JPH0772148A - ヒトｉｖ型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的定量法に
よるヒト血中のヒトＩＶ型コラーゲンの定量試薬を提供
する。 【構成】下記（１）、（２）、（３）、（４）を必須構
成要素成分として含むことを特徴とするヒトＩＶ型コラ
ーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬。 （１） ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンと交差反
応する抗ヒトＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体に酵
素標識を付与した酵素標識抗体。 （２） 緩衝用液。 （３） 上記（１）におけるモノクローナル抗体とは異
なる部位を認識する別の抗ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コ
ラーゲンモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗
体結合固相担体。 （４） 精製ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン標準
試料。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、肝臓疾患を簡易に診断するのに
有用なヒトＩＶ型コラーゲンペプチドの酵素免疫学的定
量用試薬に関するものである。さらに詳しく言えば、本
発明は、ヒトＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル
抗体を用いた１段階サンドイッチ法に基づく酵素免疫学
的定量法によるヒトＩＶ型コラーゲンの定量用試薬を提
供するものである。

【０００２】

【背景技術】従来、血中ヒトＩＩＩ型プロコラーゲンＮ
末端ペプチド、ヒトＩＶ型コラーゲンＮ末端ペプチド７
−Ｓドメインおよび同、Ｃ末端ペプチドＮＣ１ドメイン
の各ポリクローナル抗体を用いて放射性免疫学的測定を
行ったという報告はなされている（Ｒｏｈｄｅら、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９，４５１〜４５
９，１９７９、Ｈｏｅｇｅｍａｎｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，１４４１〜１０，１９８４、Ｓｃｈｕ
ｐｐａｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７８，
２４４〜２４８，１９８６）。

【０００３】しかしながら、血中のヒトＩＶ型コラーゲ
ンについて、それを実際に迅速、正確に定量する方法お
よびそのような方法に使用する試薬は未だ提供されてい
ない。本発明者らは、ヒトＩＶ型コラーゲンを特異的に
定量する方法に関し、種々研究した結果、本発明により
ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンに対するモノクロ
ーナル抗体を用い、１段階サンドイッチ法に基づく酵素
免疫学的定量法により、少量の試料で、良好な精度で迅
速に測定し得るヒトＩＶ型コラーゲンペプチドの定量法
およびその定量に使用する試薬を提供することに成功し
た。

【０００４】

【発明の開示】本発明は、以下に詳述するとおりの１段
階サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的定量法によるヒ
ト血中のヒトＩＶ型コラーゲンの定量用試薬を提供する
ものである。本発明のヒトＩＶ型コラーゲンの定量用試
薬は、下記（１）、（２）、（３）、（４）を必須構成
要素成分として含むことを特徴とする。 （１） ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンと交差反
応するモノクローナル抗体に酵素標識を付与した酵素標
識抗体。 （２） 緩衝用液。 （３） ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンに交差反
応する上記（１）のモノクローナル抗体とは異なる部位
を認識する別の抗ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン
モノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体結合固
相担体。 （４） 精製ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン標準
試料。

【０００５】上記（１）、（２）、（３）、（４）の要
素を使用して、測定対象試料中のヒトＩＶ型コラーゲン
を定量するためには、（１）の酵素標識抗体を（２）の
緩衝用液に溶解し、その溶液中に測定対象試料を希釈
し、その希釈液中に（３）の抗体結合固相担体を混和
し、上記測定対象試料中に存在するヒトＩＶ型コラーゲ
ンと上記の酵素標識抗体ならびに上記の固相担体に結合
している抗体との間において免疫反応を行わしめた後、
固相担体を分別し、その固相担体の酵素活性を常法によ
り測定することにより定量する。（４）の精製ペプシン
可溶化ヒトＩＶ型コラーゲは検量線作製用の標準試料で
あって、この標準試料を用いて同じ酵素活性測定法によ
り、あらかじめ検量線を作製しておく。

【０００６】本発明の定量用試薬において、酵素標識を
付与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥ
ＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌおよびプロテインＡアフィニテ
ィカラムにより精製したＩｇＧ画分が用いられる。本発
明において使用するモノクローナル抗体としては、それ
ら抗体における特異的結合部分Ｆ（ａｂ′）_２、あるい
はＦａｂ′そのものを使用する態様も含まれるものであ
る。

【０００７】添付の図２および図５にみられるように本
発明の定量用試薬を用いて測定した肝疾患患者血清中の
ヒトＩＶ型コラーゲンペプチドの濃度の測定値は、健常
人血清中のそれよりも有意に高いことが認められ、本発
明の定量用試薬を用いて、血中ヒトＩＶ型コラーゲンペ
プチドの濃度を測定することにより、患者に負担のかか
るバイオプシーを実施することなく、肝疾患、特に肝線
維化、肝癌および消化器肝転移癌の予知に貢献すること
ができる。

【０００８】従来の肝機能判定法として使用されている
ＺＴＴ（硫酸亜鉛混濁反応）、ＧＯＴ（グルタミンオギ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ（グルタミンピ
ルビン酸トランスアミナーゼ）、ＡＬＰ（アルカリ性フ
ォスファターゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）およびγ
−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）など
による測定では、肝組織の線維化、肝癌および消化器肝
転移癌を判定するまでの精度は得られず、このことは、
本発明者らによって確認されている。したがって、本発
明者らが先に報告した血中ヒトプロリン水酸化酵素濃度
の測定（特開昭６１−２０２１６２号公報参照）と本発
明の定量用試薬による定量法とをあわせて用いることに
より血中の、ヒトＩＶ型コラーゲンペプチドの濃度を正
確に測定することができ、上記の諸疾患の早期発見が可
能となる。

【０００９】本発明の定量用試薬により、ヒトＩＶ型コ
ラーゲンペプチドの濃度測定に基づく肝組織線維化、肝
癌および消化器肝転移癌の診断を行うことができるの
で、本発明は著しい有用性を有するものである。以下、
実施例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明
はこれら実施例に限定されるものではない。

【００１０】

【実施例】

実施例 １ 抗ヒトＩＶ型コラーゲンペプチドモノクローナル抗体の
作製 （ａ） 抗原−ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンの
調製 ヒト胎盤を材料としてＡｒｔｅｒｙ，７，２６２〜２８
０（１９８０）に記載のＭａｙｎｅらの方法に従い０．
５Ｎ酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化（１ｍｇ／ｍ
ｌ）でコラーゲンを可溶化後、最終濃度２Ｍとなるよう
に塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた。これ
を０．５Ｎ酢酸に溶解し０．７Ｍ塩化ナトリウム含有
０．５Ｎ酢酸溶液で透析することによりＩ、ＩＩＩ型コ
ラーゲンを析出させ、その上清を１．２Ｍ塩化ナトリウ
ム含有０．５Ｎ酢酸溶液で透析し、ＩＶ、Ｖ型コラーゲ
ンを析出させた。ＩＶ、Ｖ型コラーゲン画分を０．５Ｍ
塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７．４）に溶解させ、２．２Ｍ塩化ナトリウム含有５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＩＶ型コラー
ゲンを析出させ、Ｖ型コラーゲンと分別した。得られた
ＩＶ型の純度をＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７２，１４７２〜１４８０（１９
７６）記載のＳｙｋｅｓらの方法に従いドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）で調べたところ約９５％であった。なお、そ
の際１７４ＫＤ、１３５ＫＤ、１０８ＫＤ、９２ＫＤ、
７８ＫＤ、６８ＫＤ、６０ＫＤ、５６ＫＤ、４３ＫＤ、
３４ＫＤおよび２９．５ＫＤ（メルカプトエタノール存
在下）の１１個の異なるバンドが検出された。

【００１１】（ｂ） 抗体産生細胞の調製 ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン１００μｇを完全
フロインドアジュバンドと共に８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌
マウス２匹に初回腹腔内投与した。２回目以降は０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に溶解させた抗原１００μｇを２〜４週間毎
に、２〜４回ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに追加免疫した。最
終免疫として脾臓摘出３日前に静脈内投与し脾細胞を調
製した。

【００１２】（ｃ） 細胞融合 以下の材料および方法を用いる。 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に重炭酸ナトリウ
ム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ
−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム（５０
ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）、および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を加
え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍＴｏ
ｙｏメンブレンフィルターで除菌濾過する。

【００１３】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ製）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。 ＨＡＴ培地：上記のＮＳ−１培地にさらにヒポキサンチ
ン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、お
よびチミジン（１６μＭ）を加える。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６４０培地のポ
リエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ ４，００
０，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．製）５０％（ｗ／
ｗ）無血清溶液を調製する。

【００１４】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ
−１（Ｐ３−ＮＳ１−１）との融合はＳｅｌｅｃｔｅｄ
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ
Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、ＷＨ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０），３５１〜３７２に記
載の０ｉらの方法を若干改変して行った。前記（ｂ）で
調製した有核脾臓細胞（生細胞率９５％）とミエローマ
細胞（生細胞率９５％）とを５〜６：１の割合で融合す
る。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別々に前記のＲＰＭ
Ｉ １６４０培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁
し、融合させるため上記の割合で混合する。容量５０ｍ
ｌの円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗａｋｉ Ｇｌ
ａｓｓ製）を用い、４０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地
中 ４００×ｇ、１０分間遠心し、上清を完全に吸出す
る。沈殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ４，０００溶液１ｍｌ
を穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間
撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に３７℃加温Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地１ｍｌを１分間で滴下する。この
操作をさらに１回繰返した後、同培地７ｍｌを２〜３分
間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させる。これを
４００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を完全に吸引除
去する。次にこの沈殿細胞に３７℃加温ＮＳ−１培地１
０ｍｌをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを１０ｍｌ
のピペットを用いて注意深くピペッティングして分散す
る。さらに同培地２０ｍｌを加えて希釈し、ポリスチレ
ン製９６穴マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ
製）にウエル当り５．９×１０^５個／０．１ｍｌの細胞
をまき込む。なおこの時使用した９６穴マイクロウエル
の前処理として０．２ｍｌのＮＳ−１培地を加え、炭酸
ガス培養器中（３７℃）で一晩保温し、使用時に培地を
吸引除去する。細胞融合完了したマイクロウエルを７％
炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下
にインキュベートする。

【００１５】（ｄ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 培養１日目にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加える。２、３、５、８、１１日目に培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え
る。１４日目にＨＴ培地に切換え以降３〜４日毎に同操
作を繰り返す。通常２〜３週間で充分なハイブリドーマ
の生育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウエルにつ
いて次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳ
Ａ）法により陽性ウエルをチェックする。次にフィーダ
ーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍ
ｌをポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｗａｋｉ Ｇ
ｌａｓｓ製）に加えたものを用い、上記で検出された各
陽性ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記
（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３７℃で
約１週間インキュベートする。その間１〜２回各ウエル
の上清０．５ｍｌを新しいＨＴ培地０．５ｍｌと交換す
る。ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法
により陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｆ）記
載の限界希釈法によるクローニングを行う。なお、クロ
ーニングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ^２組
織培養フラスコ（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ製）に移し、
凍結保存用試料を調製する。

【００１６】（ｅ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＩＶ型
コラーゲンペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改
変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗体
の検出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプ
レート（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
製）を０．５〜１．０μｇのペプシン可溶化ヒトＩＶ型
コラーゲンでコートし、さらにその他を１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）でコートしブロックする。これにハイ
ブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１
時間インキュベートする。２次抗体として西洋わさび由
来ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン（ＣａｐｐｅｌＬａｂ．製）を加えさらに室
温で約１時間インキュベートする。次に過酸化水素と基
質であるｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を加え生成
した褐色の程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−
Ａ４，東洋曹達工業製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を
測定する。

【００１７】（ｆ） クローニング 各ウエル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。ＮＳ−１培地ｍｌ当りフィーダーとして１０^７個の
マウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し９６穴
マイクロウエルの３６ウエル、３６ウエルおよび２４ウ
エルにウエル当り５個、１個および０．５個のハイブリ
ドーマを加える。５日目、１２日目に各約０．１ｍｌの
ＮＳ−１培地を追加する。クローニング開始後１４〜１
５日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニ
ー形成陰性ウエルが５０％以上である群についてＥＬＩ
ＳＡ法を行う。テストした全ウエルが陽性でない場合、
抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１
コロニーのウエルを４〜６個選び再クローニングする。
最終的にペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンに対して２２
株のクローンを得た。

【００１８】（ｇ） モノクローナル抗体のインビトロ
増殖およびインビボ増殖 モノクローナル抗体の増殖は以下のようにして行う。上
記（ｆ）で得られた各クローンをＮＳ−１培地などの適
当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、その培養上清
から各モノクローナル抗体を得ることができる（モノク
ローナル抗体たん白濃度は１０〜１００μｇ／ｍｌであ
る）。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞とミエロ
ーマ細胞の由来動物と同系の動物（ＢＡＬＢ／ｃ、マウ
ス）に腫瘍形成促進剤プリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ製）をマウス１匹当り０．５ｍｌ腹腔内投与
する。１〜３週間後にハイブリドーマ１×１０^７個を同
じく腹腔内投与することによりインビボで１〜２週間後
にモノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｍｇ／ｍｌの
腹水を得ることができる。

【００１９】（ｈ） モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖
のアイソタイプ 上記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずペプシン可溶化
ヒトＩＶ型コラーゲンをコートしたミクロタイトレーシ
ョンプレートのウエルの各列に入れ、前述したＥＬＩＳ
Ａ法に従ってそれぞれの腹水中の各モノクローナル抗体
をそれぞれ結合させる。洗浄後、アイソタイプ特異性ウ
サギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ製）を加える。洗浄後、ＰＯＤ標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として２，２′−
アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）お
よび過酸化水素を用いて重鎖、軽鎖のアイソタイプを検
出した。その結果を第１表に示した。得られた各モノク
ローナル抗体についてみると、それらのモノクローナル
抗体のうち、１６個が免疫グロブリン鎖γ１／κを有
し、２個がγ２ｂ／κを有し、１個がα／κを有し、そ
して３個がμ／κを有していた。

【００２０】

【表１】

【００２１】（ｉ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、０．０６Ｍ塩化ナトリウム含有４０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）の非吸着画分を分取し、
培地中の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん白質を分
離、除去した。さらに、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）で平衡化し
たプロテインＡセルロファイン（生化学工業製）カラム
に吸着させ非吸着画分を除去した後、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出
することにより精製した。なお、溶出液は直ちに１．５
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）により中和した。

【００２２】実施例 ２ ヒト血清中のＩＶ型コラーゲンペプチドの定量 （ａ） 酵素標識モノクローナル抗体（Ｆａｂ′−ＰＯ
Ｄ複合体）の調製 （１） Ｆａｂ′画分の調製 実施例１（ｉ）で得られた各精製モノクローナル抗体を
０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．２）に溶解し、その溶液を以下に述べるようにして
ペプシンで消化した。すなわち、前記画分中のＩｇＧに
対し２％（ｗ／ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時
間消化した。更にその消化物に２Ｍトリス溶液を加えて
ｐＨを７．０に調整することにより消化反応を停止さ
せ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ウルトロゲルＡｃＡ４４カラム（ＬＫＢ製）を用いたゲ
ル濾過により（ａｂ′）_２画分を分取した。次に、この
Ｆ（ａｂ′）_２画分を５ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
中で透析し、終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタン
チオール（ＭＥＡ）を加え３７℃で１．５時間還元した
後、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを
用いてゲル濾過し、Ｆａｂ′画分を分取した。

【００２３】（２） マレイミド標識ＰＯＤ画分の調製 上記（１）の操作とは別に、以下に述べるようにしてＰ
ＯＤにマレイミドを標識した。すなわち、ＰＯＤを１０
ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、そのＰＯＤに対して、２５倍モル量のＮ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド
（ＥＭＣＳ）をジメチルホルムアミド溶液として加え、
３０℃、３０分間反応させた。これを０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−５
０カラムでゲル濾過し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分
取した。

【００２４】（３） Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体画分の調
製 上記（１）の如くして調製した画分中のＦａｂ′に対し
て上記（２）で得られた画分中のマレイミド標識ＰＯＤ
として等モルになるようにして、両画分を混合し、更に
Ｆａｂ′およびマレイミド標識ＰＯＤの終濃度が１００
μＭとなるように５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈した。この混合液を４℃、
２０時間反応後、Ｆａｂ′の１０倍モル量のＮ−エチル
マレイミドで未反応のチオール基をブロックした。これ
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ４４カラムでゲル濾過し、Ｆａｂ′−
ＰＯＤ複合体画分を分取後、０．１％ＢＳＡ及び０．０
０５％チメロサールを添加し、４℃で保存した。

【００２５】（ｂ） 固相担体としてポリスチレンボー
ル（径６．５ｍｍ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉ
ｃ Ｂａｌｌ製）を用いた１段階サンドイッチ法 実施例１（ｉ）で得られたペプシン可溶化ヒトＩＶ型コ
ラーゲンに対する精製モノクローナル抗体（クローンＮ
ｏ．４Ｈ１２）を０．１％アジ化ナトリウム含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解しその濃度を０．
１ｍｇ／ｍｌに調製する。この抗体溶液に固相担体とし
てのポリスチレンボールを浸漬しポリスチレンボールに
抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収しポリスチレ
ンボールを０．１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．１％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で洗浄し、４℃に保存する。使用時に
は、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄した抗体結合ポリスチレンボール
を用いる。

【００２６】標準試料として実施例１（ａ）で得られた
精製ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンを１％ＢＳ
Ａ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１／５０（ｖ／ｖ）馬血
清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）および０．０
５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて、４０ｎｇ／２０μｌの溶液を調製し、そ
れを段階希釈することにより、その各２０μｌをとり測
定試料とした。

【００２７】一方、血清試料としては健常人（ＮＯＲ）
の血清２０μｌ、肝癌（ＨＣＣ）、肝硬変（ＬＣ）およ
び慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）各患者の血清を２０μｌ用
いた。これらの試料をそれぞれ０．８μｇ／ｍｌ Ｆａ
ｂ′（クローンＮｏ．１Ｄ３）−ＰＯＤ複合体、１％Ｂ
ＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１／５０（ｖ／ｖ）馬
血清および０．０５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌに溶解した。次にこれ
らの標準試料および血清試料のそれぞれに、モノクロー
ナル抗体結合ポリスチレンボールを添加して３７℃で４
５分間インキュベート（免疫反応）後、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて
洗浄する。次に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶
解したＰＯＤ基質、すなわち０．０１３４％テトラメチ
ルベンチジン（ＴＭＢＺ）を３００μｌ加え、さらに
０．０１％過酸化水素水１００μｌを加えて３７℃で３
０分間インキュベート（発色反応）後、１．３３Ｎ硫酸
６００μｌを添加することにより反応を停止させる。反
応停止後、水を対照として島津マイクロフロー紫外可視
分光光度計（ＵＶ−７３０）で波長４５０ｎｍの吸光度
を測定し、盲検と試料の吸光度差を求める。標準試料よ
り作成した検量線より検体２０μｌの吸光度に相当する
ＩＶ型コラーゲンペプチド量を読みとり、その値を５０
倍することにより検体１ｍｌ当りのＩＶ型コラーゲン量
を求めた（第２表参照）。

【００２８】

【表２】

【００２９】図１にペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲ
ンの検量線を示した。図１で明らかなごとくこのサンド
イッチ法の定量感度は０．３１ｎｇ／試験管であり、定
量範囲は０．３１〜４０ｎｇ／試験管であった。また、
定量変動係数（ＣＶ）は２．６〜９．５％であった。こ
のビーズ法での反応時間は免疫反応４５分間、発色反応
３０分間で従来の２段階サンドイッチ法（例えば特開昭
６１−２０２１６２号公報参照）の半分以下の時間で測
定が可能となった。

【００３０】このサンドイッチ法による測定によりＮＯ
Ｒ、ＨＣＣ、ＬＣおよびＣＡＨ患者血清中のＩＶ型コラ
ーゲンを測定した結果、ＮＯＲ血清のＭ（平均値）＋２
ＳＤ（標準偏差）をカットオフ値とした時、各肝疾患の
陽性率は、それぞれ９７％、８０％および８０％であつ
た（図２）。また、胃癌患者で転移を認めない無転移群
（Ｍ（−））１２例、さらに組織学的にあるいは画像診
断で確診された肝転移群（ＨＭ）１３例およびリンパ行
性転移群（ＬＭ）１０例の血清中ＩＶ型コラーゲンを同
様にこのサンドイッチ法により測定した。図３で明らか
なようにＩＶ型コラーゲン濃度はＨＭ、ＬＭおよびＭ
（−）ではそれぞれ５５２±３００、１９９±８１およ
び１０４±６２ｎｇ／ｍｌ（Ｍ±ＳＤ）であった。ＮＯ
Ｒ血清のＭ＋２ＳＤをカットオフ値としたときに、各疾
患の陽性率は、それぞれ１００％、８０％および２５％
であった。

【００３１】（ｃ） 固相担体としてポリスチレン製マ
イクロプレート（Ｎｕｎｃ製）を用いた１段階サンドイ
ッチ法 実施例１（ｉ）で得られた精製モノクローナル抗体（ク
ローンＮｏ．４Ｈ１２）を０．１％アジ化ナトリウム含
有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、その
濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調製する。この抗体溶液を固
相担体としてのポリスチレンマイクロプレートにコート
するために１ウエル当り１００μｌ添加し、４℃保存す
る。使用時には１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．１％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）３００μｌこてマイクロプレートをブ
ロックした後、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄したマイクロプレートを用いる。

【００３２】標準試料として実施例１（ａ）で得られた
精製ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンを１％ＢＳ
Ａ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１／５０（ｖ／ｖ）馬血
清および０．０５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で５０ｎｇ／５０μｌに調製し、こ
れを段階希釈したものを各々１ウエル当り２０μｌ用い
た。一方、血清試料として健常人（ＮＯＲ）あるいはＨ
ＣＣ、ＬＣ、ＣＡＨ、慢性非活動性肝炎（ＣＩＨ）の各
患者のそれぞれの血清を１ウエル当り各２０μｌ用い
た。すなわち、これらの試料各５０μｌを０．８μｇ／
ｍｌ Ｆａｂ′（クローンＮｏ．１Ｄ３）−ＰＯＤ複合
体、１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１／５０
（ｖ／ｖ）馬血清および０．０５％チメロサール含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌに溶解
し、１ウエル当り１００μｌの試料溶液をモノクローナ
ル抗体結合マイクロプレートに添加し、室温（１０〜３
０℃）で１時間インキュベート（免疫反応）後、０．１
Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１ウエ
ル当り１００μｌ添加することにより免疫反応を停止さ
せ、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ ２０含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）にて洗浄する。次に、０．０２％過酸化水素含有ク
エン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にＯＰＤ・２塩酸
塩を溶解し、その濃度を４ｍｇ／ｍｌに調製した溶液
（ｐＨ５．０）を１００μｌ加え室温で１５分間インキ
ュベート（発色反応）後、１．３３Ｎ硫酸１００μｌを
添加し反応を停止させる。反応停止後、マイクロプレー
トリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定し、盲検と
試料の吸光度差を求める。標準試料より作成した検量線
より検体２０μｌの吸光度に相当するＩＶ型コラーゲン
量を読みとりその値を５０倍することにより検体１ｍｌ
当りのＩＶ型コラーゲン量を求めた（第３表参照）。

【００３３】

【表３】

【００３４】図４にペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲ
ンの検量線を示した。図で明らかなごとく、このサンド
イッチ法の定量感度は、０．１６ｎｇ／ウエルであり、
定量範囲は０．１６〜２０ｎｇ／ウエルであった。ま
た、この定量系のＣＶ値は０．５〜６．０％であった。
このプレート法での反応時間は免疫反応６０分間、発色
反応１５分間で、従来の２段階サンドイッチ法の半分以
下の時間で多数の検体の測定が可能となった。また、同
一検体を測定した時の同時再現性および日差変動はいず
れもＣＶ値５％以内と非常に良好な結果が得られた（第
４表参照）。

【００３５】

【表４】

【００３６】

【表５】

【００３７】本発明の定量用試薬を用いて血中コラーゲ
ンペプチドを定量することにより、ＨＣＣ、ＬＣ、ＣＡ
Ｈ各患者の血清中におけるコラーゲンペプチド量につい
て有意な増加が認められた。各肝疾患の陽性率はＮＯＲ
血清のＭ＋２ＳＤをカットオフ値とした場合、ＨＣＣ９
２％、ＬＣ ８７％、ＣＡＨ８３％、 ＣＩＨ ３９％
であった（図５）。このような測定値に基づく肝疾患患
者血清中のコラーゲンペプチド量の増加は、固相担体と
してポリスチレンボールを用いた１段階サンドイッチ法
による測定における場合と同様な傾向を示した。

【００３８】実施例 ３ （ａ） 抗原の同定 実施例１（ａ）で精製したペプシン可溶化ヒトＩＶ型コ
ラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、実施例２
（ａ）で得られたＦａｂ′−ＰＯＤ複合体を用いて細胞
工学１＆２ １０６１〜１０６８（１９８３）に記載の
田部の方法に従ってウエスタンブロッティングを行い、
酵素抗体染色のパターンを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ク
マシーブリリアントブルーにてタンパクを染色したもの
のパターン、ウエスタンブロッティング後のニトロセル
ロース膜をそれぞれ実施例２（ａ）で得られたＦａｂ′
（クローンＮｏ．１Ｄ３）−ＰＯＤ複合体で免疫染色し
たもののパターンには１９０ＫＤ、１７５ＫＤ、１２５
ＫＤ、９４ＫＤ、および８６ＫＤの５個のバンドと２０
０ＫＤ以上に凝集物２個（２０５ＫＤおよび２２０Ｋ
Ｄ）のバンドが認められた（メルカプトエタノール存在
下）。同じくＦａｂ′（クローンＮｏ．４Ｈ１２）−Ｐ
ＯＤ複合体で免疫染色したもののパターンには１８５Ｋ
Ｄ、１７０ＫＤ、１５５ＫＤ、１２０ＫＤ、および９０
ＫＤの５個のバンドと２００ＫＤ以上に凝集物２個（２
００ＫＤおよび２２０ＫＤ）のバンドが認められた（図
６）。

【００３９】（ｂ） ヒト血清中免疫反応物の分子量 実施例２（ｂ）および（ｃ）に記載したヒトＩＶ型コラ
ーゲン酵素免疫定量法で補足されるヒト血清中免疫反応
物の分子量サイズを測定した。すなわち、健常者および
肝疾患（ＨＣＣ）患者血清（いずれもヒトＩＶ型コラー
ゲン３００ｎｇ含有）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
３００（１．６×９０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）
でゲル濾過し、各画分の免疫反応物を実施例２（ｂ）の
ポリスチレンボールを用いる１段階サンドイッチ法で定
量した。図７に示した如く健常人（−●−）および肝疾
患患者（−×−）血清中の免疫反応物は単一ピークであ
り、対照として用いたペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラー
ゲンペプチド（３００ｎｇ、−○−）より若干分子量は
小さかった。フイブリノーゲン、免疫グロブリン、牛血
清アルブミン、ペルオキシダーゼを用いた検量線から血
清中免疫反応物の分子量は６２０ＫＤと推定した。

【００４０】（ｃ） 特異性 下記註に記載した方法で調製したヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶ
（酸抽出）、Ｖ、ＶＩ型コラーゲンおよびペプシン可溶
化ラットＩＶ型コラーゲンを実施例２（ｂ）記載のポリ
スチレンボールを用いる１段階サンドイッチ法で定量
し、ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンの定量値と比
較した。第５表に示した如くＶＩ型コラーゲンで若干の
交差反応（約７％）が認められた以外は他のいずれのコ
ラーゲンについても交差反応は認められなかった。

【００４１】註：ヒト胎盤および新生仔ラツトを原料に
実施例１（ａ）記載の方法に従ってヒト胎盤からペプシ
ン可溶化ＩＶ型以外にＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩ型コラ
ーゲンを分別精製した。また、新生仔ラットから同様に
ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンを調製した。酸抽出Ｉ
Ｖ型コラーゲンはヒト胎盤を材料にＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，８４，４３〜５２（１９７８）および９
５，２５５〜２６３（１９７９）に記載のＴｉｍｐｌら
の方法に従って調製した。

【００４２】

【表６】

【００４３】（ｃ） 回収率 ＩＶ型コラーゲン９３．０ｎｇ／ｍｌおよび２３４．０
ｎｇ／ｍｌ濃度の２種のヒト血清にそれぞれ３１〜５０
０ｎｇ／ｍｌの範囲でペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲ
ンを添加し、実施例２（ｂ）、同２（ｃ）記載のポリス
チレンボールおよびポリスチレンプレートを用いる１段
階サンドイッチ法でそれらの回収率を調べた。図８に示
した如くボール法およびプレート法での添加ペプシン可
溶化ＩＶ型コラーゲンペプチドに対する回収ＩＶ型コラ
ーゲンの相関係数、回収率はそれぞれγ＝０．９９９
７、９９．４±１０．３％（Ｍ±ＳＤ）およびγ＝０．
９９９３、１０１．６±７．１％であった。

【００４４】（ｅ） 抗原決定基 図６のイムノブロッティング図に示した如く実施例２
（ｂ）および同２（ｃ）記載のボールあるいはプレート
を用いる１段階サンドイッチ法に使用されている固相抗
体（クローンＮｏ．４Ｈ１２）およびＰＯＤ標識抗体
（クローンＮｏ．１Ｄ３）による抗原認識部位は若干異
なる。この固相抗体とＰＯＤ標識抗体の抗原認識部位を
明らかにするために抗原抗体阻害率を調べた。すなわ
ち、試験管当り１０ｎｇペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラ
ーゲンおよび０〜１０μｇモノクローナル抗体（クロー
ンＮｏｓ．，１Ｄ３、３Ａ９および４Ｈ１２）を１％Ｂ
ＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）中で３７℃、６０分間プレインキュベ
イションし、次に実施例２（ｂ）の方法に従って調製し
たクローンＮｏ．４Ｈ１２からのモノクローナル抗体コ
ートポリスチレンボールと試験管当り４０ｎｇＦａｂ′
（クローンＮｏ．３Ａ９）−ＰＯＤ複合体とを加え３７
℃、６０分間反応後、ＴＭＢＺおよび過酸化水素水を加
え３０℃、６０分間静置後、Ａ_４５０を測定した。図９
に示した如く標準ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン
をクローンＮｏ．１Ｄ３（−×−）からのモノクローナ
ル抗体で処理した場合は、抗原抗体反応の阻害は観察さ
れなかったが、ここで固相抗体および複合体に用いたク
ローンＮｏ．３Ａ９（−●−）およびクローンＮｏ．４
Ｈ１２（−○−）からのモノクローナル抗体で処理した
場合には阻害が認められた。この結果より、本明細書に
開示されている１段階サンドイッチ法に使用されている
固相抗体（クローンＮｏ．４Ｈ１２）がＰＯＤ標識抗体
（クローンＮｏ．１Ｄ３）に対してペプシン可溶化ヒト
ＩＶ型コラーゲンの異なる抗原決定基と特異的に反応し
ていることが明らかである。

【００４５】以上、（ａ）〜（ｅ）の結果により、上述
の１段階サンドイッチ酵素免疫定量法は、ＩＶ型コラー
ゲン分子を特異的に認識する測定系であることが判る。

【００４６】実施例 ４ （ａ） 抗ヒトＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体の
作製 実施例１に記載の方法に従ってヒトＩＶ型コラーゲンに
対するモノクローナル抗体１７個を調製した。それらク
ローンの内４個が免疫グロブリン鎖γ１／κを、他の１
３個はμ／κを有していた（第６表）。

【００４７】

【表７】

【００４８】（ｂ） 固相担体としてポリスチレンマイ
クロプレート（Ｎｕｎｃ製）を用いる１段階サンドイッ
チ法 上記（ａ）で得られたヒトＩＶ型コラーゲンに対する精
製モノクローナル抗体（クローンＮｏ．３１−８Ｇ９）
を実施例２（ｃ）と同様な方法でマイクロプレートにコ
ートした。一方、ＰＯＤ標識抗体は実施例１で得られた
ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンペプチドに対する
モノクローナル抗体（クローンＮｏ．４Ｈ１２）を用い
て実施例２の方法に従って調製した。実施例３の（ｃ）
の註記載の方法で調製したペプシン可溶化ヒトＩＶ型コ
ラーゲンを標準試料として第７表に示した方法で検量線
を作製した。

【００４９】

【表８】

【００５０】このサンドイッチ法の定量感度は０．５ｎ
ｇ／ウエルであり、定量範囲は、０．５〜５４ｎｇ／ウ
エルであった。また、その時のＣＶは０．３〜６．８％
であった。このプレート法での免疫反応は６０分間、発
色反応３０分間であり、実施例２（ｃ）に示した測定結
果と同様に短時間、高感度でヒトＩＶ型コラーゲンが測
定された。このサンドイッチ法による測定によりＮＯ
Ｒ、ＬＣおよびＨＣＣ患者血清中のヒトＩＶ型コラーゲ
ン濃度を測定した結果、ＮＯＲ血清のＭ＋２ＳＤをカッ
トオフ値とした時、ＬＣおよびＨＣＣ患者の陽性率はそ
れぞれ７１％、１００％であった（第８表）。

【００５１】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１】固相担体としてポリスチレンボールを用いた１
段階サンドイッチ法（ビーズ法）によるペプシン可溶化
ヒトＩＶ型コラーゲンの検量線である。

【図２】ビーズ法により測定したＮＯＲ、ＨＣＣ、Ｌ
Ｃ、ＣＡＨの各患者の血清中の免疫反応性ＩＶ型コラー
ゲンペプチド濃度を示す。図中、横棒はＭを、点線はＮ
ＯＲのＭ＋２ＳＤを、（）内数値は検体数を示す。

【図３】ビーズ法により測定したＨＭ、ＬＭおよびＭ
（−）の各患者の血清中の免疫反応性ＩＶ型コラーゲン
濃度を示す。図中、縦棒は、Ｍ±ＳＤを、点線は、ＮＯ
ＲのＭ＋２ＳＤを、（）内数値は、検体数を示す。

【図４】固相担体としてポリスチレンマイクロプレート
を用いた１段階サンドイッチ法（プレート法）によるペ
プシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンの検量線である。

【図５】プレート法により測定したＮＯＲ、ＨＣＣ、Ｌ
Ｃ、ＣＡＨおよびＣＩＨ各患者の血清中の免疫反応性Ｉ
Ｖ型コラーゲンペプチド濃度を示す。図中横棒はＭを、
点線はＭ＋２ＳＤを、（）内数値は検体数を示す。

【図６】標準ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンベプ
チドのイムノブロッティング図である。Ａ：Ｆａｂ′
（クローンＮｏ．１Ｄ３）−ＰＯＤによる染色Ｂ：Ｆａ
ｂ′クローンＮｏ．４Ｈ１２）−ＰＯＤによる染色。

【図７】ヒト血清中免疫反応物のゲル濾過パターンを示
す図である。

【図８】ボール法（Ａ）およびプレート法（Ｂ）による
ヒト血清への添加ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン
ペプチドに対する回収ＩＶ型コラーゲンの相関図を示
す。

【図９】３種類のモノクローナル抗体に対する抗原抗体
反応の阻害率を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（１）、（２）、（３）、（４）を
   必須構成要素成分として含むことを特徴とするヒトＩＶ
   型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬。 （１） ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンと交差反
   応する抗ヒトＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体に酵
   素標識を付与した酵素標識抗体。 （２） 緩衝用液。 （３） 上記（１）におけるモノクローナル抗体とは異
   なる部位を認識する別の抗ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コ
   ラーゲンモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗
   体結合固相担体。 （４） 精製ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン標準
   試料。