JPH021553A - ヒトiv型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量法 - Google Patents
ヒトiv型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
Vコラーゲンペプチドの酵素免疫学的定量法に関するも
のである。
対するモノクローナル抗体を用いた1段階サンドイツチ
法に基づく酵素免疫学的定量法によるヒトIVコラーゲ
ンの分子中央三重ラセン部位の定量法ならびにヒトIV
コラーゲン7−Sドメインの定量法を提供するものであ
る。
ト■梨コラーゲンN末端ペプチド7−Sドメインおよび
同、C末端ペプチドMCIドメインの各ポリクローナル
抗体を用いて放射性免疫学的測定を行ったという報告が
なされている (Rohdgら、Eur、 J、
Cl1n、 Invest、+ 9. 451〜4
5L 1979、Hagemannら、C11n、
Chim−Acta。
J、Cl1n。
重ラセン部位について、ならびにヒトIVコラーゲン7
−Sドメインについて、それらを定量する方法に関して
は、未だ報告はなされていない。
方法に関し、種々研究した結果、本発明によりペプシン
可溶化ヒトIVコラーゲンに対するモノクローナル抗体
あるいはヒトIV[コラーゲン7−Sドメインに対する
モノクローナル抗体を用い、1段階サンドイッチ法に基
づく酵素免疫学的定量法を行うことにより、少量の試料
で、良好な精度で迅速に測定し得るヒトIVコラーゲン
ペプチドの定量法を提供することに成功した。従来知ら
れているサンドイツチ法、すなわち、同相化抗体と試料
中の抗原との反応(第1反応)、次いで、固相化抗体−
抗原複合体と酵素標識抗体との反応(第2反応)、さら
に酵素基質による発色反、応(第3反応)と、発色反応
までに2段階の免疫反応を必要とするサンドイッチ法に
くらべ、本発明方法においては、第1反応と第2反応を
同時に行う1段階サンドイッチ法によるため、より高い
精度で、短時間で、多数の検体の測定を簡易に行うこと
ができる。
ンドイツチ法に基づく酵素免疫学的定量法を行うことに
よるヒトIVコラーゲンの定量法を提供するものである
。
クローナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免
疫学的測定法によるヒトIVコラーゲンの分子中央三重
ラセン部位の定量法であって、 (a)ヘプシン可溶化ヒトIVコラーゲンの分子中央三
重ラセン部位と交差反応するモノクローナル抗体に酵素
標識を付与した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測
定対象試料を希釈して得られる試料希釈液と、(b)ペ
プシン可溶化ヒトIVコラーゲンのみに交差反応するモ
ノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体結合固相
担体 とを用い、上記希釈液(a)中に、上記の抗体結合固相
担体(b)を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒ
トIVコラーゲンと上記の酵素標識抗体ならびに上記の
固相担体に結合している抗体とにおいて免疫反応を行わ
しめた後、固相担体を分別し、その固相担体の酵素活性
を測定することにより、ヒトIVコラーゲンの分子中央
三重ラセン部位を定量する方法。
クローナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免
疫学的測定法によるヒトIVコラーゲン7−Sドメイン
の定量法であって、 (a)ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲン7−Sドメイ
ンと交差反応するモノクローナル抗体に酵素標識を付与
した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測定対象試料
を希釈して得られる試料希釈液と、 (b)ヒトIVコラーゲン7−Sドメインのみに交差反
応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
結合固相担体 とを用い、上記希釈液(a)中に、上記の抗体結合固相
担体(b)を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒ
トIVコラーゲン7−Sドメインと上記の酵素標識抗体
ならびに上記の固相担体に結合している抗体とにおいて
免疫反応を行わしめた後、固相担体を分別し、その固相
担体の酵素活性を測定することにより、ヒトIVコラー
ゲン7−Sドメインを定量する方法。
、抗体含有物を硫安分画後、DEAE−Sephace
lおよびプロティンAアフイニテイ力ラムにより精製
したIgG画分が用いられる。
ポリクローナル抗体としては、それら抗体における特異
的結合部分F(ab’)、、あるいはFab’そのもの
を使用する態様も含まれるものである。
で測定した肝疾患患者血清中のヒトIV型コラーゲンペ
プチドの分子中央三重ラセン部位およびヒトIVコラー
ゲン7−Sドメインの濃度の測定値は、健常人血清中の
それよりも有意に高いことが認められ、本発明方法を用
いれば、血中ヒトIVコラーゲンペグチドの分子中央三
重ラセン部位およびヒトIVコラーゲン7−Sドメイン
の濃度測定により、患者に負担のかかるバイオプシーを
実施することなく、肝疾患、特に肝線維化、肝癌および
肝転移消化器癌を予知することができる。
亜鉛混濁反応)、GOT(グルタミンピルビン酸トラン
スアミナーゼ)、GPT(グルタミンピルビン酸トラン
スアミナーゼ)、ALP(アルカリ性7オスフアターゼ
)、LDH(乳酸脱水素酵素)およびγ−GTP (γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ)などの測定では、
肝組織の線維化、肝癌および肝転移消化器癌を判定する
ことはできず、このことは、本発明者らによって確認さ
れている。したがって、本発明者らが先に報告した血中
ヒトプロリン水酸化酵素濃度の測定(特開昭61−20
2162公報参照)と本発明方法とをあわせて用いて血
中の、ヒトIVコラーゲンペプチドの分子中央三重ラセ
ン部位およびヒトIVコラーゲン7−Sドメインの濃度
を測定することにより、この種の疾患を早期発見するこ
とが期待される。
測定に基づく肝組織線維化、肝癌および肝転移消化器癌
の診断を行うことができるので、本発明は著しい有用性
を有するものである。以下、一実施例により本発明を具
体的に説明する。ただし本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
製 (a)抗原−ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてArtery、 7.262〜2
80(1980)に記載のMayneらの方法に従い0
.5N酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化(1my/
m(1)でコラーゲンを可溶化後、最終濃度2Mとな
るように塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた
。これを0.5N酢酸に溶解し0.7M塩化ナトリウム
含有0,5N酢酸溶液で透析することによりI、III
型コラーゲンを析出させ、その上清を1.2M塩化ナト
リウム含有0.5N酢酸溶液で透析し、■、v型コラー
ゲンを析出させた。■、v型コラーゲン画分を0.5M
塩化ナトリウム含有5QmM )リス−塩酸緩衝液(p
H7,4)に溶解させ、2.2M塩化ナトリウム含有5
0mM トリス−塩酸緩衝液(pH7,4)で1Vfi
コラーゲンを析出させ、V型コラーゲンと分別した。得
られたIVfiの純度をBiochem、 Bioph
ys、 Res、 Commun−、72,1472〜
1480(1976)記載の5ykesらの方法に従イ
トデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気
泳動(5OS−PAGE)で調べたところ約95%であ
った。
、 92KD、78KD、 68KD、 60KD、
56KD143KD、 34KDおよび29.5KD
(メルカプトエタノール存在下)の11個の異なるバン
ドが検出された。
fiコラーゲン?−Sドメイン、IVWコラーゲンNC
lドメインおよびラミニンPi画分の調製 ヒト胎盤および新生仔ラットを原料に前記(a)記載の
方法に従ってヒト胎盤からペプシン可溶化IV以外にI
、I[、■および■型コラーゲンを分別精製した。また
、新生仔ラットから同様にペプシン″可溶化IVコラー
ゲンを調整した。
a)で調製したペプシン可溶化TVWコラーゲンを材料
としてEur、 J、 Biochem、+ 108+
239〜250(1980)に記載のR15teliら
の方法により調製しI;。
J、 Biochem、、 84.43〜52(197
8)および旺。
法に従って調製した。また、IVffiコラーゲンC末
端NClドメインは上記酸抽出IVWコラーゲンを材料
にEur、 J、 Biochem、、 120.20
3〜211’(1981)に記載のTimpiらの方法
に従って調製した。
em−J、、 193.749〜755 (1981
)に記載のRtsteliらの方法に従って調製した。
ロインドアジュバントと共に8週令のBALB/ C雌
マウス2匹に初回腹腔内投与した。
ス−塩酸緩衝液(pH7,4)に溶解させた抗原100
μ9を2〜4週間毎に、2〜4回BALB/c雌マウス
に追加免疫した。最終免疫として牌臓摘出3日前に静脈
内投与し牌細胞を調製した。
Difco Labora−Lories製)に重炭酸
ナトリウム(12mM)、ピルビン酸ナトリウム(1m
M)、L−グルタミン(2mM)、ペニシリンGカリウ
ム(50u/mα)、硫酸ストレプトマイシン(50μ
g/rRQ)、および硫酸アミカシン(lOOug/l
l112)を加え、ドライアイスでpHを7.2にし、
Q、271m Toyoメンブレンフィルターで除菌濾
過する。
濾過した仔牛脂児血清(M、A、 Bioproduc
ts製)を15%(v/v)の濃度に加える。
ン(100μM)、アミノプテリン(0,4μM)、お
よびチミジン(16μM)を加える。
培地と同一組成のものである。
ポリエチレングリコール4,000 (PEG 4.0
00. Merck & Go。
NSI−1)との融合は5elected 1Jeth
od 1nCellular Immunology
(ed、 B、B、 Mishell andS、M、
Shiigi)、W、H,Freeman and
Company(1980)、 351〜372に記載
のOlらの方法を若干改変して行った。前記(c)で調
製した有核牌臓細胞(生細胞率95%)とミエローマ細
胞(生細胞率95%)とを5〜6:1の割合で融合する
。肺臓細胞とミエローマ細胞とを別々に前記のRPM
11640培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁し、
融合させるため上記の割合で混合する。容量50mQの
円錐形スチロール樹脂製試験管(TvakiGlass
製)を用い、40maのRPMI 1640培地中40
0×9.10分間遠心し、上溝を完全に吸出する。
穏やかに撹拌しながら1分間で滴下し、さらに1分間撹
拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃加温RP
MI 1640培地1mQを1分間で滴下する。
3分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させる。こ
れを400Xy、10分間遠心分離し、上溝を完全に吸
引除去する。次にこの沈殿細胞に37℃加温N5−1培
地10mQをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを10
++I2のピペットを用いて注意深くピペッティングし
て分散する。さらに同培地20m(lを加えて希釈し、
ポリスチレン製96穴マイクロウエル(Iwaki G
lass製)にウェル当り5.9×10S個10.1m
(2の細胞をまき込む。なおこの時使用しI;96六マ
イクロウエルの前処理としてQ、2mQのNS−1培地
を加え、炭酸ガス培養器中(37’c)で−晩保温し、
使用時に培地を吸引除去する。細胞融合完了したマイク
ロウェルを7%炭酸ガス/93%空気中で温度37℃、
湿度100%下にインキュベートする。
0.1m12)を加える。2.3.5.8.11日日目
培地の半分(0,1m+2)を新しいHAT培地で置き
換える。14日日目HT培地に切換え以降3〜4日毎に
同操作を繰り返す。通常2〜3週間で充分なハイブリド
ーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウェル
について次項(f)記載の固相−抗体結合テスト(EL
ISA)法により陽性ウェルをチエツクする。次にフィ
ーダーとしてlOy個のマウス胸腺細胞を含むHT培地
1mαをポリスチレン製24穴セルウエル(Iwaki
Glass製)に加えたものを用い、上記で検出され
た各陽性ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記
(d)におけると同様に7%炭酸ガス存在下、37°C
で約1週間インキュベートする。その間1〜2回各ウェ
ルの上清0.5mQを新しいHT培地0.5mQと交換
する。ハイブリドーマの充分生育した時点でELISA
法により陽性を再確認し、それぞれについて次項(g)
記載の限界希釈法によるクロニングを行う。なお、クロ
ーニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm2組
織培養フラスコ(Iwaki Glass製)に移し、
凍結保存用試料を調製する。
チド抗体産土ハイブリドーマの検索 Ana1. Biochem、 104. 205
−214(1980)に記載のRennardらの方法
を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリド
ーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイトレー
ジヨンプレート(Flow Laboratorie
s、 Inc、!a)を0.5〜1.0μ9のペプシ
ン可溶化ヒトIVコラーゲンでコートし、さらにその他
を1%牛血清アルブミン(BSA)でコートしブロック
する。これにハイブリドーマ生育ウェルの上溝の一部を
加えて室温で約1時間インキュベートする。2吹拭体と
して西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(POD) I!
識ヤギ抗マウスイムノグロブリン(Cappel La
b。
OPD)を加え生成した褐色の程度ヲマイクロプレート
リーダー(MPR−A4.東洋曹達工業製)を用いて4
92nmの吸光度を測定する。
る可能性があるので、限界希釈法に、Iリクローニング
を行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得
する。NS−1培地I+IQ当りフィーダーとして10
’個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し
96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエルおよび
24ウエルにつエル当り5個、1個および0.5個のハ
イブリドーマを加える。5日目、122日目6約0.1
mQのNS−1培地を追加する。クローニング開始後1
4〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、
コロニー形成陰性ウェルが50%以上である群について
ELISA法を行う。テストした全ウェルが陽性でない
場合、抗体陽性ウェル中のコロニ数を確認し、ウェル中
に1コロニー+7)ウェル全4〜6個選び再クローニン
グする。最終的にペプシン可溶化IVコラーゲンに対し
て22株のクローンを得た。
ビボ増殖 モノクローナル抗体は、上記(g)で得られた各クロー
ンをNS−1培地などの適当な培養液で培養(インビト
ロ増殖)し、その培養上清から得ることができる(モノ
クローナル抗体たん白濃度はlO〜100μg7mQで
ある)。一方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエ
ローマ細胞の由来動物と同系の動物(BALB/c、マ
ウス)に腫瘍形成促進剤プリスタン(2,6,10,1
4−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Ch
emical製)をマウス1匹当り0.5mff腹腔内
投与する。1〜3週間後にハイブリドーマlXl0’個
を同じく腹腔内投与することによりインビボで1〜2週
間後にモノクローナル抗体たん白質濃度4〜7mg/m
(lの腹水を得ることができる。
ヒトIVコラーゲンをコートしたミクロタイトレージョ
ンプレートのウェルの各列に入れ、前述したELISA
法に従って各腹水中のモノクローナル抗体を結合させる
。洗浄後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス!g抗体
(ZymedLaboratories製)を加える。
体を加え、基質として2.2′−アジノージ(3−エチ
ルベンゾチアゾリン硫酸−6)および過酸化水素を用い
て重鎮、軽鎖のアイソタイプを検出した。その結果を第
1表に示した。得られたベズシン可溶化ヒト■塁コラー
ゲンに対するモノクローナル抗体の内、16個が免疫グ
ロブリン鎖γl/にを、2個がγ2b/にを、1個がa
/におよび3個がμ/にを有していた。
後、IgGクラスは0.06M塩化ナトリウム含有40
mMリン酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したDEAE
−5ephacel(Pharmacia製)の非吸着
画分を分取し、培地中の仔牛脂児血清およびマウス由来
のたん白質を分離、除去した。IgAおよび1gMクラ
スの精製につむ(てはO,1M塩化ナトリウム含有40
mMリン酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したDEAE
−Sapha−celカラムクロマトグラフィーにおい
て塩化ナトリウム0.1Mから1.OMまでのグラデイ
エンドでそれぞれ両画分を溶出した。
50mM )リス−塩酸緩衝液(pH8,6)で平衡化
したプロティンAセルロファイン(生化学工業製)カラ
ムに吸着させ非吸着画分を除去した後、0.15M塩化
ナトリウム含有50mM酢酸緩衝液(pH4,0)で溶
出することにより精製した。なお、溶出液は直ちに1.
5M トリス−塩酸緩衝液(pH8,9)により中和し
た。
の定量 (a)酵素標識モノクローナル抗体(Fab’−POD
複合体)の調製法 (1) Fab’画分の調製 実施例1(j)で得られたIgG画分を0.1M塩化ナ
トリウム含有0.1M酢酸緩衝液(pH4,2)に溶解
し、その溶液を以下に述べるようにしてペプシンで消化
した。すなわち、前記画分中の1gGに対し2%(v/
v)のペプシンを加え、37℃、24時間消化した。更
にその消化物に2Mトリス溶液を加えてpHを7.0に
調整することにより消化反応を停止させ、O,1Mリン
酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したクルトロゲルAc
A44カラム(LKB製)を用いたゲル濾過によりF(
ab’)、両分を分取した。
ミン四酢酸酢酸DTA)含有0.1Mリン酸緩衝液(p
H6,0)中で透析し、終濃度10mMとなるようにア
ミノエタンチオール(MEA)を加え37℃で1.5時
間還元した後、5 mM EDTA含有0.1Mリン酸
緩衝液(pH6,0)で平衡化したウルトロゲルAcA
44カラムを用いてゲル濾過し、Fab’画分を分取
した。
作とは別に、以下に述べるようにしてPODにマレイミ
ドを標識した。すなわち、PODをlOmy/m(lの
量で0.1Mリン酸緩衝液(1)H7,O)に溶解し、
そのPODに対して、25倍モル量のN−(ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ)コハク酸イミド(EMC5)を
ジメチルホルムアミド溶液として加え、30°0130
分間反応させた。これを0.1M Uン酸緩衝液(pH
6,0)で平衡化したセファデックスG−50カラムで
ゲル濾過し、マレイミド標識POD画分を分取した。
の如くして調製した画分中のFab’に対して上記(2
)で得られた画分中のマレイミド標識PODとして等モ
ルになるようにして、両両分を混合し、更にFab’お
よびマレイミド標識PODの終濃度が100μMとなる
ように5mMEDTA含有0.1Mリン酸緩衝液(pH
6,0)で希釈した。この混合液を4℃、20時間反応
後、Fab’の10倍モル量のN−エチルマレイミドで
未反応のチオール基をブロックした。これを0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH6,5)で平衡化したウルトロゲルA
cA 44カラムでゲル濾過し、Fab’−POD複合
体画分を分取後、0,1%BSA及び0.005%チメ
ロサールを添加し、4℃で保存した。
m、 Precision Plastic Ba1l
製)を用いた1段階サンドイッチ法 実施例1 (j)で得られたペプシン可溶化ヒトIVコ
ラーゲンに対する精製モノクローナル抗体(クローンN
o、4H12)を0.1%アジ化ナトリウム含有0.1
Mリン酸緩衝液(pH7,5)に溶解しその濃度を0.
1mg/mQにTA製する。この抗体溶液に固相担体と
してのポリスチレンポールを浸漬シポリスチレンポール
に抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収しポリスチ
レンボールを0.1%BSA、 0.1M塩化ナトリウ
ムおよび0.1%アジ化ナトリウム含有10mM’Jン
酸緩衝液(pH7,0)で洗浄し、4°Cに保存する。
MaI衝液(pH7,0) テ洗浄した抗体結合ポリス
チレンボールを用いる。
ン可溶化ヒトIVコラーゲンを1%BSA。
lJ、A。
ール含有10mMリン酸緩衝液(pH7,0)を用いて
、40ag/20μaの溶液を調製し、それを段階希釈
することにより、その各20μαをとり測定試料とじI
;。
Q1肝癌(HCC)、肝硬変(LC)および慢性活動性
肝炎(CAI()各患者の血清を20a(l用いた。こ
れらの試料をそれぞれ0.8μ9/mαFab’ (ク
ローンNo、ID3)−POD複合体、1%BSA、
0.1M塩化ナトリウム、1150(v/v)馬血清お
よび0,05%チメロサール含有10mMリン酸緩衝液
(pH7,0)300μaに溶解した。次にこれらの標
準試料および血清試料のそれぞれに、モノクローナル抗
体結合ポリスチレンボールを添加して37°Cで45分
間インキュベート(免疫反応)後、0.1M塩化ナトリ
ウム含有10mMリン酸緩衝液(pH7,0)にて洗浄
する。
D基質、すなわち0.0134%テトラメチルベンチジ
ン(TIJBZ)を300μ+2加え、さらj:0.0
1%過酸化水素水100μaを加えて37°Cで30分
間インキュベート(発色反応)後、1.33N硫酸60
0μαを添加することにより反応を停止させる。反応停
止後、水を対照として島津マイクロフロー紫外可視分光
光度計(uv−730)で波長450nmの吸光度を測
定し、盲検と試料の吸光度差を求める。標準試料より作
成した検量線より検体20μaの吸光度に相当す!1V
Wコラーゲンペプチド量を読みとり、その値を50倍す
ることにより検体1 mQ当りのIVコラーゲン量を求
めた(第2表参照)。
示した。第1図で明らかなごとくこのサンドイッチ法の
定i感度は0.31ag/試験管であり、定量範囲は0
.31〜40ag/試験管であった。また、定量変動係
数(CV)は2.6〜9.5%であった。このビーズ法
での反応時間は免疫反応45分間、発色反応30分間で
従来の2段階サンドイツチ法(例えば特開昭61−20
2162公報参照)の半分以下の時間で測定が可能とな
った。
を測定した結果、NOR血清のM(平均値) + 2S
D(標準偏差)をカットオフ値とした時、各肝疾患の陽
性率は、それぞれ97%、80%および80%であった
(第2図)。
12例、さらに組織学的にあるいは画像診断で確論され
た肝転移群(HM) 13例およびリンパ野性転移群(
LM) to例の血清中IVコラーゲンを同様にこのサ
ンドイッチ法により測定した。第3図で明らかなように
IVコラーゲン濃度はHM、 LMおよびM(−)では
それぞれ552±300.199±81および104±
62n9/ mQ□Jf SD)であった。
各疾患の陽性率は、それぞれ100%、80%および2
5%であった。
(Nunc製)を用いた1段階サンドイッチ法 実施例1 (j)で得られたペプシン可溶化ヒトIVコ
ラーゲンに対する精製モノクローナル抗体(クローンN
o、4H12)を0.1%アジ化ナトリウム含有0.1
Mリン酸緩衝液(pH7,5)に溶解し、その濃度をO
,1mg/mQに調製する。この抗体溶液を固相担体と
してのポリスチレンマイクロプレートにコートするため
に1ウェル当り100μa添加し、4°C保存する。使
用時には1% BSA。
ム含有10mMリン酸緩衝液(pH7,0)300μα
にてマイクロプレートをブロックした後、O,1M塩化
ナトリウムおよび0.1%(v/v)Tween 20
含有10+nMリン酸緩衝液(pH7,0)で洗浄した
マイクロプレトを用いる。
可溶化ヒトIVコラーゲンを1%BSA。
および0.05%チメロサール含有10mMリン酸緩衝
液(pH7,0)で50%g/ 50μ4に調製し、こ
れを段階希釈したものを各々lウェル当り20μa用い
た。−方、血清試料として健常人(NOR)あるいはH
CC。
それぞれの血清をlウェル当り各20μα用いた。すな
わち、これらの試料各50μaを0.8μ9/ rn(
l Fab’(クローンNo、 1D3)−POD複合
体、1%BSA、 0.1M塩化ナトリウム、1150
(v/v)馬血清および0.05%チメロサール含有1
0mMリン酸緩衝液(pH7,0)200μaに溶解し
、lウェル当り100μaの試料溶液をモノクローナル
抗体結合マイクロプレートに添加し、室温(10〜30
°C)で1時間インキュベート(免疫反応)後、0.1
M塩化ナトリウムおよび0.1%(v/v) Twee
n 20含有10mMリン酸緩衝液(pH7,0)をl
ウェル当り100μa添加することにより免疫反応を停
止させ、0.1M塩化ナトリウムおよび0.1%(v/
v)Twean 20含有10mMリン酸緩衝液(pH
7,0)にて洗浄する。次に、0.02%過酸化水素含
有クエン酸−リン酸緩衝液(pH6,0)にOPD・2
塩酸塩を溶解し、その濃度を4mg/mQに調製した溶
液(pH5、0)を100μα加え室温で15分間イン
キュベート(発色反応)後、1.33N硫酸100μQ
を添加し反応を停止させる。反応停止後、マイクロプレ
ートリーダーで波長492nmの吸光度を測定し、盲検
と試料の吸光度差を求める。
に相当するIVコラーゲン量を読みとりその値を50倍
することにより検体LmQ当りのIVコラーゲン量を求
めた(第3表参照)。
を示した。図であきらかなごとく、このサンドイッチ法
の定量感度は、0.16%g/ウェルであり、定量範囲
は0.16〜20ng/ウェルであった。また、本定量
系のCv値は0.5〜6.0%であった。このプレート
法での反応時間は免疫反応60分間、発色反応15分間
で、従来の2段階サンドイッチ法の半分以下の時間で多
数の検体の測定が可能となった。また、同一検体を測定
した時の同時再現性および日差変動はいずれもCv値5
%以内と非常に良好な結果が得られた(第4表参照)J 第4表 (A)同時再現性 (B)日差変動 また、本発明方法を用いることにより血中コラーゲンペ
プチドを定量したとき、HCC%r−c 1CAH患者
の血清中でコラーゲンペプチドの有意な増加が認められ
た。各肝疾患の陽性率はNOR血清のM + 2SDを
カットオフ値とした時、HCC92%、LC87%、C
AH83%、CIH39%であった(第5図)。このよ
うな肝疾患患者血清中のコラーゲンペプチドの増加は、
固相担体としてポリスチレンポールを用いた1段階サン
ドイツチ法による測定と同様な傾向を示した。
ラーゲンを5DS−PAGEに供した後、実施例2(a
)で得られたFab’−POD複合体を用いて細胞工学
1&21061〜1068(1983)に記載の旧都の
方法に従ってウエスタンプロツテイングヲ行い、酵素抗
体染色のパターンを得た。
ンパクを染色したもののパターン、ウェスタンブロッテ
ィング後のニトロセルロース膜ヲそれぞれ実施例2(a
)で得られたFab’(クローンNo。
には190KD、 175KD、 125KD、 94
KD、および86KDの5個のバンドと200KD以上
に凝集物2個(205KDおよび220KD)のバンド
が認められた(メルカプトエタノール存在下)。同じ<
Fab’ (クローンNo、 4H12) −POD
複合体で免疫染色したもののパターンには185KD、
170KD、 155KD、 120KD、および9
0KDの5個のバンドと200KD以上に凝集物2個(
200K[lおよび220KD)のバンドが認められた
(第6図)。
ゲン酸素免疫定量法で補足されるヒト血清中免疫反応物
の分子量サイズを測定した。すなわち、健常者および肝
疾患(HCC)患者血清(いずれもヒトIVコラーゲン
300ng含有)を0.05%Tyeen 20.0.
15M塩化ナトリウム含有20m1Jリン酸緩衝液(p
H7,0)で平衡化した5ephacryl S −3
00 (1,6X 90cm、 Pharmacia製
)でゲルf’s過し、各両分の免疫反応物を実施例2(
b)のポリスチレンポールを用いる1段階サンドイッチ
法で定量した。第7図に示した如く健常人(−・−)お
よび肝疾患患者(−X−)血清中の免疫反応物は単一ピ
ークであり、対照として用いたベズシン可溶化ヒトIV
コラーゲンペプチド(300ng、−〇−)より若干分
子量は小さかった。フィブリノーゲン、免疫グロブリン
、牛血清アルブミン、ペルオキシダーゼを用いた検量線
から血清中免疫反応物の分子量は620KDと推定した
。
、V、VI型コラーゲン、7−Sドメイン、NCIドメ
イン、ラミニンP1両分およびペプシン可溶化ラン1−
IV型コラーゲンを実施例2(b)記載のポリスチレン
ポールを用いる1段階サンドイッチ法で定量し、ペプシ
ン可溶化ヒトIVコラーゲンの定量値と比較した。第5
表に示した如く■型コラーゲンで若干の交差反応(約7
%)が認められた以外は他のいずれのコラーゲンおよび
ラミエフ21画分で交差反応は認められなかつ jこ
。
n9/mQa度の2種のヒト血清にそれぞれ31〜50
0ng/m(lの範囲でペプシン可溶化ヒト■コラーゲ
ンを添加し、実施例2(b)、同2(c)記載のポリス
チレンポールおよびポリスチレンプレートを用いる1段
階サンドイッチ法でそれらの回収率を調べた。第8図に
示した如くポール法およびプレート法での添加ペプシン
可溶化IVコラーゲンペプチドに対する回収IVコラー
ゲンの相関係数、回収率はそれぞれγ−0,9997,
99,4±10.3% (M f 5D)8 J:びy
= 0.9993、lol、6f 7.1%であった
。
(b)および同2(c)記載のポールあるいはプレート
を用いる1段階サンドイツチ法に使用されている固相抗
体(クローンNo、4H12およびPODi識抗体(ク
ローンNo、1D3)による抗原認識部位は若干具なる
。この固相抗体とPOD標識抗体の抗原認識部位を明ら
かにするために抗原抗体阻害率を調べた。すなわち、試
験管当り10ngペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンお
よび0〜lOμ9モノクロ一ナル抗体(クローンNos
、+ ID3.3A9および4H12)を1%BSA
、 0.1M塩化ナトリウム含有10mMリン酸緩衝液
(pH7,0)中で37°C160分間プレインキュベ
イジョンし、次に実施例2(b)の方法′に従って調製
したクローンNo、4H12からのモノクローナル抗体
コートポリスチレンポールを加えて更に37°C160
分間反応させる。次に試験管当り40ngFab’(ク
ローンNo、3A9) −POD複合体を加え37°C
!、60分間反応後、TMBZj−、’よび過酸化水素
水を加え30°C160分間静置後、Ats。
トIVコラーゲンをクローンNo、1D3(−X−)か
らのモノクローナル抗体で処理した場合は、抗原抗体反
応の阻害は観察されなかったが、ここで固相抗体および
複合体に用いたりa −ンNo、3A9(−@ )お
よびクローンNo、 4H12(−0−)からのモノク
ローナル抗体で処理した場合には阻害が認められた。こ
の結果より、本明細書に開示されている1段階サンドイ
ッチ法に使用されている固相抗体(クローンNo、4H
12)がPOD標識抗体(クローンNo、ID3)に対
してペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンの異なる抗原決
定基と特異的に反応していることが明らかである。
ているポールおよびマイクロプレートを用いる1段階サ
ンドイッチ酵素免疫定量法は極めてIVコラーゲン分子
中央三重ラセン部位を特異的に認識する測定系であると
言える。
ナル抗体の作製 実施例1に記載の方法に従ってヒトlV型コラーゲン7
−Sドメインに対するモノクローナル抗体17個を調製
した。それらクローンの内4個が免疫グロブリン鎖γl
/にを、他の13個はμ/にを有していた(第6表)。
Nunc製)を用いる1段階サンドイッチ法 上記(a)で得られたヒトIVコラーゲン7−Sドメイ
ンに対する精製モノクローナル抗体(クローンNo、3
18G9)を実施例2(c)と同様な方法でマイクロプ
レートにコートした。一方、POD標識抗体は実施例1
で得られたペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンペプチド
に対するモノクローナル抗体(クローンNo、4H12
)を用いて実施例2の方法に従って調製した。
Sドメインを標準試料として第7表に示した方法で検量
線を作製した(第10図)。
は0.5ng/ウェルであり、定量範囲は、0.5〜5
4ng/ウェルであった。また、その時のCVは0.3
〜6.8%であった。このプレート法での免疫反応は6
0分間、発色反応30分間であり、実施例2(c)に示
したヒトIVコラーゲン中央三重ラセン部分の測定と同
様に短時間、高感度でヒトIVコラーゲン7−Sドメイ
ンの測定が可能となった。
びHCC患者血清中のヒトIV7−Sドメイン濃度を測
定した結果、NOR血清のM + 23Dをカットオフ
値とした時、LCおよびHCC疾患の陽性率はそれぞれ
71%、100%であった(第8表)。
血清に40〜1280ng/ mQの範囲でヒトIVコ
ラーゲン7−Sドメインを添加し、上記(b)記載のマ
イクロプレートを用いる1段階サンドイッチ法でそれら
の回収率を調べた。第11図に示した如く添加7−Sド
メインに対する回収7−Sドメインの相関係数および回
収率はそれぞれγ= 0.9991および94.2±1
4.7%(M :I:SD)であった。この結果より、
上記(b)に記載のマイクロプレートを用いる1段階サ
ンドイッチ法はヒト■コラーゲン7−Sドメインの特異
的測定法であると言える。
1段階サンドイッチ法(ビーズ法)によるペプシン可溶
化ヒトIVコラーゲンの検1線である。 第2図は、ビーズ法により測定したNOI?、1(CC
1LC,CAHの各患者の血清中の免疫反応性■?コラ
ーゲンペプチド濃度を示す。図中、横棒はMを、点線は
NORのM + 25Dを、0内数値は検体数を示す。 第3図はビーズ法により測定したHM、 LMおよびM
(−)の各患者の血清中の免疫反応性IVコラーゲン濃
度を示す。図中、縦棒は、M±SDを、点線は、NOR
のM±25Dを、0内数値は、検体数を示す。 第4図は、固相担体としてポリスチレンマイクロプレー
トを用いた1段階サンドイッチ法(プレート法)による
ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンの検量線である。 第5図は、プレート法により測定したNOR。 HCClLC,CAHおよびCIH各患者の血清中の免
疫反応性IVコラーゲンペプチド濃度を示す。図中横棒
はMを、点線はM +2SDを、0内数値は検体数を示
す。 第6図は漂準ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンペプチ
ドのイムノブロッティング図である。 A : Fab’(クローンNo、1D3) −POD
による染色B: Fab’(クローンNo、4H12)
−PODによる染色。 第7図はヒト血清中免疫反応物のゲルが過パターンを示
す図である。第8図はポール法(A)およびプレート法
(B)によるヒト血清への添加ペプシン可溶化ヒトIV
Wコラーゲンペプチドに対する回収IVコラーゲンの相
関図を示す。 第9図は3種類のモノクローナル抗体に対する抗原抗体
反応の阻害率を示す図である。 第1O図はヒトIVコラーゲン7−Sドメインの検量線
を示す図である。第ti図はヒト血清への添加ヒトIV
コラーゲン7−Sドメインに対する回収コラーゲン7−
Sドメインの相関図を示す。 特許出願人 富士薬品工業株式会社 第 図 第 図 回収IVコラーデン (n?/m1) 第 図 0.00064 0.0032 0.016 0.08 0.4 モノクローナル抗体 (μ2/試験管) 手続補正書 平成1年7月21日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンに対するモノクロ
ーナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免疫学
的測定法によるヒトIV型コラーゲンの分子中央三重ラセ
ン部位の定量法であって、 (a)ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲンの分子中央三
重ラセン部位と交差反応するモノクローナル抗体に酵素
標識を付与した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測
定対象試料を希釈して得られる試料希釈液と、 (b)ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲンのみに交差反
応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
結合固相担体とを用い、 上記希釈液(a)中に、上記の抗体結合固相担体(b)
を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒトIV型コラ
ーゲンと上記の酵素標識抗体ならびに上記の固相担体に
結合している抗体とにおいて免疫反応を行わしめた後、
固相担体を分別し、その固相担体の酵素活性を測定する
ことにより、ヒトIV型コラーゲンの分子中央三重ラセン
部位を定量する方法。2)ヒトIV型コラーゲン7−Sド
メインに対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッ
チ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒトIV型コラー
ゲン7−Sドメインの定量法であって、 (a)ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲン7−Sドメイ
ンと交差反応するモノクローナル抗体に酵素標識を付与
した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測定対象試料
を希釈して得られる試料希釈液と、 (b)ヒトIV型コラーゲン7−Sドメインのみに交差反
応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
結合固相担体とを用い、 上記希釈液(a)中に、上記の抗体結合固相担体(b)
を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒトIV型コラ
ーゲン7−Sドメインと上記の酵素標識抗体ならびに上
記の固相担体に結合している抗体とにおいて免疫反応を
行わしめた後、固相担体を分別し、その固相担体の酵素
活性を測定することにより、ヒトIV型コラーゲン7−S
ドメインを定量する方法。
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JP63-35099 | 1988-02-19 | ||
JP1036111A JPH0677017B2 (ja) | 1988-02-19 | 1989-02-17 | ヒト▲iv▼型コラーゲンのサンドイツチ酵素免疫学的定量法 |
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