JPS6363971A - ヒトコラ−ゲンペプチドの酵素免疫測定法 - Google Patents
ヒトコラ−ゲンペプチドの酵素免疫測定法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、肝臓疾患な聞易に診断するのに有用なヒトm
、■および■型コ2−ゲンベプチドの定量法に関するも
のである。
、■および■型コ2−ゲンベプチドの定量法に関するも
のである。
さらて詳しくは、本発明はヒ1llI、■あるいは■型
コラーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体および
ヒ)III、F/6るいは■型コラーゲンペプチドに対
するポリクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に基づ
く酵素免疫学的測定法によるヒトIII、IVおよびV
I型コラーケ゛ンベプチドの定量法であって、固相担体
に結合させる抗体および酵素標識を付与する抗体として
、それらの少なくとも一方に、ヒト■、■およヒトコラ
ーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするヒトIII、IVおよびVI型コラーゲ
ンペプチドの定食法に関するものである。
コラーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体および
ヒ)III、F/6るいは■型コラーゲンペプチドに対
するポリクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に基づ
く酵素免疫学的測定法によるヒトIII、IVおよびV
I型コラーケ゛ンベプチドの定量法であって、固相担体
に結合させる抗体および酵素標識を付与する抗体として
、それらの少なくとも一方に、ヒト■、■およヒトコラ
ーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするヒトIII、IVおよびVI型コラーゲ
ンペプチドの定食法に関するものである。
従来、血中ヒ)III型プロコラーゲンN末端にプチド
のポリクローナル抗体を用いての放射性免疫学的測定法
はすでに報告されている(Rohdsら、Ear −J
−C11n −I nve s t −t 9 +
451〜459+ 1979 )。
のポリクローナル抗体を用いての放射性免疫学的測定法
はすでに報告されている(Rohdsら、Ear −J
−C11n −I nve s t −t 9 +
451〜459+ 1979 )。
しかし、血中のIII、IVおよびVI型コラーゲンそ
のものの測定法は壕だ報告されていない。すなわち、コ
ラーゲン構造が動物種間であまり差がなく測定に使う抗
体が他の動物で極めてできてくいばかりか、血中での溶
解度が小さく、血中濃度を測定することは困難であるこ
とが主な原因である。
のものの測定法は壕だ報告されていない。すなわち、コ
ラーゲン構造が動物種間であまり差がなく測定に使う抗
体が他の動物で極めてできてくいばかりか、血中での溶
解度が小さく、血中濃度を測定することは困難であるこ
とが主な原因である。
本発明者らは、簡便な方法でヒ)III、■および■型
コラーゲンペヲチドを特異的に定量する方法を種々研究
した結果、それらヒ)l、■あるいは■型コラーゲンペ
プチドに対するモノクで精度よく、迅速に測定する方法
を開発した。
コラーゲンペヲチドを特異的に定量する方法を種々研究
した結果、それらヒ)l、■あるいは■型コラーゲンペ
プチドに対するモノクで精度よく、迅速に測定する方法
を開発した。
すなわち、本発明は、固相担体に結合させる抗体、およ
び酵素標識を付与する抗体として、それらの一方又は両
方に、ヒ)III、■あるいは■型コラーゲンペプチド
に対するモノクローナル抗体を用い、酵素免疫学的定量
法てよりヒトm1■および■型コラーゲンペプチドを定
量する方法を提供するものである。
び酵素標識を付与する抗体として、それらの一方又は両
方に、ヒ)III、■あるいは■型コラーゲンペプチド
に対するモノクローナル抗体を用い、酵素免疫学的定量
法てよりヒトm1■および■型コラーゲンペプチドを定
量する方法を提供するものである。
本発明方法において、酵素標識を付与する抗体としては
、抗体含有物を硫安分画後、DEAE −8ephac
elカラムにより精製したIgG画分が用いられる。ポ
リクローナル抗体の場合には各々ヒト徂、■あるいは■
型コラーゲンをカップルした5epharose 4β
アフイニテイーカラムで精製したものを用いると特異性
が増大するので好ましい。本発明方法で使用するモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体としては、それら抗
体における特異的結合部分F(ab’)2 、あるいは
Fab’そのものを使用する態様も含まれるものである
。
、抗体含有物を硫安分画後、DEAE −8ephac
elカラムにより精製したIgG画分が用いられる。ポ
リクローナル抗体の場合には各々ヒト徂、■あるいは■
型コラーゲンをカップルした5epharose 4β
アフイニテイーカラムで精製したものを用いると特異性
が増大するので好ましい。本発明方法で使用するモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体としては、それら抗
体における特異的結合部分F(ab’)2 、あるいは
Fab’そのものを使用する態様も含まれるものである
。
以上の如く、本発明は、固相担体に結合させる抗体、お
よび酵素標識を付与する抗体として、それらの少なくと
も一方に、ヒトIII、IVあるいはVI型コラーゲン
ペプチドに対するモノクローナル抗体を用いることを特
徴とする固相法酵素免疫学的測定法を提供するものであ
る。
よび酵素標識を付与する抗体として、それらの少なくと
も一方に、ヒトIII、IVあるいはVI型コラーゲン
ペプチドに対するモノクローナル抗体を用いることを特
徴とする固相法酵素免疫学的測定法を提供するものであ
る。
添付の第2図、第3図および第4図にみられるように本
発明の方法で測定した肝疾患患者血清中のヒトIII、
■および■型コラーゲンペプチド濃度の測定値は、健常
人血清中のそれよりも有意に高いことが認められ、本発
明の方法によれば、血中ヒ)III、■および〜1型コ
ラーゲン6プチド濃度測定により、患者に負担のかかる
バイオプシーなすることなく、肝疾患、特に肝線維化な
予知することができる。従来の肝機能判定法として使用
されているZTT (硫酸亜鉛混濁反応)、GOT (
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、GPT
(グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、ALP
(アルカリ性フォスファターゼ)、LDH(乳酸脱水
素酵素)およびγ−GTP (γ−グルタミルトランス
はブチダーゼ)などの測定では、肝組織の線維化を判定
することはできず、このことは本発明者らによって確認
されている。したがって、本発明者らが先に報告した血
中ヒトプロリン水酸化酵素濃度の測定(特開昭60−2
04726公報参照)と合わせて本発明方法により血中
のヒ)III、■および■型コラーゲンペプチド濃度を
測定することにより、この種の疾患を早期発見すること
が期待され、本発明方法により、ヒトコラーゲンペプチ
ド濃度測定に基づく肝組織線維化の診断を行うことがで
きるので、本発明は著しい有用性を有する。以下、実施
例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はこ
れらに限定されるものではない。
発明の方法で測定した肝疾患患者血清中のヒトIII、
■および■型コラーゲンペプチド濃度の測定値は、健常
人血清中のそれよりも有意に高いことが認められ、本発
明の方法によれば、血中ヒ)III、■および〜1型コ
ラーゲン6プチド濃度測定により、患者に負担のかかる
バイオプシーなすることなく、肝疾患、特に肝線維化な
予知することができる。従来の肝機能判定法として使用
されているZTT (硫酸亜鉛混濁反応)、GOT (
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、GPT
(グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、ALP
(アルカリ性フォスファターゼ)、LDH(乳酸脱水
素酵素)およびγ−GTP (γ−グルタミルトランス
はブチダーゼ)などの測定では、肝組織の線維化を判定
することはできず、このことは本発明者らによって確認
されている。したがって、本発明者らが先に報告した血
中ヒトプロリン水酸化酵素濃度の測定(特開昭60−2
04726公報参照)と合わせて本発明方法により血中
のヒ)III、■および■型コラーゲンペプチド濃度を
測定することにより、この種の疾患を早期発見すること
が期待され、本発明方法により、ヒトコラーゲンペプチ
ド濃度測定に基づく肝組織線維化の診断を行うことがで
きるので、本発明は著しい有用性を有する。以下、実施
例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はこ
れらに限定されるものではない。
実施例 1
抗ヒトコラーゲンペプチドモノクローナル抗体の作製
(a) 抗原−ヒトIll、 IVおよび■型コラー
ゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてArter77.262〜280
(1980)に記載のMayneらの方法に従い0.5
N酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化(1119/d
)でコラーゲンを可溶化後、最終濃度2Mとなるよう
に塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた。これ
を0.5 N酢酸に溶解し0.7M塩化ナトリウム含有
0.5 N酢酸溶液で透析することにより■、■型コラ
ーゲンを析出させ、その上清を1.2M塩化ナトリウム
含有0.5N酢酸溶液で透析し、■、■型コラーゲンを
析出させた。
ゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてArter77.262〜280
(1980)に記載のMayneらの方法に従い0.5
N酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化(1119/d
)でコラーゲンを可溶化後、最終濃度2Mとなるよう
に塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた。これ
を0.5 N酢酸に溶解し0.7M塩化ナトリウム含有
0.5 N酢酸溶液で透析することにより■、■型コラ
ーゲンを析出させ、その上清を1.2M塩化ナトリウム
含有0.5N酢酸溶液で透析し、■、■型コラーゲンを
析出させた。
更にその上清を1.8M塩化す)IJウム含有0.5
N酢酸溶液に対して透析し〜1型コラーゲンを析出させ
た。次に上記で得たI、■型コラーゲン画分を0.5M
塩化ナトリウム含有50 mM )−1)スー塩酸緩衝
液、pH7,4に溶解させ、1.7M塩化ナトリウム含
有50mM)リス−塩酸緩衝液、pH7,4および2.
7M塩化ナトリウム含有トリス−塩酸緩衝液、pH7,
4で順次透析することにより各々I型、および■型コラ
ーゲンを析出させ■型コラーゲンをI型コラーゲンから
分別した。■、■型コラーゲン画分についてはI、■型
コラーケ゛ン画分と同様に0.5 M塩化ナトリウム含
有50mMトリス−塩酸緩衝液、pH7,4に溶解させ
、2.2M塩化ナトリウム含有50IIIMトリス−塩
酸緩衝液、pH7,4で■型コラーゲンを析出させ、■
型コラーゲンと分別した。得られたIII、IVおよび
VI型の純度をBiochem、 Biophys、
Res。
N酢酸溶液に対して透析し〜1型コラーゲンを析出させ
た。次に上記で得たI、■型コラーゲン画分を0.5M
塩化ナトリウム含有50 mM )−1)スー塩酸緩衝
液、pH7,4に溶解させ、1.7M塩化ナトリウム含
有50mM)リス−塩酸緩衝液、pH7,4および2.
7M塩化ナトリウム含有トリス−塩酸緩衝液、pH7,
4で順次透析することにより各々I型、および■型コラ
ーゲンを析出させ■型コラーゲンをI型コラーゲンから
分別した。■、■型コラーゲン画分についてはI、■型
コラーケ゛ン画分と同様に0.5 M塩化ナトリウム含
有50mMトリス−塩酸緩衝液、pH7,4に溶解させ
、2.2M塩化ナトリウム含有50IIIMトリス−塩
酸緩衝液、pH7,4で■型コラーゲンを析出させ、■
型コラーゲンと分別した。得られたIII、IVおよび
VI型の純度をBiochem、 Biophys、
Res。
Commun、、 72+ 1472〜1480 (1
976)記載の5yhesらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE )で調べたところ約95%であった。
976)記載の5yhesらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE )で調べたところ約95%であった。
(1)) 抗体産生細胞の調製
ヒ)I、■および■型コラーゲン各に100μ2を完全
フロインドアジュバントと共に8週令のBALB /c
雌マウス2匹に初回腹腔内投与した。
フロインドアジュバントと共に8週令のBALB /c
雌マウス2匹に初回腹腔内投与した。
2回目以降は0.5 M塩化ナトリウム含有50mMト
リス−塩酸緩衝液、pH7,4に溶解させた抗原各々1
00μ2を2〜4週間毎に、2〜4回BALB/C雄マ
ウスに追加免疫した。最終免疫として膵臓摘出5日前に
静脈内投与し牌細胞を調製した。
リス−塩酸緩衝液、pH7,4に溶解させた抗原各々1
00μ2を2〜4週間毎に、2〜4回BALB/C雄マ
ウスに追加免疫した。最終免疫として膵臓摘出5日前に
静脈内投与し牌細胞を調製した。
(C) 細胞融合
以下の材料および方法を用いる。
RPMI 1640培地: RPMI A 1640
(Difco Labo−ratories)に重炭酸
ナトリウム(12mM )、ピルビン酸ナトリウム(1
mM )、L−グルタミン(2mM)、ペニシリンGカ
リウム(50u/d) 、硫酸ストレプトマイシン(5
0μt/rd)、および硫酸アミカシン(100μt7
mt)を加え、ドライアイスで−をZ2にし、0.2μ
m Toyoメンブレンフィルターで除菌濾過する。
(Difco Labo−ratories)に重炭酸
ナトリウム(12mM )、ピルビン酸ナトリウム(1
mM )、L−グルタミン(2mM)、ペニシリンGカ
リウム(50u/d) 、硫酸ストレプトマイシン(5
0μt/rd)、および硫酸アミカシン(100μt7
mt)を加え、ドライアイスで−をZ2にし、0.2μ
m Toyoメンブレンフィルターで除菌濾過する。
N5−1培地二上記RPMI 1640培地に除菌濾過
した仔牛脂児血清(M、 A、 Bioproduct
s )を15%(V/’V)の濃度に加える。
した仔牛脂児血清(M、 A、 Bioproduct
s )を15%(V/’V)の濃度に加える。
HAT培地:上記のN5−1培地にさらにヒポキサンチ
ン(100μM)、アミノプテリン(0,4μM)、お
よびチミジン(16μM)を加える。
ン(100μM)、アミノプテリン(0,4μM)、お
よびチミジン(16μM)を加える。
HT培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記HAT
培地と同一組成のものである。
培地と同一組成のものである。
PEG 4,000溶液: RPMI 1640培地の
ポリエチレングリコール4,000 (PE()4,0
00 、 Merck & Co、。
ポリエチレングリコール4,000 (PE()4,0
00 、 Merck & Co、。
Inc、) 50%(w7w)無血清溶液を調製する。
8−アザグアニン耐性ミエローマ細1Ns−1(P3−
NS1−1)との融合は5elected Mstho
d 1nCellular Immunology (
ed、 B、B、 Mishell ar1dS+M、
Shiigi)、 W、 H,Freeman an
d Company(1980)、 35.1〜672
に記載の01らの方法を若干改変して行った。前記軸)
で調製した有核肺臓細胞(生細胞率95%)とミエロー
マ細胞(生細胞率95%)とを5〜6:1の割合で融合
する。
NS1−1)との融合は5elected Mstho
d 1nCellular Immunology (
ed、 B、B、 Mishell ar1dS+M、
Shiigi)、 W、 H,Freeman an
d Company(1980)、 35.1〜672
に記載の01らの方法を若干改変して行った。前記軸)
で調製した有核肺臓細胞(生細胞率95%)とミエロー
マ細胞(生細胞率95%)とを5〜6:1の割合で融合
する。
膵臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記のRPM116
40培地で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合さ
せるため上記の割合で混合する。容量50ゴの円錐形ス
チロール樹脂製試験管(工waki ()lass )
を用い、40ゴのRPM工1640培地中400Xf、
10分間遠心し、上清を完全に吸出する。沈殿細胞に6
7℃加温PEG4,000溶液1−を穏やかに攪拌しな
がら1分間で滴下し、さらに1分間攪拌し細胞を再けん
濁、分散させる。次に37℃加温RPMI 1640培
地1−を1分間で滴下する。この操作をさらに1回繰返
した後、同培地7−を2〜3分間で常に攪拌しながら滴
下し細胞を分散させる。これを400×?、10分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細
胞に37℃加温N5−1培地10−をすみやかに加え、
細胞の大きい塊りを10−のピはットを用いて注意深く
ピプッティングして分散する。さらに同培地20−を加
えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイクロワエル(I
waki Glass )にウェル渦り5.9X105
個10.1−の細胞をまき込む。なおこの時使用した9
6穴マイクロウエルの前処理として0.2−のN5−i
培地を加え、炭酸ガス培養器中(67℃)で−晩保温し
、使用時に培地を吸引除去する。
40培地で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合さ
せるため上記の割合で混合する。容量50ゴの円錐形ス
チロール樹脂製試験管(工waki ()lass )
を用い、40ゴのRPM工1640培地中400Xf、
10分間遠心し、上清を完全に吸出する。沈殿細胞に6
7℃加温PEG4,000溶液1−を穏やかに攪拌しな
がら1分間で滴下し、さらに1分間攪拌し細胞を再けん
濁、分散させる。次に37℃加温RPMI 1640培
地1−を1分間で滴下する。この操作をさらに1回繰返
した後、同培地7−を2〜3分間で常に攪拌しながら滴
下し細胞を分散させる。これを400×?、10分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細
胞に37℃加温N5−1培地10−をすみやかに加え、
細胞の大きい塊りを10−のピはットを用いて注意深く
ピプッティングして分散する。さらに同培地20−を加
えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイクロワエル(I
waki Glass )にウェル渦り5.9X105
個10.1−の細胞をまき込む。なおこの時使用した9
6穴マイクロウエルの前処理として0.2−のN5−i
培地を加え、炭酸ガス培養器中(67℃)で−晩保温し
、使用時に培地を吸引除去する。
細胞融合完了したマイクロウェルな7%炭酸ガス/96
チ空気中で温度67℃、湿度100%下にインキュベー
トする。
チ空気中で温度67℃、湿度100%下にインキュベー
トする。
(d) 選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖
培養1日目にバスツールビはットでHAT培地2滴(約
0.1 m/ )を加える。2.3.5.8.11日目
に培地の半分(0,1m)を新しいHAT培地で置き換
える。14日目にHT培地に切換え以降3〜4日毎に同
操作を繰り返す。通常2〜3週間で充分なハイブリドー
マの生育が観察される。
0.1 m/ )を加える。2.3.5.8.11日目
に培地の半分(0,1m)を新しいHAT培地で置き換
える。14日目にHT培地に切換え以降3〜4日毎に同
操作を繰り返す。通常2〜3週間で充分なハイブリドー
マの生育が観察される。
ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項(e)記載の
固相−抗体結合テスト法(ELISA)により陽性ウェ
ルなチェックする。次にフィーダーとして107個のマ
ウス胸腺細胞を含むHT培地1−をホリスチレン製24
穴セルウェル(Iwaki C)lass )に加えた
ものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの
全内容物を移す。これを前記(C)におけると同様に7
%炭酸ガス存在下、37℃で約1週間インキュベートす
る。その間1〜2回各ウェルの上清0.5 rntを新
しいHT培地0.5−と交換する。ハイブリドーマの充
分生育した時点でELISA法により陽性な再確認し、
それぞれについて次項(f)記載の限界希釈法によるク
ローニングを行う。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製25cyR2組織培養フラスコ(Iw
aki Glass)に移し、凍結保存用試料を調製す
る。
固相−抗体結合テスト法(ELISA)により陽性ウェ
ルなチェックする。次にフィーダーとして107個のマ
ウス胸腺細胞を含むHT培地1−をホリスチレン製24
穴セルウェル(Iwaki C)lass )に加えた
ものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの
全内容物を移す。これを前記(C)におけると同様に7
%炭酸ガス存在下、37℃で約1週間インキュベートす
る。その間1〜2回各ウェルの上清0.5 rntを新
しいHT培地0.5−と交換する。ハイブリドーマの充
分生育した時点でELISA法により陽性な再確認し、
それぞれについて次項(f)記載の限界希釈法によるク
ローニングを行う。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製25cyR2組織培養フラスコ(Iw
aki Glass)に移し、凍結保存用試料を調製す
る。
(e) 固相−抗体結合テスト(ELISA)による
抗ヒトコラーゲンペプチド抗体産生ノ・イブリドーマの
検索 Anal、 Biochem、 104.205〜21
4 (1980)に記載のRennardらの方法を若
干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ
抗体の検出に適している。96穴ミクロタイトレージヨ
ンプレー) (Flow Laboratories、
Inc−)を0.5〜tOμtのヒト1、■あるいは
■型コラーゲンで各々コートし、さらにその他を1%牛
血清アルブミン(BSA)でブロックする。これにハイ
ブリドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約1
時間インキュベートする。2次抗体として西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン(C
appel Lab、)を加えさらに室温で約1時間イ
ンキュベートする。次に過酸化水素と基質であるO−フ
二二レンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉眼で女
性的に判定するか、あるいはコロナ2波長マイクロプレ
ート光度計(MTP−22,コロナ電気社)を用いて5
00 nmの吸光度を測定する。
抗ヒトコラーゲンペプチド抗体産生ノ・イブリドーマの
検索 Anal、 Biochem、 104.205〜21
4 (1980)に記載のRennardらの方法を若
干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ
抗体の検出に適している。96穴ミクロタイトレージヨ
ンプレー) (Flow Laboratories、
Inc−)を0.5〜tOμtのヒト1、■あるいは
■型コラーゲンで各々コートし、さらにその他を1%牛
血清アルブミン(BSA)でブロックする。これにハイ
ブリドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約1
時間インキュベートする。2次抗体として西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン(C
appel Lab、)を加えさらに室温で約1時間イ
ンキュベートする。次に過酸化水素と基質であるO−フ
二二レンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉眼で女
性的に判定するか、あるいはコロナ2波長マイクロプレ
ート光度計(MTP−22,コロナ電気社)を用いて5
00 nmの吸光度を測定する。
(f) クローニング
各ウェル中には2種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。N5−1培地−描すフィーダーとして107個のマ
ウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し96穴マ
イクロウエルの56ウエル、36ウエルおよび24ウエ
ルにウェル当り5個、1個および0.5個のハイブリド
ーマをカロえる。5日目、12日目に各約0.1−のN
5−1培地を追加する。クローニング開始後14〜15
日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウェルが50係以上である群についてELIS
Aを行う。テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体
陽性ウェル中のコロニー数ヲ確認シ、ウェル中に1コロ
ニーのウェルな4〜6個選び再クローニングする。最終
的Km、■および■コラーゲンに対して各々5.22お
よび5株のクローンを得た。
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。N5−1培地−描すフィーダーとして107個のマ
ウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し96穴マ
イクロウエルの56ウエル、36ウエルおよび24ウエ
ルにウェル当り5個、1個および0.5個のハイブリド
ーマをカロえる。5日目、12日目に各約0.1−のN
5−1培地を追加する。クローニング開始後14〜15
日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウェルが50係以上である群についてELIS
Aを行う。テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体
陽性ウェル中のコロニー数ヲ確認シ、ウェル中に1コロ
ニーのウェルな4〜6個選び再クローニングする。最終
的Km、■および■コラーゲンに対して各々5.22お
よび5株のクローンを得た。
(g)モノクローナル抗体のインビトロ増殖およびイン
ビボ増殖 モノクローナル抗体は、得られたクローンをMS−1培
地などの適当な培養液で培養(インビトロ増殖)し、そ
の培養上清から得ることができる(モノクローナル抗体
たん白濃度は10〜100μf/atである)。一方、
大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞の由
来動物と同系の動物(BALB/C、マウス)に腫瘍形
成促進剤ブリスタン(2,6,10,14−テトラメチ
ルペンタデカン、Aldrich Chsmica1社
)をマウス−匹当リ0.57!腹腔内投与する。1〜5
週間後1c /%イブリドーマlX107個を同じく腹
腔内投与することによりインビボで1〜2週間後にモノ
クローナル抗体たん白質濃度4〜7*y/atの腹水を
得ることができる。
ビボ増殖 モノクローナル抗体は、得られたクローンをMS−1培
地などの適当な培養液で培養(インビトロ増殖)し、そ
の培養上清から得ることができる(モノクローナル抗体
たん白濃度は10〜100μf/atである)。一方、
大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞の由
来動物と同系の動物(BALB/C、マウス)に腫瘍形
成促進剤ブリスタン(2,6,10,14−テトラメチ
ルペンタデカン、Aldrich Chsmica1社
)をマウス−匹当リ0.57!腹腔内投与する。1〜5
週間後1c /%イブリドーマlX107個を同じく腹
腔内投与することによりインビボで1〜2週間後にモノ
クローナル抗体たん白質濃度4〜7*y/atの腹水を
得ることができる。
の
Ch)モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖←÷←アインタ
イプ 得られた各々の腹水を先ずヒ)I[I、■または■型コ
ラーゲンを各々コートしたミクロタイトレージョンプレ
ートに前述したELISA法に従って結合させる。洗滌
後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスIg抗体(Zy
med Laboratories)を加える。洗滌後
、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG
(H+L )抗体を加え、基質として2,2′−アジノ
ージ(3−エチルベンゾチアゾリン硫酸−6)および過
酸化水素を用いて検出した。その結果をまとめて後掲の
第1表、第2表、および第6表に示した。得られたヒト
■型コラーゲンに対するモノクローナル抗体の内4個は
免疫グロブリン鎖γ1/にを、1個がγ2a/にを(第
1表参照)、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内16
個がγ1/にを、2個が12b/′にを、1個がα/に
および6個がμ/にを有していた(第2表参照)。なお
、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内1個がγ1/に
、1個が12a/におよび5個がγ2b/にを有してい
た(第3表参照)。
イプ 得られた各々の腹水を先ずヒ)I[I、■または■型コ
ラーゲンを各々コートしたミクロタイトレージョンプレ
ートに前述したELISA法に従って結合させる。洗滌
後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスIg抗体(Zy
med Laboratories)を加える。洗滌後
、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG
(H+L )抗体を加え、基質として2,2′−アジノ
ージ(3−エチルベンゾチアゾリン硫酸−6)および過
酸化水素を用いて検出した。その結果をまとめて後掲の
第1表、第2表、および第6表に示した。得られたヒト
■型コラーゲンに対するモノクローナル抗体の内4個は
免疫グロブリン鎖γ1/にを、1個がγ2a/にを(第
1表参照)、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内16
個がγ1/にを、2個が12b/′にを、1個がα/に
および6個がμ/にを有していた(第2表参照)。なお
、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内1個がγ1/に
、1個が12a/におよび5個がγ2b/にを有してい
た(第3表参照)。
(1)モノクローナル抗体の精製
前記(ロ)で得られた各腹水を硫安分画(40%飽和)
後、IgGクラスは食塩0.06Mを含む40mM9ン
酸緩衝液、pHs、 0で平衡化したDEAE −3e
phacel (pharmacia社)の非吸着画分
を分取し、このIgG画分を更に0.42M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液、pH7,4で平衡化したSeμ
5drylS−3005uperfine (phar
macia社)カラムでゲル濾過し、培地中の仔牛脂児
血清およびマウス由来のたん白質を分離、除去した。I
gAおよびIgMクラスの精製についてはDEAE−3
ephacelカラムクロマトグラフイーにおいて食塩
0.06MからtOMまでのグラディエンドでそれぞれ
両画弁を溶出した。その他はIgGクラスの場合と同様
の条件で精製した。
後、IgGクラスは食塩0.06Mを含む40mM9ン
酸緩衝液、pHs、 0で平衡化したDEAE −3e
phacel (pharmacia社)の非吸着画分
を分取し、このIgG画分を更に0.42M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液、pH7,4で平衡化したSeμ
5drylS−3005uperfine (phar
macia社)カラムでゲル濾過し、培地中の仔牛脂児
血清およびマウス由来のたん白質を分離、除去した。I
gAおよびIgMクラスの精製についてはDEAE−3
ephacelカラムクロマトグラフイーにおいて食塩
0.06MからtOMまでのグラディエンドでそれぞれ
両画弁を溶出した。その他はIgGクラスの場合と同様
の条件で精製した。
実施例 2
抗血清、ヒ)Ill、■および■型コラーゲンポリクロ
ーナル抗体の作製 実施例1(a)の場合と同様にヒト胎盤より精製したヒ
トIII、IVおよびVI型コラーゲン各々119を等
量の完全フロインドアジュバントと共に家兎の皮下に2
週間毎に4〜6回免疫した。最終的に得られた抗血清は
各凰コラーゲンをカップルさせたアフイニテイクロマト
グラフイーにより精製しくe)記載のELISA法によ
り精製型別コラーゲンを用いて抗体価および特異性を調
べたところ、それらポリクローナル抗体はそれぞれヒト
III、IVおよびVI型コラーゲンとのみ交叉した。
ーナル抗体の作製 実施例1(a)の場合と同様にヒト胎盤より精製したヒ
トIII、IVおよびVI型コラーゲン各々119を等
量の完全フロインドアジュバントと共に家兎の皮下に2
週間毎に4〜6回免疫した。最終的に得られた抗血清は
各凰コラーゲンをカップルさせたアフイニテイクロマト
グラフイーにより精製しくe)記載のELISA法によ
り精製型別コラーゲンを用いて抗体価および特異性を調
べたところ、それらポリクローナル抗体はそれぞれヒト
III、IVおよびVI型コラーゲンとのみ交叉した。
実施例 3
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体併用によ
る血清III、IVおよびVI型コラーゲンペプチドの
定量 第2版酵素免疫測定法(石川栄治、河合忠、宮井潔編集
)医学書院(1982)、30〜49に記載のサンドイ
ッチ法を用いヒト血清中のIII、IVおよびVI型コ
ラーゲン量を測定した。
る血清III、IVおよびVI型コラーゲンペプチドの
定量 第2版酵素免疫測定法(石川栄治、河合忠、宮井潔編集
)医学書院(1982)、30〜49に記載のサンドイ
ッチ法を用いヒト血清中のIII、IVおよびVI型コ
ラーゲン量を測定した。
ホリスチレン製96穴ミクロタイトレージョンプレート
(Flow Laboratories、 Inc、)
を実施例1(1)で得られたヒトIII、IVあるいは
VI型コラーゲンに対する精製モノクローナル抗体でコ
ートし、さらにその他を1.0%BSAでブロックする
。一方、標準品として実施例1(a)で得られた精製ヒ
)III、■あるいは■型コラーゲンおよび血清試料と
して健常人、生検による組織学的検索で診断の確定した
慢性活動性肝炎および肝硬変患者のもの各10μtを用
いた。これら試料溶液をモノクローナル抗体処理ミクロ
タイトレージョンプレートに添加し室温°で約1時間イ
ンキュベートする。
(Flow Laboratories、 Inc、)
を実施例1(1)で得られたヒトIII、IVあるいは
VI型コラーゲンに対する精製モノクローナル抗体でコ
ートし、さらにその他を1.0%BSAでブロックする
。一方、標準品として実施例1(a)で得られた精製ヒ
)III、■あるいは■型コラーゲンおよび血清試料と
して健常人、生検による組織学的検索で診断の確定した
慢性活動性肝炎および肝硬変患者のもの各10μtを用
いた。これら試料溶液をモノクローナル抗体処理ミクロ
タイトレージョンプレートに添加し室温°で約1時間イ
ンキュベートする。
さらに実施例2で得られたウサギポリクローナル抗体、
および2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサ
ギIgG (Miles−Yeda Ltd、)を加え
、さらに室温で約1時間インキュベートする。次に過酸
化水素と基質であるO−フエニレンジアミンを加え生成
した赤褐色をコロナ2波長マイクロプレート光度計(M
TP−22)で定量した。第1図にヒ)I[I、■およ
び■型コラーゲンの検量線を示したが、その定量感度は
いずれも約5nrであった。またこのサンドイツチ法に
より血中コラーゲンペプチドが定量でき、ヒト肝疾患に
伴う血中コラーゲンペプチド濃度の増加が認められた(
第2図、3図および4図)。特て、■および■型コラー
ゲンはゾチドが慢性活動性肝炎、および肝硬変患者血中
で増大した。
および2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサ
ギIgG (Miles−Yeda Ltd、)を加え
、さらに室温で約1時間インキュベートする。次に過酸
化水素と基質であるO−フエニレンジアミンを加え生成
した赤褐色をコロナ2波長マイクロプレート光度計(M
TP−22)で定量した。第1図にヒ)I[I、■およ
び■型コラーゲンの検量線を示したが、その定量感度は
いずれも約5nrであった。またこのサンドイツチ法に
より血中コラーゲンペプチドが定量でき、ヒト肝疾患に
伴う血中コラーゲンペプチド濃度の増加が認められた(
第2図、3図および4図)。特て、■および■型コラー
ゲンはゾチドが慢性活動性肝炎、および肝硬変患者血中
で増大した。
なお、本発明では固相にモノクローナル抗体、複合体に
ポリクローナル抗体および2次抗体としてペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギIgGを用いたサンドイツチ法によっ
たが、免疫実験操作法X、3497〜3519(198
2)に記載の古式らの酵素標識ヒ)Ill、■および■
型コラーゲンペプチドに対するマウスモノクローナル抗
体、あるいはウサギポリクローナル抗体(IgG、およ
びFab’)を用いるサンドイッチイムノアッセイ法、
およびアイソトープ標識抗体(モノおよびポリクローン
)を用いるラジオイムノアッセイ法(特開昭6l−P7
47、P776)血中コラーケ゛ンベプチド定量に応用
できる。
ポリクローナル抗体および2次抗体としてペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギIgGを用いたサンドイツチ法によっ
たが、免疫実験操作法X、3497〜3519(198
2)に記載の古式らの酵素標識ヒ)Ill、■および■
型コラーゲンペプチドに対するマウスモノクローナル抗
体、あるいはウサギポリクローナル抗体(IgG、およ
びFab’)を用いるサンドイッチイムノアッセイ法、
およびアイソトープ標識抗体(モノおよびポリクローン
)を用いるラジオイムノアッセイ法(特開昭6l−P7
47、P776)血中コラーケ゛ンベプチド定量に応用
できる。
実施例 4
モノクローナル抗体による血清■型コラーゲンペプチド
の定量 J 、 Immunoassay 4 、209〜32
7.1983に記載の石川らの方法に従い固相および複
合体共にモノクローナル抗体を用いて定量した。まず、
実施例1(1)で得られたヒ)III型コラーゲンに対
する精製モノクローナル抗体IgG 1 (クローン&
12)を0.1係アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸
緩衝液、pH7,5K溶解し、その濃度を0.1肩9/
−に調整する。この抗体溶液て固相担体としてのポリス
チレンボール(径6.5 yIl!I%Prec1s1
ツnPlastic Ba11社)を浸漬し、ポリスチ
レンボールに抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収
しポリスチレンボールを0.1%BSA、 0.1 M
塩化ナトリウムおよび0.1%アジ化ナトリウム含有1
0mM!Jン酸緩衝液、pH7,0で洗滌し使用する。
の定量 J 、 Immunoassay 4 、209〜32
7.1983に記載の石川らの方法に従い固相および複
合体共にモノクローナル抗体を用いて定量した。まず、
実施例1(1)で得られたヒ)III型コラーゲンに対
する精製モノクローナル抗体IgG 1 (クローン&
12)を0.1係アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸
緩衝液、pH7,5K溶解し、その濃度を0.1肩9/
−に調整する。この抗体溶液て固相担体としてのポリス
チレンボール(径6.5 yIl!I%Prec1s1
ツnPlastic Ba11社)を浸漬し、ポリスチ
レンボールに抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収
しポリスチレンボールを0.1%BSA、 0.1 M
塩化ナトリウムおよび0.1%アジ化ナトリウム含有1
0mM!Jン酸緩衝液、pH7,0で洗滌し使用する。
一方、標準試料として実施例1(a)で得られた精製ヒ
)III型コラーゲンおよび血清試料として健常人、生
検による組織学的検索で診断の確定した慢性活動性肝炎
および肝硬変患者のもの各10μtを用いた。これら試
料溶液をモノクローナル抗体処理ポリスチレンボールに
添加し30℃1時間インキュベートする(第1反応)。
)III型コラーゲンおよび血清試料として健常人、生
検による組織学的検索で診断の確定した慢性活動性肝炎
および肝硬変患者のもの各10μtを用いた。これら試
料溶液をモノクローナル抗体処理ポリスチレンボールに
添加し30℃1時間インキュベートする(第1反応)。
更に固相に用いたモノクローナル抗体とは異なるクロー
ンからのモノクローナル抗体IgG又はFab’ (ク
ローンA33)−’ルオキシダーゼ複合体を加え、50
℃、1時間インキュベートする(第2反応)。次に過酸
化水素と基質である3 、 3’、 5 、5’−テト
ラメチルベンジジン(TMBZ )を加え30℃で60
分間反応させた後(第3反応)1.33 N硫酸で反応
を停止させる。反応停止後、水を対照として島津マイク
ロフロー紫外可視分光光度計(UV−730)の波長4
50 nmで吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度差を
求める。別に標準試料より作成した検量線より、検体1
oμtの吸光度て相邑するm型コラーゲンペプチド量を
読みとり、その値を100倍することにより検体1−当
りの■型コラーゲン量を求めた。
ンからのモノクローナル抗体IgG又はFab’ (ク
ローンA33)−’ルオキシダーゼ複合体を加え、50
℃、1時間インキュベートする(第2反応)。次に過酸
化水素と基質である3 、 3’、 5 、5’−テト
ラメチルベンジジン(TMBZ )を加え30℃で60
分間反応させた後(第3反応)1.33 N硫酸で反応
を停止させる。反応停止後、水を対照として島津マイク
ロフロー紫外可視分光光度計(UV−730)の波長4
50 nmで吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度差を
求める。別に標準試料より作成した検量線より、検体1
oμtの吸光度て相邑するm型コラーゲンペプチド量を
読みとり、その値を100倍することにより検体1−当
りの■型コラーゲン量を求めた。
実施例 5
モノクローナル抗体による血清■型コラーゲンペプチド
の定量 固相にモノクローナル抗体IgG1(り0−ン、4H1
2)を、複合体にペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体Ig()又はFab’ (クローン、1D3)を用
いた以外の他の測定条件は実施例4の血清m型コラーゲ
ンペプチドの定量の場合と同様に健常人、慢性活動性肝
炎および肝硬変患者の血清■型コラーゲンペプチドを定
量した。
の定量 固相にモノクローナル抗体IgG1(り0−ン、4H1
2)を、複合体にペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体Ig()又はFab’ (クローン、1D3)を用
いた以外の他の測定条件は実施例4の血清m型コラーゲ
ンペプチドの定量の場合と同様に健常人、慢性活動性肝
炎および肝硬変患者の血清■型コラーゲンペプチドを定
量した。
第 1 表
A11 IgG2a r2a7に黒12 I
gG1 γ1/に A33 Igol γ1/に A41 IgG1 γ1/に 黒53 Ig()1 γ1/l 第 2 表 4C1工gM μ/に 7A11 IgM μ/に ID3 工gG1 γ1/に ID6 工gG1 γ1/に I E 10 Ig()1 γ1/に2A7
IgM μ/に 2 D 5 IgG1 γ1/に2HI I
gA α/に 3A9 IgG1 γ1/に 4 B I IgG1 γ1/に4H12IgG
1 γ1/に 5D10 工gG1 γ1/に 5 F 6 IgG1 γ1/に6B5 I
gG1 γ1/に 6C11IgG1 γ1/に 6 G 5 IgG2b γ2b/に7 C8I
gG1 γ1/に 7 H2IgG1 γ1/に 8 B4 Ig()1 γ1/に8G12
IgG1 11/1 9A3 IgG2b r2b/’9C7工gG1
γ1/に 第 3 表 煮14 IgG2b γ2b/にA17 I
gG2b γ2b/にA26 IgG1 γ1
/に A29 IgG2b r2b/’&38 I
gG2a r2a/’
gG1 γ1/に A33 Igol γ1/に A41 IgG1 γ1/に 黒53 Ig()1 γ1/l 第 2 表 4C1工gM μ/に 7A11 IgM μ/に ID3 工gG1 γ1/に ID6 工gG1 γ1/に I E 10 Ig()1 γ1/に2A7
IgM μ/に 2 D 5 IgG1 γ1/に2HI I
gA α/に 3A9 IgG1 γ1/に 4 B I IgG1 γ1/に4H12IgG
1 γ1/に 5D10 工gG1 γ1/に 5 F 6 IgG1 γ1/に6B5 I
gG1 γ1/に 6C11IgG1 γ1/に 6 G 5 IgG2b γ2b/に7 C8I
gG1 γ1/に 7 H2IgG1 γ1/に 8 B4 Ig()1 γ1/に8G12
IgG1 11/1 9A3 IgG2b r2b/’9C7工gG1
γ1/に 第 3 表 煮14 IgG2b γ2b/にA17 I
gG2b γ2b/にA26 IgG1 γ1
/に A29 IgG2b r2b/’&38 I
gG2a r2a/’
第1図は精製マウス抗ヒトコラーゲンペプチドモノクロ
ーナル抗体(IgGタイプ)と精製ウサギ抗ヒトコラー
ゲンペプチドボリクローナル抗体を用いてのサンドイッ
チ法によるヒトコラーゲンペプチドの標準曲線である。 (−〇−)ヒト■型コラーゲン、(−・−)ヒト■型コ
ラーゲン、(−ム一)ヒト■型コラーゲン。 第2図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンペプチド濃度。図中横
棒は平均値を、(り印は肝疾患患者血清中m型コラーゲ
ンはプテド濃度の健常人のそれと比較しての有意差(P
(0,01)を()内数値は試料数を、陰影部は健常人
平均値(M)の±28Dを示す。 第3図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンメプチド濃度。(11
り印は肝疾患患者血清中■型コラーケ゛ンベプチド濃度
の健常人のそれと比較しての有意差(P<0.001)
を示す。 第4図は健常人、慢性活動性肝炎患者およC肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンープチド濃度。(り印
は肝疾患患者血清中■型ラーゲンベプチド濃度の健常人
のそれと比較しての有意差(P<0.05)を示す。 特許出願人 富士薬品工業株式会社 第一図 健常人 慢性活動性肝炎 肝硬変第3図 健常人 慢性活動性肝炎 肝硬変第9図
ーナル抗体(IgGタイプ)と精製ウサギ抗ヒトコラー
ゲンペプチドボリクローナル抗体を用いてのサンドイッ
チ法によるヒトコラーゲンペプチドの標準曲線である。 (−〇−)ヒト■型コラーゲン、(−・−)ヒト■型コ
ラーゲン、(−ム一)ヒト■型コラーゲン。 第2図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンペプチド濃度。図中横
棒は平均値を、(り印は肝疾患患者血清中m型コラーゲ
ンはプテド濃度の健常人のそれと比較しての有意差(P
(0,01)を()内数値は試料数を、陰影部は健常人
平均値(M)の±28Dを示す。 第3図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンメプチド濃度。(11
り印は肝疾患患者血清中■型コラーケ゛ンベプチド濃度
の健常人のそれと比較しての有意差(P<0.001)
を示す。 第4図は健常人、慢性活動性肝炎患者およC肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンープチド濃度。(り印
は肝疾患患者血清中■型ラーゲンベプチド濃度の健常人
のそれと比較しての有意差(P<0.05)を示す。 特許出願人 富士薬品工業株式会社 第一図 健常人 慢性活動性肝炎 肝硬変第3図 健常人 慢性活動性肝炎 肝硬変第9図
Claims (1)
- ヒトIII、IVあるいはVI型コラーゲンペプチドに対する
モノクローナル抗体およびヒトIII、IVあるいはVI型コ
ラーゲンペプチドに対するポリクローナル抗体を用いた
サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒト
III、IVおよびVI型コラーゲンペプチドの定量法であつ
て、固相担体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
る抗体として、それらの少なくとも一方に、ヒトIII、
IVあるいはVI型コラーゲンに対するモノクローナル抗体
を用いることを特徴とするヒトIII、IVおよびVI型コラ
ーゲンペプチド定量法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61206862A JPH0638081B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヒトコラーゲンペプチドの酵素免疫測定法 |
CA 530844 CA1287801C (en) | 1986-09-04 | 1987-02-27 | Method for determining human collagen peptides by way of enzyme immunoassay |
US07/831,645 US5316914A (en) | 1986-09-04 | 1992-02-07 | Method for determining human collagen peptides by way of enzyme immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61206862A JPH0638081B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヒトコラーゲンペプチドの酵素免疫測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6363971A true JPS6363971A (ja) | 1988-03-22 |
JPH0638081B2 JPH0638081B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=16530271
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61206862A Expired - Lifetime JPH0638081B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヒトコラーゲンペプチドの酵素免疫測定法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0638081B2 (ja) |
CA (1) | CA1287801C (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Families Citing this family (4)
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US5962639A (en) * | 1987-11-06 | 1999-10-05 | Washington Research Foundation | Synthetic peptides corresponding to telopeptide sequences of cross-linked type I collagen metabolites |
US6153732A (en) * | 1987-11-06 | 2000-11-28 | Washington Research Foundation | Kit for detecting analyte indicative of type II collagen resorption in vivo |
US6027903A (en) * | 1987-11-06 | 2000-02-22 | Washington Research Foundation | Kit for detecting analyte indicative of type I collagen resorption in vivo |
Citations (2)
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JPS57208458A (en) * | 1981-06-18 | 1982-12-21 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Labeled antibody for immunochemical measurement |
-
1986
- 1986-09-04 JP JP61206862A patent/JPH0638081B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-02-27 CA CA 530844 patent/CA1287801C/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1287801C (en) | 1991-08-20 |
JPH0638081B2 (ja) | 1994-05-18 |
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