JPH09189698A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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Abstract
える免疫学的測定方法の提供。 【解決手段】 分析物の濃度が1段階の工程で測定さ
れ、分析物がこの場合に第三特異的結合成分と結合する
際に第一および第二特異的結合成分と競合し、第一特異
的結合成分が非水溶性支持体に固定され、第二特異的結
合成分にはシグナル発生標識が付されている、競合免疫
化学的測定方法。図1は様々な抗体濃度の測定吸光度を
示す。
Description
析物がこの場合に第三特異的結合成分と結合する際に第
一および第二特異的結合成分と競合し、第一特異的結合
成分が非水溶性支持体と結合され、第二特異的結合成分
にはシグナル発生標識が付されている、競合免疫化学的
測定方法に関する。
載(1959年)と最初の酵素イムノアッセイ以来、臨
床診断の多くの分野でかなりの重要性を帯びてきた。
では、例えばハプテン、抗原、抗体または抗体の断片の
ような免疫学的結合および反応成分が用いられる。一方
用いられる結合および反応成分はこの場合だと固相に結
合されているか、あるいは例えば共有結合でシグナル発
生標識、例えば標識酵素と複合化されている。用いられ
る固相は、例えばチューブまたは微量滴定プレート形態
のくぼみのような凹部形状物でも、例えば球体のような
凸部形状物でもよい。例えば試験片のような平面的固相
も用いてよい。アルカリホスファターゼ、β‐ガラクト
シダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼがしばしば
標識酵素として用いられ、発色原、蛍光原または発光化
合物が基質として用いられる。サンプルの組成、インキ
ュベートおよび洗浄緩衝液と様々な基質/発色原試薬
は、当業者に知られている。
均一酵素イムノアッセイでは未結合反応成分が相分離と
その後の洗浄工程により結合反応成分から除去される。
この場合には、1段階と2段階の工程との間には相違が
ある。1段階の工程では合わせて1回だけの分離工程
(“結合/遊離”分離)が行われるが、これは2段階の
工程だと各々個別のインキュベートまたは反応工程後に
行う。
アッセイは非競合および競合技術に分けられる。非競合
技術(“サンドイッチ”試験)は、固相結合およびシグ
ナル発生反応成分が測定される分析物と比較してかなり
モル過剰に存在するという点で区別される。“サンドイ
ッチ”複合体の形成には、分析物の少くとも2つの結合
部位が必要であり、各場合において固相結合またはシグ
ナル発生反応成分により認識される。形成された“サン
ドイッチ”複合体の測定されるシグナル活性は、この場
合だと分析物濃度と正比例する。
濃度のために免疫複合体形成に限界があり、そのため競
合が相互結合成分の少くとも1つの結合部位のところで
反応成分と分析物との間に生じる。競合技術の中では、
これらはそれらの点で2つのグループに細分類できる。
第一グループだと不溶化結合成分の数はシグナル発生反
応成分および測定される分析物分子の数よりも少なく、
第二グループだとシグナル発生反応成分の濃度は不溶化
結合成分および遊離分析物分子の数よりも少ない。双方
の場合において、形成された複合体のシグナル活性は測
定される分析物濃度と反比例する。
と、公知の競合技術は感度、測定範囲、特異性、強さお
よびインキュベート時間に関して非競合技術より劣るこ
とがわかる(EKINS R.(1985) CURRENT CONCEPTS AND FU
TURE DEVELOPMENTS: IN ALTERNATIVE IMMUNOASSAYS)。
親和性は、1段階または2段階の工程のどちらが用いら
れるかをかなり有意に決定する。低親和性抗体の検出で
は、特に血清インキュベート時間が第一工程として一夜
行われるならば、2段階の工程は1段階の工程と比較し
て有利とわかった。しかしながら、第二インキュベート
工程では、低親和性分析物抗体の置換を起こす平衡に結
合および未結合シグナル発生反応成分間で達しないよう
な注意が払われるべきである。このため、低親和性抗体
の検出は、ユーザーにとり実施上容易で短時間ですむ1
段階の工程よりも2段階の工程を用いた方が原則として
うまく実施できる。
シグナル発生反応成分の双方が競合酵素イムノアッセイ
で競合する結合において、重要な役割を果たす。不溶化
抗原のエピトープ密度はこの場合に検出感度上重要であ
る(KENNY G.et al.(1983) J.CLIN.MICROBIOL.17,655-6
65)。タンパク質混合物がその場合で例えば精製HAV
ウイルス抗原と共に用いられるならば、ウイルス特異的
タンパク質フラクションが用いられる全タンパク質の小
さなフラクションだけを提供するときに、検出感度は著
しい悪影響をうけることがある。したがってこれを避け
るために、公知の方法では、適切な高度に精製された抗
原が用いられねばならず、必要な純度の達成にはかなり
の費用を伴い、それに対応して困難で、高価で、しかも
時間を費やすようになる(PURCELL R.et al.(1976) JOU
RNAL OF IMMUNOLOGY,116,349-356)。特に、接種直後に
形成される低親和性抗HAV抗体の検出に際してはそう
であり、様々な市販診断試験は感度に乏しい。精製HA
V抗原またはワクチン抗原の使用によってのみ、低親和
性抗体の検出に際して感度を改善することが可能であっ
た(DELEM A.(1992) BIOLOGICALS,20,289-291 )。
程により低親和性抗体の検出を行える方法を開発するこ
とであり、この場合には最小限にだけ精製された抗原が
使用できる。
様により本質的に達成された。不均一競合測定方法によ
る分析物の測定のための本発明による免疫化学方法は、
下記工程: a)分析物と第一、第二および第三特異的結合成分とを
インキュベートする(第一特異的結合成分は非水溶性固
相(固相結合反応成分)と結合され、第二特異的結合成
分にはシグナル発生標識(シグナル発生反応成分)が付
されており、分析物並びに第一および第二特異的結合成
分は第三特異的結合成分(共通結合成分)と結合する上
で競合する)、 b)未結合フラクションから第三特異的結合成分により
固相に結合されたシグナル発生標識を分離する、 c)標識の結合フラクションにより生ずるシグナルを測
定する、および d)工程c)でみられる値を、同一の条件下でプロット
されたかまたは理論的に計算された標準曲線と比較する
ことによって分析物濃度を測定することを含む。
析物は、当業者にそれ自体知られている。有利には、分
析物は、微生物診断、特に血液バンクで行われるような
感染診断の分野に関連した抗体、特にヒトまたは動物起
源の抗体、例えば抗HAV抗体、抗HIV抗体、抗HC
V抗体またはB型肝炎の診断における抗体である。
異的結合成分と特異的に反応できなければならない。有
利には、第一および第二特異的結合成分はモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体、あるいは抗体断片であ
る。しかしながら、本発明による方法を行うためには、
レクチンまたは合成/組換え抗体も用いることができ
る。
抗原の検出にも用いることができ、第一および第二特異
的結合成分が抗原であり、第三特異的結合成分が抗体で
あることも可能である。
利には、例えばラテックス粒子、磁気誘引性粒子または
微量滴定プレートのような非水溶性固相が用いられる。
れている。このような標識は関連した特異的結合成分に
直接、あるいは例えばビオチン‐ストレプトアビジン、
fos-jun または抗体‐抗原結合のような当業者にそれ自
体知られている可逆的カップリングにより複合化させる
ことができる。
または蛍光を行える成分、あるいは発光原、蛍光原また
は発色原基質を変換できる酵素であることが好ましい。
酵素の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼが特に好
ましい。化学発光標識の場合には、欧州特許出願EP‐
A‐0257541およびEP‐A‐0330050に
記載された化合物が特に好ましい。
固相および液相の分離後に、シグナルが固相または分離
された上澄で測定される。測定されたシグナルから、分
析物濃度がいわゆる標準曲線により当業者にそれ自体知
られている手法で決定される。標準曲線をプロットする
ために、シグナルは公知の分析物濃度に関する各測定方
法を用いて測定され、図でまたは数学的に曲線形に変換
される。このような標準曲線は、特異的結合成分の公知
の物理的および化学的性質に基づいて、ある程度正確に
理論的に計算できる。
シグナル発生反応成分および/または不溶化反応成分と
の間の競合が共通結合成分と結合する際に起きるよう
な、免疫化学方法に用いることができる。
最小限で精製されなければならないという点で、更に区
別される。共通結合成分は少くとも2つの異なる結合部
位を有して、1つは不溶化反応成分により認識され、シ
グナル発生反応成分は第二結合部位と結合すべきことが
重要となる。検出される分析物の存在下で、分析物分子
とシグナル発生および/または不溶化反応成分との特異
的競合が共通結合成分と結合する際に生じる。この場合
に、分析物の不在下ではシグナル発生“サンドイッチ”
複合体の形成が不溶化およびシグナル発生反応成分間の
競合により妨げられないことが、本発明による方法に必
須とわかった。
ロール)においてシグナル発生反応成分(=モノクロー
ナル抗HAV特異的抗体複合体)と不溶化反応成分(=
ポリクローナル抗HAV特異的抗体)との競合が共通結
合成分(=HAV抗原)と結合する際に起きず、その結
果シグナル発生“サンドイッチ”複合体の形成が可能と
なることが、A型肝炎ウイルスに対する抗体の検出に関
する本発明の方法でわかった。これはすべて、HAVに
対する公知のモノクローナル抗体が様々な競合イムノア
ッセイでウイルスへのポリクローナル抗体の結合をほぼ
完全に阻止できることから、全く意外であった(LEMOM
S.et al.(1993) VIROLOGY 4,285-295 ;HUGHES J.et a
l.(1984) J.VIROL.52,465-473;STAPLETON J.et al.(19
87) J.VIROL.61,491-498 )。しかしながら、分析物分
子(=抗HAV特異的抗体=陽性コントロール)の存在
下だと、共通結合成分に対する特異的競合が分析物と不
溶化反応成分および/またはシグナル発生反応成分との
間で生じることが意外にも発見された。
たは接種後に生じる低親和性抗体を検出できるために
は、共通結合成分だけが最小限で精製されねばならない
か、または全く精製しなくてよい、という発見も意外で
あった。本発明による方法では、おそらく固相結合反応
成分の存在のために、共通結合成分の結合部位に対する
分析物とシグナル発生および/または固相結合反応成分
との特に効果的で特異的な競合を行わせる条件が作られ
る。この場合に本発明の意味で最小限に精製されたと
は、特異的タンパク質の割合が80%以下、好ましくは
50%以下、非常に好ましくは20%以下であることを
意味する。
分は、抗体または抗体の限定断片である。ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体の製造(KOHLER G.and MIL
STEIN C.(1975) NATURE 256,495-497 )は、当業者にそ
れ自体知られた方法で行われる。ポリクローナル抗体以
外に、モノクローナル抗体またはその断片(F(a
b′)2またはFab′)も用いてよい。本発明による
方法によれば、この場合だと、1つの反応成分は非水溶
性固相に結合され、第二反応成分はシグナル発生成分と
して用いられる。好ましくは、本発明による方法におい
て、ポリクローナル抗体は固相に結合され、標識酵素に
複合化されたモノクローナル抗体はシグナル発生反応成
分として用いられる。本発明で用いられるモノクローナ
ル複合体の製造も同様に当業者に知られている(総説:
ISHIKAWA E.et al.(1983) J.IMMUNOASSAY 4,209-327
)。
にそれ自体知られる実験で調べることができる。
溶化およびシグナル発生反応成分に対して少くとも2つ
の別々な結合部位を有しているあらゆる高分子である。
この場合に適切な高分子は、場合により炭水化物および
/または脂質で改質されたタンパク質、炭水化物、脂
質、合成ポリマーおよび核酸である。結合成分の分子量
は、好ましくは50,000〜2百万である。
イにおいて、特異的競合が共通結合成分の少くとも2つ
の結合部位に対して分析物と固相結合反応成分および/
またはシグナル発生反応成分との間で生じる、すべての
免疫学的検出方法で用いることができる。
る: 略号: HAV:A型肝炎ウイルス POD:ペルオキシダーゼ SH:スルフヒドリル基 ATCC:American tissue cell culture
(TARRIMORE et al.(1983) J.IMM.METH.62,123-131)と
反応させ、その後SH活性化ペルオキシダーゼ(KING e
t al.(1978) BIOCHEMISTRY 17,1499-1506 )と共にイン
キュベートして、ゲルクロマトグラフィーにより精製す
る。
維芽細胞のような市販細胞を、例えばATCC HM‐
175のような特徴的A型肝炎ウイルス株で感染させ
る。数日後、除去された細胞上澄を遠心し、得られた細
胞ペレットを慣用の貯蔵緩衝液に溶解し、抗原を当業者
に知られる方法に従い不活性化させる。不活性化抗原は
追加精製せずに更に用いることができる。
の製造について上記された方法に限定されず、当業者に
知られる抗原単離のための他の製造方法も用いることが
できる。更に、市販HAV抗原調製物も本発明による方
法に用いてもよい。
ィング 既定量(16μg/ml)のヒトポリクローナル抗HAV抗
体を穏やかに撹拌しながらコーティング溶液(炭酸ナト
リウム0.01mol/lpH9.6)に加え、混合液を約
30分間ホモゲナイズする。次いで微量滴定プレートの
個々のくぼみのコーティングは150μlのコーティン
グ容量を用いて行った。室温で一夜インキュベート後、
コーティング溶液を吸引し、微量滴定プレートの個々の
くぼみを洗浄溶液(0.25mol/lクエン酸/0.05
mol/lトリスpH7.4)で2回洗浄する。最後の洗浄
工程後、微量滴定プレートの個々のくぼみを吸上げて空
にし、それをパック詰め乾燥剤(例えばシリカゲル)と
一緒にアルミニウムフィルム中に密封する。コートされ
た微量滴定プレートはそれらが用いられるまで4℃で貯
蔵する。
ムノアッセイ 本発明による方法は、1段階の工程による競合酵素イム
ノアッセイである。試験されるサンプル(25μl)、
複合体(=POD複合化抗HAV特異的モノクローナル
抗体、50μl)およびHAV抗原(50μl)を、ヒ
トポリクローナル抗HAV特異的抗体でコートされた微
量滴定プレートのくぼみに逐次加える。コートされた微
量滴定プレート、複合体およびHAV抗原は Enzygnost
(商標名)抗HAV試験キット(オーダーコードOQE
C Behringwerke AG,Marburg)からのものであった。試
験されるサンプルがこの場合に測定される抗HAV抗体
を含有しているならば、これらはHAV抗原と結合する
際に複合体分子および/または不溶化ポリクローナル抗
HAV特異的抗体と競合する。37℃で2時間のインキ
ュベート時間後、過剰の複合体および未結合反応物を例
えばBehring ELISAProcessor IIまたはBehring ELISA P
rocessor III (Behringwerke AG,Marburg)で4回の吸
引および洗浄により除去し、結合複合体の量を基質/発
色原溶液(Behringwerke AG,オーダーコードOUVP)
100μlの添加により測定する(3分間、室温、光防
御)。発色原テトラメチルベンジジン二塩酸の酵素反応
は0.5N硫酸100μlの添加により妨げ、450n
mの吸光度を分光測定する。測定された吸光度はこの場
合に、サンプル中に含有される抗HAV抗体濃度と間接
的に比例している。
ル方法との比較 本発明による方法は、固相に結合されたヒト起源のポリ
クローナル抗HAV特異的抗体と、複合体抗体としてモ
ノクローナル抗HAV特異的マウス抗体を含有した、1
段階の工程による酵素イムノアッセイである。比較され
る方法は、ポリクローナル固相抗体がモノクローナル抗
体によって置換されている点で、本発明による方法と異
なる。
の全モノクローナル方法と共に、陰性コントロールのシ
グナル強度および測定検出限界に関して示されている。 表1:本発明による方法と全モノクローナル方法との比較 陰性コントロールの吸光度 検出限界 本発明による方法 1427mE 13IU/l 全モノクローナル方法 543mE 28IU/l
AV抗体から開発された本発明による方法の陰性コント
ロールの高いシグナル強度と改善された検出限界は、全
モノクローナル方法と比較して、本発明による方法の優
越性を明らかに示している。
準(WHO標準)の限定希釈により測定した。図1で
は、様々な抗体濃度の測定吸光度が半対数表示で示され
ている。競合アッセイ方式のため、吸光度は抗体濃度の
増加に伴い減少する。
の吸光度がカットオフとして半分にされた13.4IU/
lである。
る方法を用いて非常に初期の段階で検出されうること
は、接種セロコンバージョンによって示された。図2で
は、典型的抗HAVセロコンバージョン(0193)の
時間経過が示されている。血清サンプルを様々な時間に
接種体から採取し、後者を本発明による方法を用いて試
験した。この場合に示された比率は、測定吸光度および
カットオフからの比に相当する。<1の比率は、抗HA
V抗体の検出しうる出現で、セロコンバージョンが起き
たことを示している。図2で示されるように、接種が行
われた後、2週目からセロコンバージョンを検出するこ
とさえも、本発明による方法を用いて可能であった。
0193の測定吸光度を図1の検量曲線によって定量し
た。2週目からでも、20IU/lの接種保護閾値を明ら
かに超える抗体濃度を測定した。
る。
3)の時間経過を示した図である。
吸光度を図1の検量曲線によって結果を示した図であ
る。
Claims (19)
- 【請求項1】下記工程: a)分析物と第一、第二および第三特異的結合成分とを
インキュベートする(第一特異的結合成分は非水溶性固
相と結合され、第二特異的結合成分にはシグナル発生標
識が付されており、分析物並びに第一および第二特異的
結合成分は第三特異的結合成分と結合する上で競合す
る)、 b)未結合フラクションから第三特異的結合成分により
固相に結合されたシグナル発生標識を分離する、 c)標識の結合フラクションにより生ずるシグナルを測
定する、および d)工程c)で与えられた値を、同一の条件下でプロッ
トされたかまたは理論的に計算された標準曲線と比較す
ることによって分析物濃度を決定することを含む、不均
一競合測定方法による分析物の測定のための免疫化学方
法。 - 【請求項2】用いられる免疫化学的測定方法が1段階の
工程である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】抗体または抗体断片が第一および第二特異
的結合成分として用いられる、請求項1または2に記載
の方法。 - 【請求項4】ポリクローナル抗体または適切な抗体断片
が第一特異的結合成分として用いられる、請求項3に記
載の方法。 - 【請求項5】抗HAV特異的抗体または対応抗体断片が
第一特異的結合成分として用いられる、請求項3に記載
の方法。 - 【請求項6】同様の抗HAV特異的抗体または対応抗体
支持体が第二特異的結合成分として用いられる、請求項
3に記載の方法。 - 【請求項7】もう1つの抗HAV特異的抗体または対応
抗体支持体が第二特異的結合成分として用いられる、請
求項6に記載の方法。 - 【請求項8】酵素がシグナル発生成分として用いられ
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】西洋ワサビペルオキシダーゼが酵素として
用いられる、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】第一特異的結合成分および第二特異的結
合成分が共通結合成分上の異なる結合部位を認識する、
請求項7に記載の方法。 - 【請求項11】分析物が抗体である、請求項1または2
に記載の方法。 - 【請求項12】分析物が抗HAV特異的抗体である、請
求項11に記載の方法。 - 【請求項13】測定される分析物がサブクラスIgMお
よび/またはIgGの抗HAV特異的抗体である、請求
項12に記載の方法。 - 【請求項14】第三特異的結合成分が少くとも2つの異
なる免疫学的に関連した結合部位を有していなければな
らない、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】第三特異的結合成分が最小限にだけ精製
された形で用いられる、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】第三特異的結合成分が高分子である、請
求項14に記載の方法。 - 【請求項17】第三特異的結合成分がウイルス抗原であ
る、請求項14に記載の方法。 - 【請求項18】第三特異的結合成分が細胞培養で生じた
ウイルス抗原である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項19】第三特異的結合成分がHAVウイルス抗
原である、請求項14に記載の方法。
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