JPS6173067A - 重合化酵素と抗体との共有結合接合体を用いるイムノアツセイ - Google Patents
重合化酵素と抗体との共有結合接合体を用いるイムノアツセイInfo
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- JPS6173067A JPS6173067A JP20194785A JP20194785A JPS6173067A JP S6173067 A JPS6173067 A JP S6173067A JP 20194785 A JP20194785 A JP 20194785A JP 20194785 A JP20194785 A JP 20194785A JP S6173067 A JPS6173067 A JP S6173067A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
酵素標識抗体の免疫細胞化学的検出への最初の使用は、
1966年にAvrameasおよびσrial(CA
R,5eancesムcad* Elci、 13sr
、、 D262+ 2543(1966) )およびN
akaneおよびPierce (、T。
1966年にAvrameasおよびσrial(CA
R,5eancesムcad* Elci、 13sr
、、 D262+ 2543(1966) )およびN
akaneおよびPierce (、T。
Hlatoehem、 Oytochem、、 Vol
ume 14:929(1966)]によって報告され
た。これら酵素標識抗体の診断医学上の重要性は、In
gvallおよびPerlmann〔工mmunoch
emietry、 Volume sl 871(19
71)参照〕およびvan Weemanと5chuu
rs(米国特許3.654,090(1972):)が
抗体−酵素接合体の定食的酵素結合イムノアッセイへ0
(je用を記述した1971頃までは正しくは理解され
ていなかった。それ以来、抗体およびそれらの断片を各
種酵素に結合するための方法を記載する数多くの刊行物
が存在している。
ume 14:929(1966)]によって報告され
た。これら酵素標識抗体の診断医学上の重要性は、In
gvallおよびPerlmann〔工mmunoch
emietry、 Volume sl 871(19
71)参照〕およびvan Weemanと5chuu
rs(米国特許3.654,090(1972):)が
抗体−酵素接合体の定食的酵素結合イムノアッセイへ0
(je用を記述した1971頃までは正しくは理解され
ていなかった。それ以来、抗体およびそれらの断片を各
種酵素に結合するための方法を記載する数多くの刊行物
が存在している。
広範に用いられつつあり、また酵素標識抗体を用いる一
群の異質イムノアッセイはイムノメトリック参アッセイ
(immunometric assay)と呼ばれる
。1つのタイプのイムノメトリック・アッセイはいわゆ
るサンドインチ・アッセイである。サンドインチ・アッ
セイでは(1)固相の未標識抗体、(li)目的とする
被分析物および(10可溶性標識抗体から三成分系コン
プレックスが形成される。サンドイッチ・アッセイは目
的とする化合物が多価である。すなわち、2M1以上の
異なる抗原決定基または単一の多重的に存在する決定基
を有することを必要とする。
群の異質イムノアッセイはイムノメトリック参アッセイ
(immunometric assay)と呼ばれる
。1つのタイプのイムノメトリック・アッセイはいわゆ
るサンドインチ・アッセイである。サンドインチ・アッ
セイでは(1)固相の未標識抗体、(li)目的とする
被分析物および(10可溶性標識抗体から三成分系コン
プレックスが形成される。サンドイッチ・アッセイは目
的とする化合物が多価である。すなわち、2M1以上の
異なる抗原決定基または単一の多重的に存在する決定基
を有することを必要とする。
サンドイッチ・アッセイは標識抗体の添加方法に応じて
フォワード式、リバース式および同時式アッセイに分け
ることができろ。フォワード式サンドイッチ・アッセイ
では、標識抗体が固相抗体および被分析物の予め形成さ
れた二成分系コンプレックスに添加される。リバース式
サンドイッチ・アッセイでは、固相抗体を添加する前に
標識抗体と被分析物とのコンプレックスを形成させる。
フォワード式、リバース式および同時式アッセイに分け
ることができろ。フォワード式サンドイッチ・アッセイ
では、標識抗体が固相抗体および被分析物の予め形成さ
れた二成分系コンプレックスに添加される。リバース式
サンドイッチ・アッセイでは、固相抗体を添加する前に
標識抗体と被分析物とのコンプレックスを形成させる。
同時式サンドイッチにおいては、被分析物含有検体を標
識抗体と固相抗体の両方と同時に接触させる。フォワー
ド式アッセイは洗浄段階を2回必要とするのに対し、リ
バース式および同時式アッセイは1回の洗浄段階しか必
要としない。
識抗体と固相抗体の両方と同時に接触させる。フォワー
ド式アッセイは洗浄段階を2回必要とするのに対し、リ
バース式および同時式アッセイは1回の洗浄段階しか必
要としない。
5huursおよびVan foemanにより最初に
記載され〔米国特許第3,654,090号明細書(1
972年)参照〕、そしてMOchidaおよびOga
wa (米国特許第4,200,436号明細書(19
80年)参照〕およびFreytagら[01inic
al Ohem、 84巻、417−(1984年)参
照〕により発展された単一抗体イムノメトリック・アッ
セイの場合には、簡易さ、速度、融通性、および聡体的
感度という要素が加わる。更にまた、被分析物は多価で
ある必要はない。このアッセイ方式では(好ましくは一
価の)過剰な標識抗体を被分析物含有検体と混合する。
記載され〔米国特許第3,654,090号明細書(1
972年)参照〕、そしてMOchidaおよびOga
wa (米国特許第4,200,436号明細書(19
80年)参照〕およびFreytagら[01inic
al Ohem、 84巻、417−(1984年)参
照〕により発展された単一抗体イムノメトリック・アッ
セイの場合には、簡易さ、速度、融通性、および聡体的
感度という要素が加わる。更にまた、被分析物は多価で
ある必要はない。このアッセイ方式では(好ましくは一
価の)過剰な標識抗体を被分析物含有検体と混合する。
短時間インヤユベーションして被分析物を結合させた後
、過剰の未反応標識抗体を、その混合物を固体支持体に
固定された抗原に晒すことにより除去する。次に遊離(
または結合)画分を定量するが、それは被分析物濃度の
直接の尺度である。
、過剰の未反応標識抗体を、その混合物を固体支持体に
固定された抗原に晒すことにより除去する。次に遊離(
または結合)画分を定量するが、それは被分析物濃度の
直接の尺度である。
抗体−酵素接合体の品質および性質がイムノアッセイの
抗原の定量への究極的な有用性に深く影響することが示
されている。Ishikawaらはモノマー性非凝集t
ab /酵素接合体は、特サンドインチ型二重抗体イム
ノメトリック・アッセイにおいて最低の非特異的バック
グラウンドおよび最高の感度を与えることを報告してい
る〔工mmunoenzymatic Techniq
ues、 ed、s、 AvrajI18asElae
vier 5cience Publ、 B、 V、
pp、 219〜232(1983ン参照〕。モノマー
性Fab−酵素接合体は単一抗体イムノメトリック・ア
ッセイにおける性能を最大とするために必要でもある〔
工shikawa 、前掲書および同時係属特許出願(
xp −0458’)参照〕。しかしながら極めて低レ
ベル(<1 fmole )の被分析物を分析するとき
は、これらのアッセイは、測定のために有意量の酵素生
成物を生成させるために長時間のインキュベーションを
必要とスル。
抗原の定量への究極的な有用性に深く影響することが示
されている。Ishikawaらはモノマー性非凝集t
ab /酵素接合体は、特サンドインチ型二重抗体イム
ノメトリック・アッセイにおいて最低の非特異的バック
グラウンドおよび最高の感度を与えることを報告してい
る〔工mmunoenzymatic Techniq
ues、 ed、s、 AvrajI18asElae
vier 5cience Publ、 B、 V、
pp、 219〜232(1983ン参照〕。モノマー
性Fab−酵素接合体は単一抗体イムノメトリック・ア
ッセイにおける性能を最大とするために必要でもある〔
工shikawa 、前掲書および同時係属特許出願(
xp −0458’)参照〕。しかしながら極めて低レ
ベル(<1 fmole )の被分析物を分析するとき
は、これらのアッセイは、測定のために有意量の酵素生
成物を生成させるために長時間のインキュベーションを
必要とスル。
抗体上の単一結合部位に単一#素分子を結合するための
共有結合法が知られている〔例えば、工magawaほ
か、J、 Appl、 Biocham、 4巻、40
0(1982)参照〕。
共有結合法が知られている〔例えば、工magawaほ
か、J、 Appl、 Biocham、 4巻、40
0(1982)参照〕。
凝集抗体−酵素接合体の信号発生が純モノマー性抗体−
酵素接合体のそれよりも高いことはこれまで長い間認め
られているところである。
酵素接合体のそれよりも高いことはこれまで長い間認め
られているところである。
凝集抗体−酵素接合体は一般に、非特異的結合化学、例
えばゲルタールアルデヒド架橋(糊vallおよびPe
rlmann、、工mmunoch@m1stry 8
巻、871(1971ン参照〕または過沃素酸塩酸化(
Booramaおよび5treefkerk、 J、工
mmuno1. Methods、 30巻、245(
1979) 参照〕などを用いて調製されている。こ
れら接合体の調製は、抗体または抗体断片が凝集コンプ
レックス内に深く埋設される可能性があるため抗原結合
目的には大刀近接し得ない状態にとどまる無秩序架橋法
よりなる。更に、これら無定形高分子コンプレックスは
再現性よく調製することが困難である。このような凝集
抗体−酵素接合体を利用するイムノアッセイには非特異
的結合の故に常にパックグラウンド・ブランクが極めて
高いという罐点があり、またイムノメトリック・アッセ
イで達成しうる究極的感度hs著しく低下してしまう〔
工shikawaほか、Ann、 C11m、 Bio
chem、、 19巻、379(1982)参照〕。
えばゲルタールアルデヒド架橋(糊vallおよびPe
rlmann、、工mmunoch@m1stry 8
巻、871(1971ン参照〕または過沃素酸塩酸化(
Booramaおよび5treefkerk、 J、工
mmuno1. Methods、 30巻、245(
1979) 参照〕などを用いて調製されている。こ
れら接合体の調製は、抗体または抗体断片が凝集コンプ
レックス内に深く埋設される可能性があるため抗原結合
目的には大刀近接し得ない状態にとどまる無秩序架橋法
よりなる。更に、これら無定形高分子コンプレックスは
再現性よく調製することが困難である。このような凝集
抗体−酵素接合体を利用するイムノアッセイには非特異
的結合の故に常にパックグラウンド・ブランクが極めて
高いという罐点があり、またイムノメトリック・アッセ
イで達成しうる究極的感度hs著しく低下してしまう〔
工shikawaほか、Ann、 C11m、 Bio
chem、、 19巻、379(1982)参照〕。
Learyらはモノマー註醇素なジスク7ンイミジルス
ベレートで架橋することによる重合アルカリ性ホスファ
ターゼの形成を報告している。
ベレートで架橋することによる重合アルカリ性ホスファ
ターゼの形成を報告している。
次いでその、d IJママ−酵素はビオチニル−ε−ア
ミノカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
でビオチニル化された。そのビオチニル化酵素を次に過
剰のアビジンと反応させ總生成接合体を次いでビオチニ
ル化核酸プローブと反応させろと重合酵素がプローブに
対し非共有結合的に結合した。[Learyほか、
P、N、A、S。
ミノカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
でビオチニル化された。そのビオチニル化酵素を次に過
剰のアビジンと反応させ總生成接合体を次いでビオチニ
ル化核酸プローブと反応させろと重合酵素がプローブに
対し非共有結合的に結合した。[Learyほか、
P、N、A、S。
(σ、3.A、)、 80巻、4045(1983)参
照 〕。
照 〕。
非共有結合化学を利用して高い酵素対抗比をもって抗体
−酵素接合体を生成させる多(の方法が報告されている
。例えばButlerは、ペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ抗体またはホスファターゼ−抗ホスファター
ゼ抗体という免疫コンプレックスよりなる抗体−酵素接
合体を記載している。(Butler、 Method
s Knzymol、。
−酵素接合体を生成させる多(の方法が報告されている
。例えばButlerは、ペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ抗体またはホスファターゼ−抗ホスファター
ゼ抗体という免疫コンプレックスよりなる抗体−酵素接
合体を記載している。(Butler、 Method
s Knzymol、。
73巻ユニ82〜523(1981)参照) 。Ho1
beckおよびNepomはプロティンAおよび抗−プ
ロチインへ−西洋わさびペルオキシダーゼ接合体ノコン
プレックスよりなる抗体−酵素接合体を記載している(
Ho1beckおよびNo pom 、 、T、工f
fLmuno l。
beckおよびNepomはプロティンAおよび抗−プ
ロチインへ−西洋わさびペルオキシダーゼ接合体ノコン
プレックスよりなる抗体−酵素接合体を記載している(
Ho1beckおよびNo pom 、 、T、工f
fLmuno l。
Methods、 60巻、47(1983)参照)。
Guesdo nらはワシ血清アルブミンと#索標識抗
りシ血臂アルブミン抗体との接合体を用いた抗体−鉢累
コンプレックスの調製方法をd己載している。
りシ血臂アルブミン抗体との接合体を用いた抗体−鉢累
コンプレックスの調製方法をd己載している。
[Guasdonら、J、工mmuno1. Meth
ods、 58巻。
ods、 58巻。
133(1983)参照〕。最後に、Yolkenらは
アビジンと醇素標識ビオナンとのコンプレックスよりな
る抗体−#素接合体を記載している。
アビジンと醇素標識ビオナンとのコンプレックスよりな
る抗体−#素接合体を記載している。
[YOlkonほか、J、工mmuno1. Meth
ods 、 56巻。
ods 、 56巻。
319(1983)参照]。前述の方法にはすべて、抗
体の酵素への結合が共有結合でないため、望ましくない
解離を受けやすい可逆的結合が生じるという欠点がある
。
体の酵素への結合が共有結合でないため、望ましくない
解離を受けやすい可逆的結合が生じるという欠点がある
。
もとの醇索活性およびもとの免役反応性のいずれもが維
持されている、共有結合的に結合されたポリマー性醇素
/抗体接合体を調製するための再現性の高い方法が必要
とされている。
持されている、共有結合的に結合されたポリマー性醇素
/抗体接合体を調製するための再現性の高い方法が必要
とされている。
この必要性は本発明により満たされる。本発明は一面に
おいて、次の工程、すなわち、(&) 少くとも2つ
の酵素分子を共M結合的に結合させて予め重合した酵素
を生成させ、そして (1)) 予め重合した酵素を抗体またはその断片に
共有結合的に結合させる 工程よりなるポリマー性#素/抗体接合体の製造方法で
ある。
おいて、次の工程、すなわち、(&) 少くとも2つ
の酵素分子を共M結合的に結合させて予め重合した酵素
を生成させ、そして (1)) 予め重合した酵素を抗体またはその断片に
共有結合的に結合させる 工程よりなるポリマー性#素/抗体接合体の製造方法で
ある。
もう一つの面において、本発明は予め重合された酵素と
抗体または抗体断片との共有結合接合体を用いるイムノ
アッセイに関する。
抗体または抗体断片との共有結合接合体を用いるイムノ
アッセイに関する。
もう一つの面において、本発明は抗体と予め重合された
酵素との共有結合接合体である。
酵素との共有結合接合体である。
一般に本発明の方法は、イムノアッセイに用いられる抗
体に結合されうる実質的にすべての酵素に適用される。
体に結合されうる実質的にすべての酵素に適用される。
適切な酵素は、
!−D−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、
西洋わさびペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼ、
β−ラクタマーゼ、
グルコース−6−ホス7エートデヒドロゲナーゼ、ウレ
アーゼ、 ウリカーゼ、 スーパーオキシドディスムターゼ ルシ7工2−ゼ、 ピルベートキナーゼ、 ラクテートデヒドロゲナーゼ、 ガラクトースオキシダーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 エンテロキナーゼ チロ7ナーゼ、および キサンチンオキシダーゼ である。
アーゼ、 ウリカーゼ、 スーパーオキシドディスムターゼ ルシ7工2−ゼ、 ピルベートキナーゼ、 ラクテートデヒドロゲナーゼ、 ガラクトースオキシダーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 エンテロキナーゼ チロ7ナーゼ、および キサンチンオキシダーゼ である。
好ましい酵素はβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、およびア
ルカリ性ホスファターゼである。極めて好ましいものは
β−D−ガラクトシダーゼである。
オキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、およびア
ルカリ性ホスファターゼである。極めて好ましいものは
β−D−ガラクトシダーゼである。
β−D−ガラクトシダーゼは細菌である大腸菌(K、
coli)から精製される酵素であり、また商業的に入
手しつる。この酵素はいくつかの望ましい特徴を有して
いる。すなわち、 (&) それは、極めて高い酵素ターンオーA +
a(enz)rmic turnover numbe
r)を有する:(b) それは簡単な比色測定用基質
を有する;(C) それは比較的安定な酵素である:
(a) それは大抵の生物学的標本からの干渉がない
;そして極めて重要な点として (e) それは酵素活性には必要とされない多数(1
2〜20)の遊離スルフヒドリル基を茨面のあたりに有
している。
coli)から精製される酵素であり、また商業的に入
手しつる。この酵素はいくつかの望ましい特徴を有して
いる。すなわち、 (&) それは、極めて高い酵素ターンオーA +
a(enz)rmic turnover numbe
r)を有する:(b) それは簡単な比色測定用基質
を有する;(C) それは比較的安定な酵素である:
(a) それは大抵の生物学的標本からの干渉がない
;そして極めて重要な点として (e) それは酵素活性には必要とされない多数(1
2〜20)の遊離スルフヒドリル基を茨面のあたりに有
している。
共有結合的に結合された酵素の高分子コンプレックスは
所定の架橋剤を用いてその酵素を所定の官能基を介して
架橋することにより合成することができる。適当な架橋
剤は例えば以下に列挙されるようなホモ2官能性剤、お
よびヘテロ2官能性剤である。
所定の架橋剤を用いてその酵素を所定の官能基を介して
架橋することにより合成することができる。適当な架橋
剤は例えば以下に列挙されるようなホモ2官能性剤、お
よびヘテロ2官能性剤である。
重合されるべき酵素がβ−D−ガラクトシダーゼである
場合には、フォール特異性ホモ2官能性jlilJ o
−;yエニレンジマレイミドが好ましい。
場合には、フォール特異性ホモ2官能性jlilJ o
−;yエニレンジマレイミドが好ましい。
ヘテロ2官能性架橋剤
m−マレイミトヘンゾイルN−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル N−スクシンイミジル5−(2−ピリジルジチオ)プロ
ビオネート スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン−1−カルボキシレートスフクンイミジル−4
−(p−マレイミドフェニル)ブチレート N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベ
ンゾエート マレイミドヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル m−マレイミドベンゾイルスルフォスフシンイミドエス
テル スルフォスフシンイミジル4−(N−マレイミドメチル
)フクロヘキサン−1−カルボギアレート スル7オスクンンイミジル4−(p−マレイミドフェニ
ル)ブチレート N−5−アジド−2−ニトロベンゾイルオキシスクシン
イミド、 N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−アジドベンゾエ
ート スルフォスフシンイミジル6−(4’−アジド−2′−
二トロフェニルアミノ)−ヘキサノエート ホモ2官能性架橋剤 0−7二二レンジマレイミト 3.3’ −’、;チオビス(スルフォスクシンイミジ
ルプロピオネート) ビス(スルフォスフシンイミジル)スベレート ビス(マレイミド)メチルエステル ジメチルスベリミデート・2に−ICI。
ドエステル N−スクシンイミジル5−(2−ピリジルジチオ)プロ
ビオネート スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン−1−カルボキシレートスフクンイミジル−4
−(p−マレイミドフェニル)ブチレート N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベ
ンゾエート マレイミドヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル m−マレイミドベンゾイルスルフォスフシンイミドエス
テル スルフォスフシンイミジル4−(N−マレイミドメチル
)フクロヘキサン−1−カルボギアレート スル7オスクンンイミジル4−(p−マレイミドフェニ
ル)ブチレート N−5−アジド−2−ニトロベンゾイルオキシスクシン
イミド、 N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−アジドベンゾエ
ート スルフォスフシンイミジル6−(4’−アジド−2′−
二トロフェニルアミノ)−ヘキサノエート ホモ2官能性架橋剤 0−7二二レンジマレイミト 3.3’ −’、;チオビス(スルフォスクシンイミジ
ルプロピオネート) ビス(スルフォスフシンイミジル)スベレート ビス(マレイミド)メチルエステル ジメチルスベリミデート・2に−ICI。
ジメチルピメリミデート
ジメチルアジピミデート
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート )
重合方法は、所定サイズのポリマーの形成を制御できか
つ再現性よ(行うことができる条件下に実施される。酵
素のa度、緩衝剤の[)d、架橋剤に対する遊離官能性
基の化学量論、温度および反応時間はすべてこの制御可
能なプロセスを達成する上で重要な要因である。
つ再現性よ(行うことができる条件下に実施される。酵
素のa度、緩衝剤の[)d、架橋剤に対する遊離官能性
基の化学量論、温度および反応時間はすべてこの制御可
能なプロセスを達成する上で重要な要因である。
例えば、高タンパク濃度では、重合は、ポリマー性酵素
がゲル化し溶液から析出し【くる程に急速に生じる。他
方、5#素濃度が低過ぎると、重合は極めて僅かしか起
こらない。反応の−lは、水性溶液中での架橋剤の安定
性および酵素の相対的−感受性に対し重要な要因である
。一般にこれらの架橋剤は水に極めて難溶性であり、ま
た6、0以上のpi(では水性溶液中で迅速に加水分解
する。従って反応の−は、架橋剤の不安定性および非中
性声に対する#素の感受性のバランスがとれるよう注意
深(選択されなければならない。反応温度および時間も
重要である。その理由にはこの場合も架橋剤の不安定性
および至適−よりも低い声に晒された場合の酵素の失活
可能性が挙げられろ。最後に、架橋剤と架橋されるべき
酵素上の官能基の化学量論は好ましい重合度を達成する
上で重要である。この至適化学量論は実験的に決定され
なければならず、また各酵素および/または架橋剤ごと
にいくらか異なる可能性ρ・大ぎい。
がゲル化し溶液から析出し【くる程に急速に生じる。他
方、5#素濃度が低過ぎると、重合は極めて僅かしか起
こらない。反応の−lは、水性溶液中での架橋剤の安定
性および酵素の相対的−感受性に対し重要な要因である
。一般にこれらの架橋剤は水に極めて難溶性であり、ま
た6、0以上のpi(では水性溶液中で迅速に加水分解
する。従って反応の−は、架橋剤の不安定性および非中
性声に対する#素の感受性のバランスがとれるよう注意
深(選択されなければならない。反応温度および時間も
重要である。その理由にはこの場合も架橋剤の不安定性
および至適−よりも低い声に晒された場合の酵素の失活
可能性が挙げられろ。最後に、架橋剤と架橋されるべき
酵素上の官能基の化学量論は好ましい重合度を達成する
上で重要である。この至適化学量論は実験的に決定され
なければならず、また各酵素および/または架橋剤ごと
にいくらか異なる可能性ρ・大ぎい。
至適な架橋が達成された後、過剰の架橋剤または酵素上
の官能基を消費する適当なりエンチング剤を添加するこ
とにより止めることができる。重合された酵素はゲル濾
過クロマトグラフィにより反応混合物から分離すること
ができ、それによって既知サイズの純粋な重分された均
質高分子植’t 4ることかできる。
の官能基を消費する適当なりエンチング剤を添加するこ
とにより止めることができる。重合された酵素はゲル濾
過クロマトグラフィにより反応混合物から分離すること
ができ、それによって既知サイズの純粋な重分された均
質高分子植’t 4ることかできる。
次に抗体、好ましくはFab’−8H断片を、重合反応
の停止に用いられた架橋剤または第2の部位特異性架橋
剤の導入により提供される過剰の官能基を介してJ リ
マー性酵素の「外側」に結合させる。抗体−酵素接合体
の化学量論は、イムノアッセイにおける感度が最高とな
りそしてバックグラウンド活性が最低となるように注意
深(選択することができる。この至適化は、抗体(また
は抗体断片)をポリマー性酵素に様々なモル比で結合さ
せ、次いで生成接合体を所定のイムノアッセイで試験す
ることにより実験的に行われなければならない。一般に
、当該被分析物に対する単因子抗体を用いるのが望まし
い。
の停止に用いられた架橋剤または第2の部位特異性架橋
剤の導入により提供される過剰の官能基を介してJ リ
マー性酵素の「外側」に結合させる。抗体−酵素接合体
の化学量論は、イムノアッセイにおける感度が最高とな
りそしてバックグラウンド活性が最低となるように注意
深(選択することができる。この至適化は、抗体(また
は抗体断片)をポリマー性酵素に様々なモル比で結合さ
せ、次いで生成接合体を所定のイムノアッセイで試験す
ることにより実験的に行われなければならない。一般に
、当該被分析物に対する単因子抗体を用いるのが望まし
い。
アフイニテイ精製による単因子抗体剤の調製方法は当該
技術分野において周知である〔Weir。
技術分野において周知である〔Weir。
D、M、、 Handbook of Experim
ental工mmunolog7゜B工ackvrel
l Sci、 Publ、 、 London、第3版
、1978年〕。抗体はポリクローナルまたはモノクロ
ーナルのいずれの起源のものであってもよい。−価抗体
断片、すなわち、抗原結合部位を1つしかもたないもの
は、当該技術分野においてやはり周知の方法によりアフ
イニテイ精製抗体から調製することができる。
ental工mmunolog7゜B工ackvrel
l Sci、 Publ、 、 London、第3版
、1978年〕。抗体はポリクローナルまたはモノクロ
ーナルのいずれの起源のものであってもよい。−価抗体
断片、すなわち、抗原結合部位を1つしかもたないもの
は、当該技術分野においてやはり周知の方法によりアフ
イニテイ精製抗体から調製することができる。
例えば、 Fab−断片は工gGのパ/ぐイン消化に
より得られる;ハb′断片は!gGのペプシン消化によ
り得られるF(ILI)92のジスルフィド還元により
得られる。半一抗体は工gGの選択的サルファイド分解
により得られる。これらの方法は前掲のWeir、 D
IIMII o r Handbook Of Kxp
erimentaIImmunology Jに記載さ
れている。
より得られる;ハb′断片は!gGのペプシン消化によ
り得られるF(ILI)92のジスルフィド還元により
得られる。半一抗体は工gGの選択的サルファイド分解
により得られる。これらの方法は前掲のWeir、 D
IIMII o r Handbook Of Kxp
erimentaIImmunology Jに記載さ
れている。
ヒンジ領域に遊離スルフヒドリルを有する抗体断片(例
えばFab’−8Hまたは半−工gG )を利用するこ
とが望ましい。何故なら、ポリマー性酵素コンプレック
スをこれらチオールを通して、スルフヒドリル特異性架
橋剤〔例えば、0−フエニVンジマVイミドまたはスク
シンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキ
サン−1−カルボキシレート〕を用いて結合させること
ができ、従ってそのグミストリーおよび結合を抗体結合
部位から遠位に離間された状態に維持できるからである
。ポリマー性酵素を抗体分子の炭水化物部分を通して結
合させる場合にもそれと同じことがいえる。前者の方が
好ましいが、適当な部位特異的架橋剤を用いて抗体のア
ミン基またはカルボキシル基を通して結合を達成するこ
とができる。
えばFab’−8Hまたは半−工gG )を利用するこ
とが望ましい。何故なら、ポリマー性酵素コンプレック
スをこれらチオールを通して、スルフヒドリル特異性架
橋剤〔例えば、0−フエニVンジマVイミドまたはスク
シンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキ
サン−1−カルボキシレート〕を用いて結合させること
ができ、従ってそのグミストリーおよび結合を抗体結合
部位から遠位に離間された状態に維持できるからである
。ポリマー性酵素を抗体分子の炭水化物部分を通して結
合させる場合にもそれと同じことがいえる。前者の方が
好ましいが、適当な部位特異的架橋剤を用いて抗体のア
ミン基またはカルボキシル基を通して結合を達成するこ
とができる。
これら、451Jマー性酵素−抗体接合体を二重抗体ま
たは単一抗体イムノメトリック・アッセイに用いると信
号発生が高まり、従ってアッセイ時間は短縮され、また
全体としての感度は高まる。更にまた、これら抗体−酵
素接合体の調製方法により、酵素および免疫反応性の維
持は最大となりそして非特異的吸着は最小となる。
たは単一抗体イムノメトリック・アッセイに用いると信
号発生が高まり、従ってアッセイ時間は短縮され、また
全体としての感度は高まる。更にまた、これら抗体−酵
素接合体の調製方法により、酵素および免疫反応性の維
持は最大となりそして非特異的吸着は最小となる。
本発明を次の非制限的実施例により説明する。
実施例 1
β−D−ガラクトシダーゼ0重合およびFab’−8H
への結合 (凍結乾燥した)/−D−ガラクトシダーゼヲ0.05
M Tris−HCA%0.15M Na0J!、0.
0001MMgOj!2、α002M N!1DTA(
pH6,5)に様々な濃度(1〜4〜/−タンパク)で
溶解し、次に5倍モル過剰の0−2二二レンジマレイミ
ド(N、N’−ジメチルホルムアミドに11M1/dl
11度で溶解ンで処理した。4℃で16時間反応させた
後、付加的アlJ:’−)(200倍モル過剰)の0−
7二二レンジマレイミドを添加した。25℃で45分間
インキュベートした後、その酵素混合物を、同じτri
g−NaC1−MgC12緩衝液(IDTA不使用)で
平衡したEiephadex G−25カラム(1,5
X40m)にかけ九下記の表は、重合工程に用いられた
β−D−ガ2クトシダーゼの儂度がポリマー性酵素接合
体の究極的なサイズおよびその特異的鉢素活性にどのよ
うに影響するかを示している。
への結合 (凍結乾燥した)/−D−ガラクトシダーゼヲ0.05
M Tris−HCA%0.15M Na0J!、0.
0001MMgOj!2、α002M N!1DTA(
pH6,5)に様々な濃度(1〜4〜/−タンパク)で
溶解し、次に5倍モル過剰の0−2二二レンジマレイミ
ド(N、N’−ジメチルホルムアミドに11M1/dl
11度で溶解ンで処理した。4℃で16時間反応させた
後、付加的アlJ:’−)(200倍モル過剰)の0−
7二二レンジマレイミドを添加した。25℃で45分間
インキュベートした後、その酵素混合物を、同じτri
g−NaC1−MgC12緩衝液(IDTA不使用)で
平衡したEiephadex G−25カラム(1,5
X40m)にかけ九下記の表は、重合工程に用いられた
β−D−ガ2クトシダーゼの儂度がポリマー性酵素接合
体の究極的なサイズおよびその特異的鉢素活性にどのよ
うに影響するかを示している。
第1表
monomer 540,000 6391
.0 3,400.000 5302.0
18,000,000 529五0 39−6
6.000,000 6034.0 714−8
70,000,000 562*Sθphacryl
S−1000カラムでの溶出位置により測定カラムか
らボイド容量ずつ溶出させたβ−D−ガラクトシダーゼ
ポリマーを様々なto用時還元アフイニテイ精製F′a
b’−8H断片と合一させ九B’abLSH断片は、ウ
アバイン−アガロースカラムでの一工程アフイニテイク
ロマトグラフイにおいてジゴキシン−ウシ血清アルブミ
/に対するウサギ抗血清よりそれ自体免疫精製されたジ
ゴキシン特異的工g()から調製された。この手順の詳
細は、更に、Freytagらによって記載されている
( C11n、 Chem、 、 84巻、417(1
984)参照〕。ジゴキシン特異的工gGは、ドデシル
硫酸ナトリクムポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
した場合795チの純度であり、また1409M−1の
アフイニテイ定数を有した。その工gGをやはり前述の
方法と同様にして[EPreytagほか、前掲書参照
〕、ペプシン消化によりEl’(ab’)2断片に変え
た。
.0 3,400.000 5302.0
18,000,000 529五0 39−6
6.000,000 6034.0 714−8
70,000,000 562*Sθphacryl
S−1000カラムでの溶出位置により測定カラムか
らボイド容量ずつ溶出させたβ−D−ガラクトシダーゼ
ポリマーを様々なto用時還元アフイニテイ精製F′a
b’−8H断片と合一させ九B’abLSH断片は、ウ
アバイン−アガロースカラムでの一工程アフイニテイク
ロマトグラフイにおいてジゴキシン−ウシ血清アルブミ
/に対するウサギ抗血清よりそれ自体免疫精製されたジ
ゴキシン特異的工g()から調製された。この手順の詳
細は、更に、Freytagらによって記載されている
( C11n、 Chem、 、 84巻、417(1
984)参照〕。ジゴキシン特異的工gGは、ドデシル
硫酸ナトリクムポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
した場合795チの純度であり、また1409M−1の
アフイニテイ定数を有した。その工gGをやはり前述の
方法と同様にして[EPreytagほか、前掲書参照
〕、ペプシン消化によりEl’(ab’)2断片に変え
た。
Fab’−8Hの各種マレイミド−β−ガラクトシダー
ゼポリマーへの接合を4℃で16時時間待させた後、そ
れら様々な接合体をElephacryl S −10
00(Pharmacia Fine Chemica
ls、 Uppsala。
ゼポリマーへの接合を4℃で16時時間待させた後、そ
れら様々な接合体をElephacryl S −10
00(Pharmacia Fine Chemica
ls、 Uppsala。
8weasn )でのカラムクロマトグラフィにかけた
。
。
接合体のピーク溶出位置は抗体−酵素接合体の分子サイ
ズ測定を可能にした。
ズ測定を可能にした。
アクイニテイカラムー介在イムノメトリック会アッセイ
各種tab’ −g IJマー性β−ガラクトシダーゼ
接合体の性能をジゴキシンのアフイニテイカラムー介在
イムノメトリック・アッセイで分析した。このアッセイ
は、まずアリコートの各種Fab’−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体(1〜10μL)を様々な量のジゴキシン(
0、α5.1.5.3.5および5.0IIq/d)を
含有する血清キャリブレータ−(iooμ2)と混合す
ることにより行った。室温で10〜15分間ブレインキ
ュベーション行った後、その反応混合物を、ウアバイン
−ウシ血清アルプミンアフイニテイカラム(0,5X1
3crn)を通して1rnt/分の流速で溶出した。カ
ラムから溶出したβ−ガラクトシダーゼ活性の量を、0
.05M Tris−Han (PH7,5)、cLl
5M Na0A、 0.001M MgO!2に溶解
された2、5mMo−ニトロフェニルガラクトピラノシ
ドを用い37℃で分光測光的に定量した。酵素的に生じ
たO−ニトロフェル−トイオンによる吸光度変化を4’
O5nmで測定した。
接合体の性能をジゴキシンのアフイニテイカラムー介在
イムノメトリック・アッセイで分析した。このアッセイ
は、まずアリコートの各種Fab’−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体(1〜10μL)を様々な量のジゴキシン(
0、α5.1.5.3.5および5.0IIq/d)を
含有する血清キャリブレータ−(iooμ2)と混合す
ることにより行った。室温で10〜15分間ブレインキ
ュベーション行った後、その反応混合物を、ウアバイン
−ウシ血清アルプミンアフイニテイカラム(0,5X1
3crn)を通して1rnt/分の流速で溶出した。カ
ラムから溶出したβ−ガラクトシダーゼ活性の量を、0
.05M Tris−Han (PH7,5)、cLl
5M Na0A、 0.001M MgO!2に溶解
された2、5mMo−ニトロフェニルガラクトピラノシ
ドを用い37℃で分光測光的に定量した。酵素的に生じ
たO−ニトロフェル−トイオンによる吸光度変化を4’
O5nmで測定した。
第2表は、抗体−酵素接合体の分子サイズおよびF’a
b’−断片:β−D−ガラクトシダーゼモル比が、バッ
クグラウンドおよびアッセイ感度としてみた全体的アッ
セイ性能にどのように影響するかを示している。
b’−断片:β−D−ガラクトシダーゼモル比が、バッ
クグラウンドおよびアッセイ感度としてみた全体的アッ
セイ性能にどのように影響するかを示している。
第2表
540.000 1/1 0.020 α0
1013.000,000 47/1 α044
α02513.000.000 24/1
0.145 α06820.000,000 3
0/1 [1101G、03520.000,00
0 20/1 0.223 0.06635.0
00,000 40/1 α075 α10
8714.000.000 793/1 0.378
0.308上記データから分かるように、ホリマ
ー性β−ガラクトシダーゼの分子量が大きい程、このア
ッセイで達成しうる最高感度が太き(なる一般的傾向が
ある。また、所定の分子量の任意の、4 +)マー性β
−ガラクトシダーゼについては1、d リマー性β−ガ
ラクトシダーゼ1個あたりに結合する抗体部位数が多い
程パツクグラウ・“ンド・ブランク活性および感度が低
(なる。
1013.000,000 47/1 α044
α02513.000.000 24/1
0.145 α06820.000,000 3
0/1 [1101G、03520.000,00
0 20/1 0.223 0.06635.0
00,000 40/1 α075 α10
8714.000.000 793/1 0.378
0.308上記データから分かるように、ホリマ
ー性β−ガラクトシダーゼの分子量が大きい程、このア
ッセイで達成しうる最高感度が太き(なる一般的傾向が
ある。また、所定の分子量の任意の、4 +)マー性β
−ガラクトシダーゼについては1、d リマー性β−ガ
ラクトシダーゼ1個あたりに結合する抗体部位数が多い
程パツクグラウ・“ンド・ブランク活性および感度が低
(なる。
至適化された予め重合した酵素(分子量2C1,000
,000およびF′ab’/β−ガラクトシダーゼモル
比20)を用いて達成しうる感度増加と七ツマー性酵素
接合体を用いた場合とを直接比較したのが第1図である
。七ツマー性接合体を用いると直線状検量曲線が得られ
るものの、予め重合したtFab′−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体を用いろと感度が20〜50倍高くなる。
,000およびF′ab’/β−ガラクトシダーゼモル
比20)を用いて達成しうる感度増加と七ツマー性酵素
接合体を用いた場合とを直接比較したのが第1図である
。七ツマー性接合体を用いると直線状検量曲線が得られ
るものの、予め重合したtFab′−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体を用いろと感度が20〜50倍高くなる。
カラム介在二重抗体イムノメトリック・アッセイEI′
ab′−ポリマー性β−ガラクトシダーゼ接合体(分子
量= 35,000,000 : [Fab’/β−G
ap w40/1)の性能をサンドイッチ型二重抗体イ
ムノメトリック・アッセイにおいてFab’モノマー性
−β−ガラクトシダーゼ接合体のそれと比較した。被分
析物であるジゴキシンは、次の方法を用いて7〜12個
のジゴキシン分子をウシ血清アルブミンに共有結合的に
結合させることによりポリエピトーピック(polye
pitopic ) (すなわち多重的に存在する抗原
決定基を有するよう)にした。すなわち、結晶性ジゴキ
シン(1,251)を75−のエタノールに溶解し、次
いで1、83 Fのメタ過沃素酸ナトリウム(Na工0
4)を含有する水150rntと合一した。(暗所で)
攪拌しながら室温(20〜30℃)で2時間経過させた
後、その混合物を100−のDowex j XX 8
陰イオン交換樹脂(Bio −Raa Laborat
ories、 Rlchmond。
ab′−ポリマー性β−ガラクトシダーゼ接合体(分子
量= 35,000,000 : [Fab’/β−G
ap w40/1)の性能をサンドイッチ型二重抗体イ
ムノメトリック・アッセイにおいてFab’モノマー性
−β−ガラクトシダーゼ接合体のそれと比較した。被分
析物であるジゴキシンは、次の方法を用いて7〜12個
のジゴキシン分子をウシ血清アルブミンに共有結合的に
結合させることによりポリエピトーピック(polye
pitopic ) (すなわち多重的に存在する抗原
決定基を有するよう)にした。すなわち、結晶性ジゴキ
シン(1,251)を75−のエタノールに溶解し、次
いで1、83 Fのメタ過沃素酸ナトリウム(Na工0
4)を含有する水150rntと合一した。(暗所で)
攪拌しながら室温(20〜30℃)で2時間経過させた
後、その混合物を100−のDowex j XX 8
陰イオン交換樹脂(Bio −Raa Laborat
ories、 Rlchmond。
CA 94804 )床に通すことによって酸化を停止
させた。その溶出液をウシ血清アルブミンの溶液(2,
51を100m/のα6M燐酸ナトリウム緩衝液(pH
a5)に溶解)と合一した。20〜23℃で1時間経過
後、0.241の固体ナトリウムシアノボロハイドライ
ドを混合しながら添加し、その溶液を20〜26℃で4
8時間反応させた。未接合ジゴキシンおよび反応副生物
を、流蒸留水に対して2日間そして次に20谷のcLo
15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)、(L1
5MNaOλに対して4℃で透析(ビスキング(Vil
iking )膜、6000〜8000分子量カットオ
フ)することによりその溶液から除去した。
させた。その溶出液をウシ血清アルブミンの溶液(2,
51を100m/のα6M燐酸ナトリウム緩衝液(pH
a5)に溶解)と合一した。20〜23℃で1時間経過
後、0.241の固体ナトリウムシアノボロハイドライ
ドを混合しながら添加し、その溶液を20〜26℃で4
8時間反応させた。未接合ジゴキシンおよび反応副生物
を、流蒸留水に対して2日間そして次に20谷のcLo
15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)、(L1
5MNaOλに対して4℃で透析(ビスキング(Vil
iking )膜、6000〜8000分子量カットオ
フ)することによりその溶液から除去した。
固定された抗ジゴキシン支持体を合成した。
20d(Do、IM硼硼酸ナトタウ(1)Na5)に溶
解した26wl1のアフイニテイ精製抗ジゴキシン工g
Gを5Fのカルボジイミダゾールで活性化され調節され
た細孔を有するガラスピーズ〔カルボジイミダゾールで
活性化され、グリセロールで被覆され、調節された細孔
を有するガラスピーズ、細孔径250k、 120/2
00メツシユ、PierceOhemical Co、
、 Roakford、工L61105製〕と合一した
。一定したゆるやかな混合を加えながら4℃で16時間
反応させた後、それらガラスピーズな20rntの0.
1M硼酸ナトリウム(pHa5 )で洗浄し、次に1η
/−のヒト血清アルブミンを含む20W1tの0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液(m 7.0 )で再び合一した
。更に一夜4℃で反応させた後、それらガラスピーズを
α015M燐酸ナトリウム(pH7,0)、 α15
M Na0A (50(ld)で十分洗浄した。その樹
脂を使用のために、小さなカラム(5X80sm)に充
填した。
解した26wl1のアフイニテイ精製抗ジゴキシン工g
Gを5Fのカルボジイミダゾールで活性化され調節され
た細孔を有するガラスピーズ〔カルボジイミダゾールで
活性化され、グリセロールで被覆され、調節された細孔
を有するガラスピーズ、細孔径250k、 120/2
00メツシユ、PierceOhemical Co、
、 Roakford、工L61105製〕と合一した
。一定したゆるやかな混合を加えながら4℃で16時間
反応させた後、それらガラスピーズな20rntの0.
1M硼酸ナトリウム(pHa5 )で洗浄し、次に1η
/−のヒト血清アルブミンを含む20W1tの0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液(m 7.0 )で再び合一した
。更に一夜4℃で反応させた後、それらガラスピーズを
α015M燐酸ナトリウム(pH7,0)、 α15
M Na0A (50(ld)で十分洗浄した。その樹
脂を使用のために、小さなカラム(5X80sm)に充
填した。
まず200μLアリコートの様々な量のジゴキシン−B
SAを含有する検体を約1Q Q fmolの抗体−酵
素接合体(前述の如く調製されたモノマー性またはポリ
マー性F!ab’−β−ガラクトシダーゼ)と混合する
ことによりアッセイ応答曲線を作成した。周囲温度(2
0〜23℃)で60分間インキュベーションした後、そ
の検体混合物を抗ジゴキシンー調整細孔ガラスカラムを
通して10μλ/θの流速で溶出し1次いで1.511
17!のα15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7,8)
を溶出した。
SAを含有する検体を約1Q Q fmolの抗体−酵
素接合体(前述の如く調製されたモノマー性またはポリ
マー性F!ab’−β−ガラクトシダーゼ)と混合する
ことによりアッセイ応答曲線を作成した。周囲温度(2
0〜23℃)で60分間インキュベーションした後、そ
の検体混合物を抗ジゴキシンー調整細孔ガラスカラムを
通して10μλ/θの流速で溶出し1次いで1.511
17!のα15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7,8)
を溶出した。
カラムを通して未結合画分に溶出したβ−ガラクトシダ
ーゼ活性量を3岬の0−ニトロフェニルガラクトピラノ
シドを含有する2、3dCD水を添加することにより定
量した。黄色(o−ニトロフェル−トイオン)の生成を
405 nmで分光測光的に測定した。そのデータを第
6図に示す。
ーゼ活性量を3岬の0−ニトロフェニルガラクトピラノ
シドを含有する2、3dCD水を添加することにより定
量した。黄色(o−ニトロフェル−トイオン)の生成を
405 nmで分光測光的に測定した。そのデータを第
6図に示す。
それら2種類の接合体の性能は免疫化学的感受性の点で
は同様であったが、ポリマー性酵素接合体の与える信号
生成は一段と大きかった。すなわち、ポリマー性酵素接
合体を用いた場合には結果を測定するための時間が相当
に短縮された。例えば0〜1.2X10 モルのジ
ゴキシン−BSAでは、ポリマー性酵素接合体を用いた
場合の405nmでの1分あたりの吸光度変化は0−0
15であったのに対し、モノマー性酵素接合体を用いた
場合の吸光度変化は0.002にすぎなかった。
は同様であったが、ポリマー性酵素接合体の与える信号
生成は一段と大きかった。すなわち、ポリマー性酵素接
合体を用いた場合には結果を測定するための時間が相当
に短縮された。例えば0〜1.2X10 モルのジ
ゴキシン−BSAでは、ポリマー性酵素接合体を用いた
場合の405nmでの1分あたりの吸光度変化は0−0
15であったのに対し、モノマー性酵素接合体を用いた
場合の吸光度変化は0.002にすぎなかった。
第3表
0 (L170 [1L0181.2
X 10−20(1164−−−−1,2XIC1”8
Q、156 α0161.2X10−16
0.142 0.0131.2X10−14
(11240,0081,2X10−12
[10520,004実施例 2 β−ガラクトシダーゼの重合および工gGへの結合β−
ガラクトシダーゼの重合 6■のβ−ガラクト7ダーゼ(酵素イムノアッセイ級、
Boehringer−Mannheim Corp、
工n6ianapolis。
X 10−20(1164−−−−1,2XIC1”8
Q、156 α0161.2X10−16
0.142 0.0131.2X10−14
(11240,0081,2X10−12
[10520,004実施例 2 β−ガラクトシダーゼの重合および工gGへの結合β−
ガラクトシダーゼの重合 6■のβ−ガラクト7ダーゼ(酵素イムノアッセイ級、
Boehringer−Mannheim Corp、
工n6ianapolis。
IN)を3−のα05 M Tris−FiOX (p
H7,0)、CL15MNa cl、、1mM MgC
j12.5mMFDTAに溶解し、次いで1.1μ2の
N、N’−ジメチルホルムアミドに溶解された14.7
μmの0−フェニレンジマレイミドと混合した。4℃で
16時間後、その混合物を前述したものと同じTris
−Naij!−MgOJ12−II)TA緩衝液を用い
て5ephadax G−25カラム(1,5X40c
m)でのクロマトグラフィにかけた。重合したβ−ガラ
クトシダーゼをボイド容量画分からプールした。
H7,0)、CL15MNa cl、、1mM MgC
j12.5mMFDTAに溶解し、次いで1.1μ2の
N、N’−ジメチルホルムアミドに溶解された14.7
μmの0−フェニレンジマレイミドと混合した。4℃で
16時間後、その混合物を前述したものと同じTris
−Naij!−MgOJ12−II)TA緩衝液を用い
て5ephadax G−25カラム(1,5X40c
m)でのクロマトグラフィにかけた。重合したβ−ガラ
クトシダーゼをボイド容量画分からプールした。
1−(α89HI)のβ−ヒト絨毛ゴナドトロピン(β
−hOG )に対するモノクローナルエgG[Hybr
itech Corporation、 13an D
iego、 c/k ]を12のα015M燐酸ナトリ
ウム(pH7,0)、cl、1 S M NaCJ&、
1 mM KDTAに対し4℃で16時間透析した。
−hOG )に対するモノクローナルエgG[Hybr
itech Corporation、 13an D
iego、 c/k ]を12のα015M燐酸ナトリ
ウム(pH7,0)、cl、1 S M NaCJ&、
1 mM KDTAに対し4℃で16時間透析した。
透析後、その抗体を5.9μkON、N’−ジメチルホ
ルムアミドに溶解された59μfのスクシンイミジル−
4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボキシレートと20〜25℃で1時間反応させた。そ
の混合物を、ao 15M燐酸ナトリウム(声7.0
) 、0.15MNa01゜1mM KDTA中で平衡
化した5ephadex G−25カラム(1,5X4
0crn)に通すことにより反応を止めた。
ルムアミドに溶解された59μfのスクシンイミジル−
4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボキシレートと20〜25℃で1時間反応させた。そ
の混合物を、ao 15M燐酸ナトリウム(声7.0
) 、0.15MNa01゜1mM KDTA中で平衡
化した5ephadex G−25カラム(1,5X4
0crn)に通すことにより反応を止めた。
力2ムのボイド容量として溶出するマレイミドー工g[
)をプールしそして加圧−過により1.13mまで濃縮
した。
)をプールしそして加圧−過により1.13mまで濃縮
した。
抗体のポリマー性酢素への接合は1.13d(Q、61
ni/ntt)の前記マレイミドーエgGを5.73−
の重合したβ−ガラクトシダーゼ(CL87〜/−)と
合一し、そして20時間4℃で混合することにより行っ
た。その混合物を加圧濾過することによりλ0−まで濃
縮し、次いで4℃で、α05MTris−Han(pH
7,5)、α15MNa0jl、Q、001 M Mg
OA2で平衡化した5epharose 4Bカラム(
1,5X90cIM)でのクロマトグラフィにかけた。
ni/ntt)の前記マレイミドーエgGを5.73−
の重合したβ−ガラクトシダーゼ(CL87〜/−)と
合一し、そして20時間4℃で混合することにより行っ
た。その混合物を加圧濾過することによりλ0−まで濃
縮し、次いで4℃で、α05MTris−Han(pH
7,5)、α15MNa0jl、Q、001 M Mg
OA2で平衡化した5epharose 4Bカラム(
1,5X90cIM)でのクロマトグラフィにかけた。
カラムのボイド容量中に溶出した工gG−β−ガラクト
シダーゼ接合体をプールしそして4℃で貯蔵した。
シダーゼ接合体をプールしそして4℃で貯蔵した。
β−hCGアフイニテイカラムの調製
10■のβ−hOG (Diosynth、 Ohic
ago、工L)を5tdOα1M硼酸ナトリウム緩衝液
(mas )に溶解し、5Fのカルボジイミダゾールで
活性化され、調整された細孔を有するガラスビーズ(O
DニーOPG 1Pierce Ohemical C
am 、 Rockfozd。
ago、工L)を5tdOα1M硼酸ナトリウム緩衝液
(mas )に溶解し、5Fのカルボジイミダゾールで
活性化され、調整された細孔を有するガラスビーズ(O
DニーOPG 1Pierce Ohemical C
am 、 Rockfozd。
工L)と合一し、そして4℃で16時間混合しへその樹
脂にα1M硼酸ナトリウム緩衝液に溶解されたウシ血清
アルブミンの10H1/m1ll液10dを添加し、そ
して4℃で更に16時間混合を続けた。そのアフイニテ
イ樹脂を次いでα15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7
,8)で十分洗浄した。
脂にα1M硼酸ナトリウム緩衝液に溶解されたウシ血清
アルブミンの10H1/m1ll液10dを添加し、そ
して4℃で更に16時間混合を続けた。そのアフイニテ
イ樹脂を次いでα15M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7
,8)で十分洗浄した。
β−hOGに対するアフイニテイカラム介在イムノメト
リック番アッセイ 100μぶのβ−hOGキャリブレータ−(0,5,1
0,25,50および100m工U/−)を5μ2の工
gG−!−ガ2クトシダーゼ接合体と20℃で60分間
混合した。それら検体を次に、再使用可能な!−hOG
アフイニテイカラム(3X15mm)を通して5μL/
秒の流速で連続的に溶出させ、次いで250μλの0.
15M燐酸ナトリウム緩@液(pH7,8)を溶出させ
た。アリコート(77μA)のカラム流出液を、それを
620μ2の2.5mMo−二トロフェニルガラクトシ
ドと67℃で合一させることによりアッセイした。黄色
(405nm )の生成を動力学的速度方式により分光
測光的に定量した。この用量一応答曲線の結果を第2図
に示す。この図に示された結果はβ−hOL)の検出の
ための従来技術の感度および速度を示す。
リック番アッセイ 100μぶのβ−hOGキャリブレータ−(0,5,1
0,25,50および100m工U/−)を5μ2の工
gG−!−ガ2クトシダーゼ接合体と20℃で60分間
混合した。それら検体を次に、再使用可能な!−hOG
アフイニテイカラム(3X15mm)を通して5μL/
秒の流速で連続的に溶出させ、次いで250μλの0.
15M燐酸ナトリウム緩@液(pH7,8)を溶出させ
た。アリコート(77μA)のカラム流出液を、それを
620μ2の2.5mMo−二トロフェニルガラクトシ
ドと67℃で合一させることによりアッセイした。黄色
(405nm )の生成を動力学的速度方式により分光
測光的に定量した。この用量一応答曲線の結果を第2図
に示す。この図に示された結果はβ−hOL)の検出の
ための従来技術の感度および速度を示す。
実施例 6
グルコースオキシダーゼの重合および工gGまたはr(
abつ2への結合 燐酸す) IJウム緩衝液(pH6,5)に溶解された
グルコースオキシダーゼ(1〜4〃l/−タンパクンを
25〜200倍モル過剰のN 、 N’−ジメチルホル
ムアミドに溶解されたS−アセチルメルカプトコハク酸
無水物と反応させる。20〜26℃で30〜60分間ま
たは4℃で一夜反応させた後、アリコートのα05Mヒ
ドロキシルアミン−aai (pH7、0)、1mM
FIDTAを30℃で5分間添加し、次いで、そのスル
フヒドリル−活性化#素を小さな(1,5840cm)
5ephadex e−25カラムで脱塩する。その
スルフヒドリル−活性化酵素をボイド容量画分として集
める。
abつ2への結合 燐酸す) IJウム緩衝液(pH6,5)に溶解された
グルコースオキシダーゼ(1〜4〃l/−タンパクンを
25〜200倍モル過剰のN 、 N’−ジメチルホル
ムアミドに溶解されたS−アセチルメルカプトコハク酸
無水物と反応させる。20〜26℃で30〜60分間ま
たは4℃で一夜反応させた後、アリコートのα05Mヒ
ドロキシルアミン−aai (pH7、0)、1mM
FIDTAを30℃で5分間添加し、次いで、そのスル
フヒドリル−活性化#素を小さな(1,5840cm)
5ephadex e−25カラムで脱塩する。その
スルフヒドリル−活性化酵素をボイド容量画分として集
める。
燐酸ナトリウム緩衝液CpH6,5)に溶解されたグル
コースオキシダーゼ(1〜5WII/r!L1.タンパ
クンノモウ一つの検体を10〜100倍モル過剰のスク
シンイミジル4−(N−マレイミドメチルンシクロヘキ
サン−1−カルボキシレート(sMcc)と20〜23
℃で30〜90分間反応させる。次いでその検体を小さ
な(1,5X 40 cm ) 5epadex G−
25カラムで脱塩する。マレイミド活性化酵素をポイド
容量画分として集める。
コースオキシダーゼ(1〜5WII/r!L1.タンパ
クンノモウ一つの検体を10〜100倍モル過剰のスク
シンイミジル4−(N−マレイミドメチルンシクロヘキ
サン−1−カルボキシレート(sMcc)と20〜23
℃で30〜90分間反応させる。次いでその検体を小さ
な(1,5X 40 cm ) 5epadex G−
25カラムで脱塩する。マレイミド活性化酵素をポイド
容量画分として集める。
スル7ヒドリルー活性化グルコースオキシダーゼとマレ
イミド活性化グルコースオキシダーゼとを様々なモル比
(例えば1:1,2:1、または1:2)で4〜16時
間4℃で合一する。その結合反応を次いで2−メルカプ
トエチルアミン(マレイミド含量に対しややモル過剰)
の添加によりクエンチし、そしてポリマー性酵素を5e
phaaex ()−25カラムで脱塩する。
イミド活性化グルコースオキシダーゼとを様々なモル比
(例えば1:1,2:1、または1:2)で4〜16時
間4℃で合一する。その結合反応を次いで2−メルカプ
トエチルアミン(マレイミド含量に対しややモル過剰)
の添加によりクエンチし、そしてポリマー性酵素を5e
phaaex ()−25カラムで脱塩する。
燐酸ナトリウム緩衝液(pH6,5)に溶解された工g
Gまたはtr(abう2断片(1〜5v/lntタンパ
ク)を20〜60倍モル過剰oaMccと20〜25℃
で50〜90分間反応させついで5ephadex G
−25カラムで脱塩する。マンイミド−活性化抗体を予
め重合したグルコースオキシダーゼと様々な酵素:抗体
比(例えば1:1.1:2または2二1)で合一し、そ
して4℃で16〜20時間反応させる。
Gまたはtr(abう2断片(1〜5v/lntタンパ
ク)を20〜60倍モル過剰oaMccと20〜25℃
で50〜90分間反応させついで5ephadex G
−25カラムで脱塩する。マンイミド−活性化抗体を予
め重合したグルコースオキシダーゼと様々な酵素:抗体
比(例えば1:1.1:2または2二1)で合一し、そ
して4℃で16〜20時間反応させる。
次いでその接合体をα1M燐酸ナトリウム緩衝液(pH
7,0)中で平衡した8epharose 4Bカラム
でのクロマトグラフィーにかけ、そしてその接合体をボ
イド容量画分として集める。この予め重合したグルコー
スオキシダーゼ−抗体接合体を単一または二重イムノメ
トリック・アッセイに用いれば、抗体とモノマー性グル
コースオキ7ダーゼとの接合体により生成される信号よ
りも信号発生が増大するものと期待される。
7,0)中で平衡した8epharose 4Bカラム
でのクロマトグラフィーにかけ、そしてその接合体をボ
イド容量画分として集める。この予め重合したグルコー
スオキシダーゼ−抗体接合体を単一または二重イムノメ
トリック・アッセイに用いれば、抗体とモノマー性グル
コースオキ7ダーゼとの接合体により生成される信号よ
りも信号発生が増大するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
第1図は至適化され予め重合した#累を用いて達成しう
る感度増加とモノマー性酵素接合体を用いた場合とを直
接比較したものであり、第2図はβ−hOGに対するア
フィニティヵラム介在イムノメトリック・アッセイ例の
用量応答曲線である。 FIG、1 (ジゴ渣シン)nc4/*L FIG、2 (hcGl mIU/mL
る感度増加とモノマー性酵素接合体を用いた場合とを直
接比較したものであり、第2図はβ−hOGに対するア
フィニティヵラム介在イムノメトリック・アッセイ例の
用量応答曲線である。 FIG、1 (ジゴ渣シン)nc4/*L FIG、2 (hcGl mIU/mL
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)(1)少くとも2つの酵素分子を共有結合的に結合
させて予め重合した酵素を生成させ、そして (2)予め重合した酵素を抗体またはその断片に共有結
合的に結合させる ことよりなるポリマー性酵素/抗体接合体の製造方法。 2)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ、β−ラクタマーゼ、グルコース−6−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ
、スーパーオキシドディスムターゼ、ルシフェラーゼ、
ピルベートキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ガ
ラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、エンテロキナーゼ、チロシナーゼおよびキサンチンオ
キシダーゼよりなる群から選択される特許請求の範囲第
1項記載の方法。 3)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリ
性ホスファターゼよりなる群から選択される特許請求の
範囲第2項記載の方法。 4)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼである特許請求の
範囲第3項記載の方法。 5)結合工程(1)が架橋剤を用いて行われる特許請求
の範囲第1項記載の方法。 6)架橋剤がホモ2官能性架橋剤である特許請求の範囲
第5項記載の方法。 7)ホモ2官能性架橋剤が、o−フェニレンジマレイミ
ド、3,3’−ジチオビス(スルフォスクシンイミジル
プロピオネート)、ビス(スルフォスクシンイミジル)
スベレート、ビス(マレイミド)メチルエステル、ジメ
チルスベリミデート・2HCl、ジメチルピメリミデー
ト、ジメチルアジピミデート、ジチオビス(スクシンイ
ミジルプロピオネート)よりなる群から選択される特許
請求の範囲第6項記載の方法。 8)架橋剤が、m−マレイミドベンゾイルN−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、N−スクシンイミジル3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、スクシンイミ
ジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1
−カルボキシレート、スクシンイミジル−4−(p−マ
レイミドフェニル)ブチレート、N−スクシンイミジル
(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート、マレイミ
ドヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、m−マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミド
エステル、スルフォスクシンイミジル4−(N−マレイ
ミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、
スルフォスクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニ
ル)ブチレート、N−5−アジド−2−ニトロベンゾイ
ルオキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−4−アジドベンゾエート、スルフォスクシンイミ
ジル6−(4’−アジド−2’−ニトロフェニルアミノ
)ヘキサノエートよりなる群から選択されるヘテロ2官
能性架橋剤である特許請求の範囲第5項記載の方法。 9)架橋剤がo−フェニレンジマレイミドである特許請
求の範囲第7項記載の方法。 10)結合工程(2)が架橋剤を用いて行われる特許請
求の範囲第1項記載の方法。 11)架橋剤がo−フェニレンジマレイミド、3、3’
−ジチオビス(スルフォスクシンイミジルプロピオネー
ト)、ビス(スルフォスクシンイミジル)スベレート、
ビス(マレイミド)メチルエステル、ジメチルスベリミ
デート・2HCl、ジメチルピメリミデート、ジメチル
アジピミデート、ジチオビス(スクシンイミジルプロピ
オネート)よりなる群から選択されるホモ2官能性架橋
剤である特許請求の範囲第10項記載の方法。 12)架橋剤がm−マレイミドベンゾイルN−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、N−スクシンイミジル3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、スクシンイミ
ジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1
−カルボキシレート、スクシンイミジル−4−(p−マ
レイミドフェニル)ブチレート、N−スクシンイミジル
(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート、マレイミ
ドヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、m−マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミド
エステル、スルフォスクシンイミジル4−(N−マレイ
ミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、
スルフォスクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニ
ル)ブチレート、N−5−アジド−2−ニトロベンゾイ
ルオキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−4−アジドベンゾエート、スルフォスクシンイミ
ジル6−(4’−アジド−2’−ニトロフェニルアミノ
)ヘキサノエートよりなる群から選択されたヘテロ2官
能性架橋剤である特許請求の範囲第10項記載の方法。 13)抗体またはその断片がIgG分子、Fab断片、
Fab′断片、F(ab′)_2断片または半分子であ
る特許請求の範囲第1項記載の方法。 14)Fab′断片がFab′−SH断片である特許請
求の範囲第13項記載の方法。 15)抗体がFab′−SH断片であり、酵素がβ−D
−ガラクトシダーゼであり、そして結合工程(1)およ
び(2)がo−フェニレンジマレイミドを用いて行われ
る特許請求の範囲第1項記載の方法。 16)(1)液体試料を酵素標識抗−被分析物抗体と接
触させて、 (i)酵素標識抗−被分析物抗体と被分析物とよりなる
コンプレックスおよび (ii)遊離酵素標識抗−被分析物抗体を形成し; (2)所望によりそのコンプレックスを遊離酵素標識抗
−被分析物抗体から分離し; (3)そのコンプレックスかまたは遊離酵素標識抗−被
分析物抗体の酵素活性を測定し;そして (4)その酵素活性を前記試料中に最初に存在した被分
析物量に関連付ける ことよりなる液体試料中の被分析物を測定するためのイ
ムノアッセイにおいて、前記酵素標識抗−被分析物抗体
として、予め重合した酵素と抗体またはその断片との共
有結合接合体を用いることを特徴とする前記イムノアッ
セイ。 17)被分析物がジゴキシンであり、そして共有結合接
合体がFab′断片と約20,000,000〜約35
,000,000の分子量の予め重合したβ−D−ガラ
クトシダーゼとよりなり、そのFab′断片;予め重合
したβ−D−ガラクトシダーゼのモル比がそれぞれ約2
0:1〜約40:1である特許請求の範囲第16項記載
の方法。 18)共有結合的に結合した少くとも2つの酵素分子よ
りなり、そして抗体またはその断片に共有結合的に結合
した予め重合した酵素よりなる接合体。 19)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ、グルコース−6−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ルシフェラーゼ
、ピルベートキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、
ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ、およびキサンチ
ンオキシダーゼよりなる群から選択される特許請求の範
囲第18項記載の接合体。 20)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカ
リ性ホスファターゼよりなる群から選択される特許請求
の範囲第19項記載の接合体。 21)酵素がβ−D−ガラクトシダーゼである特許請求
の範囲第20項記載の接合体。 22)抗体またはその断片がFab′断片である特許請
求の範囲第21項記載の接合体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20194785A JPS6173067A (ja) | 1984-09-14 | 1985-09-13 | 重合化酵素と抗体との共有結合接合体を用いるイムノアツセイ |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US650868 | 1984-09-14 | ||
JP20194785A JPS6173067A (ja) | 1984-09-14 | 1985-09-13 | 重合化酵素と抗体との共有結合接合体を用いるイムノアツセイ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6173067A true JPS6173067A (ja) | 1986-04-15 |
Family
ID=16449411
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20194785A Pending JPS6173067A (ja) | 1984-09-14 | 1985-09-13 | 重合化酵素と抗体との共有結合接合体を用いるイムノアツセイ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6173067A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6345561A (ja) * | 1986-07-24 | 1988-02-26 | マイルス・インコーポレーテッド | ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 |
JPH02173569A (ja) * | 1988-12-27 | 1990-07-05 | Teijin Ltd | ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット |
JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
-
1985
- 1985-09-13 JP JP20194785A patent/JPS6173067A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6345561A (ja) * | 1986-07-24 | 1988-02-26 | マイルス・インコーポレーテッド | ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 |
JPH0535990B2 (ja) * | 1986-07-24 | 1993-05-27 | Miles Inc | |
JPH02173569A (ja) * | 1988-12-27 | 1990-07-05 | Teijin Ltd | ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット |
JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
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