JP3896303B2

JP3896303B2 - チトクロムｃ測定によるｓｉｒｓにおける多臓器不全の検査試薬

Info

Publication number: JP3896303B2
Application number: JP2002129478A
Authority: JP
Inventors: 文夫遠藤; 尚登足立; 博幸布井; 啓祐渡辺
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-05-01
Publication date: 2007-03-22
Anticipated expiration: 2022-05-01
Also published as: JP2003028860A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome; SIRS）における多臓器不全の検査方法及び検査試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
SIRSは、全身性エリテマトーデス (SLE)や移植片対宿主反応疾患（GVHD）のように、特定の抗原（SLEの場合の二本鎖DNA等自己抗原、GVHDの場合の同種抗原）に反応して、サイトカイン量が上昇し炎症反応を起こすのでなく、具体的なターゲット無しに、生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫反応が活性化し、サイトカイン産生が制御不能になって、重篤な多臓器不全（MOF）を起こす疾患群である（Bone RC, Crit Care Med 24: 1125-1128, 1996、Davies MG. Et al., Br J Surgery 84: 920-935, 1997）。
【０００３】
SIRSには、血球貪食症候群（hemophagocytic syndrome; HPS）、敗血症、急性膵炎などの重症膵炎、外科手術後に起こる臓器障害などが含まれ、殆どがICU患者で見られ、予後の予測が難しい疾患群である。
【０００４】
多臓器不全（MOF）の指標としては、体温、呼吸数、血液ガス、心拍数などの身体徴候をスコアー化（APACHE II、MOF score、PRISM III score）して判断しているが、客観性に乏しいと言われている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、SIRSにおける多臓器不全を検査する、簡便で感度・定量性に優れた検査試薬及び検査方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
チトクロムＣは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知られているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリアにあったチトクロムＣが急速にサイトゾルへと放出されることが報告されている（Dinsdale D. et al., American J. Pathol. 155:607-18, 1999）。そしてサイトゾルのチトクロムＣは、アポトーシスのキーファクターであるカスパーゼ(caspase)-3の活性化に関与し、チトクロムＣの増加が、アポトーシス進行と関係することが報告されている（Medina V. et al., Cancer Research 57:3697-707, 1999）。
【０００７】
本発明者らは、非特異的に免疫反応が活性化しサイトカイン産生能が制御不能になって、多臓器不全に陥れば、各臓器でアポトーシスが起こり、臓器のミトコンドリアより放出されたチトクロムＣが、血液などの体液中でも測定できるのではないかと考えた。そして、チトクロムＣを測定するELISAを確立し、血中のチトクロムＣの量が多臓器不全のスコアと強く相関することを見出して、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち本発明は、チトクロムＣを定量することにより、SIRSにおける多臓器不全を検査する方法及びその方法に使用できる試薬に関する。より具体的には、以下のものに関する。
【０００９】
１．体液中のチトクロムＣを定量し、定量結果を多臓器不全の指標として用いることを特徴とする、SIRSにおける多臓器不全を検査する方法。
２．チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、１に記載の方法。
３．体液中のチトクロムＣを定量するための試薬を含む、SIRSにおける多臓器不全の検査試薬。
４．チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、３に記載の試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の検査方法は、SIRSにおける多臓器不全を検査する方法であって、体液中のチトクロムＣを定量し、定量結果を多臓器不全の指標として用いることを特徴とする。
【００１２】
ここで、体液とは、生体より採取された血液、血漿、血清、脳脊髄液等を意味する。
【００１３】
体液中のチトクロムＣを測定する方法としては、免疫化学的方法、電気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロムＣをバンドとして検出する方法、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１４】
チトクロムＣを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロムＣに対する抗体を用いて、チトクロムＣを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムＣを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムＣに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。
【００１５】
チトクロムＣを測定する免疫化学的方法の例として、以下にサンドイッチ法についてステップを追って説明する。
【００１６】
1).チトクロムＣに対する抗体をビーズまたはカップ上に固相化する。ビーズはマイクロビーズでもよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好ましい。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。通常、ビーズまたはカップ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ウシ血清アルブミン（BSA)、カゼイン等の蛋白質、Tween 20等の界面活性剤でブロッキング操作を行う。
【００１７】
2).検体を、必要であればBSA、カゼイン等の蛋白質、または、Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈し、ビーズまたはカップに加える。また、既知の量のチトクロムＣも同様に希釈して加える。
【００１８】
3).ビーズまたはカップを、できればTween 20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、できればBSA、カゼイン等の蛋白質、または、Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗体を加える。
【００１９】
4).ビーズまたはカップを、できればTween 20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に応じた方法で測定する。例えば、放射性標識であれば放射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。また、ビオチン化標識であれば更に標識アビジンを加えて、標識に応じた方法で測定する。
【００２０】
5).既知量のチトクロムＣから検量線を作成し、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
【００２１】
以上のステップにより、検体中のチトクロムＣが定量される。
【００２２】
チトクロムＣの定量結果を指標として用いることにより、SIRSにおける多臓器不全が検査される。例えばチトクロムＣの定量値が正常値よりも高い場合に、SIRSにおける多臓器不全が検出されたとすることができる。
【００２３】
また本発明は、チトクロムＣを測定することによりSIRSにおける多臓器不全を検査する検査試薬にも関し、この試薬は体液中のチトクロムＣを定量するための試薬を含む。チトクロムＣを定量するための試薬は、好ましくは、免疫化学的方法により定量するための試薬である。このような試薬としては、チトクロムＣに対する抗体が挙げられる。
【００２４】
免疫化学的方法としては、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法は、固定化抗体と標識抗体により抗原がサンドイッチされた状態を利用する、ELISAなど免疫化学的方法である。サンドイッチ法は、蛋白質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度で定量するのに適した方法である。
【００２５】
本発明の検査試薬は、好ましくは、チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量する検査試薬である。この態様の検査試薬は、抗体として抗チトクロムＣ抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロムＣを測定する検査試薬は、例えば1).抗チトクロムＣ抗体コートカップ、抗チトクロムＣ抗体コートビーズなどの抗チトクロムＣ抗体コート固相、2).標識抗チトクロムＣ抗体、3).既知濃度のチトクロムＣ標準溶液、4).希釈液、5).洗浄液、を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、6).発色基質、7).反応停止液が含まれてもよい。
【００２６】
体液中のチトクロムＣ濃度は、多臓器不全の指標として用いられるPRISM IIIスコアと良く相関し、チトクロムＣ濃度を測定することにより、SIRSで起こっている多臓器不全を客観的に評価することが可能である。
【００２７】
特に、血清の場合にはチトクロムＣ濃度が10 ng/mlを超えると予後が悪く、チトクロムＣ濃度を測定することにより予後を予測することが可能である。
【００２８】
【実施例】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記しない限り質量％である。
【００２９】
【参考例１】
チトクロムＣのELISAによる測定
チトクロムＣの測定法は、以下の手順で実施する。
【００３０】
1).抗チトクロムＣ抗体の精製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）をウサギに免疫し、チトクロムＣに対する抗血清を得る。その抗血清に最終濃度2 Mになるように硫安を添加し、室温（20〜30℃）で５時間撹拌する。撹拌した溶液を10000回転で30分遠心し上清を捨て、沈殿物を0.1 Mリン緩衝液pH 7.2で溶解後、同一緩衝液に対して透析する。透析した溶液は、CNBr-Sepharose 4B（ファルマシア社）にウシのチトクロムＣを結合させて得たカラムに流す。0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5でカラムを洗浄後、0.1 M塩酸グアニジンで抗チトクロムＣ抗体を溶出し、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5に対して透析し抗体(IgG)精製物とする。
【００３１】
2).チトクロムＣF(ab')₂の調製
精製したIgGを0.1 M酢酸緩衝液pH 4.2に対して透析する。透析したIgG溶液にペプシン（シグマ社）を質量濃度比で20:1の割合になるように加え、37℃で16時間反応させる。反応後の溶液のpHを1 N NaOHで7.5に調整した後、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で平衡化したSephacryl S-200（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、濃縮し抗チトクロムＣ抗体 F(ab')₂液とする。
【００３２】
3).西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗チトクロムＣ F(ab')₂抗体の作製
4 mg/mlに調整したHRP（東洋紡）の1 mlに0.1 Mメタ過ヨウ素酸ナトリウムを60μl加え、室温（20〜30℃）で20分撹拌後、0.001 M酢酸緩衝液pH 4.4に対して透析する。透析後、0.2 M炭酸ナトリウム液でpH 9.0〜9.5に調整する。この溶液に0.1 M炭酸緩衝液pH 9.5に対して透析したチトクロムＣ F(ab')₂溶液4 mg/mlを加え、室温（20〜30℃）で２時間撹拌する。4 mg/mlに調整した水素化ホウ素ナトリウム液を50μl加え、4℃で2時間撹拌後、16時間静置保存する。この溶液を0.15 M NaClを含むリン酸緩衝液 pH 7.2で透析後、Sephacryl S-200（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、25% ウサギ血清（日本生物材料）を含む0.2 Mリン酸二ナトリウム緩衝液pH 5.4で希釈し、HRP標識抗チトクロムＣ抗体 F(ab')₂液（標識抗体液）とする。
【００３３】
4).抗チトクロムＣ抗体固相化カップの作製
上記1)で得られたIgG精製物を、0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で吸光度0.1に調整する。この抗体溶液を、ポリスチレンカップに100μl注入し4℃で16時間反応後、EIA法専用洗浄機によって0.15 M NaCl及び0.01% Tween 20を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で3回（各4秒間）洗浄する。洗浄したカップに0.5% ウシアルブミンを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5を200μl加え、再度4℃で16時間反応させ固相化カップとする。
【００３４】
5).標準抗原の調製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）を2% BSA、0.01 M EDTA 2Na、0.1% NaN₃、0.01% Tween 20及び0.15 M NaClを含む0.05 Mトリス緩衝液pH 7.5で50 ng/ml〜0.05 ng/mlの希釈液を作製する。
【００３５】
6).測定
抗チトクロムＣ抗体を固相化したカップ中のウシアルブミン液を吸い取り、全カップに2% BSA、0.01 M EDTA 2Na、0.1% NaN₃、0.01% Tween 20及び0.15 M NaClを含む0.05 Mトリス緩衝液pH 7.5を50μl注入する。そのカップに標準抗原希釈液及び検体を50μl加え、室温（20〜30℃）で1時間反応させる。反応後、EIA専用洗浄機を用い0.01% Tween 20、0.0015 M NaCl、0.0015% パラオキシ安息香酸メチル及び0.005% ２-クロロアセトアミドを含む0.005 Mトリス緩衝液pH 7.5で3回（各4秒間）洗浄する。洗浄後、標識抗体を100μl加え室温（20〜30℃）で1時間反応させる。反応後、EIA専用洗浄機を用い0.01% Tween 20、0.15 M NaCl、0.0015% パラオキシ安息香酸メチル及び0.005% ２-クロロアセトアミドを含む0.005 Mトリス緩衝液pH 7.5で3回（各4秒間）洗浄する。洗浄後、1.5 mg/mlのABTS（2,2-アジノ-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)を含む 0.1 M クエン酸緩衝液pH 4.2を100μl加え室温（20〜30℃）で1時間反応させ、0.013% NaN₃液を100μl加え反応を停止する。発色した溶液の405nmの吸光度を分光光度計で測定する。
【００３６】
7).標準抗原曲線の特性
各濃度のチトクロムＣ及び検体の吸光度値からブランクの吸光度値を引く。横軸に標準抗原濃度、縦軸に標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
【００３７】
【実施例１】
SIRSの患者血清中のチトクロムＣの定量
参考例１に記載したチトクロームＣのELISA系を用いて、SIRSのHPS、敗血症、熱傷、急性膵炎及び外科手術後の患者ならびに健常人の血清中チトクロムＣ濃度を測定した。
【００３８】
その結果、表１に示す通り、健常人15人では全て陰性（< 0.05 ng/ml）であったが、HPSでは13例中13例（100%）、敗血症では８例中８例（100%）、熱傷では６例中４例（67%）、急性膵炎では９例中９例（100%）、外科手術後では８例中６例（75%）が陽性であった。
【００３９】
【表１】

【００４０】
またHPSでは、血清中チトクロムＣ濃度が10 ng/ml以上であった５例中４例（80%）が死亡したのに対し、10 ng/ml未満であった８例中に死亡例は無く（0%）、血清中チトクロムＣ濃度が10 ng/ml以上の患者で予後が悪いことが示された。
【００４１】
【実施例２】
SIRS患者血清中のチトクロムＣ測定値と多臓器不全スコアの相関 SIRSの患者12人に関し、多臓器不全のスコアPRISM IIIをPollack MMらの報告（Crit Care Med 24: 743-752, 1996）に従って算定し、血清中チトクロムＣ濃度との相関を調べた。
【００４２】
その結果、図１に示す通りチトクロムＣ濃度はPRISM IIIスコアと良く相関し、チトクロムＣ濃度が多臓器不全の客観的な指標として有用であることが示された。
【００４３】
【発明の効果】
チトクロムＣの測定が、SIRSの多臓器不全の検査、予後の予測に有用であることが明らかにされた。したがって、SIRSにおける多臓器不全を検査する、簡便で感度・定量性に優れた検査試薬及び検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 SIRS患者血清中のチトクロムＣ測定値と多臓器不全スコアの相関を示す。

Claims

体液中のチトクロムＣを定量し、定量結果を多臓器不全の指標として用いることを特徴とする、SIRS（systemic inflammatory response syndrome）における多臓器不全を検査する方法。
チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、請求項１に記載の方法。
体液中のチトクロムＣを定量するための試薬を含む、SIRSにおける多臓器不全の検査用試薬。
チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、請求項３に記載の試薬。