶
出を行った。ＮaＣl濃度は０.０２Ｍ、０.０４Ｍ、０.
０８Ｍ、０.１Ｍ、０.１２Ｍ、０.２Ｍ、０.４Ｍ、１Ｍ
とし、容量は各３０ｍｌで行った。溶出時の流速は６０
ｍｌ／ｈとし、溶出液を３ｍｌずつ分画・採取した。各
分画の一部をとり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に付した後、
このゲルについて、ＲＦＡを行ない各分画中のＰＡＩ−
１活性を検出した。
２.７Ｌを、メンブレンフィルター（フィルター孔径０.
２μｍ以下）でろ過した後、ペンシル型モジュール（旭
化成社製）を用いて約１４０ｍｌまで限外濃縮した。得
られた濃縮培養上清を、ＦＰＬＣにより分画した。ＦＰ
ＬＣのカラム操作は４℃で行い、溶出液は２８０ｎｍで
検出した。カラム操作は、以下のように実施した。ま
ず、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で平衡化し
たＣonＡ−セファロースカラム（１.６×２０ｃｍ、容
量４０ｍｌ）（Ｐharmacia社製）に、濃縮培養上清を添
加した。続いてカラムを、４０ｍｌの０.０５Ｍ トリ
ス−ＨＣl含有 ０.１Ｍ ＮaＣl（pＨ７.４）、次いで
４０ｍｌの０.０５Ｍ トリス−ＨＣl含有１Ｍ ＮaＣl
（pＨ７.４）で洗浄した後、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl
含有０.５Ｍ ＮaＣl、０.５Ｍ α−メチル−Ｄ−マン
ノシッド（pＨ７.４）を用いて溶出を行ない、溶出液を
５ｍｌずつ分画・採取した。各分画の一部をとり、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）に付した後、このゲルについて、後記参考例記載の
方法によりリバースフィブリンオートグラフィー（ＲＦ
Ａ；reverse fibrin autography）を行ない各分画中の
ＰＡＩ−１活性を検出した。活性が認められた画分を集
め、４Ｌの水で２回透析後、１／１０容の０.１Ｍトリ
ス−ＨＣl 含有０.１Ｍ ＮaＣl（pＨ８.４）を添加し
た。次いでこれを、０.０１Ｍ トリス−ＨＣl含有
０.０１Ｍ ＮaＣl、（pＨ８.４）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファセルカラム（１.６×１.５ｃｍ、容量３ｍ
ｌ）（Ｐharmacia社製）に、流速９ｍｌ／ｈで添加し
た。同緩衝液３０ｍｌで洗浄した後、０.０１Ｍ トリ
ス−ＨＣl（pＨ８.４）を用いＮaＣlの濃度段階法で溶
出を行った。ＮaＣl濃度は０.０２Ｍ、０.０４Ｍ、０.
０８Ｍ、０.１Ｍ、０.１２Ｍ、０.２Ｍ、０.４Ｍ、１Ｍ
とし、容量は各３０ｍｌで行った。溶出時の流速は６０
ｍｌ／ｈとし、溶出液を３ｍｌずつ分画・採取した。各
分画の一部をとり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に付した後、
このゲルについて、ＲＦＡを行ない各分画中のＰＡＩ−
１活性を検出した。
【００２４】活性が認められた画分を集め、３Ｌの０.
０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で２回透析した後
これを、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で平衡
化したブルー−セファロースカラム（１×５ｃｍ、容量
３.９ｍｌ）（Ｐharmacia社製）に、流速３０ｍｌ／ｈ
で添加した。溶出は、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ
７.４）で開始し、０〜１０分までは０Ｍ ＮaＣl、流
速３０ｍｌ／ｈで、１０〜５０分までは０〜３Ｍ Ｎa
Ｃl、流速６０ｍｌ／ｈの濃度勾配で行った。各分画の
ＰＡＩ−１活性をＲＦＡにより検出し、活性の認められ
た画分をセントリコン（Ｃentricon）−３０（ＡＭＩＣ
ＯＮ社製）で１ｍｌに濃縮した。得られた濃縮液につい
て、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl含有０.１Ｍ ＮaＣl（p
Ｈ７.４）で平衡化したスーパーデックス（Ｓuperdex）
１６／６０（１.６×６０ｃｍ、容量１２０ｍｌ）（Ｐh
armacia社製）を用い、ゲルろ過した。各分画のＰＡＩ
−１活性をＲＦＡにより検出し、ＰＡＩ−１活性を含む
分画をセントリコン−３０で濃縮し、精製ラットＰＡＩ
−１を含む溶液を得た。精製ＰＡＩ−１について、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行ない、コマシー・ブリリアント・ブル
ー（Ｃomassie Ｂrilliant Ｂlue；ＣＢＢ）染色した結
果、分子量約５２Ｋｄの位置にメインのバンドが、ま
た、分子量約４９Ｋｄに薄いバンドが認められた（グリ
コシレーションの異なる複数の型で存在している可能性
が考えられる）。さらに、同電気泳動ゲルを用いて、Ｒ
ＦＡにより生物活性を調べたところ、前記の２つのバン
ドと対応する位置に、組織型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（ｔ−ＰＡ）活性に対する阻害活性が認められた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量（５２Ｋｄ）および
ｔ−ＰＡ対する阻害活性により、精製物がラットＰＡＩ
−１であることを確認した。
０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で２回透析した後
これを、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７.４）で平衡
化したブルー−セファロースカラム（１×５ｃｍ、容量
３.９ｍｌ）（Ｐharmacia社製）に、流速３０ｍｌ／ｈ
で添加した。溶出は、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ
７.４）で開始し、０〜１０分までは０Ｍ ＮaＣl、流
速３０ｍｌ／ｈで、１０〜５０分までは０〜３Ｍ Ｎa
Ｃl、流速６０ｍｌ／ｈの濃度勾配で行った。各分画の
ＰＡＩ−１活性をＲＦＡにより検出し、活性の認められ
た画分をセントリコン（Ｃentricon）−３０（ＡＭＩＣ
ＯＮ社製）で１ｍｌに濃縮した。得られた濃縮液につい
て、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl含有０.１Ｍ ＮaＣl（p
Ｈ７.４）で平衡化したスーパーデックス（Ｓuperdex）
１６／６０（１.６×６０ｃｍ、容量１２０ｍｌ）（Ｐh
armacia社製）を用い、ゲルろ過した。各分画のＰＡＩ
−１活性をＲＦＡにより検出し、ＰＡＩ−１活性を含む
分画をセントリコン−３０で濃縮し、精製ラットＰＡＩ
−１を含む溶液を得た。精製ＰＡＩ−１について、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行ない、コマシー・ブリリアント・ブル
ー（Ｃomassie Ｂrilliant Ｂlue；ＣＢＢ）染色した結
果、分子量約５２Ｋｄの位置にメインのバンドが、ま
た、分子量約４９Ｋｄに薄いバンドが認められた（グリ
コシレーションの異なる複数の型で存在している可能性
が考えられる）。さらに、同電気泳動ゲルを用いて、Ｒ
ＦＡにより生物活性を調べたところ、前記の２つのバン
ドと対応する位置に、組織型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（ｔ−ＰＡ）活性に対する阻害活性が認められた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量（５２Ｋｄ）および
ｔ−ＰＡ対する阻害活性により、精製物がラットＰＡＩ
−１であることを確認した。
【００２５】得られた精製ラットＰＡＩ−１（非活性化
ＰＡＩ−１）は、不活性な潜在型として存在するため、
最終濃度４Ｍグアニジン塩酸を添加し、室温にて１０分
間放置することにより活性型に変換した。得られた活性
化ＰＡＩ−１を、２Ｌの０.０１％ツイーン８０含有０.
１Ｍ酢酸緩衝液（pＨ５.５）に対して透析した後、−８
０℃にて保存した。バイオプール（Ｂiopool）社製測定
キット（商品名：Ｓpectrolyse／fibrin）を用いる酵素
阻害活性測定法［Chmielewskaら、Thrombosis Researc
h、第31巻、427〜436頁、1983年］により、活性化ＰＡ
Ｉ−１のＰＡＩ活性を測定した結果、比活性は２２００
０ｕ／ｍｇであった。また、活性化精製ラットＰＡＩ−
１について、市販ヒトＰＡＩ−１測定キット（Ｂiopool
社製 Ｉmlyse ＰＡＩ−１）を用いて、抗ヒトＰＡＩ−
１マウスモノクローナル抗体との交差反応性を調べたと
ころ、精製ラットＰＡＩ−１は抗ヒトＰＡＩ−１モノク
ローナル抗体とは反応がみられなかった。以下の実施例
中「非活性化ＰＡＩ−１」と特記する場合を除き、「精
製ラットＰＡＩ−１」は、活性化した精製ラットＰＡＩ
−１を意味する。
ＰＡＩ−１）は、不活性な潜在型として存在するため、
最終濃度４Ｍグアニジン塩酸を添加し、室温にて１０分
間放置することにより活性型に変換した。得られた活性
化ＰＡＩ−１を、２Ｌの０.０１％ツイーン８０含有０.
１Ｍ酢酸緩衝液（pＨ５.５）に対して透析した後、−８
０℃にて保存した。バイオプール（Ｂiopool）社製測定
キット（商品名：Ｓpectrolyse／fibrin）を用いる酵素
阻害活性測定法［Chmielewskaら、Thrombosis Researc
h、第31巻、427〜436頁、1983年］により、活性化ＰＡ
Ｉ−１のＰＡＩ活性を測定した結果、比活性は２２００
０ｕ／ｍｇであった。また、活性化精製ラットＰＡＩ−
１について、市販ヒトＰＡＩ−１測定キット（Ｂiopool
社製 Ｉmlyse ＰＡＩ−１）を用いて、抗ヒトＰＡＩ−
１マウスモノクローナル抗体との交差反応性を調べたと
ころ、精製ラットＰＡＩ−１は抗ヒトＰＡＩ−１モノク
ローナル抗体とは反応がみられなかった。以下の実施例
中「非活性化ＰＡＩ−１」と特記する場合を除き、「精
製ラットＰＡＩ−１」は、活性化した精製ラットＰＡＩ
−１を意味する。
【００２６】（２）抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル
抗体産生マウスハイブリドーマの作製 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケー
ラーとミルシュタインの方法〔Ｇ．Ｋohler ＆ Ｃ．Ｍi
lstein；Nature、第256巻、495〜497頁、1975年〕に準
じて以下のように実施した。 ＜マウスの免疫＞前記（１）で得られた精製ラットＰＡ
Ｉ−１ １０μｇを、完全フロイントアジュバントと共
に、５週令ＢＡＬＢ／c雌マウスの鼠径部皮下に投与し
て免疫し、この初回免疫後、２回の追加免疫を３週間間
隔で行った。免疫の初回は完全フロイントアジュバント
を、２回目および３回目は不完全フロイントアジュバン
トを用いて同量の抗原を投与した。免疫時には尾採血に
より血液を採取し、血漿中の抗体価の高かった個体につ
いて、追加免疫の３週間後、さらに同量の抗原を腹腔内
投与し、３日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞懸濁
液を（４.２５×１０6cells／ｍｌ）調製した。
抗体産生マウスハイブリドーマの作製 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケー
ラーとミルシュタインの方法〔Ｇ．Ｋohler ＆ Ｃ．Ｍi
lstein；Nature、第256巻、495〜497頁、1975年〕に準
じて以下のように実施した。 ＜マウスの免疫＞前記（１）で得られた精製ラットＰＡ
Ｉ−１ １０μｇを、完全フロイントアジュバントと共
に、５週令ＢＡＬＢ／c雌マウスの鼠径部皮下に投与し
て免疫し、この初回免疫後、２回の追加免疫を３週間間
隔で行った。免疫の初回は完全フロイントアジュバント
を、２回目および３回目は不完全フロイントアジュバン
トを用いて同量の抗原を投与した。免疫時には尾採血に
より血液を採取し、血漿中の抗体価の高かった個体につ
いて、追加免疫の３週間後、さらに同量の抗原を腹腔内
投与し、３日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞懸濁
液を（４.２５×１０6cells／ｍｌ）調製した。
【００２７】＜細胞融合とクローニング＞ミエローマ親
株としてマウス骨髄腫細胞Ｓp２／Ｏ−Ａg１４（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １５８０）を用いた。Ｓp２／Ｏ−Ａg１４細
胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ、ピルビン
酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、グルタミン
およびアザグアニン含有）で培養した。前記免疫マウス
の脾細胞とミエローマ細胞を、５：１の比率で混ぜ
（８.６×１０7cells：１.７×１０7cells）、ＰＥＧ１
５００を用いて細胞融合を行なった。融合を終了した細
胞は遠心し、上清を除去した後、エス・クロンクローニ
ングメデュームＣＭ−Ｂ（三光純薬製）にＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）を添加し
たＨＡＴセレクション用培地（ＨＡＴ含有ＣＭ−Ｂ培
地）５０ｍｌに浮遊させた。得られた細胞浮遊液を、９
６穴プレートに、各ウェル５×１０5cells／１００μｌ
ずつ添加し培養した。４日間培養した後、アミノプテリ
ンを含まずヒポキサンチンおよびチミジンを添加したＨ
Ｔ含有ＣＭ−Ｂ培地に培地を交換し、以後必要に応じて
同培地の追加または交換を行った。２週間目に培養上清
を採取し、培養上清中の抗ラットＰＡＩ−１抗体（Ｉg
Ｇ）の有無をＥＬＩＳＡ法で検出することにより、抗体
スクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡは、精製ラットＰ
ＡＩ−１を物理的吸着により固相化した９６穴プレート
を用い、該培養上清を添加してインキュベートした後、
二次抗体としてペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス
ＩgＧ（Ｃappel社製）を添加して反応させ、発色基質を
用いて抗原に結合した抗体を検出することにより行なっ
た。抗体陽性ウェルについては、１０％ＦＣＳ含有ＣＭ
−Ｂ培地を用い、９６穴プレートにて１cell／ウェルと
なるように限界希釈を行なって単クローン化した。単ク
ローン化後、約２週間培養しコロニーが増殖した段階
で、再度抗体スクリーニングを行い、同様にして２次お
よび３次クローニングを行った。得られたハイブリドー
マは、前記と同様の１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０
培地にて培養した。このようにして、ラットＰＡＩ−１
に対して強い結合能を有するモノクローナル抗体（Ｉg
Ｇ）を産生するマウスハイブリドーマ１０クローンが得
られた。これらハイブリドーマ１０種を、それぞれＢ
２．Ｈ１２．２、Ｄ１．Ｈ１．１、Ｄ１．Ｂ１２、Ａ
５．Ｈ１１．１、Ｂ２．Ｂ１０．１、Ｃ２．Ｆ５．１、
Ｃ２．Ｆ５．２、Ｃ２．Ｈ１０．２、Ａ５．Ｆ１１．２
およびＤ１．Ｃ２．１と命名し（それらが産生するモノ
クローナル抗体も同一名称を付した）、そのうち１株Ｄ
１．Ｂ１２（寄託時の細胞株名：Ｄ１．Ｂ１２−３）に
ついて、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５６５８）。
株としてマウス骨髄腫細胞Ｓp２／Ｏ−Ａg１４（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １５８０）を用いた。Ｓp２／Ｏ−Ａg１４細
胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ、ピルビン
酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、グルタミン
およびアザグアニン含有）で培養した。前記免疫マウス
の脾細胞とミエローマ細胞を、５：１の比率で混ぜ
（８.６×１０7cells：１.７×１０7cells）、ＰＥＧ１
５００を用いて細胞融合を行なった。融合を終了した細
胞は遠心し、上清を除去した後、エス・クロンクローニ
ングメデュームＣＭ−Ｂ（三光純薬製）にＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）を添加し
たＨＡＴセレクション用培地（ＨＡＴ含有ＣＭ−Ｂ培
地）５０ｍｌに浮遊させた。得られた細胞浮遊液を、９
６穴プレートに、各ウェル５×１０5cells／１００μｌ
ずつ添加し培養した。４日間培養した後、アミノプテリ
ンを含まずヒポキサンチンおよびチミジンを添加したＨ
Ｔ含有ＣＭ−Ｂ培地に培地を交換し、以後必要に応じて
同培地の追加または交換を行った。２週間目に培養上清
を採取し、培養上清中の抗ラットＰＡＩ−１抗体（Ｉg
Ｇ）の有無をＥＬＩＳＡ法で検出することにより、抗体
スクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡは、精製ラットＰ
ＡＩ−１を物理的吸着により固相化した９６穴プレート
を用い、該培養上清を添加してインキュベートした後、
二次抗体としてペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス
ＩgＧ（Ｃappel社製）を添加して反応させ、発色基質を
用いて抗原に結合した抗体を検出することにより行なっ
た。抗体陽性ウェルについては、１０％ＦＣＳ含有ＣＭ
−Ｂ培地を用い、９６穴プレートにて１cell／ウェルと
なるように限界希釈を行なって単クローン化した。単ク
ローン化後、約２週間培養しコロニーが増殖した段階
で、再度抗体スクリーニングを行い、同様にして２次お
よび３次クローニングを行った。得られたハイブリドー
マは、前記と同様の１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０
培地にて培養した。このようにして、ラットＰＡＩ−１
に対して強い結合能を有するモノクローナル抗体（Ｉg
Ｇ）を産生するマウスハイブリドーマ１０クローンが得
られた。これらハイブリドーマ１０種を、それぞれＢ
２．Ｈ１２．２、Ｄ１．Ｈ１．１、Ｄ１．Ｂ１２、Ａ
５．Ｈ１１．１、Ｂ２．Ｂ１０．１、Ｃ２．Ｆ５．１、
Ｃ２．Ｆ５．２、Ｃ２．Ｈ１０．２、Ａ５．Ｆ１１．２
およびＤ１．Ｃ２．１と命名し（それらが産生するモノ
クローナル抗体も同一名称を付した）、そのうち１株Ｄ
１．Ｂ１２（寄託時の細胞株名：Ｄ１．Ｂ１２−３）に
ついて、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５６５８）。
【００２８】また、各モノクローナル抗体のサブクラス
は、マウス−ハイブリドーマ・サブタイピング・キット
（Ｂoehringer Ｍannheim社製）を用いて決定し、下記
表１に示した。
は、マウス−ハイブリドーマ・サブタイピング・キット
（Ｂoehringer Ｍannheim社製）を用いて決定し、下記
表１に示した。
【表１】
【００２９】（３）モノクローナル抗体の大量調製と精
製 前記（２）の方法によって得られた抗ラットＰＡＩ−１
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、以下のよう
にしてマウス腹腔内で培養した。５週令ＢＡＬＢ／c
雌マウスの腹腔内にプリスタン（２,６,１０,１４−テ
トラメチルペンタデカン）０.５ｍｌを投与し、２週間
後にハイブリドーマ細胞（２×１０6cells／０.５ｍ
ｌ）を腹腔内投与した。細胞投与の１０日後に、腹水を
採取した。得られた腹水から、モノクローナル抗体を以
下のようにして精製した。腹水と飽和硫酸アンモニウム
を等量混合、撹拌した後、４℃で１時間放置し、これを
遠心した。ペレットを５０％飽和硫酸アンモニウムに懸
濁し、４℃、３０分間放置後、遠心分離し、同様の操作
を２回繰り返した。ペレットをリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ；pＨ７.４）に溶解し、ＰＢＳで透析した。透
析液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（pＨ７.０）で平衡化し
たアフィニティカラム（ＨiＴrap ＰroteinＧ、カラム
容積；５ｍｌ；Ｐharmacia社製）に添加して吸着させ
た。平衡化に使用した緩衝液（ベッド体積の１０倍容）
でこれを洗浄した後、１５ｍｌの０.１Ｍ グリシン−
ＨＣｌ（pＨ２.７）で結合した抗体を溶出し、１Ｍ ト
リス−ＨＣl（pＨ９）が分注された受器に分画を採取し
た。抗体を含む画分を集め、これをＰＢＳで透析し、精
製抗体溶液を得た。精製抗体溶液は−８０℃にて保存し
た。
製 前記（２）の方法によって得られた抗ラットＰＡＩ−１
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、以下のよう
にしてマウス腹腔内で培養した。５週令ＢＡＬＢ／c
雌マウスの腹腔内にプリスタン（２,６,１０,１４−テ
トラメチルペンタデカン）０.５ｍｌを投与し、２週間
後にハイブリドーマ細胞（２×１０6cells／０.５ｍ
ｌ）を腹腔内投与した。細胞投与の１０日後に、腹水を
採取した。得られた腹水から、モノクローナル抗体を以
下のようにして精製した。腹水と飽和硫酸アンモニウム
を等量混合、撹拌した後、４℃で１時間放置し、これを
遠心した。ペレットを５０％飽和硫酸アンモニウムに懸
濁し、４℃、３０分間放置後、遠心分離し、同様の操作
を２回繰り返した。ペレットをリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ；pＨ７.４）に溶解し、ＰＢＳで透析した。透
析液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（pＨ７.０）で平衡化し
たアフィニティカラム（ＨiＴrap ＰroteinＧ、カラム
容積；５ｍｌ；Ｐharmacia社製）に添加して吸着させ
た。平衡化に使用した緩衝液（ベッド体積の１０倍容）
でこれを洗浄した後、１５ｍｌの０.１Ｍ グリシン−
ＨＣｌ（pＨ２.７）で結合した抗体を溶出し、１Ｍ ト
リス−ＨＣl（pＨ９）が分注された受器に分画を採取し
た。抗体を含む画分を集め、これをＰＢＳで透析し、精
製抗体溶液を得た。精製抗体溶液は−８０℃にて保存し
た。
【００３０】実施例２ 抗ラットＰＡＩ−１モノクロー
ナル抗体の反応特異性 実施例１で得られた１０種類の抗ラットＰＡＩ−１モノ
クローナル抗体について、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−１
／ｔ−ＰＡ複合体に対する反応性を、ウェスタンブロッ
ティングおよびＥＬＩＳＡにより、以下のようにして調
べた。（１）ウェスタンブロッティングＰＡＩ−１に対
するモノクローナル抗体の反応性を以下のようにして確
認した。精製ラットＰＡＩ−１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離した後、これをＰＶＤＦ（Ｐolyvinylidene difluo
ride）膜（ミリポア社製）に転写した。これをブロッキ
ングした後、一次抗体として抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体、二次抗体としてワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ；Ｈorse Ｒaddish peroxidase）標識し
たヤギ抗マウスＩgＧ（カッペル社製）、発色基質とし
てＤＡＢ（３,３'−diaminobenzidine terahydrochlori
de）／Ｈ2Ｏ2を用いて、ＰＡＩ−１に結合したモノクロ
ーナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰＡＩ−１
モノクローナル抗体について、上記のようにウェスタン
ブロッティングを行った結果、いずれのモノクローナル
抗体も５０Ｋd付近のＰＡＩ−１を認識した。すなわ
ち、ＣＢＢ染色で５２および４９ＫＤの２バンドが認め
られたのに対して、ウェスタンブロッティングでもほぼ
同位置に２バンドが認められた。この結果から、これら
１０種類の抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体は、
ＰＡＩ−１対して特異的に結合することが確認できた。
ナル抗体の反応特異性 実施例１で得られた１０種類の抗ラットＰＡＩ−１モノ
クローナル抗体について、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−１
／ｔ−ＰＡ複合体に対する反応性を、ウェスタンブロッ
ティングおよびＥＬＩＳＡにより、以下のようにして調
べた。（１）ウェスタンブロッティングＰＡＩ−１に対
するモノクローナル抗体の反応性を以下のようにして確
認した。精製ラットＰＡＩ−１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離した後、これをＰＶＤＦ（Ｐolyvinylidene difluo
ride）膜（ミリポア社製）に転写した。これをブロッキ
ングした後、一次抗体として抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体、二次抗体としてワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ；Ｈorse Ｒaddish peroxidase）標識し
たヤギ抗マウスＩgＧ（カッペル社製）、発色基質とし
てＤＡＢ（３,３'−diaminobenzidine terahydrochlori
de）／Ｈ2Ｏ2を用いて、ＰＡＩ−１に結合したモノクロ
ーナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰＡＩ−１
モノクローナル抗体について、上記のようにウェスタン
ブロッティングを行った結果、いずれのモノクローナル
抗体も５０Ｋd付近のＰＡＩ−１を認識した。すなわ
ち、ＣＢＢ染色で５２および４９ＫＤの２バンドが認め
られたのに対して、ウェスタンブロッティングでもほぼ
同位置に２バンドが認められた。この結果から、これら
１０種類の抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体は、
ＰＡＩ−１対して特異的に結合することが確認できた。
【００３１】さらに、ＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に対
する抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体の反応性を
以下のように調べた。ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体
ラットは、ＰＡＩ−１とヒトｔ−ＰＡ（ヒトメラノーマ
細胞由来一本鎖ｔ−ＰＡ、Ｂiopool社製）を、０.３Ｍ
ＮaＣlおよび０.０１Ｍ ＣaＣl2含有０.１Ｍ トリ
ス−ＨＣl（pＨ７.５）緩衝液中で２５℃、３０分イン
キュベーションして形成させた。この反応液についてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、上
記と同様にしてＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に結合した
モノクローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰ
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにウ
ェスタンブロッティングを行った結果、いずれのモノク
ローナル抗体も１１７Ｋｄ付近のＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ
複合体を認識した。
する抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体の反応性を
以下のように調べた。ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体
ラットは、ＰＡＩ−１とヒトｔ−ＰＡ（ヒトメラノーマ
細胞由来一本鎖ｔ−ＰＡ、Ｂiopool社製）を、０.３Ｍ
ＮaＣlおよび０.０１Ｍ ＣaＣl2含有０.１Ｍ トリ
ス−ＨＣl（pＨ７.５）緩衝液中で２５℃、３０分イン
キュベーションして形成させた。この反応液についてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、上
記と同様にしてＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に結合した
モノクローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰ
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにウ
ェスタンブロッティングを行った結果、いずれのモノク
ローナル抗体も１１７Ｋｄ付近のＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ
複合体を認識した。
【００３２】（２）ＥＬＩＳＡ ＰＡＩ−１に対するモノクローナル抗体の反応性を、固
相化したＰＡＩ−１を用いて以下のようにして確認し
た。すなわち、０.１Ｍリン酸バッファー（pＨ７.４）
で溶解した精製ラットＰＡＩ−１を９６穴マイクロタイ
タープレートに添加（４５ｎｇ／ウェル）して物理的吸
着により固相化した。プレートをＢＳＡ含有ＰＢＳでブ
ロッキングし、洗浄した後、抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体を添加して反応させ、さらに洗浄
後、ＨＲＰ標識抗マウスＩgＧヤギＩgＧ（カッペル社
製）と反応させた。発色基質としてＴＭＢlue(ＴＭ１０
２、ビーエム機器社製）を用いてＰＡＩ−１に結合した
モノクローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰ
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにＥ
ＬＩＳＡを行った結果、いずれのモノクローナル抗体も
固相化ラットＰＡＩ−１と用量依存的に反応した。ただ
し、抗体により反応性の強弱があり、特にＡ５．Ｆ１
１．２（抗体Ｎｏ．９）は非常に弱い反応性を示した。
相化したＰＡＩ−１を用いて以下のようにして確認し
た。すなわち、０.１Ｍリン酸バッファー（pＨ７.４）
で溶解した精製ラットＰＡＩ−１を９６穴マイクロタイ
タープレートに添加（４５ｎｇ／ウェル）して物理的吸
着により固相化した。プレートをＢＳＡ含有ＰＢＳでブ
ロッキングし、洗浄した後、抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体を添加して反応させ、さらに洗浄
後、ＨＲＰ標識抗マウスＩgＧヤギＩgＧ（カッペル社
製）と反応させた。発色基質としてＴＭＢlue(ＴＭ１０
２、ビーエム機器社製）を用いてＰＡＩ−１に結合した
モノクローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰ
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにＥ
ＬＩＳＡを行った結果、いずれのモノクローナル抗体も
固相化ラットＰＡＩ−１と用量依存的に反応した。ただ
し、抗体により反応性の強弱があり、特にＡ５．Ｆ１
１．２（抗体Ｎｏ．９）は非常に弱い反応性を示した。
【００３３】さらに、ＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体に対
する抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体反応性を、
レイモンドらの方法〔Raymond et al., J. Lab. Clin.
Med.、第106巻、408−415頁、1985年〕に準じて、固相
上に形成させた複合体を用いて以下のように調べた。す
なわち、０.１Ｍリン酸バッファー（pＨ７.４）で溶解
したヒトｔ−ＰＡを９６穴マイクロタイタープレートに
添加（４５ｎｇ／ウェル）して物理的吸着により固相化
した。プレートをＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングし洗
浄した後、精製ラットＰＡＩ−１を０.３μｇ／ウェル
添加し、２５℃、３０分間反応させて複合体を形成させ
た。プレートを洗浄後、この複合体に抗ラットＰＡＩ−
１マウスモノクローナル抗体を添加して反応させ、以下
前記と同様にしてＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡに結合したモノ
クローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰＡＩ
−１モノクローナル抗体について、上記のようにＥＬＩ
ＳＡを行った結果、いずれのモノクローナル抗体もＰＡ
Ｉ−１／ｔ−ＰＡ複合体と用量依存的に反応した。ただ
し、抗体により反応性の強弱があり、特にＤ１．Ｃ２．
１（抗体Ｎｏ．１０）は非常に弱い反応性を示した。
する抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体反応性を、
レイモンドらの方法〔Raymond et al., J. Lab. Clin.
Med.、第106巻、408−415頁、1985年〕に準じて、固相
上に形成させた複合体を用いて以下のように調べた。す
なわち、０.１Ｍリン酸バッファー（pＨ７.４）で溶解
したヒトｔ−ＰＡを９６穴マイクロタイタープレートに
添加（４５ｎｇ／ウェル）して物理的吸着により固相化
した。プレートをＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングし洗
浄した後、精製ラットＰＡＩ−１を０.３μｇ／ウェル
添加し、２５℃、３０分間反応させて複合体を形成させ
た。プレートを洗浄後、この複合体に抗ラットＰＡＩ−
１マウスモノクローナル抗体を添加して反応させ、以下
前記と同様にしてＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡに結合したモノ
クローナル抗体を検出した。１０種類の抗ラットＰＡＩ
−１モノクローナル抗体について、上記のようにＥＬＩ
ＳＡを行った結果、いずれのモノクローナル抗体もＰＡ
Ｉ−１／ｔ−ＰＡ複合体と用量依存的に反応した。ただ
し、抗体により反応性の強弱があり、特にＤ１．Ｃ２．
１（抗体Ｎｏ．１０）は非常に弱い反応性を示した。
【００３４】上記ウェスタンブロッティングおよびＥＬ
ＩＳＡの結果を表２にまとめて示した。なお、mＡb１０
の複合体との反応性は、実験系により異なっていたが、
ウェスタンブロッティング（イムノブロッティング）で
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより複合体のコンフォメーション
が変化するため、ＥＬＩＳＡによる実験系の結果の方
が、生体中の複合体に対する抗体の反応性を正しく表し
ているものと考えられる。
ＩＳＡの結果を表２にまとめて示した。なお、mＡb１０
の複合体との反応性は、実験系により異なっていたが、
ウェスタンブロッティング（イムノブロッティング）で
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより複合体のコンフォメーション
が変化するため、ＥＬＩＳＡによる実験系の結果の方
が、生体中の複合体に対する抗体の反応性を正しく表し
ているものと考えられる。
【表２】
【００３５】実施例３ 抗ラットＰＡＩ−１モノクロー
ナル抗体のＰＡＩ−１活性中和作用 合成基質を用いてＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性を測定
する方法〔Keijerら、Blood、第78巻、401〜409頁、199
1年〕に準じて、ＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対す
る抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体の中和作用を
以下のように調べた。ラットＰＡＩ−１はｔ−ＰＡ活性
を２０％前後阻害させる量を添加した。精製ラットＰＡ
Ｉ−１溶液（１１０Ｕ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ）１５
０μｌに、１、３または６.２５ｍｇ／ｍｌの抗体溶液
５μｌを混合し、４℃で一晩放置して反応させた。反応
液２５μｌを氷冷下で９６穴プレートに添加し、これに
二本鎖（two-chain）ヒトｔ−ＰＡ（Ｂiopool社製）を
０.１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有１５０ｍＭ ＮaＣ
l−２０ｍＭ トリス−ＨＣl（pＨ７.８）で希釈した溶
液（１００Ｕ／ｍｌ）２５μｌを加え、３７℃で１５分
間反応させた。これに０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン８０
含有１００ｍＭ トリス−ＨＣl（pＨ８.４）１５０μ
ｌを添加して反応を停止させた後、５ｍＭ Ｓ２２８８
（合成基質、CHROMOGENIX社製）を５０μｌ加えた。Ｓ
２２８８は１０ｍＭ水溶液とし、等量の１００ｍＭ ト
リス−ＨＣl（pＨ８.４）で希釈して用いた。残余のｔ
−ＰＡ活性は、合成基質の発色を経時的にプレートリー
ダーで測定（測定波長：４０５ｎｍ）してＯＤ／minを
算出することにより測定した。
ナル抗体のＰＡＩ−１活性中和作用 合成基質を用いてＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性を測定
する方法〔Keijerら、Blood、第78巻、401〜409頁、199
1年〕に準じて、ＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対す
る抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体の中和作用を
以下のように調べた。ラットＰＡＩ−１はｔ−ＰＡ活性
を２０％前後阻害させる量を添加した。精製ラットＰＡ
Ｉ−１溶液（１１０Ｕ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ）１５
０μｌに、１、３または６.２５ｍｇ／ｍｌの抗体溶液
５μｌを混合し、４℃で一晩放置して反応させた。反応
液２５μｌを氷冷下で９６穴プレートに添加し、これに
二本鎖（two-chain）ヒトｔ−ＰＡ（Ｂiopool社製）を
０.１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有１５０ｍＭ ＮaＣ
l−２０ｍＭ トリス−ＨＣl（pＨ７.８）で希釈した溶
液（１００Ｕ／ｍｌ）２５μｌを加え、３７℃で１５分
間反応させた。これに０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン８０
含有１００ｍＭ トリス−ＨＣl（pＨ８.４）１５０μ
ｌを添加して反応を停止させた後、５ｍＭ Ｓ２２８８
（合成基質、CHROMOGENIX社製）を５０μｌ加えた。Ｓ
２２８８は１０ｍＭ水溶液とし、等量の１００ｍＭ ト
リス−ＨＣl（pＨ８.４）で希釈して用いた。残余のｔ
−ＰＡ活性は、合成基質の発色を経時的にプレートリー
ダーで測定（測定波長：４０５ｎｍ）してＯＤ／minを
算出することにより測定した。
【００３６】実施例１で得られた１０種類の抗ラットＰ
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにＰ
ＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和作用を調べた
結果を下記表３および図１に示した。モノクローナル抗
体Ｄ１．Ｈ１．１（表中、抗体Ｎｏ．２）、Ｄ１．Ｂ１
２（同Ｎｏ．２）およびＤ１．Ｃ２．１（同Ｎｏ．１
０）はＰＡＩ−１活性を４５％以上を阻害し、強い中和
作用を示した。これら強い中和を示す抗体は、ＰＡＩ−
１とｔ−ＰＡとの結合部位、つまり活性中心との反応部
位および二次的結合部位を認識している可能性が考えら
れる。
ＡＩ−１モノクローナル抗体について、上記のようにＰ
ＡＩ−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和作用を調べた
結果を下記表３および図１に示した。モノクローナル抗
体Ｄ１．Ｈ１．１（表中、抗体Ｎｏ．２）、Ｄ１．Ｂ１
２（同Ｎｏ．２）およびＤ１．Ｃ２．１（同Ｎｏ．１
０）はＰＡＩ−１活性を４５％以上を阻害し、強い中和
作用を示した。これら強い中和を示す抗体は、ＰＡＩ−
１とｔ−ＰＡとの結合部位、つまり活性中心との反応部
位および二次的結合部位を認識している可能性が考えら
れる。
【表３】
【００３７】実施例４ モノクローナル抗体の競合性
（交差反応性） 実施例１で得たモノクローナル抗体、およびこれらをビ
オチン標識したモノクローナル抗体を用いて、競合性を
ＥＬＩＳＡにより調べた。ビオチン標識モノクローナル
抗体の調製は以下のように行った。すなわち、２ｍｇの
精製モノクローナル抗体（１gＧ）を含む溶液を、セン
トリコン−３０（アミコン社製、限外濃縮器）を用いて
０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．６）に溶
媒交換し、０.６ｍｌに濃縮した後、２.６μＭになるよ
うＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（sulfosuccinimidyl−6−(b
iotinamide)hexanoate）（ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液
を添加した。これを室温で３０分間反応させて抗体をビ
オチン化した後、反応液をＰＢＳで透析した。
（交差反応性） 実施例１で得たモノクローナル抗体、およびこれらをビ
オチン標識したモノクローナル抗体を用いて、競合性を
ＥＬＩＳＡにより調べた。ビオチン標識モノクローナル
抗体の調製は以下のように行った。すなわち、２ｍｇの
精製モノクローナル抗体（１gＧ）を含む溶液を、セン
トリコン−３０（アミコン社製、限外濃縮器）を用いて
０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．６）に溶
媒交換し、０.６ｍｌに濃縮した後、２.６μＭになるよ
うＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（sulfosuccinimidyl−6−(b
iotinamide)hexanoate）（ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液
を添加した。これを室温で３０分間反応させて抗体をビ
オチン化した後、反応液をＰＢＳで透析した。
【００３８】抗体の競合（交差反応性）の試験は、以下
のように実施した。９６穴マイクロタイタープレート
に、精製ラットＰＡＩ−１を物理的吸着により固相化
し、これに一定量のビオチン標識モノクローナル抗体
と、非標識モノクローナル抗体（０.０１〜１００μｇ
／ｍｌもしくは０μｇ／ｍｌ）を添加して競合反応させ
た。ウェルを洗浄した後、ＡＢＣキット（アビジン溶液
およびビオチン化ペルオキシダーゼ溶液を用いるビオチ
ン化抗体検出用キット、ベクスタイン社製）および発色
基質ＴＭＢlueを用いて、固相化ＰＡＩ−１に結合した
ビオチン標識モノクローナル抗体量を吸光度により測定
し、競合（交差反応）の有無を判定した。それらの結果
を図２および図３に示した。ビオチン標識したモノクロ
ーナル抗体 Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）、Ｄ
１．Ｂ１２（同Ｎｏ．３）、Ｃ２．Ｆ５．１（同Ｎｏ．
６）およびＡ５．Ｆ１１．２（同Ｎｏ．９）は、いずれ
も単独では用量依存的に固相化ラットＰＡＩ−１と反応
することが確認された。これらビオチン標識したモノク
ローナル抗体の各々に対して、実施例１で得られた１０
種類のモノクローナル抗体（非標識）各々を組み合わせ
て競合反応させた。その結果、抗体Ｎｏ．３に対して
は、図２および図３に示したとおり、抗体Ｎｏ．２およ
び抗体Ｎｏ．１０が競合し、固相化ＰＡＩ−１との結合
を阻害した。このことから抗体Ｎｏ．２、抗体Ｎｏ．
３、抗体Ｎｏ．１０は認識するエピトープが同じかある
いは近傍であると考えられた。また、この結果と他のビ
オチン標識モノクローナル抗体に対して同様に行った競
合反応の結果から、実施例１で得られた１０種類のモノ
クローナル抗体は、認識部位の差異により４つのグルー
プ、すなわち、Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）、Ｂ
２．Ｂ１０．１（同Ｎｏ．５）、Ｃ２．Ｆ５．１（同Ｎ
ｏ．６）、Ｃ２．Ｆ５．２（同Ｎｏ．７）、Ｃ２．Ｈ１
０．２（同Ｎｏ．８）およびＡ５．Ｆ１１．２（同Ｎ
ｏ．９）からなるグループ、Ｄ１．Ｈ１．１（同Ｎｏ．
２）とＤ１．Ｂ１２（同Ｎｏ．３）からなるグループ、
Ａ５．Ｈ１１．１（同Ｎｏ．４）のグループ、およびＤ
１．Ｃ２．１（同Ｎｏ．１０）のグループに分類される
と考えられる。
のように実施した。９６穴マイクロタイタープレート
に、精製ラットＰＡＩ−１を物理的吸着により固相化
し、これに一定量のビオチン標識モノクローナル抗体
と、非標識モノクローナル抗体（０.０１〜１００μｇ
／ｍｌもしくは０μｇ／ｍｌ）を添加して競合反応させ
た。ウェルを洗浄した後、ＡＢＣキット（アビジン溶液
およびビオチン化ペルオキシダーゼ溶液を用いるビオチ
ン化抗体検出用キット、ベクスタイン社製）および発色
基質ＴＭＢlueを用いて、固相化ＰＡＩ−１に結合した
ビオチン標識モノクローナル抗体量を吸光度により測定
し、競合（交差反応）の有無を判定した。それらの結果
を図２および図３に示した。ビオチン標識したモノクロ
ーナル抗体 Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）、Ｄ
１．Ｂ１２（同Ｎｏ．３）、Ｃ２．Ｆ５．１（同Ｎｏ．
６）およびＡ５．Ｆ１１．２（同Ｎｏ．９）は、いずれ
も単独では用量依存的に固相化ラットＰＡＩ−１と反応
することが確認された。これらビオチン標識したモノク
ローナル抗体の各々に対して、実施例１で得られた１０
種類のモノクローナル抗体（非標識）各々を組み合わせ
て競合反応させた。その結果、抗体Ｎｏ．３に対して
は、図２および図３に示したとおり、抗体Ｎｏ．２およ
び抗体Ｎｏ．１０が競合し、固相化ＰＡＩ−１との結合
を阻害した。このことから抗体Ｎｏ．２、抗体Ｎｏ．
３、抗体Ｎｏ．１０は認識するエピトープが同じかある
いは近傍であると考えられた。また、この結果と他のビ
オチン標識モノクローナル抗体に対して同様に行った競
合反応の結果から、実施例１で得られた１０種類のモノ
クローナル抗体は、認識部位の差異により４つのグルー
プ、すなわち、Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）、Ｂ
２．Ｂ１０．１（同Ｎｏ．５）、Ｃ２．Ｆ５．１（同Ｎ
ｏ．６）、Ｃ２．Ｆ５．２（同Ｎｏ．７）、Ｃ２．Ｈ１
０．２（同Ｎｏ．８）およびＡ５．Ｆ１１．２（同Ｎ
ｏ．９）からなるグループ、Ｄ１．Ｈ１．１（同Ｎｏ．
２）とＤ１．Ｂ１２（同Ｎｏ．３）からなるグループ、
Ａ５．Ｈ１１．１（同Ｎｏ．４）のグループ、およびＤ
１．Ｃ２．１（同Ｎｏ．１０）のグループに分類される
と考えられる。
【００３９】実施例５ 抗ラットＰＡＩモノクローナル
抗体のヒトＰＡＩ−１との交差反応性 ヒトＰＡＩ−１を含むことが知られているヒト血小板お
よびヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の培養上清を用い
て、抗ラットＰＡＩモノクローナル抗体の交差反応性を
以下のように試験した。ヒト血小板は、３.８％クエン
酸ナトリウムを１／１０容添加して採取した血液より遠
心により調製し、得られた血小板を１０ｍＭＨＥＰＥＳ
（pＨ７.４）により洗浄した。これに２％ＳＤＳ／１０
ｍＭＨＥＰＥＳを０.５ｍｌ加えて超音波処理すること
により可溶化し、可溶化液をサンプルとした。ヒト線維
肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）お
よびラットヘパトーマＨＴＣ細胞株は、１０％新生仔牛
血清および１％非必須アミノ酸含有ＭＥＭ増殖用培地を
用い、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中にて３〜４
日間培養し、コンフルエントになった後培地を除去して
細胞をＰＢＳで洗浄した。この細胞に無血清培地４０ｍ
ｌを添加し、さらに最終濃度１０-7Ｍとなるようデキサ
メタゾンを加えた。これを２４時間培養して、培養上清
を採取し、サンプルとした。これらサンプルをＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、以下、実施例２に記載した方法に準じ
て、ウェスタンブロッティングを行なった。抗体として
は、実施例５に準じて調製した酵素標識抗ラットＰＡＩ
−１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２を用い、発色基質
はＤＡＢ（ＤＡＢ／Ｈ2Ｏ2）を用いた。その結果を図４
に示した。ラットＨＴＣ細胞培養上清については、５２
ｋｄ付近にバンドが認められたが、ヒト血小板、および
ヒト細胞株ＨＴ１０８０の培養上清については、バンド
を検出できなかった。この結果から、ハイブリドーマＤ
１−Ｂ１２は、ラットＰＡＩ−１に対して高い選択性を
有し、ヒトＰＡＩ−１とは結合しないと考えられる。
抗体のヒトＰＡＩ−１との交差反応性 ヒトＰＡＩ−１を含むことが知られているヒト血小板お
よびヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の培養上清を用い
て、抗ラットＰＡＩモノクローナル抗体の交差反応性を
以下のように試験した。ヒト血小板は、３.８％クエン
酸ナトリウムを１／１０容添加して採取した血液より遠
心により調製し、得られた血小板を１０ｍＭＨＥＰＥＳ
（pＨ７.４）により洗浄した。これに２％ＳＤＳ／１０
ｍＭＨＥＰＥＳを０.５ｍｌ加えて超音波処理すること
により可溶化し、可溶化液をサンプルとした。ヒト線維
肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）お
よびラットヘパトーマＨＴＣ細胞株は、１０％新生仔牛
血清および１％非必須アミノ酸含有ＭＥＭ増殖用培地を
用い、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中にて３〜４
日間培養し、コンフルエントになった後培地を除去して
細胞をＰＢＳで洗浄した。この細胞に無血清培地４０ｍ
ｌを添加し、さらに最終濃度１０-7Ｍとなるようデキサ
メタゾンを加えた。これを２４時間培養して、培養上清
を採取し、サンプルとした。これらサンプルをＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、以下、実施例２に記載した方法に準じ
て、ウェスタンブロッティングを行なった。抗体として
は、実施例５に準じて調製した酵素標識抗ラットＰＡＩ
−１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２を用い、発色基質
はＤＡＢ（ＤＡＢ／Ｈ2Ｏ2）を用いた。その結果を図４
に示した。ラットＨＴＣ細胞培養上清については、５２
ｋｄ付近にバンドが認められたが、ヒト血小板、および
ヒト細胞株ＨＴ１０８０の培養上清については、バンド
を検出できなかった。この結果から、ハイブリドーマＤ
１−Ｂ１２は、ラットＰＡＩ−１に対して高い選択性を
有し、ヒトＰＡＩ−１とは結合しないと考えられる。
【００４０】実施例６ モノクローナル抗体を用いたラ
ットＰＡＩ−１の免疫化学的定量法 （１）サンドウィッチエンザイムイムノアッセイによる
定量 抗原認識部位の異なる二つのモノクローナル抗体を用い
て、サンドウィッチ型の酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと
略）によりＰＡＩ−１の定量を実施した。実施例１で得
られた１０種のモノクローナル抗体のうち、異なるエピ
トープを認識する２種類の抗体を組み合わせることと
し、また、生体内のＰＡＩ−１を測定することを考慮し
てフリー型ＰＡＩ−１だけでなくｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１
複合体とも高い反応性を示す抗体を選出した。このよう
な抗体組合せの例として、Ｄ１．Ｂ１２とＢ２Ｈ１２．
２を組合せ、Ｄ１．Ｂ１２を固相化し、Ｂ２Ｈ１２．２
をペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ’として用いたサンドウ
ィッチＥＩＡを実施した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａ
ｂ’は、イシカワらの方法〔Journal of Immunoassay、
第4巻、209−227頁、1983年〕に準じ、以下のようにモ
ノクローナル抗体をペプシンで消化、還元後Ｆａｂ’フ
ラグメントとＨＲＰを結合することにより調製した。
ットＰＡＩ−１の免疫化学的定量法 （１）サンドウィッチエンザイムイムノアッセイによる
定量 抗原認識部位の異なる二つのモノクローナル抗体を用い
て、サンドウィッチ型の酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと
略）によりＰＡＩ−１の定量を実施した。実施例１で得
られた１０種のモノクローナル抗体のうち、異なるエピ
トープを認識する２種類の抗体を組み合わせることと
し、また、生体内のＰＡＩ−１を測定することを考慮し
てフリー型ＰＡＩ−１だけでなくｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１
複合体とも高い反応性を示す抗体を選出した。このよう
な抗体組合せの例として、Ｄ１．Ｂ１２とＢ２Ｈ１２．
２を組合せ、Ｄ１．Ｂ１２を固相化し、Ｂ２Ｈ１２．２
をペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ’として用いたサンドウ
ィッチＥＩＡを実施した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａ
ｂ’は、イシカワらの方法〔Journal of Immunoassay、
第4巻、209−227頁、1983年〕に準じ、以下のようにモ
ノクローナル抗体をペプシンで消化、還元後Ｆａｂ’フ
ラグメントとＨＲＰを結合することにより調製した。
【００４１】＜Ｆ（ａｂ'）2の調製＞抗ラットＰＡＩ−
１モノクローナル抗体Ｂ２．Ｈ１２．２（ＩgＧ２a）１
０ｍｇについて、セントリコン−３０を用いて０.１Ｍ
クエン酸緩衝液（pＨ４.１）に溶媒交換し、最終容量を
０.８ｍｌにした後、これにブタ胃ペプシン（Ｓigma社
製）１.２５ｍｇを添加した。３７℃で２時間インキュ
ベーションした後、１Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ８.５）
０.１ｍｌを添加することにより反応を停止した。これ
を、０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.０）で平衡化したセ
ファクリル２００ＨＲ（２.５×７０ｃｍ）（Ｐharmaci
a社製）でゲルろ過し、Ｆ（ａｂ'）2を含む画分を得
た。これをセントリコン−３０を用いて０.１Ｍリン酸
緩衝液（pＨ６.０）に溶媒交換し、濃縮して最終容量を
１.３５ｍｌとした。 ＜Ｆａｂ'の調製＞上記で得たＦ（ａｂ'）2 ５.４ｍｇ
／１.３５ｍｌに、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノール
アミン・ＨＣｌおよび１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む
０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）１５０μｌを添加
し、３７℃で１１０分間反応させた。その後、５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）で平
衡化したセファクリル２００ＨＲ（Ｐharmacia社製）で
ゲルろ過し、Ｆａｂ'を含む画分を得た。これをセント
リコン−３０を用いて濃縮し、得られたＦａｂ'溶液を
以下用いた。 ＜ＨＲＰ標識Ｆａｂ'の調製＞西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ；Ｈorseradish peroxidase、ベーリンガ
ーマンハイム社製、ＥＩＡ用）６.７ｍｇとＳulfo−Ｓ
ＭＣＣ（Ｐierce社製）１.２ｍｇとを０.１Ｍリン酸緩
衝液（pＨ７.０）中、３０℃、６０分間インキュベート
して反応させた。反応液をゲルろ過した後、ペルオキシ
ダーゼを含む分画を４０３ｎｍの吸光度により確認し、
セントリコン−３０を用いて濃縮した。得られたマレイ
ミド・ペルオキシダーゼ２.５２ｍｇと前記で得たＦａ
ｂ'２.６９ｍｇを０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）中
で混合して４℃、１６時間反応させた。反応液をゲルろ
過し、ＨＲＰ標識Ｆａｂ'化抗ラットＰＡＩ−１モノク
ローナル抗体ｍＡｂ１を得た。
１モノクローナル抗体Ｂ２．Ｈ１２．２（ＩgＧ２a）１
０ｍｇについて、セントリコン−３０を用いて０.１Ｍ
クエン酸緩衝液（pＨ４.１）に溶媒交換し、最終容量を
０.８ｍｌにした後、これにブタ胃ペプシン（Ｓigma社
製）１.２５ｍｇを添加した。３７℃で２時間インキュ
ベーションした後、１Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ８.５）
０.１ｍｌを添加することにより反応を停止した。これ
を、０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.０）で平衡化したセ
ファクリル２００ＨＲ（２.５×７０ｃｍ）（Ｐharmaci
a社製）でゲルろ過し、Ｆ（ａｂ'）2を含む画分を得
た。これをセントリコン−３０を用いて０.１Ｍリン酸
緩衝液（pＨ６.０）に溶媒交換し、濃縮して最終容量を
１.３５ｍｌとした。 ＜Ｆａｂ'の調製＞上記で得たＦ（ａｂ'）2 ５.４ｍｇ
／１.３５ｍｌに、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノール
アミン・ＨＣｌおよび１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む
０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）１５０μｌを添加
し、３７℃で１１０分間反応させた。その後、５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）で平
衡化したセファクリル２００ＨＲ（Ｐharmacia社製）で
ゲルろ過し、Ｆａｂ'を含む画分を得た。これをセント
リコン−３０を用いて濃縮し、得られたＦａｂ'溶液を
以下用いた。 ＜ＨＲＰ標識Ｆａｂ'の調製＞西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ；Ｈorseradish peroxidase、ベーリンガ
ーマンハイム社製、ＥＩＡ用）６.７ｍｇとＳulfo−Ｓ
ＭＣＣ（Ｐierce社製）１.２ｍｇとを０.１Ｍリン酸緩
衝液（pＨ７.０）中、３０℃、６０分間インキュベート
して反応させた。反応液をゲルろ過した後、ペルオキシ
ダーゼを含む分画を４０３ｎｍの吸光度により確認し、
セントリコン−３０を用いて濃縮した。得られたマレイ
ミド・ペルオキシダーゼ２.５２ｍｇと前記で得たＦａ
ｂ'２.６９ｍｇを０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.０）中
で混合して４℃、１６時間反応させた。反応液をゲルろ
過し、ＨＲＰ標識Ｆａｂ'化抗ラットＰＡＩ−１モノク
ローナル抗体ｍＡｂ１を得た。
【００４２】＜精製ＰＡＩ−１のＥＩＡによる測定＞９
６穴マイクロタイタープレート（Ｎunc社製；Ｍaxi Ｓo
rp）に、抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｄ１．
Ｂ１２を添加（４５０ｎｇ／１００μｌ／穴）し、４℃
下一晩放置することにより抗体を物理的に吸着させて固
相化した。固相化プレートを０.１％ツイーン２０含有
ＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）で５回洗浄後、市販のブロ
ッキング用液（商品名：Ｂlock Ａce、大日本製薬社
製）でブロッキングした。同様にプレートを洗浄後、
０.１牛血清アルブミン含有ＰＢＳツイーンで１.９５〜
１２５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した活性化ラットＰＡＩ
−１を添加し、室温で３時間もしくは４℃で１６時間反
応させた。プレートを洗浄後、前記で得たＨＲＰ標識Ｆ
ａｂ'化抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｂ２．
Ｈ１２．２を添加し、室温で２時間反応させた。洗浄
後、２００μｌの発色基質ＴＭＢｌｕｅを添加し２５分
間室温で振とうした。５０μｌの１Ｎ硫酸を添加して反
応を停止させた後、マイクロプレートリーダーで、吸光
度を測定した（波長４５０ｎｍ／６００ｎｍ）。その結
果、図５に示したように、１.９５〜１２５ｎｇ／ｍｌ
の範囲で精製ラットＰＡＩ−１を測定することが可能で
あった。このようなモノクローナル抗体組合せを用いた
サンドイッチＥＩＡにより、フリー型のＰＡＩ−１（ｔ
−ＰＡとの複合体を形成していないＰＡＩ−１）および
ＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体の定量測定が可能と考えら
れる。
６穴マイクロタイタープレート（Ｎunc社製；Ｍaxi Ｓo
rp）に、抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｄ１．
Ｂ１２を添加（４５０ｎｇ／１００μｌ／穴）し、４℃
下一晩放置することにより抗体を物理的に吸着させて固
相化した。固相化プレートを０.１％ツイーン２０含有
ＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）で５回洗浄後、市販のブロ
ッキング用液（商品名：Ｂlock Ａce、大日本製薬社
製）でブロッキングした。同様にプレートを洗浄後、
０.１牛血清アルブミン含有ＰＢＳツイーンで１.９５〜
１２５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した活性化ラットＰＡＩ
−１を添加し、室温で３時間もしくは４℃で１６時間反
応させた。プレートを洗浄後、前記で得たＨＲＰ標識Ｆ
ａｂ'化抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｂ２．
Ｈ１２．２を添加し、室温で２時間反応させた。洗浄
後、２００μｌの発色基質ＴＭＢｌｕｅを添加し２５分
間室温で振とうした。５０μｌの１Ｎ硫酸を添加して反
応を停止させた後、マイクロプレートリーダーで、吸光
度を測定した（波長４５０ｎｍ／６００ｎｍ）。その結
果、図５に示したように、１.９５〜１２５ｎｇ／ｍｌ
の範囲で精製ラットＰＡＩ−１を測定することが可能で
あった。このようなモノクローナル抗体組合せを用いた
サンドイッチＥＩＡにより、フリー型のＰＡＩ−１（ｔ
−ＰＡとの複合体を形成していないＰＡＩ−１）および
ＰＡＩ−１／ｔ−ＰＡ複合体の定量測定が可能と考えら
れる。
【００４３】（２）固相化ｔ−ＰＡを用いた活性型ＰＡ
Ｉ−１の定量 固相化ｔ−ＰＡ利用し、実施例２の（２）記載の方法に
準じて以下のように、活性型ＰＡＩ−１の定量を行なっ
た。この活性型ＰＡＩ−１の定量方法は、レイモンドら
の方法〔RAYMOND R. et. al., J. Lab. Clin. Med. 106
（4） 408−415（1985）〕を参考に実施した。９６ウェ
ルマイクロタイタープレートにｔ−ＰＡを物理的に吸着
させ、得られたｔ−ＰＡ固相化プレートに、１.９５〜
１２５ｎｇ／ｍｌの活性化ラットＰＡＩ−１溶液の１０
０μｌを添加し、一定時間反応させた。プレートを洗浄
した後、ＨＲＰ標識Ｆａｂ'抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）
を添加し、固相化ｔ−ＰＡと複合体形成したＰＡＩ−１
を定量する。この方法により定量されるＰＡＩ−１は、
ｔ−ＰＡと複合体を形成した後に測定しているため活性
型ＰＡＩ−１である。その測定結果を図６に示した。こ
の結果から、３.９５〜１２５ｎｇ／ｍｌの範囲で活性
型ラットＰＡＩ−１を測定することが可能であった
Ｉ−１の定量 固相化ｔ−ＰＡ利用し、実施例２の（２）記載の方法に
準じて以下のように、活性型ＰＡＩ−１の定量を行なっ
た。この活性型ＰＡＩ−１の定量方法は、レイモンドら
の方法〔RAYMOND R. et. al., J. Lab. Clin. Med. 106
（4） 408−415（1985）〕を参考に実施した。９６ウェ
ルマイクロタイタープレートにｔ−ＰＡを物理的に吸着
させ、得られたｔ−ＰＡ固相化プレートに、１.９５〜
１２５ｎｇ／ｍｌの活性化ラットＰＡＩ−１溶液の１０
０μｌを添加し、一定時間反応させた。プレートを洗浄
した後、ＨＲＰ標識Ｆａｂ'抗ラットＰＡＩ−１マウス
モノクローナル抗体Ｂ２．Ｈ１２．２（抗体Ｎｏ．１）
を添加し、固相化ｔ−ＰＡと複合体形成したＰＡＩ−１
を定量する。この方法により定量されるＰＡＩ−１は、
ｔ−ＰＡと複合体を形成した後に測定しているため活性
型ＰＡＩ−１である。その測定結果を図６に示した。こ
の結果から、３.９５〜１２５ｎｇ／ｍｌの範囲で活性
型ラットＰＡＩ−１を測定することが可能であった
【００４４】実施例７ 抗ラットＰＡＩ−１モノクロー
ナル抗体を用いた組織中ＰＡＩ−１の検出 （１）ラット組織中ＰＡＩ−１のウェスタンブロティン
グによる検出 エーテル麻酔下リポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｓigma
社製）を５０μｇ／ｋｇ静脈内投与し、投与後３、６、
２４時間にペントバルビタール麻酔下、腹部大動脈より
採血後、右心室より生理食塩水を点滴（１１０ｃｍＨ2
Ｏ）し、３分間かん流した。その後直ぐに各種組織（大
動脈、腎、肝）を摘出し凍結した。組織１００ｍｇ当た
り２ｍｌの可溶化緩衝液（０.１５Ｍ−ＮaＣl、１％Ｓ
ＤＳ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ・２Ｎaを含む５０ｍＭ ト
リス−ＨＣl緩衝液、pＨ７.４）を加え、ポッター型ガ
ラスホモジナイザーで、蛋白を可溶化し抽出した後、抽
出液を遠心分離し上清を得た。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分離した後、これをＰＶＤＦ膜に転写した。これをブ
ロッキングした後、一次抗体として抗ラットＰＡＩ−１
マウスモノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２、二次抗体にＨ
ＲＰ標識抗マウスＩgＧヤギＩgＧ（カッペル社製）を用
い、順次反応させた後、ＤＡＢとＨ2Ｏ2で発色させた。
その結果、ラット大動脈、腎および肝の組織中ＰＡＩ−
１に相当する蛋白を特異的に検出できた。大動脈組織に
おいては、ＬＰＳ投与３時間後でＰＡＩ−１抗原が検出
され始め６時間後で最も産生量が増大しているのが明確
に観察できた。この結果を図８に示した。一方、モノク
ローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２にかえて、抗ラットＰＡＩ−
１ウサギＩgＧ（Ａmerican diagnosis社製）（市販ポリ
クローナル抗体）を用い、同様に検出を試みたが、ラッ
ト大動脈組織中のＰＡＩ−１を検出することはできなか
った。
ナル抗体を用いた組織中ＰＡＩ−１の検出 （１）ラット組織中ＰＡＩ−１のウェスタンブロティン
グによる検出 エーテル麻酔下リポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｓigma
社製）を５０μｇ／ｋｇ静脈内投与し、投与後３、６、
２４時間にペントバルビタール麻酔下、腹部大動脈より
採血後、右心室より生理食塩水を点滴（１１０ｃｍＨ2
Ｏ）し、３分間かん流した。その後直ぐに各種組織（大
動脈、腎、肝）を摘出し凍結した。組織１００ｍｇ当た
り２ｍｌの可溶化緩衝液（０.１５Ｍ−ＮaＣl、１％Ｓ
ＤＳ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ・２Ｎaを含む５０ｍＭ ト
リス−ＨＣl緩衝液、pＨ７.４）を加え、ポッター型ガ
ラスホモジナイザーで、蛋白を可溶化し抽出した後、抽
出液を遠心分離し上清を得た。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分離した後、これをＰＶＤＦ膜に転写した。これをブ
ロッキングした後、一次抗体として抗ラットＰＡＩ−１
マウスモノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２、二次抗体にＨ
ＲＰ標識抗マウスＩgＧヤギＩgＧ（カッペル社製）を用
い、順次反応させた後、ＤＡＢとＨ2Ｏ2で発色させた。
その結果、ラット大動脈、腎および肝の組織中ＰＡＩ−
１に相当する蛋白を特異的に検出できた。大動脈組織に
おいては、ＬＰＳ投与３時間後でＰＡＩ−１抗原が検出
され始め６時間後で最も産生量が増大しているのが明確
に観察できた。この結果を図８に示した。一方、モノク
ローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２にかえて、抗ラットＰＡＩ−
１ウサギＩgＧ（Ａmerican diagnosis社製）（市販ポリ
クローナル抗体）を用い、同様に検出を試みたが、ラッ
ト大動脈組織中のＰＡＩ−１を検出することはできなか
った。
【００４５】（２）免疫組織染色による組織中ＰＡＩ−
１の検出 組織中ＰＡＩ−１の検出には、前記実施例６の（１）に
準じてＨＲＰ標識Ｆａｂ'に調製した抗ラットＰＡＩ−
１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２を用い、以下のよう
に、免疫組織染色を実施した。前記（１）と同様にし
て、ＬＰＳ投与ラットから摘出した各種組織（大動脈、
肝、腎）を、直ちにティシュウ−テック・オー・シィ・
ティ・コンパウンド（Ｔissue−Ｔek Ｏ.Ｃ.Ｔ．Ｃompo
und、商品名、マイルス三共製）に包埋し、ドライアイ
ス中で凍結した。包埋した組織からは、ミクロトーム・
クリオスタットを用いて１０μｍ厚の凍結切片を作製
し、アミノプロピルトリエトキシシランコートグラス
（松浪硝子製）に貼付し、免疫組織化学用検査材料とし
た。凍結切片を、冷アセトン固定後、内因性ペルオキシ
ダーゼ活性阻止するためＨ2Ｏ2添加メタノールで処理
し、また非特異的吸着を防止するため１０％正常マウス
血清を添加したブロッキング用液（商品名：Ｂlock Ａc
e、大日本製薬社製）にて処理した後、ＨＲＰ標識抗ラ
ットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２（Ｆａ
ｂ’フラグメント）と４℃一晩反応させた。これをＰＢ
Ｓで洗浄後、ＤＡＤ／Ｈ2Ｏ2で発色させた。対比染色と
してはメチルグリーン染色を行った。コントロールとし
ては、特異抗体の代わりに希釈非免疫ＢＡＬＢ／ｃ マ
ウス血清を用いて同様にして免疫組織染色を実施した。
その結果、抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体を用
いた免疫組織染色では、大動脈、肝、腎に陽性像が見ら
れた。特に大動脈内膜では強い陽性像が認められた。一
方、コントロールとして非特異的血清を用いた染色で
は、いずれの臓器においても陽性像は認められなかっ
た。以上（１）および（２）の結果から本発明の実施例
で得られた抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体は、
分離精製したラットＰＡＩ−１のみならず、ラット生体
組織中のＰＡＩ−１とも特異的に結合し、組織中のＰＡ
Ｉ−１検出のために実際に使用可能であることがわかっ
た。
１の検出 組織中ＰＡＩ−１の検出には、前記実施例６の（１）に
準じてＨＲＰ標識Ｆａｂ'に調製した抗ラットＰＡＩ−
１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２を用い、以下のよう
に、免疫組織染色を実施した。前記（１）と同様にし
て、ＬＰＳ投与ラットから摘出した各種組織（大動脈、
肝、腎）を、直ちにティシュウ−テック・オー・シィ・
ティ・コンパウンド（Ｔissue−Ｔek Ｏ.Ｃ.Ｔ．Ｃompo
und、商品名、マイルス三共製）に包埋し、ドライアイ
ス中で凍結した。包埋した組織からは、ミクロトーム・
クリオスタットを用いて１０μｍ厚の凍結切片を作製
し、アミノプロピルトリエトキシシランコートグラス
（松浪硝子製）に貼付し、免疫組織化学用検査材料とし
た。凍結切片を、冷アセトン固定後、内因性ペルオキシ
ダーゼ活性阻止するためＨ2Ｏ2添加メタノールで処理
し、また非特異的吸着を防止するため１０％正常マウス
血清を添加したブロッキング用液（商品名：Ｂlock Ａc
e、大日本製薬社製）にて処理した後、ＨＲＰ標識抗ラ
ットＰＡＩ−１モノクローナル抗体Ｄ１．Ｂ１２（Ｆａ
ｂ’フラグメント）と４℃一晩反応させた。これをＰＢ
Ｓで洗浄後、ＤＡＤ／Ｈ2Ｏ2で発色させた。対比染色と
してはメチルグリーン染色を行った。コントロールとし
ては、特異抗体の代わりに希釈非免疫ＢＡＬＢ／ｃ マ
ウス血清を用いて同様にして免疫組織染色を実施した。
その結果、抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体を用
いた免疫組織染色では、大動脈、肝、腎に陽性像が見ら
れた。特に大動脈内膜では強い陽性像が認められた。一
方、コントロールとして非特異的血清を用いた染色で
は、いずれの臓器においても陽性像は認められなかっ
た。以上（１）および（２）の結果から本発明の実施例
で得られた抗ラットＰＡＩ−１モノクローナル抗体は、
分離精製したラットＰＡＩ−１のみならず、ラット生体
組織中のＰＡＩ−１とも特異的に結合し、組織中のＰＡ
Ｉ−１検出のために実際に使用可能であることがわかっ
た。
【００４６】参考例１ ＲＦＡによるＰＡＩ−１活性の
検出 リバースフィブリンオートグラフィー（ＲＦＡ；revers
e fibrin autography）によるＰＡＩ−１活性の検出
は、グラネリ−ピペルノ（Ｇranelli−Ｐiperno）らの
方法〔Journal of Experimental Medicine、第148巻、2
23−234頁、1978年〕に準じて以下のように実施した。 ＜フィブリンプレートの作製＞リバースフィブリンオー
トグラフィー用のフィブリンプレートを以下のように調
製した。すなわち、アガロースを２％になるようにＰＢ
Ｓに入れ加熱融解して調製し４２℃に保温した溶液（溶
液Ａ）と、ウシトロンビン（三共社製）を０.６Ｕ／ｍ
ｌになるようにＰＢＳで希釈し４２℃に保温した溶液
（溶液Ｂ）とを混合した後、ウシプラスミノーゲン（Ｓ
igma社製）（最終濃度０.０６２５Ｕ／ｍｌ）と一本鎖
（single-chain）のヒトｔ−ＰＡ（Ｂiopool社製）（最
終濃度０．６ＩＵ／ｍｌ）を加えた。最後に、あらかじ
め３７℃で保温したＰＢＳに１％となるようにウシフィ
ブリノーゲン（プラスミノーゲン−リッチ）（Ｓigma社
製）を加えて溶解した後濾過をして調製した溶液（溶液
Ｃ）を添加し、すばやく撹拌した後、角シャーレに注ぎ
ゲル化させた。 ＜ＲＦＡ＞被験サンプルについて、１０％アクリルアミ
ドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、泳動後
のゲルを２．５％トリトンＸ−１００含有０．１５ＭＮ
ａＣｌ−０．０５Ｍ トリス・ＨＣl（pＨ７.５）溶液
に浸し、２時間おだやかに振とうした。このゲルを精製
水で２回洗浄した後、前記のフィブリンプレート上にの
せ、水浴中３０℃で３時間インキュベートした。ＰＡＩ
−１活性は、フィブリン分解の抑制によりプレート上
（５０ｋＤ前後の位置）に生じる白色バンドとして検出
される。また、被験サンプル中の潜在型（不活性）ＰＡ
Ｉ−１は、ＳＤＳ処理により活性化される。
検出 リバースフィブリンオートグラフィー（ＲＦＡ；revers
e fibrin autography）によるＰＡＩ−１活性の検出
は、グラネリ−ピペルノ（Ｇranelli−Ｐiperno）らの
方法〔Journal of Experimental Medicine、第148巻、2
23−234頁、1978年〕に準じて以下のように実施した。 ＜フィブリンプレートの作製＞リバースフィブリンオー
トグラフィー用のフィブリンプレートを以下のように調
製した。すなわち、アガロースを２％になるようにＰＢ
Ｓに入れ加熱融解して調製し４２℃に保温した溶液（溶
液Ａ）と、ウシトロンビン（三共社製）を０.６Ｕ／ｍ
ｌになるようにＰＢＳで希釈し４２℃に保温した溶液
（溶液Ｂ）とを混合した後、ウシプラスミノーゲン（Ｓ
igma社製）（最終濃度０.０６２５Ｕ／ｍｌ）と一本鎖
（single-chain）のヒトｔ−ＰＡ（Ｂiopool社製）（最
終濃度０．６ＩＵ／ｍｌ）を加えた。最後に、あらかじ
め３７℃で保温したＰＢＳに１％となるようにウシフィ
ブリノーゲン（プラスミノーゲン−リッチ）（Ｓigma社
製）を加えて溶解した後濾過をして調製した溶液（溶液
Ｃ）を添加し、すばやく撹拌した後、角シャーレに注ぎ
ゲル化させた。 ＜ＲＦＡ＞被験サンプルについて、１０％アクリルアミ
ドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、泳動後
のゲルを２．５％トリトンＸ−１００含有０．１５ＭＮ
ａＣｌ−０．０５Ｍ トリス・ＨＣl（pＨ７.５）溶液
に浸し、２時間おだやかに振とうした。このゲルを精製
水で２回洗浄した後、前記のフィブリンプレート上にの
せ、水浴中３０℃で３時間インキュベートした。ＰＡＩ
−１活性は、フィブリン分解の抑制によりプレート上
（５０ｋＤ前後の位置）に生じる白色バンドとして検出
される。また、被験サンプル中の潜在型（不活性）ＰＡ
Ｉ−１は、ＳＤＳ処理により活性化される。
【図１】 本発明のモノクローナル抗体のラットＰＡＩ
−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和作用を示すグラ
フ。
−１のｔ−ＰＡ阻害活性に対する中和作用を示すグラ
フ。
【図２】 本発明のモノクローナル（抗体Ｎｏ．１〜
５）の抗体Ｎｏ．３との競合性（交差反応性）試験結果
を示すグラフ。
５）の抗体Ｎｏ．３との競合性（交差反応性）試験結果
を示すグラフ。
【図３】 本発明のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．６
〜１０）の抗体Ｎｏ．３との競合性（交差反応性）試験
結果を示すグラフ。
〜１０）の抗体Ｎｏ．３との競合性（交差反応性）試験
結果を示すグラフ。
【図４】 ヒト血小板、ＨＴ１０８０培養上清およびＨ
ＴＣ培養上清中本発明のモノクローナル（抗体Ｎｏ．
３）を用いたウエスタンブロッティングによる検出にお
ける電気泳動写真。
ＴＣ培養上清中本発明のモノクローナル（抗体Ｎｏ．
３）を用いたウエスタンブロッティングによる検出にお
ける電気泳動写真。
【図５】 本発明のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．
１）によるラットＰＡＩ−１測定の検量線。
１）によるラットＰＡＩ−１測定の検量線。
【図６】 本発明のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．
１）による活性型ＰＡＩ−１測定の検量線。
１）による活性型ＰＡＩ−１測定の検量線。
【図７】 本発明のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．
３）を用いたラット大動脈ＰＡＩ−１のウエスタンブロ
ッティングによる検出結果を示す電気泳動写真。
３）を用いたラット大動脈ＰＡＩ−１のウエスタンブロ
ッティングによる検出結果を示す電気泳動写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大谷 章雄 埼玉県川口市並木１丁目６番35−519号
Claims (15)
- 【請求項１】 ラットＰＡＩ−１（タイプ１プラスミノ
ーゲンアクチベーターインヒビター）と特異的に結合す
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ラットＰＡＩ−１とｔ−ＰＡ（組織型プ
ラスミノーゲンアクチベーター）との複合体と特異的に
結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ラットＰＡＩ−１の活性を中和する作用
を有する請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒトＰＡＩ−１とは結合しない請求項１
または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 マウスＩｇＧである請求項１または２記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 ハイブリドーマ細胞株Ｄ１．Ｂ１２−３
（生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
６５８号）が産生する請求項１または２記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項７】 ラットＰＡＩ−１で免疫感作した哺乳動
物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合さ
せて得られた、請求項１〜６のいずれかの項に記載のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項８】 免疫感作に使用されるラットＰＡＩ−１
が、ラットヘパトーマ由来であることを特徴とする請求
項７記載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】 免疫感作に使用されるラットＰＡＩ−１
が、デキサメタゾン処理されたＨＴＣ細胞の培養液から
精製単離された、ｔ−ＰＡの活性阻害作用を有する分子
量約５２０００ダルトンの物質であることを特徴とする
請求項８記載のハイブリドーマ。 - 【請求項１０】 ハイブリドーマ細胞株Ｄ１．Ｂ１２−
３（生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
５６５８号）。 - 【請求項１１】 請求項１〜６記載のモノクローナル抗
体を用いることを特徴とするラットＰＡＩ−１の検出ま
たは定量法。 - 【請求項１２】 ラットＰＡＩ−１に対する抗原認識部
位が互いに異なる２種類のモノクローナル抗体を用いた
酵素免疫測定法である請求項１１記載の検出または定量
法。 - 【請求項１３】 ラット組織中のＰＡＩ−１を免疫組織
化学的に検出する請求項１１記載の検出または定量法。 - 【請求項１４】 （１）ラットＰＡＩ−１と特異的に結
合するモノクローナル抗体（第１抗体）を固相化し、こ
の固相化したモノクローナル抗体に、被験試料を接触せ
しめて、該モノクローナル抗体と被験試料中のラットＰ
ＡＩ−１を結合させる工程、（２）ラットＰＡＩ−１と
特異的に結合し、第１抗体とは抗原認識部位が異なるモ
ノクローナル抗体（第２抗体）もしくはラットＰＡＩ−
１に対するポリクローナル抗体（第２'抗体）であっ
て、必要に応じて標識物で標識された第２もしくは第
２'抗体を、（１）で得られた結合物に結合させる工
程、（３）工程（２）で用いる抗体が標識物で標識され
ていない場合は、（２）で得られた結合物にさらに、第
２抗体もしくは第２'抗体を認識しかつ標識物で標識さ
れた抗体（第３抗体）を結合させる工程、および（４）
標識物の活性を測定する工程を含むことを特徴とする、
請求項１１記載の検出または定量法。 - 【請求項１５】 （１）ラットＰＡＩ−１と複合体を形
成し得るｔ−ＰＡを固相化し、この固相化したｔ−ＰＡ
に、被験試料を接触せしめて、該ｔ−ＰＡと被験試料中
のラットＰＡＩ−１を結合させる工程、（２）ラットＰ
ＡＩ−１と特異的に結合し、かつ必要に応じて標識物で
標識されたモノクローナル抗体を、（１）で得られた結
合物に結合させる工程、（３）工程（２）で用いる抗体
が標識物で標識されていない場合は、（２）で得られた
結合物にさらに、（２）で用いる抗体を認識しかつ標識
物で標識された抗体（第２抗体）を結合させる工程、お
よび（４）標識物の活性を測定する工程を含むことを特
徴とする、請求項１１記載の検出または定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8174675A JPH1014592A (ja) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8174675A JPH1014592A (ja) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014592A true JPH1014592A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=15982737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8174675A Pending JPH1014592A (ja) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1014592A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016529255A (ja) * | 2013-08-13 | 2016-09-23 | サノフイ | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ｐａｉ−１）に対する抗体及びその使用 |
-
1996
- 1996-07-04 JP JP8174675A patent/JPH1014592A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016529255A (ja) * | 2013-08-13 | 2016-09-23 | サノフイ | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ｐａｉ−１）に対する抗体及びその使用 |
| JP2020125333A (ja) * | 2013-08-13 | 2020-08-20 | サノフイＳａｎｏｆｉ | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ｐａｉ−１）に対する抗体及びその使用 |
| JP2021155440A (ja) * | 2013-08-13 | 2021-10-07 | サノフイSanofi | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ｐａｉ−１）に対する抗体及びその使用 |
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