JPH0220567A - アゾ色素配糖体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、多糖加水分解酵素、例えばアミラーゼの活性
を測定するのに有用なアゾ色素配糖体およびその製法に
関する。

［従来技術とその欠点］ グルコース単位のα位に、紫外線または可視光の特定波
長域に特性吸収を有する芳香族環、例えばフェノール、
ｐ−二トロフェノール等が結合しなオリゴ糖誘導体が例
えば、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、１８２゜ｐ、５２５−
５２６　（１９５８）　；　　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｒ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）、　　Ｖｏｌ、
６２．　　Ｎｏ、４．　４３９−４４６　　（１９６）
）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　
Ｖｏｌ、２．　Ｎｏ、５．４１８−４２０（１９６６）
　、特開昭５３−１２３８１号、特開昭５４−５１８９
２号等で知られている。これらの基質は、血液等の生体
液中のマルターゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ等の
多糖加水分解酵素の活性を測定するのに有用である。し
かしこのような基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定
する場合に、光吸収の測定は４１０ｎｍ付近のかなり短
い波長で行う必要があり、試料液例えば血清中に、ビリ
ルビン等の短波長に吸収を有する物質が存在すると、そ
の妨害を受は易い、妨害を除くなめには、いわゆる検体
盲検を行う必要があり、分析操作が煩雑になる。

［解決すべき技術課題］ 本発明は、α−アミラーゼ活性測定において血中の色素
、例えばビリルビンやヘモグロビンによる妨害を受けに
＜＜、簡単な分析操作で、しかも検出感度の高い測定を
可能にする。自己顕色性基質として有用な化合物および
その製法を提供することを、技術的課題とする。

［技術的課題の解決手段］ 上記課題の第１は、下記−最大［Ｉ］で表わされる化合
物により解決された。

［Ｉま ただし、式中Ａはフェニル基またはナフチル基（これら
は置換されていてもよい）、Ｂは置換されていてもよい
ナフチレン基を表す、ｎは０または８までの正の整数を
表わす、ｎは３．４または５であることが好ましい。

一般式［ＩＪ中のＡで表されるフェニル基またはナフチ
ル基は置換基を有してもよく、例えばハロゲン原子（例
えば塩素原子）、ニトロ基、シアノ基、アルカンスルホ
ニル基（炭素原子数４以下が好ましい）、スルホンアミ
ド基もしくはスルファモイル基（炭素原子数１から７が
好ましい〉、アルキル基（炭素原子数４以下が好ましい
）、アルコキシ基もしくはアルキルチオ基（炭素原子数
４以下が好ましく、さらにアルコキシ基等で置換されて
いてもよい）、フェノキシ基（ハロゲン等の置換基を有
していてもよい）、フェニルチオ基等を有してもよい。

一般式［Ｉ］のＢで表されるナフチレン基は無置換また
は置換基を有する１、４−ナフチレン基が好ましい、置
換基は例えばハロゲン原子（例えば塩素原子）、アルキ
ル基（炭素原子数４以下が好ましい）、アルコキシ基も
しくはアルキルチオ基（炭素原子数４以下が好ましく、
さらにアルコキシ基等で置換されていてもよい）、スル
ホンアミド基もしくはスルファモイル基（炭素原子数７
以下が好ましい）、カルボンアミド基もしくはカルバモ
イル基（炭素原子数８以下が好ましい）、ヒドロキシ基
等を有してもよい。

上記課題の第２は以下の方法により解決された。

すなわち、下記−最大［Ｉｃｌ ［Ｉａｌ で表わされるオリゴ糖に次式 ％式％） （Ｒは低級アルキル基を表わす、） で表わされる有機酸無水物を作用させ、得られる下記式
［Ｉｂ］ （ただしＹはＣＯＲを表わす） で表わされる化合物をハロゲン化して、下記式［Ｉｃｌ
で表わされる化合物とし、 ［Ｉｃ’ｌ 安定な化合物は式中の　−〇−Ｎ＝Ｎ−Ａ　　が次に示
す一般式［Ｉ１］で表される場合である。

［Ｉ目 （ただしＸはハロゲンを表わす） これに下記式［Ｉｄ］ ［Ｉｄ］ ＨＯ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ−Ａ で表わされるアゾ色素を作用させて、下記式［Ｉｅｌで
表わされる化合物を得、 ［Ｉｅｌ これを脱アシル化する。

一般式［Ｉ］で表される化合物のうち、比較的Ｒ’、ｒ
（２，Ｒコ、　Ｒ’　、　Ｒ’　、　Ｒ’　、　Ｒ’は
それぞれ水素原子、塩素原子、臭素原子、ニトロ基、メ
タンスルボニル基、エタンスルホニル基、シアノ基、ス
ルホンアミド基もしくはスルファモイル基（炭素原子数
７以下が好ましい）、カルボンアミド基もしくはカルバ
モイル基（炭素原子数８以下が好ましい）、アルコキシ
基（炭素原子数４以下が好ましい）またはアルキルチオ
基（炭素原子数４以下が好ましい）を表す　Ｒｌ　、　
ＲＺの少なくとも一つがスルホンアミド基、スルファモ
イル基、カルボンアミド基またはカルバモイル基、Ｒ３
、Ｒｓ　、　Ｒｔの少なくとも一つが塩素原子、臭素原
子、ニトロ基、メタンスルホニル基、エタンスルホニル
基、シアノ基のような電子吸引性基を表す化合物は、加
水分解の結果放出される色素の吸収極大波長が比較的大
きく、かつ分子吸光係数が大きい、Ｒ’、Ｒ”。

１（３、Ｒ４、Ｒ％　、　）ｊ　＠　、　Ｒ？のいずれ
かが低級アルキル基（炭素数４以下、メチル基、エチル
基等）を表してもよい。

一般式［Ｉ］で表される化合物は、従来α−アミラーゼ
活性測定に広く用いられた基質であるｐニトロフェニル
ペンタオースまたはｐ−ニトロフェニルへ１タオースと
異なり、放出される色素の吸収極大が長波長であるため
、血液中のビリルビン、ヘモグロビン等の妨害を受けに
くい。

−最大［Ｉ１で表される化合物の具体例を以下に示す。

ただし以下の式でＱは、 を表わす〈ｎは３または５を表わす）。

（次ページへ続く） ＮＨＬ：υＬ；、１ｌｓ Ｓ０２ＮＴ。

本発明の化合物の製法における各反応を、以下に詳しく
説明する。

水酸基のアシル化反応： オリゴ糖のアシル化は、公知の方法、例えば反応物とし
ての有機酸無水物中で、好ましくは無水有機酸のアルカ
リ金属塩等の触媒の存在下に加熱処理することによって
行うことができる。

（ＲＣＯ）２０　　で表わされる有機＃ｌＩ無水物は、
例えば無水酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸等である
。触媒としては、無水有機酸のナトリウム塩、カリウム
塩等のアルカリ金属塩、ピリジン、ピコリン等が用いら
れる。

（次ページへ） 反応の調節又は反応後の目的物の精製を容易にするため
、反応溶液に非水溶媒例えばクロロホルム、ジクロロメ
タン等を添加することもできる。

上記反応に使用される有機酸無水物の量は、オリゴ糖の
重量の５〜５０倍、好ましくは７〜１５倍であり、また
触媒として無水有機酸のアルカリ金属塩を使用する場合
は、その量はオリゴ糖の重量の０．５〜３倍、好ましく
は０．５〜１．５倍である。

反応温度は普通は約９０〜１４０℃、好ましくは１００
〜１１０℃である。反応時間は反応温度に影響されるが
、好ましい反応温度条件では約２ないし４時間である０
反応混合物を常法により０〜５°Ｃに冷却し、析出する
固形物を分別し、水洗したのち乾燥する。得られた固体
生成物は、エタノール、メタノール等のアルコール類、
メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類、ジメチル
エーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類等の溶媒を
単独でもしくは組み合わせて使用して再結晶することが
できるが、該固体生成物を十分乾燥してそのまま次の反
応に使用することもできる。

末端のハロゲン化： ハロゲン化はζ無水ハロゲン化水素、塩化アルミニウム
と五塩化リン、又は四塩化チタン、塩化第二スズ等で行
われるが、生成物の収率とこれに関連する副反応の抑制
および目的物の精製の容易さから、例えばクロロホルム
、ジクロロメタン等の低極性非水溶媒中で、無水４ハロ
ゲン化チタンを用いて処理する方法が特に好ましい。

なお無水４ハロゲン化チタンとしては、４塩化チタン、
４臭化チタン、４ヨウ化チタン等を用いることができ、
ヘプタデカアシルマルトペンタオースに対する無水４ハ
ロゲン化チタンの量は、通常は１〜２０倍モルでよく、
３〜８倍モルが好ましい。

このハロゲン化反応は、常圧で室温と使用する溶媒の沸
点との間で行われるが、溶媒の沸点で還流しながら実施
することが特に好ましい０反応時間は反応温度に影響さ
れるが、溶媒の沸点付近で反応させる場合、通常は３０
分ないし１．　　Ｏ時間程度である。

反応混合物を常法により冷却し、これに有ｊａ溶媒例え
ばクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル等を加え
、有機溶媒層を分取し、水、飽和重炭酸ソーダ水溶液等
で数回洗浄したのち乾燥し乾固する。

得られた固体生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー
等の常法により分離精製したのち、エタノール、メタノ
ール等のアルコール類、メチルエチルケトン、アセトン
等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等
のエーテル類等の溶媒を単独でもしくは組み合わせて使
用して再結晶することができるが、乾固物のまま十分乾
燥して次の反応に使用することもできる。

置換反応： 前記のハロゲン体（Ｉ　ｃ）のアノマー性／％ロゲン基
ヲ、前記−最大〔！ｄ〕のアゾ色素で置換して、〔！ｅ
〕を得る。

本反応に使用するアゾ色素の量は、１〜２０倍モル好ま
しくは１．２〜３．０倍モルである。

アゾ色素は、本反応を促進させるために反応溶媒中で塩
となって解離している必要があり、このためアゾ色素の
無機塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、バリウム塩
又は有機塩、例えばトリエチルアミン塩、トリブチルア
ミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩等が用いられる。２種
以上のこれらの塩を併用することもでき、また前もって
アゾ色素の塩を調製せずに、反応溶液中に無機塩基又は
有機塩基を添加するか、又は有機塩基を直接反応溶媒と
してもよい、塩基の添加量は、反応が終了するまで液性
を中性ないしアルカリ性に保持するのに必要な量が好ま
しい。

本反応は、通常は溶媒の存在下に行うことが好ましい、
溶媒としては、本反応に関与しないものであれば特に限
定されないがハロゲン体（Ｉ　ｃ）及びアゾ色素（Ｉｄ
）又はその塩の溶解度が大きく、かつその反応性を高め
る溶媒が好ましく、例えば下記の溶媒が用いられる。ア
ミド例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミ
ド等、ニトリル例えばアセトニトリル、ベンゾニトリル
等、ジメチルスルホキシド、有機塩基例えばトリアルキ
ルアミン、ピリジン、ルチジン等、芳香族炭化水素例え
ばベンゼン、トルエン等、ならびにこれらの２Ｎ以上の
混合液。

本反応は一般に−５〜１００”Ｃ程度で進行するが、通
常は１０〜５０℃の反応温度が好ましい。

反応時間は、反応助剤である塩基の種類ならびに反応温
度によって異なるが、通常は５〜２０時間である０反応
終了後、反応混合物を氷水中に投入して析出する固形物
を濾取するか、又は適当な有機溶媒で目的物を抽出し、
乾燥後に乾固することにより、固形物を得る。化合物（
Ｉ　ｅ）が固形物として得られる。

これを常法により、例えばアルミナ、シリカゲル等を用
いるカラムクロマトグラフィ、有機溶媒を用いる結晶化
法などを適宜組合わせて施すことにより、精製できる。

脱アシル化反応： 化合物（Ｉｃ）からのアシル基の除去は、公知方法例え
ば脱水したメタノール中のアルカリ金属アルコキシド又
は無水アンモニ　アのメタノール溶液等の触媒の存在下
で実施することができる。

アルカリ金属アルコキシドとしては、例えばナトリウム
メトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムエトキシ
ド、カリウムエトキシド、カリウム−１−ブトキシド等
を用いることができる。

反応終了後の目的物の精製を容易にするため、脱水メタ
ノールにクロロホルム゛、ジクロロメタン等の低極性非
水溶媒を添加して反応するこ七は好ましい、添加する低
極性非水溶媒は、脱アシル化反応を阻害せず、生成した
アゾ色素配糖体が反応系から析出することが必要である
ため、その量は溶媒によって異なるが、使用する脱水メ
タノールの量の０．５〜２倍が好ましい。

脱アシル化反応は、０〜３０℃の温度で６〜２４時間以
内で終了する。脱水メタノール単独溶媒の反応系では、
反応終了後に減圧下でメタノールを留去し、得られる固
形物を酸性のイオン交換樹脂又は無機酸を用いて混在す
る塩基性物質を中和処理したのち、薄層クロマトグラフ
ィ、カラムクロマトグラフィ等により化合物を精製する
。低極性溶媒を添加した反応系の場合は、目的物が反応
液中から析出するので、これを枦し取り、分離精製する
。

次に、本発明の化合物のうち代表的なものについて製造
方法の実施例を示す、下記化合物以外についても実施例
に準じて容易に合成することができる。

［実施例１］　化合物例（１７）の製法（Ａ）ヘプタデ
カアセチルマルトペンタオースの合成 マルトペンタオース２０ｇ１無水酢酸２６０＠１および
無水酢酸ナトリウム２０ｇの混合物を、１００〜１１０
℃で５時間撹拌し、氷水６００ｍ１中に投入して１０時
間撹拌した。５℃以下に冷却して結晶化させ、枦取し、
水洗し、乾燥した。得られた結晶をエタノールから２回
再結晶を繰り返し、下記構造式に相当する目的物３５ｇ
を得た。

融点　１２３ないし１２７℃ させた、下記構造式に相当する白色結晶８．１ｇが得ら
れた。　融点　１２３〜ｂ ＾ＣはＣ１，ＣＯ−を表す （Ｂ）ヘキサデカアセチルマルトペンタオシルクロリド
の合成 上記（Ａ）で得たヘプタデカアセチルマルトペンタオー
ス１０ｇ、脱水クロロポルム５０＋＊１および四塩化チ
タン６ｇを、１時間環流撹拌して反応させた。反応後ク
ロロホルム３００社を加え、Ｌｏｏｍｌの水で３回洗浄
し、クロロホルム相を分離し、ついで無水硫酸ナトリウ
ム３０ｇを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ過し
て除去した。減圧下で濃縮、乾燥した後、メタノール２
０Ｉ１１１に加熱溶解し、水冷して、結晶化させた。メ
タノールをデカンテーションで除き、エタノール１０ｍ
１’とｎ−ヘキサン２０社の混合液で加熱溶解し、得ら
れた液を撹拌上水冷すると白色結晶が析出する。結晶を
炉取し、ｎ−ヘキサンで洗い、乾燥へＣはＣＩｌ：Ｉｃ
０−を表す。

元素分析値：Ｃ，□ＨｓｓＯｎ＋Ｃｔ’としてＣＨＣ１ 理論値（％）　　４９．００　５．５６　　２．２３実
測値（％）　　４８．７０　５．４０　　２．１８（Ｃ
）化合物例（１７）の合成 上記（Ｂ）で得られたヘキサデカアセチルマルトペンタ
オシルクロリド２ｇ、下記構造の色素９ｇ、トリエチル
アミン１．５社を脱水ジメチルホルムアミド５０ｍ１に
溶解したのち、５時間撹拌上加熱、環流した。

（次ページへ） 反応終了後ベンゼン１００ｍ１を追加して、炭酸ナトリ
ウム１０ｇ、水１５０ｎ＋１．ジメチルスルホキシド２
５−１より成るアルカリ水溶液で過剰のアゾ色素を抽出
、除去した。この操作を４回繰り返した後、水３００社
でさらに水洗し、ベンゼン相を分離して、無水硫酸ナト
リウムで脱水し、減圧下に蒸発乾固した。赤褐色の粗生
成物１．９ｇを得た。この粗生成物１ｇを脱水メタノー
ル２ｍｌ。

脱水ジクロロメタン７ｔａｌの混合液に溶解し、これに
さらに０．５Ｎすｌ・リウムメトキサイド１社を添加し
て、室温下撹拌して１０時間反応させた。

反応後析出した沈澱を枦取し、脱水メタノール−ジクロ
ロメタン混合液（１：１）、次にジクロロメタンの順で
洗浄し、減圧乾燥すると、目的とする化合物の粗製結晶
０．４３ｇが得られた。この粗生成物を水とＢｉｏ−Ｒ
ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、製Ｂ１ｏ−
Ｇｅ１　Ｐ−２を用いたカラムクロマトグラフィにより
精製し、０．３１ｇの目的とする化合物（１７）を得た
。

融点　１８９〜１９１℃ 元素分析値　ＣＳ　４　［Ｉｔ　２　Ｎ　６　Ｓコ０：
１５としてＣＨＮ 理論値（％）　　４４．３８　４．９７　　５．７５実
測値（％）　　４４．４１　４．９６　　５．７８次に
上記のアゾ色素配糖体をもちいた多層分析要素およびア
ミラーゼ活性測定方法の実施例を示す。

［実施例２］ ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチレ
ンテレフタレート無色透明平滑フィルム上に下記の組成
（ａ）の水溶液を乾燥後の厚さが７μｍになるように塗
布し、乾燥した。

（ａ） ゼラチン　　　　　　　　　　　３００ｇ界面活性剤　
　　　　　　　　　　　５ｇ（オリン社製５ｕｒｆａｃ
ｔａｎｔ　ＩＯＧ　）ポリーコ（スチレン−Ｎ−メチル
モル ホリニウムメチルスチレン−ジビニ ルベンゼン）　重合比５５：４３：２ １５％ラテックス溶液　　　　２８０ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２１５０ｇ（希ＮａＯＨ溶液
でｐＨを７．０（二ｉｎする）次に上記ゼラチン層上に
、下記の組成（ｂ）の水溶液を乾燥後の厚さが５μｍに
なるよう（こ塗布し乾燥した。

（ｂ） ゼラチン　　　　　　　　　　　２°０８界面活性剤　
　　　　　　　　　　　５ｇ（オリン社製５ｕｒｆａｃ
ｔａｎｔ　ＩＯＧ　）α−グルコシダーゼ　　　　　３
５０万ＩＵ水　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
００ｇ（希Ｎ　ａ　ＯＩ（溶液でｐ　Ｈを７．０に調整
する）次に上記ゼラチン層上に下記の組成（Ｃ）の水溶
液を乾燥後の厚さが３μｍになるように塗布し乾燥した
。

（ｃ） ゼラチン　　　　　　　　　　　　３０ｇ界面活性剤　
　　　　　　　　　　　４ｇ（オリン社製５ｕｒｆａｃ
ｔａｎｔ　ＩＯＧ　）酸化チタン（アナターセ型）　　
　２０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９
５０ｇ（希Ｎ　ａ　ＯＨ溶液でｐ）（を７．０に調整す
る）次に上記酸化チタン／ゼラチン層の上に約３０ｇ／
ｍ２の割合で水を全面に均一に供給して湿潤させた後、
その上にトリコット編み物（ポリエステルｊＭ４０ゲイ
ジ）を軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥させた。

次にこの布に下記の組成（ｄ）の水溶液を１５０　ｃｃ
／　ｍ　２の割合でほぼ均一に塗布し、乾燥させアミラ
ーゼ測定用多層分析要素を作製した。

（ｄ） 化合物例（１））　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１６００ｇリン酸カ
リウム　　　　　　　　　　６０ｇポリビニルピロリド
ン　　　　　１４０ｇ（平均分子量　７０万） （希ＮａＯＨ溶液でｐＨを７．３に調整する）この分析
要素にアミラーゼ活性値の異なる管理血清■とＩｔを１
０μ！それぞれ点着し、３７℃に保った際の、３分後か
ら６分後の間の１分あたりの反射濃度変化を波長６６２
ｎ＋ｍで測定し、あらかじめ標準液により作成しておい
た検量線からアミラーゼ濃度を算出した。その結果は第
１表に示す通りであった。

第１表 第１表から明らがなごとく、本発明の分析要素により管
理血清中のアミラーゼ活性を精度よく測定できた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式［ I ］で表わされる化合物：［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ただし、式中Ａはフェニル基またはナフチル基（これら
   は置換されていてもよい）、Ｂはナフチレン基（置換さ
   れていてもよい）を表わす、ｎは０または８までの整数
   を表わす。
2. （２）一般式（ I ）のｎが３、４または５を表わす特
   許請求の範囲（ I ）の化合物。
3. （３）下記一般式［ I ａ］： ［ I ａ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるオリゴ糖に下記式： （ＲＣＯ）＿２Ｏ （Ｒは低級アルキル基を表わす。） で表わされる有機酸無水物を作用させ、得られる下記式
   ［ I ｂ］： ［ I ｂ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＹはＣＯＲを表わす） で表わされる化合物をハロゲン化して、下記式［ I ｃ
   ］で表わされる化合物とし、 ［ I ｃ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＸはハロゲンを表わす） これに下記式［ I ｄ］ ［ I ｄ］ ＨＯ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ−Ａ ｛ただし、式中Ａはフェニル基またはナフチル基（これ
   らは置換されていてもよい）、Ｂは置換されていてもよ
   いナフチレン基を表わす。｝で表わされるアゾ色素を作
   用させて、下記式［ I ｅ］で表わされる化合物を得、 ［ I ｅ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ これを脱アシル化することを特徴とする一般式［ I ］
   で表わされる化合物の製法。 ［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ただし各式中ｎは０または８までの整数を表わす。