JPH02173569A - ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、サンドイッチ法による免疫学的測定方法にお
いて、標識抗体として抗じト組織プラスミノーゲンアク
チベーター抗体あるいは抗ヒトプラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビター抗体のＦａｂ’フラグメントを用
いることを特徴とするヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター複合体を高感度に測定する方法及びその測定キッ
トに関する。

ｂ、従来技術及び発明が解決しようとする課題フィブリ
ンを溶解する酵素であるプラスミンは、プラスミノーゲ
ンが組織プラスミノーゲンアクチベーターにより変換さ
れて生成する。近年、この組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに対するインヒビター（ヒトプラスミノーゲン
アクチベーターインヒビター）が血管内皮細胞、血小板
、胎盤などに存在しており、速やかに組織プラスミノー
ゲンアクチベーターと複合体を形成し組織プラスミノー
ゲンアクチベーター活性を抑制することがわかった（）
１．Ｐｈ１ｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ　Ｂ
ｔｏｐｈｙｓＡｃｔａ、　８０２　、９９−１１（）、
　１９８４．　Ｓ、Ｔｈｏｒｓｅｎ、　８ｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｂｙｓ　Ａｃｔａ、　８０２．１１１−０８．
１９８４．　Ｔ、Ｗｕｎ　ｅｔａｔ、　Ｊ、　８ｉｏＩ
　Ｃｈｅｍ、　２６２　３６４６−３６５３．１９８７
．　）１．Ａ。

５ａｎｚｏ　　ｅｔ　ａｌ　８ｉｏｃｈｅｍ、　２６．
　７４４３−７４４９．　１９８７゜Ｙ、５ａｋａｔａ
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　　８ｉｏｔ　Ｃｈｅｍ、　２６３
．　１９６０−１９６９゜１９８８）。また血中プラス
ミノーグンアクチベーターインヒビター活性値と疾患と
の関係が明らかになりツツあり（Ｂ、Ｗｉｍａｒｌ　ｅ
ｔ　ａｔ、　５Ｃａｒｌｄ、　Ｊ、　ＣＪｉｎＬａｂ　
Ｉｎｖｅｓｔ　４５．４３−４３．　ｔ９８５．　Ｐ、
Ｖａｇｕｅ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　３５．２５０−２５３．１９８
６．　Ａ、Ｈａｍｓｔｅｎ。

ＬａｎＣｅｔ　８５４９．３−８．１９８７）　、プラ
スミノーゲンアクチベーターインヒビターは血液凝固線
溶系の開始機構の重要な制御因子であることが示唆され
ている。従って、プラスミノーゲンアクナベ−ターイン
ヒビター１組織プラスミノーゲンアクチベーターや組織
プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミノーゲンア
クチベーターインヒビター複合体の血中濃度を知れば、
線溶系の異常をモニターすることができる可能性が大で
ある。

現在、ヒトＩＩプラスミノーゲンアクチベーターの測定
法としてはサンドイッチ　ェンザイムイムノアッセイに
よる方法（特開昭５９−１７４７５９号公報）や市販キ
ット（バイオブール社ＩＨＵＬＹＳＥ　ｔ−ＰＡ）など
があり、一方ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイン
ヒビターを測定する方法としては放射性物質を用いる方
法（Ｒ，Ｒ，５ｃｈｌｅｆ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｌａｂ　Ｃｌ１ｎ　Ｍｅｄ　１０Ｂ、　４０８．１９８
５）やモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ　ェン
ザイムイムノアツセイ　キット（バイオプール社ＩＨＵ
ＬＹＳＥ　ＰＡＩ−Ｉ）などがある。

しかしながら、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー・ヒトブラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
複合体は血漿中に微量存在すると言われながら、従来ヒ
ト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体を測定した
例は見あたらない。

本発明者らは、この点に鑑み鋭意研究した結果、標識抗
体として該抗体に標識物質を標識したものを用いた場合
には、非特異的吸着が大きいために検出感度が不十分で
正確な測定は困難であった。

そこで更に研究を重ねた結果、標識抗体として該抗体の
Ｆａｂ’フラグメントを用いることにより、高感度にヒ
ト組織プラスミノーグンアクチベーター・ヒトプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体のみだけを
、正確に測定できることを見い出し本発明に到達したも
のである。

Ｃ６課題を解決するための手段 すなわち本発明は、サンドイッチ法による免疫学的測定
法において、不溶性担体に固定された抗体と標識抗体の
いずれか一方が抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベー
ター抗体で他方が抗ヒトプラスミノーグンアクチベータ
ーインヒビター抗体であり、かつ該標識抗体として該抗
体のＦａｂ’フラグメントを用いることを特徴とするヒ
ト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法
である。

本発明で使用される抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター抗体および抗ヒトプラスミノ−ゲンアクチベー
ターインヒビター抗体としては、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体めるいはこれらの７ラグメント
が挙げられる。かかる抗体を（ｑるための抗原としての
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターあるいはヒト
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターは原則的
には天然の材料から抽出した天然型のものと遺伝子組換
え技術によるリコンビナント型のものが用いられるが、
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビターの天然型と
同等の免疫学的性質を持つ物であれば、遺伝子工学的手
法によってえられるものでもよい。天然型のヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプラスミノー
ゲンアクチベーターを得る材料としては細胞培養液が好
んで用いられる。分離、精製は、通常用いられる蛋白分
離技術、例えば塩析、抽出、遠心分離。

限外罎過、各種のクロマトグラフィーなどを組み合わせ
て行うことができる。このようにして得られたヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトブラスミノ
ーゲンアクチベーターインヒビターを抗原としてポリク
ローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作成するこ
とができる。

本発明で用いられる抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター抗体あるいは抗ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター抗体のポリクローナル抗体は通常行
なわれている方法で得ることができる。例えば「日本生
化学金偏、続生化学実験講座、５巻、１−１０頁、東京
化学同人、　１９８６年」に記載されているように、免
疫動物、例えばモルモット、ウサギ、ラット、マウス、
ヤギなど抗体産生能力のある動物を用い通常の方法で免
疫した後、採血し、抗血清を得る。抗血清より通常用い
られる方法、例えば、塩析、抽出、遠心分離。

限外）濾過、各種のクロマトグラフィーなどを組み合わ
せて精製抗体を得ることができる。

一方、モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイ
ンによる細胞融合法（Ｇ、ＫＯｈｌｅｒ　ａｎｄＨｕｌ
ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２
５６．４９５−４９７（１９７５）により作成されたハ
イプリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離
することにより得ることができる。すなわち、ヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプラスミノ
ーゲンアクチベーターインヒビターでマウスを免疫した
後、このマウスの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞と融
合させハイブリドーマを作成する。このようにして得た
ハイブリドーマは融合された種々のリンパ球に応じて種
々のモノクローナル抗体を産生ずるので、目的とするモ
ノクローナル固体を産生ずるハイブリドーマをクローニ
ングによってクローン化されたバイプリドーマとして単
離する。このクローン化されたハイブリドーマをイン・
ビトロまたはマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗
体を分泌させる。この培養液から抗ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター抗体または抗ヒトプラスミノーゲ
ナクチベーターインヒビター抗体を分離する。

このような方法で得られるモノクローナル抗体として具
体的には、例えば抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター・モノクローナル抗体は、特願昭６３−８１３６
６号（昭和６３年４月４日出願：発明の名称「プラスミ
ノーゲンアクティベーターに対するモノクローナル抗体
」）に記載された方法で（ｑられた、ヒトｉｓプラスミ
ノーゲンアクチベーターのＨ鎖あるいはヒト組織プラス
ミノーグンアクチベーター・プラスミノーゲンインヒビ
ター複合体を認識し、サブクラスＩ（ｌｌＧ＋で、組織
プラスミノーゲンアクチベーター中和活性を有しないＪ
ＴＡ−１，ＪＴＡ−２，ＪＴＡ−４あるいはヒト組織ブ
ラスミノーゲンアクチベーターのＨ鎖を認識しないＪＴ
Ａ−３が挙げられる。また抗ヒト・プラスミノーグンア
クチベーターインヒビター・モノクローナル抗体は、特
願昭６３−８１３６７号（昭和６３年４月４日出願：発
明の名称「プラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体」）に記載された方法
で１ｑられた、プラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビターとヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−寺プ
ラスミノーゲンインヒビター複合体を認識し、サブクラ
スがｌＪＧ＋であって、かつブラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター阻害活性の中和活性を有するＪＴＩ
−３又は有しないＪＴＩ−１，ＪＴＩ−２，ＪＴＩ−４
が挙げられる。

本発明の抗ヒト組織ブラスミノーグンアクチベーター抗
体またはヒトブラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター抗体のＦａｂ’フラグメントは、このようにして得
られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を
公知の方法、例えば該抗体をペプシンで分解して得られ
るＦ　（ａｂ’）２フラグメントを還元処理することに
より得ることができる（Ａ、Ｎ１５ｏｎｏｆｆ　ｅｔ　
ａｔ、、　Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
。

８９、２３０　（１９６０）；　Ｐ、Ｐａｒｈａｍ、　
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、　１３１゜２８９５　（１９
８３）など）。

また、かかるＦａｂ’フラグメントと結合させる標識物
質としては、酵素、蛍光物質２発光物質または放射性物
質などがある。酵素には例えばリゾチームマレート番デ
ヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デ
ヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース・オキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ
、ベーターガラクトシダーゼなど；蛍光物質には例えば
フルオレセイン、ローダミン、ウンブベリフエロン。

ランタニド・キレートなど二発光物質には例えばルミノ
ール、アクリニジラム争エステル、ルシフェリンなど；
また放射性物質には例えばヨウ素−１２５、ヨウ素−１
３１、トリチウム、炭素−１３などを例示することがで
きる。これらのなかでも標識物質としては、酵素が好ま
しい。これら標識物質とＦａｂ　’フラグメントとの結
合方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレ
イミド法など通常の方法に従うことが、マレイミド法が
好ましく用いられる。

酵素のマレイミド化は公知の方法（石川栄冶編「酵素免
疫測定法」、医学書院）２例えばザクシンイミジル　４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン　カーボネ
ート（ＳＭＣＣ）、スルホザクシンイミジル　４−　（
Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン　カーボネート
（スルホＳＭＣＣ）、ザクシンイミジルーメタ　マレイ
ミドベンゾエート（ＭＢＳ）、ザクシンイミジル　６−
マレイミドヘキサノエート（ＥＭＣ８）などにより行う
ことができる。

Ｆａｂ’フラグメントとマレイミド化標識物質との反応
は一般に前記記載の方法（石川栄治編「酵素免疫測定法
」、医学書院）例えば反応温度４〜３０℃、　Ｆａｂ’
フラグメントとマレイミド化標識物質のモル比は１：１
２反応時間２０時間の条件に従うことができる。この場
合には主として、抗体のＦａｂ’フラグメントの硫黄原
子を介して標識物質がＦａｂ’フラグメント１分子当分
子力子標識されたものを得ることができる。

本発明においては、抗体のＦａｂ　’フラグメントの硫
黄原子を介して、Ｆａｂ　’フラグメント１分子当り、
平均１．５分子以上の標識物質で標識されたものを標識
抗体として用いるのが本発明の測定の高感度化を達成で
きるので好ましい。１．５以下では酵素の結合量が少な
く、活性が低いため高感度化測定には向かず好ましくは
１．８以上である。上限は特に限定しないが５までが好
ましい。かかる多標識抗体は、前記反応により反応液か
ら分離精製することにより得られるが、収率よく多標識
抗体を得るためには反応温度２５℃以上、Ｆａｂ’フラ
グメントとマレイミド化標識物質のモル比は１：４以上
、反応時間は２４時間以上で行うことが好ましい。反応
を行う際の緩衝液としては反応を阻害しない限りどのよ
うな緩衝液でもよいが０．０１から０．５リン酸緩衝液
ＤＨ５，５〜８．０が好ましく用いられ、Ｆａｂ’フラ
グメントの安定化のため１から１０１ＴＩモル程度のＥ
ＤＴＡを含めば更によい。このようにして得られた多標
識抗体はゲルクロマトグラフィーにより分離精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としてはウルトロゲルＡＣＡ４４などがあげられるが
、ＴＳＫＧｅｌ−３０００ＳＷ　　（東ソー）　、　Ｄ
ＩＯＬ−２００（Ｙ　Ｍ　Ｃ）カラムなどを用いたＨＰ
ＬＣのほうが分離に優れているため好ましく用いられる
。

分離精製された該多標識抗体における標識物質の標識数
は、分子量の測定や吸光度、蛍光強度。

酵素活性などの測定などにより求めることができる。例
えば、標識物質がペルオキシダーゼの場合には、Ｆａｂ
’フラグメントとペルオキシダーゼに由来する２８０ｎ
ｍの吸光度と、ペルオキシダーゼに由来する４３０ｎｍ
の吸光度を測定することにより標識数を求めることがで
きる。

かくして、本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター複合体を高感度に測定するための、標識物質で標識
された抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターＦａ
ｂ’フラグメントまたは抗ヒトプラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビターＦａｂ’フラグメントを得ること
ができる。

次に、このようにして得られる標識化Ｆａｂ’フラグメ
ントを用いてヒトの体液に存在する組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター・プラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体を免疫反応を利用して測定することを
特徴とする本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター複合体の測定方法について説明する。

本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチベ−ター・ヒ
トプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体
の測定方法は免疫反応を利用した測定法であって、いわ
ゆるサンドイッチ法である。

本発明のサンドイッチ法とは通常行なわれている方法、
すなわち、測定しようとする抗原、不溶性担体に固定さ
れた第１抗体、標識物質を標識した第２抗体を反応溶液
中に共存させて、一定時間インキュベーション後洗浄操
作を行い発色反応させる一段反応と、測定しようとする
抗原と不溶性担体に固定された第１抗体とを反応させ洗
浄後、標識物質を標識した第２抗体を反応させ、洗浄後
、発色反応させる２段反応とがある。本発明では、１段
反応又は２段反応のいづれでも抗原としてのヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲン
アクチベーター・インヒビター複合体の測定は可能であ
るが、測定しようとする検体中にヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターが多量に存在すると予想される場合
には、２段反応が好ましい。

本発明では第１抗体と第２抗体のいずれか一方が抗ヒト
組織プラスミノーゲン抗体であり、他方が抗ヒトプラス
ミノーゲンアクチベーターインヒビター抗体であり、か
つ第２抗体として該抗体のＦａｂ’フラグメントを用い
る。例えば第１抗体に抗ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター抗体を用いた場合、第２抗体として
は抗ヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーター抗体のＦ
ａｂ’フラグメントを用いる。

かかる第１抗体を固定する不溶性担体としては、天然か
ら得られる重合体とその誘導体、合成重合体とその誘導
体を挙げることができる。前者には、多糖類とその誘導
体、たとえばセルロース、セフ７デツクスセルロース、
カルボキシメチルセルロース、ニトロセルロース、酢酸
セルロース、デキストランなど、あるいはガラス、シリ
カゲルなどの無機重合体などがある。また後者にはビニ
ル系重合体、たとえばポリスチレン、ポリエチレン。

ポリプロピレン、ＡＢＳ、ポリフッ化ビニル、ポリアミ
ンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、エチレ
ン−マレイン酸共重合体など縮合系重合体、たとえば６
−ナイロン、６，６−ナイロンなどのポリアミド、ポリ
エチレン、テレフタレートなどのポリエステル、アミノ
酸重合体などがある。また、その形状は、試験管、マイ
クロタイタープレート、ビーズあるいはメンブレンなど
がめげられる。なかでも鏡面化された材質の不溶性担体
を用いると非特異的吸着が低くなり、測定感度が向上す
るので好ましい。かかる鏡面化された不溶性担体として
は例えばポリスチレンビーズ、その表面の中心線平均粗
さ（Ｒａ）が１．５μｍ以下のものがあげられる。かく
なる不溶性担体に固定される第１抗体としては、抗体分
子、抗原結合能が失われないそのフラグメントたとえば
Ｆ　（ａｂ’）２　。

Ｆａｂ　、　ＦａＣｂなどあるいは抗原結合能が失われ
ない抗体分子またはそのフラグメントの誘導体である。

これらの第１抗体を不溶性担体へ固定する方法は、物理
的吸着法たとえばポリスチレンの担体を該第１抗体の溶
液に浸漬する方法など；イオン結合法たとえばイオン交
換樹脂あるいはアミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基
、リンＭ基などのイオン化する官能基をもった担体を用
いる方法など：あるいは化学反応による共有結合法たと
えばカルボキシ・クロライド法、カルボジイミド法、無
水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化
シアン活性化多糖法、ジアゾ法、活性エステル法、架橋
試薬による担体結合法（架橋試薬としてゲルタールアル
デヒド、ヘキサメチレンインシアナート、コハク酸イミ
ド・マレイミド化合物など）など：更にはヒト組織プラ
スミノーゲンアクチベーターまたはヒトブラスミノーゲ
ンアクチベーターインヒビターに対しては結合能はない
が第１抗体に対し生物学的反応により結合しえる物質を
介して結合する方法たとえばプロティンＡ結合担体を用
いる方法などである。

本発明の測定方法においては、免疫反応溶液に分子間１
，６万〜５．０万、好ましくは２．０〜４，６万及び等
重点１．０〜５．０１好ましくは１．２〜４．８である
蛋白質を存在せしめ、この蛋白質の免疫反応溶液におけ
る最終濃度が０．００２〜０．９重量％となるように調
整するのが、非特異的吸着が抑制され、従ってバックグ
ランドが著しく低くなり高感度が得られやすいので好ま
しい。かかる物質としては、例えばカゼイン、βカゼイ
ン、αカビイン、ペプシン、オボグリコプロテイン、オ
ロソムコイドなどが挙げられる。あるいはまた、かかる
蛋白質はその混合物を使用することもできる。このよう
な混合物としては、例えば主成分として前記蛋白質１０
〜６０重量％、好ましくは２０〜５０重量％、糖（例え
ば乳糖）　３０〜８０重量％、好ましくは４０〜６０重
量％、その他脂肪（例えば０．５〜２重量％）、灰分（
例えば５〜１２重凹％）、水分く例えば２〜８重量％）
などを含むことができる。このような混合物として典型
的なのはスキムミルクである。スキムミルクは蛋白質と
してカゼインを含むものであるが、カビインを単独で使
用した場合に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中
における分散性がよく、蛋白質単位重量当りのＮＢＳ（
Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｒｉｄｉｎｇ）効果が
高く、温度４℃における保存性がよい（沈澱が生じにく
い）という特長を有する。なお、本発明に用いるスキム
ミルクとしては、脱脂したミルクであれば何の由来の乳
であってもよい。すなわち、免疫反応溶液にスキムミル
クを存在せしめ免疫反応溶液におけるその最終１度が０
．００２〜０．８重量％となるように調整するのも、同
様に高感度が得られるので好ましい。

０、００２重」％より低濃度では十分な抑制効果が得ら
れず、また、スキムミルクの場合には０．８重量％、上
記蛋白の場合には０．９重量％より高濃度とすると、特
異的反応も抑制されるので好ましくない。

上記における測定系に用いられる溶媒としては、反応に
悪影響を与えない通常の各種のものいずれであってもよ
い。たとえばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩
衝液などのｐＨが６．０から８．０程度のものを用いる
のが好ましい。

測定に際しての免疫反応＠度条件は、構成要素である蛋
白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制し
ないかぎり制限はないが、一般には、５０℃以下、好ま
しくは約４〜４５℃程度の温度条件下に約５分から２０
時間程度を要して反応を行えばよい。

また本発明測定法における検体としては、通常の臨床サ
ンプル、例えば血清あるいは血漿形態の血液、関節液、
リンパ液、胸腺水、腹水、羊水。

細胞組織液、骨髄液、尿などの体液のいずれであっても
よい。

ｄ０発明の効果 かくして、本発明方法によれば、臨床サンプルなどの微
量のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体を含
む試料を検体として、該検体中のヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベー
ターインヒビター複合体を高感度、高精度に、しかも簡
便な操作で定量することができる。

以下実施例により本発明の詳細な説明する。実施例中、
％表示は重量％を示す。

実施例１ ［酵素標識抗体の作成］ ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノ
クローナル抗体（ＪＴＡ−１＞のＦａｂ　’フラグメン
トをニソノフの方法に準じて調整し、常法によりペルオ
キシダーゼと結合してペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ’を
得た（日本生化学金偏、続生化学実験講座、５巻、　１
０９−１１２頁、東京化学同人。

１９８６年）。すなわち、該モノクローナル抗体のｉ、
ｏｍａ　、、’ｒＩ！ｉ溶液（０，０１Ｍ　ＰＢＳｐＨ
７，２）の２ｄに４０μ９のペプシンを加え、１Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ３，５）でｌ）Ｈを３．１に調整した
あと３７℃で１時間消化分解した。反応液に１Ｎ−Ｎａ
ＯＨを滴下し、ｐＨ８として反応を停止した。ＴＳＫＧ
ｅｌ　Ｇ−３０００ＳＷカラム−ＨＰＬＣで溶出液に５
ｎ＋ＨＥＤＴＡ−０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
を用いて、この反応液から分子１１０万のＦ　（ａｂ’
）ｚフラグメントを分離した。

これを限外濾過器により濃縮した。これに０．１Ｍ　２
−メルカプトエチルアミン２００μｌを加え、３７℃で
２時間還元処理した。この反応液を限外？濾過器によっ
て、濃縮後、Ｆ　（ａｂ’）ｚと同様にＨＰＬＣによっ
テ分子量５万のＦａｂ’を分離し１．Ｏ７ｍＭｄのＦａ
ｂ　’フラグメントの液を１．Ｏｒｄ得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡）の６．０
ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
　０．９ｄに溶解し、Ｎ−ザクシンイミジル−３−マレ
イミドメチル−シクロヘキサンカルボネートのジメチル
ホルムアミド溶液を６０μｍ　（２，９ｍａ／８０μｉ
）滴下し、３０℃で１時間反応した。この反応液をセフ
ァデックスＧ−２５カラムに添加、０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，０）を流してマレイミド化パー
オキシダーゼを分離した。かくして得られた５、２８ｍ
Ｍｍ１のマレイミド−パーオキシダーゼ２００μｌを上
記のＦａｂ’フラグメント液に滴下、４℃で２００時間
反応た。この反応液を限外）濾過器で濃縮した後、ＴＳ
ＫＧｅｌ　Ｇ−３０００ＳＷカラム−ＨＰＬＣでＰＢＳ
　（１）Ｈ７，２）溶出液として分離し、分子量９万の
パーオキシダーゼ標識したＦａｂ’を得た。

この標識Ｆａｂ　’を以下の検量線作成に用いた。

［固体抗体の作成］ 抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターの
モノクローナル抗体（ＪＴＩ−４＞を、濃度２０μ（Ｊ
　／ｄの０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ３，０
）の溶液としてマイクロプレートにウェル当り２００μ
ｌずつ分配し、４℃で一昼夜放置して固定化した。これ
をＰＢＳで洗浄１ｉ、ｏ％ＢＳＡ−ＰＢＳをウェル当り
２５０μｌずつ加えて４℃で一昼夜放置しアフターコー
トを行い、次いでＰＢＳにて洗浄して抗体固定マイクロ
プレートを調整した。

［検量線の作成］ 次に、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒト
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の
０．０，３．０，６．１．２５．２．５．５．１０ｎＭ
ｉｙｆの希釈系列を最終濃度０．２５％スキムミルク−
１０ｍＨリン酸−０，５Ｍ、　ＮａＣｆ１（ｐＨ７，２
）にて作成し、該抗体固定プレートにウェル当り２００
μｌずつ加えて室温で２時間反応させた。１０１１１８
リン酸−０，５Ｍ　　Ｎａα−０，０５％ツイーン２０
（洗浄バッファー）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識Ｆ
ａｂ’成分の濃度が０．３μＱ　／ｒｄであるように洗
浄バッファーで希釈、調整した該標識Ｆａｂ　’液をウ
ェル当り２００μｌずつ配分して室温で１時間反応させ
た。洗浄バッファーにて洗浄後、ペルオキシダーゼ用基
質液（２，５ｍＨＨｚＯｚ−０，０２５％　３，３°、
５，５°−テトラメチルベンチジンを含む）を２００μ
ｌ加え室温で１時間発色させ、８Ｎ−硫酸溶液２５μｌ
を加えて停止反応を行い、４５０１ｍでプレートリーダ
ーにて吸光度を測定した。

その結果得られた検量線を第１図に（イ）として示した
。この図から、測定下限は０．３ｑｇ／ｒｄであった。

検体液としてヒト正常人血漿を測定した結果を第１表に
まとめた。

比較例 実施例１においてＦａｂ　’の代わりに抗ヒト組織プラ
スミノーゲンアクチベーター・モノクローナル抗体（Ｊ
ＴＡ−１＞を用いて、Ｎａｋａｎｅの方法（Ｐ。

に、Ｎａｋａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２２゜１０８４、１
９７４）により酵素標識抗体を作成した。実施例１と同
様の条件で（酵素標識抗体は本標識抗体をＩｇＧ　’ｆ
Ａ度として０．６μ０　／ｄに調整し、実施例１と同じ
濃度にした）検量線を作成した。

その結果得られた検量線を第１図の（０）に示した。

第１図から標識抗体としてＦａｂ’フラグメント−ＨＲ
Ｐを用いた場合（（イ）一実施例１）の方が、全抗体−
ＨＲＰを用いた場合（（Ｏ）−比較例）よりも、非特異
的吸着が低く、いことが明らかでおる。

実施例２ ［Ｆａｂ’フラグメント／ペルオキシダーゼ　１：２結
合酵素標識抗体の作成コ 実施例１で得られたＦａｂ”フラグメント（ｏ、ｉｍｇ
）とマレイミド化ペルオキシダーゼ（３，２ｍｇ）を２
５℃テ２４時間反応させてＴＳＫＧｅｌ　３０００ＳＷ
によるＨＰＬＣ（溶離液０．０１Ｍ　　ＰＢＳ＞にて分
離精製したところ分子量約１３万の標識抗体が０．３５
ｍｇ得られた。

得られた標識抗体の２８０ｑｍと４０３ｑｍの吸光度よ
りＦａｂ’フラグメントとペルオキシダーゼの結合モル
比は１：２であった。以下Ｆａｂ’−（ＨＲＰ）２と略
記する。

実施例３ 「固定抗体の作成］ ポリスチレンビーズ（積水化学６．３５ｍｍφ＄８０　
）をマウス抗ヒトプラスミノーグンアクチベーターイン
ヒビター抗体（ＪＴＩ−４）の濃度２０μｇ／ｄの０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＤＨ９，０）の溶液にいれ、４℃で
２０時間静置した。ビーズを０．ＯＩＭ　　ＰＢＳで３
回洗浄したあと１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に室温で２時間
静置後、再度０．０１Ｍ　　ＰＢＳで３回洗浄し固定抗
体を得た。

［検量線の作成］ ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミノ
ーゲンアクチベーターインヒビター複合体を最終濃度０
．２５％スキムミルクを含む０．０１Ｍリン酸−０，５
Ｍ　　ＮａＣＲＭ衝液（ｐＨ７，２）で希釈して２５．
５．６．２５．３，１２５．　ｏｎＭｒＩＪｉのスタン
ダード溶液を作成した。スタンダード溶液０．３ｄと固
定ビーズを小試験管にいれ３７℃で２時間インキュベー
ションした。次に０．ＯＩＭ　　ＰＢＳ−０，０５％ツ
イーン２０　（ｔ）Ｈ７，２）で３回洗浄した。実施例
１（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）と実施例２　（Ｆａｂ’　−（
ＨＲＰ）２　＞で１ｑられたペルオキシダーゼ標識抗ヒ
ト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗体Ｆａｂ　’
フラグメントをＦａｂ　’フラグメント濃度として０．
６Ｍｇ／ｒｎｌｌであるように０．ＯＩＭ　　ＰＢＳ−
０，０５％ツイーン２０（１）Ｈ７，２）で調整し０．
３ｒｄ加え３７℃で３０分間インキュベーションした。

０．ＯＩＭ　　ＰＢＳ−０，０５％ツイーン２０で３回
洗浄し０．３ｄのペルオキシダーゼ用基質液（２，５ｍ
ＨＨ２Ｏ２−０，０２５％　３，３°、５，５°テトラ
メチルベンチジンを含む）を加え３７℃で３０分間発色
させ、ＩＮ−硫酸で発色を停止し、４５０ｎｌｌｌでの
吸光度を測定した。

その結果得られた検量線を第２図に示す。

第２図から実施例２で得られたペルオキシダーゼ標識抗
体（Ｆａｂ’−（トＩＲＰ）ｚ　＞は実施例１で得られ
たペルオキシダーゼ標識抗体（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）より
も約４倍の活性を示したことが判る。

実施例４ ＥＩＡ用ポリスチレンビーズとして表面粗さの異なるビ
ーズを用い、実施例３と同様に抗体を固定し、スタンダ
ード（Ｓｔｄ）濃度０，２５ｎＭｄ、標識抗体はＦａｂ
’−（ＨＲＰ）２を用いる以外は実施例３と同様にして
測定を行った。

非特異的吸着のパーセント（％） Ｓｔ（ｆ　２．５ｎＱ　／ｒｄの吸光度Ｓｔｄ　０ｎ（
ＩＩ／ｄの吸光度 を第３図に示す。

第３図より表面粗さ計サーフコム（東京精密■製）で測
定した場合、中心線平均粗さ（Ｒａ）が１．５μｍ以下
のポリスチレンビーズの場合に特異的吸着が低く、本発
明の測定に有効であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は標識抗体としてＦａｂ’　−ＨＲＰ　（実施例
１）と全抗体−ＨＲＰ　（比較例）を用いた場合の検問
線を示す。 図中（イ）は実施例１　、　（０）は比較例の検量線で
ある。 第２図は、標識抗体としてＦａｂ’　−（ＨＲＰ）２（
実施例２）とＦａｂ’−ＨＲＰ（実施例１）を用いた場
合の検」線を示す。 第３図は、不溶性担体の平均中心線粗さの程度と、非特
異的吸着との関係を示す。 第１（！ｌ ＊２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンドイッチ法による免疫学的測定法において、不
   溶性担体に固定された抗体と標識抗体のいずれか一方が
   抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗体で他方
   が抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
   抗体であり、かつ該標識抗体が該抗体としてＦａｂ′フ
   ラグメントを用いることを特徴とするヒト組織プラスミ
   ノーベンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチ
   ベーターインヒビター複合体の測定方法。 ２、標識抗体が、酵素標識抗体である請求項１記載のヒ
   ト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミ
   ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法
   。 ３、標識抗体が、抗体のＦａｂ′フラグメントの硫黄原
   子を介してＦａｂ′フラグメント１分子当り、平均１．
   ５分子以上の酵素で標識された酵素標識抗体であること
   を特徴とする請求項１記載のヒト組織プラスミノーゲン
   アクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーター
   インヒビター複合体の測定方法。 ４、不溶性担体が鏡面化されたポリスチレンビーズであ
   ることを特徴とする請求項１記載のヒト組織プラスミノ
   ーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベ
   ーターインヒビター複合体の測定方法。 ５、免疫反応溶液に分子量１．６万〜５．０万及び等電
   点１．０〜５．０である蛋白質を存在せしめ、免疫反応
   溶液における該蛋白質の最終濃度が０．００２〜０．９
   重量％となるように調整することを特徴とする請求項１
   記載のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒト
   プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の
   測定方法。 ６、免疫反応溶液にスキムミルクを存在せしめ、免疫反
   応溶液における該スキムミルクの最終濃度が０．００２
   〜０．８重量％となるように調整することを特徴とする
   請求項１記載のヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ
   ー、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
   複合体の測定方法。 ７、サンドイッチ法による免疫学的測定キットにおいて
   、不溶性担体に固定化された抗体と標識抗体のいずれか
   一方が抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗体
   で他方が抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒ
   ビター抗体であり、かつ標識抗体が該抗体のＦａｂ′フ
   ラグメントからなる該標識抗体試薬と固定抗体試薬を含
   むことを特徴とするヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
   ーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
   ター複合体の測定キット。