JPS5838151B2 - カリクレインの精製法 - Google Patents
カリクレインの精製法Info
- Publication number
- JPS5838151B2 JPS5838151B2 JP10325981A JP10325981A JPS5838151B2 JP S5838151 B2 JPS5838151 B2 JP S5838151B2 JP 10325981 A JP10325981 A JP 10325981A JP 10325981 A JP10325981 A JP 10325981A JP S5838151 B2 JPS5838151 B2 JP S5838151B2
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- JP
- Japan
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- kallikrein
- antibody
- solution
- insoluble
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はカリクレインの精製方法に関する。
さらに詳細には、本発明は不溶型カリクレイン抗体を用
いることによってカリクレインを簡単に高純度に精製す
る方法に関する。
いることによってカリクレインを簡単に高純度に精製す
る方法に関する。
カリクレインは動物の尿、血清、唾液、汗、涙、顎下腺
、膵臓、副性腺、腎臓などの生体内に広く分布している
蛋白分解酵素である。
、膵臓、副性腺、腎臓などの生体内に広く分布している
蛋白分解酵素である。
またカリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプ
チドキニンを遊離させるキニン遊離酵素であり、近年、
循環器系疾患の治療剤として重要であり、臨床的に広く
用いられている。
チドキニンを遊離させるキニン遊離酵素であり、近年、
循環器系疾患の治療剤として重要であり、臨床的に広く
用いられている。
カリクレインの精製法としては、従来、硫安塩析、溶媒
沈殿、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交換
クロマト、電気泳動法、また阻害剤を利用するアフイニ
テイークロマトグラフイーを行う方法等があるが、これ
らの方法はカリクレインと交雑蛋白との分離除去が困難
であり特異性に欠け、またかなりの時間と労力を要する
という欠点を有している。
沈殿、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交換
クロマト、電気泳動法、また阻害剤を利用するアフイニ
テイークロマトグラフイーを行う方法等があるが、これ
らの方法はカリクレインと交雑蛋白との分離除去が困難
であり特異性に欠け、またかなりの時間と労力を要する
という欠点を有している。
最近ではこうした精製方法に代わって不溶型力リクレイ
ン抗体を用0)たカリクレインの精製法が適用されつつ
ある。
ン抗体を用0)たカリクレインの精製法が適用されつつ
ある。
しかしながら、不溶型力リクレイン抗体を用いる精製法
は抗原一抗体反応の特異性を利用するため、その抗原一
抗体複合体の結合力が強く、従来、溶離には尿素及び塩
酸グアニジン等の変性溶離剤を用いざるを得なかった。
は抗原一抗体反応の特異性を利用するため、その抗原一
抗体複合体の結合力が強く、従来、溶離には尿素及び塩
酸グアニジン等の変性溶離剤を用いざるを得なかった。
( Biochem.J.189,153−159.1
980および特開昭56−5095参照) その結果、これらの溶離剤により、蛋白質の構造を変化
せしめ、溶出工程中でのカリクレインの失活は回避でき
ず、また、溶出後、ただちにこれらの溶離剤として用い
た試薬を除去することが必要であった。
980および特開昭56−5095参照) その結果、これらの溶離剤により、蛋白質の構造を変化
せしめ、溶出工程中でのカリクレインの失活は回避でき
ず、また、溶出後、ただちにこれらの溶離剤として用い
た試薬を除去することが必要であった。
本発明者は不溶型カリクレイン抗体を用いるカリクレイ
ンの精製方法について種々検討の結果、不溶型カリクレ
イン抗体吸着物をアルカリ性水溶液で溶出することによ
り、約95%の回収率で、しかも高純度でかつ安定なカ
リクレイン溶出液を取得する方法を見出した。
ンの精製方法について種々検討の結果、不溶型カリクレ
イン抗体吸着物をアルカリ性水溶液で溶出することによ
り、約95%の回収率で、しかも高純度でかつ安定なカ
リクレイン溶出液を取得する方法を見出した。
本発明においては、まず目的とする純度のカリクレイン
を動物に免疫することによって得た抗体を不溶性担体と
化学的に共有結合させて不溶型カリクレイン抗体を調整
する。
を動物に免疫することによって得た抗体を不溶性担体と
化学的に共有結合させて不溶型カリクレイン抗体を調整
する。
不溶性担体としては不活性であり、疎であり、不溶性で
ある担体、例えばアガロース、ガラスビーズ、デキスト
ラン、ポリアクリルアミド等を用いることができ、前記
抗体とは公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型カ
リクレイン抗体を調整することができる。
ある担体、例えばアガロース、ガラスビーズ、デキスト
ラン、ポリアクリルアミド等を用いることができ、前記
抗体とは公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型カ
リクレイン抗体を調整することができる。
このような不溶型カリクレイン抗体を用いて粗製カリク
レイン溶液を処理することにより、カリクレインを特異
的に吸着せしめたのち、洗浄によって不純物を完全に除
去し、ついでアルカリ性水溶液、好ましくは0. 2
M N a 2 C O s水溶液により、カリクレイ
ンを溶離させることによって、高純度なカリクレインを
高収率で得ることができる。
レイン溶液を処理することにより、カリクレインを特異
的に吸着せしめたのち、洗浄によって不純物を完全に除
去し、ついでアルカリ性水溶液、好ましくは0. 2
M N a 2 C O s水溶液により、カリクレイ
ンを溶離させることによって、高純度なカリクレインを
高収率で得ることができる。
本発明で用いる粗製カリクレインは人を含む動物の尿、
血液、膵臓等の公知のカリクレイン含有原料から公知の
方法で調整することができる。
血液、膵臓等の公知のカリクレイン含有原料から公知の
方法で調整することができる。
本発明者らは、カリクレインが溶液中、酸性側では不安
定であるが、アルカリ性側では比較的安定である事を見
出し、その特性を利用し、本精製法を確立した。
定であるが、アルカリ性側では比較的安定である事を見
出し、その特性を利用し、本精製法を確立した。
すなわち、本発明で用いる溶出液、例えば0. 2 M
N a 2 C O s水溶液(pH11.0〜11
.5)中では25℃で3時間処理後も97%以上の活性
を残存することが見出されている。
N a 2 C O s水溶液(pH11.0〜11
.5)中では25℃で3時間処理後も97%以上の活性
を残存することが見出されている。
さらに、本発明で用いるアルカリ性水溶液は不溶性担体
一抗体結合に何ら影響を与えず、PH8付近の適当な緩
衝液で再生することにより、半永久的に繰り返し使用が
可能であり、その吸着容量、活性回収率及び純度に変化
を与えることはない。
一抗体結合に何ら影響を与えず、PH8付近の適当な緩
衝液で再生することにより、半永久的に繰り返し使用が
可能であり、その吸着容量、活性回収率及び純度に変化
を与えることはない。
またその溶離剤は安価でその後の悦塩及び廃棄が非常に
容易であるという利点を有している。
容易であるという利点を有している。
以上の点より不溶型力リクレイン抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液を用いるカリクレインの精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。
てアルカリ性溶液を用いるカリクレインの精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれ
らの具体例により限定されるものではない○ 実施例 1 成人尿45lをIN水酸化ナトリウムでpH8.0に調
整する。
らの具体例により限定されるものではない○ 実施例 1 成人尿45lをIN水酸化ナトリウムでpH8.0に調
整する。
これを瀘過し、瀘液を限外濾過器によって濃縮して全量
1000mlとする。
1000mlとする。
この濃縮液を抗カリクレイン抗体を固定化したセファロ
ーズ4Bのカラム(200mのに流下し、吸着(1時間
)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む0.05
MIJン酸緩衝液により充分洗浄する。
ーズ4Bのカラム(200mのに流下し、吸着(1時間
)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む0.05
MIJン酸緩衝液により充分洗浄する。
次に0.2M炭酸ナトリウム溶液で溶出し、これをセフ
ァデツクスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
ァデツクスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
この処理によって表1に示される如く、比活性は104
倍上昇し、活性回収率は94%であった。
倍上昇し、活性回収率は94%であった。
実施例 2
部分精製ヒト尿中カリクレイン溶液500l71l(0
.15M塩化ナトリウムを含む0.05Mトリス塩酸緩
衝液pH8.0)を抗カリクレイン抗体を固定したセフ
ァローズ4Bのカラム(200m0に流下し、吸着(約
30分)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む0
.05Mトリス塩酸緩衝液pH8.0で充分洗浄後、0
.2M炭酸ナトリウム溶液で溶出し、これをセファデツ
クスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
.15M塩化ナトリウムを含む0.05Mトリス塩酸緩
衝液pH8.0)を抗カリクレイン抗体を固定したセフ
ァローズ4Bのカラム(200m0に流下し、吸着(約
30分)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む0
.05Mトリス塩酸緩衝液pH8.0で充分洗浄後、0
.2M炭酸ナトリウム溶液で溶出し、これをセファデツ
クスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
この処理によって表2に示す如く、比活性は約8倍上昇
し、活性回収率は97%であった。
し、活性回収率は97%であった。
実施例 3
部分精製カリクレイン溶液2 0 07rLl( 0.
1 5M塩化ナトリウムを含む0.05MIJン酸緩衝
液I)H8.0)を抗カリクレイン抗体を固定化したガ
ラスビーズのカラム(200mのに流下し、吸着(約1
0分)後、0.15M塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液1)H8.Oで充分洗浄後、0.2M炭酸ナトリウム
溶液で溶出し、これをセファデックスG 一25により
脱塩後、凍結乾燥する。
1 5M塩化ナトリウムを含む0.05MIJン酸緩衝
液I)H8.0)を抗カリクレイン抗体を固定化したガ
ラスビーズのカラム(200mのに流下し、吸着(約1
0分)後、0.15M塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液1)H8.Oで充分洗浄後、0.2M炭酸ナトリウム
溶液で溶出し、これをセファデックスG 一25により
脱塩後、凍結乾燥する。
この処理によって表3に示す如く、比活性は7.5倍上
昇し、 活性回収率は85%であった。
昇し、 活性回収率は85%であった。
実施例 4
部分精製カリクレイン溶液5 0 0ml( 0.1
5 M塩化ナトリウムを含む0.05MIJン酸緩衝液
PH8.0)を抗カリクレイン抗体を固定化したセファ
ーローズ4Bのカラム(200mA)に流下し、吸着(
約30分)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む
0.05MIJン酸緩衝液pH8.0で充分洗浄後0.
1Mグリシンー水酸化ナトリウム緩衝液( pH1 1
.5 ’)で溶出し、セファデツクスG一25により脱
塩後凍結乾燥する。
5 M塩化ナトリウムを含む0.05MIJン酸緩衝液
PH8.0)を抗カリクレイン抗体を固定化したセファ
ーローズ4Bのカラム(200mA)に流下し、吸着(
約30分)させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む
0.05MIJン酸緩衝液pH8.0で充分洗浄後0.
1Mグリシンー水酸化ナトリウム緩衝液( pH1 1
.5 ’)で溶出し、セファデツクスG一25により脱
塩後凍結乾燥する。
この処理によって表4に示す如く、比活性は7.3倍上
昇し、活性回収率は80%であった。
昇し、活性回収率は80%であった。
実施例 5
バンクレアチン100gを冷水1000′fILlに懸
濁し、約2時間攪拌抽出し、5000回転10分間遠心
分離後、上清を集め、0.IN水酸化ナトリウムでPH
8.0に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定したセ
ファローズ4Bカラム(200rrLl)に流下し、吸
着(約50分)させた後0.15M塩化ナトリウムを含
むリン酸緩衝液PH8.0で充分洗浄後、0.2M炭酸
ナトリウム溶液で溶出し、セファデツクスG−25によ
り脱塩後、凍結乾燥する。
濁し、約2時間攪拌抽出し、5000回転10分間遠心
分離後、上清を集め、0.IN水酸化ナトリウムでPH
8.0に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定したセ
ファローズ4Bカラム(200rrLl)に流下し、吸
着(約50分)させた後0.15M塩化ナトリウムを含
むリン酸緩衝液PH8.0で充分洗浄後、0.2M炭酸
ナトリウム溶液で溶出し、セファデツクスG−25によ
り脱塩後、凍結乾燥する。
この処理によって表5に示す如く、比活性は3700倍
上昇し、 活性回収率は96%であった。
上昇し、 活性回収率は96%であった。
実施例 6
豚膵臓原末1 00gから実施例5と同様の操作によっ
て得た抽出液を0.IN水酸化ナl− IJウムでp
H 8. 0に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定
化したセファローズ4Bカラム(2007rtのに流下
し、吸着(約50分)させた後、0.1Mグリシンー水
酸化ナトリウム緩衝液pH11.5で溶出し、セファデ
ツクスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
て得た抽出液を0.IN水酸化ナl− IJウムでp
H 8. 0に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定
化したセファローズ4Bカラム(2007rtのに流下
し、吸着(約50分)させた後、0.1Mグリシンー水
酸化ナトリウム緩衝液pH11.5で溶出し、セファデ
ツクスG−25により脱塩後、凍結乾燥する。
この処理によって表6に示す如く、比活性は3600倍
上昇し活性回収率は82%であった。
上昇し活性回収率は82%であった。
実施例 7
豚生膵臓500gをミンチし、水1500mlを加え、
自己消化させて抽出する。
自己消化させて抽出する。
この抽出液を瀘過して瀘液を取り、これを0,IN水酸
化ナトリウムでpH8.0に調節した後、抗カリクレイ
ン抗体を固定化したガラスビーズのカラムに流下し、吸
着(約70分)させた後、0.2M炭酸ナトリウムによ
り溶出し、セファデツクスG−25により脱塩後、凍結
乾燥する。
化ナトリウムでpH8.0に調節した後、抗カリクレイ
ン抗体を固定化したガラスビーズのカラムに流下し、吸
着(約70分)させた後、0.2M炭酸ナトリウムによ
り溶出し、セファデツクスG−25により脱塩後、凍結
乾燥する。
この処理によって表7に示す如く、比活性は3500倍
上昇し、活性回収率は85%であった。
上昇し、活性回収率は85%であった。
0 抗カリクレイン抗体固定化セファローズ4Bの調節
例 GNBr活性化セファローズ4 B ( Phar−m
acis Fine Chemicals 社製)10
0gを1mMHC lにて洗浄、膨潤を行ない、0.5
M塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩
衝液pH8.3中で1.5gの抗カリクレイン抗体と結
合させ、室温で2時間攪拌し、未反応の活性基をIMの
エタノールアミンpH8.0でプロツキング(2時間ノ
する。
例 GNBr活性化セファローズ4 B ( Phar−m
acis Fine Chemicals 社製)10
0gを1mMHC lにて洗浄、膨潤を行ない、0.5
M塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩
衝液pH8.3中で1.5gの抗カリクレイン抗体と結
合させ、室温で2時間攪拌し、未反応の活性基をIMの
エタノールアミンpH8.0でプロツキング(2時間ノ
する。
次に上記の炭酸水素ナトリウム緩衝液によりプロツキン
グ試薬を洗浄し、抗力リクレイン抗体固定化セファロー
ズ4Bとする。
グ試薬を洗浄し、抗力リクレイン抗体固定化セファロー
ズ4Bとする。
0 抗カリクレイン抗体固定化ガラスビーズの調整
径2mmのガラスビーズ200gを十分に水洗した後、
150℃にて24時間乾燥する。
150℃にて24時間乾燥する。
その後2%r−アミノプロビルトリエトキシシランーア
セトン溶液200771lを加え、45℃にて24時間
還流する。
セトン溶液200771lを加え、45℃にて24時間
還流する。
次にビーズを水洗後1%グルタルアルデヒド200yd
を加え4℃にて24時間振とウする。
を加え4℃にて24時間振とウする。
その後50mM’Jン酸緩衝液p H 7. 0にて洗
浄し、同緩衝液200ml,抗カリクレイン抗体140
■を添加し、4℃にて24時間振とラする。
浄し、同緩衝液200ml,抗カリクレイン抗体140
■を添加し、4℃にて24時間振とラする。
次いで0.1M炭酸ナトリウムに溶解した50mMエタ
ノールアミン2001rLlを添加し、4°Cで24時
間振とラする。
ノールアミン2001rLlを添加し、4°Cで24時
間振とラする。
このビーズを50mM酢酸緩衝液pH5.0で十分洗浄
後、0.9%塩化ナトリウム、0.05%アジ化ナトリ
ウム、0.3%牛血清アルブミン及び0.6%トリトン
X−405を含む5 0 m M トリスー塩酸緩衝液
PH5.0中に4℃にて保存する。
後、0.9%塩化ナトリウム、0.05%アジ化ナトリ
ウム、0.3%牛血清アルブミン及び0.6%トリトン
X−405を含む5 0 m M トリスー塩酸緩衝液
PH5.0中に4℃にて保存する。
Pro−Phe −Arg−MCA活性測定法プロリル
ーフエニルアラニルーアルギニン−4−メチルークマリ
ル−7一アミドを基質とし、加藤らの方法(J .Bi
ochem.87.1127−1132.1980)に
基づいて行なった。
ーフエニルアラニルーアルギニン−4−メチルークマリ
ル−7一アミドを基質とし、加藤らの方法(J .Bi
ochem.87.1127−1132.1980)に
基づいて行なった。
0. 2 mlの0.15M塩化ナトリウムを含む0.
1Mトリス塩酸緩衝液pH8.0に10μlの試料を加
え、37°05分間のプレインキュベートの後、10m
MPro−Phe−Arg−MCA溶液を加え、60分
間の酵素反応を行なう。
1Mトリス塩酸緩衝液pH8.0に10μlの試料を加
え、37°05分間のプレインキュベートの後、10m
MPro−Phe−Arg−MCA溶液を加え、60分
間の酵素反応を行なう。
0.1M酢酸緩衝液p H 4. 5を2.5ml!加
え、反応を停止し、励起波長3 8 0 nm,蛍光波
長440nmにおける蛍光を測定する。
え、反応を停止し、励起波長3 8 0 nm,蛍光波
長440nmにおける蛍光を測定する。
カリクレイン活性は1分間当り1μモルの4メチルーク
マリン−7−アミンを遊離する酵素量をlunitとし
た。
マリン−7−アミンを遊離する酵素量をlunitとし
た。
Claims (1)
- 1 粗製カリクレイン溶液を不溶型カリクレイン抗体で
処理してカリクレインを特異的に吸着せしめ、吸着物を
洗浄したのち、溶離剤としてアルカリ性水溶液を用いて
カリクレインを溶離することを特徴とするカリクレイン
の精製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10325981A JPS5838151B2 (ja) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | カリクレインの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10325981A JPS5838151B2 (ja) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | カリクレインの精製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS585191A JPS585191A (ja) | 1983-01-12 |
JPS5838151B2 true JPS5838151B2 (ja) | 1983-08-20 |
Family
ID=14349439
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10325981A Expired JPS5838151B2 (ja) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | カリクレインの精製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5838151B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6019052U (ja) * | 1983-07-18 | 1985-02-08 | コニカ株式会社 | 複写機 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS596883A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-13 | Nippon Chem Res Kk | 人尿カリクレインの濃縮精製法 |
AU627427B2 (en) * | 1987-06-30 | 1992-08-27 | Amgen, Inc. | Production of kallikrein |
JP2557548B2 (ja) * | 1990-04-06 | 1996-11-27 | 住友電気工業株式会社 | SiCウイスカー強化Si3N4複合材料の製造方法 |
-
1981
- 1981-07-03 JP JP10325981A patent/JPS5838151B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6019052U (ja) * | 1983-07-18 | 1985-02-08 | コニカ株式会社 | 複写機 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS585191A (ja) | 1983-01-12 |
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